JP2000336040A - 筋線維芽細胞系疾患の予防または治療剤 - Google Patents
筋線維芽細胞系疾患の予防または治療剤Info
- Publication number
- JP2000336040A JP2000336040A JP11149493A JP14949399A JP2000336040A JP 2000336040 A JP2000336040 A JP 2000336040A JP 11149493 A JP11149493 A JP 11149493A JP 14949399 A JP14949399 A JP 14949399A JP 2000336040 A JP2000336040 A JP 2000336040A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- type
- cells
- collagen
- collagen gel
- smooth muscle
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＰＴＣＡ術後もしくはステント留置後の動脈
再狭窄、動脈硬化、脳動脈硬化症、肺線維症、肝硬変、
腎糸球体硬化症等の筋線維芽細胞増殖性の疾患に対する
予防または治療剤を提供することにある。 【解決手段】 ＩＶ型コラーゲンゲルまたはＩ型コラー
ゲンゲルは、動脈平滑筋細胞、腎臓糸球体メサンギウム
細胞、肝星細胞等の分化維持を保つかあるいは脱分化し
た筋線維芽細胞の再分化を誘導する作用し、従って動脈
硬化症、腎糸球体硬化症、肝硬変等の筋線維芽細胞系疾
患の予防または治療に有効である。
再狭窄、動脈硬化、脳動脈硬化症、肺線維症、肝硬変、
腎糸球体硬化症等の筋線維芽細胞増殖性の疾患に対する
予防または治療剤を提供することにある。 【解決手段】 ＩＶ型コラーゲンゲルまたはＩ型コラー
ゲンゲルは、動脈平滑筋細胞、腎臓糸球体メサンギウム
細胞、肝星細胞等の分化維持を保つかあるいは脱分化し
た筋線維芽細胞の再分化を誘導する作用し、従って動脈
硬化症、腎糸球体硬化症、肝硬変等の筋線維芽細胞系疾
患の予防または治療に有効である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はＰＴＣＡ術後もしく
はステント留置後の動脈再狭窄、動脈硬化症、腎糸球体
硬化症、肝硬変等、各組織の線維症または硬化症の予
防、もしくは進展防止、および治療方法についての分野
に属する。
はステント留置後の動脈再狭窄、動脈硬化症、腎糸球体
硬化症、肝硬変等、各組織の線維症または硬化症の予
防、もしくは進展防止、および治療方法についての分野
に属する。
【０００２】
【従来の技術】動脈硬化症、およびＰＴＣＡもしくはス
テント留置後の動脈再狭窄は、Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｒｏｓ
ｓの提唱する障害血管モデル仮説（Ｎａｔｕｒｅ（１９
９３）３６２：８０１−８０９，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．（１９８６）１４：１１５−１
２６）に従って生じると考えられている。すなわち、動
脈壁に加えられる様々な刺激・傷害による血管内皮細胞
の剥離などを契機として、一部の動脈平滑筋細胞は、そ
の形質が分化型から脱分化型に変化し（形質転換）、血
管内腔に向かい遊走し増殖し、Ｉ型コラーゲンなどの細
胞外マトリックス蛋白の過剰生産、コラーゲン線維の沈
着の結果、新生内膜の肥厚を引き起こすというものであ
る。従って、動脈平滑筋細胞の脱分化型への抑制および
脱分化型筋線維芽細胞の再分化を誘導することが、動脈
硬化症、動脈再狭窄の防止、治療に役立つと考えられ
る。現在までのところインビトロの培養系において動脈
平滑筋細胞の脱分化型への抑制効果があるものとして
は、ＩＧＦ１、インスリン、Ｉ型コラーゲンゲル等が知
られている。しかしながらこれらの抑制効果は一時的で
あり、１週間、１０日の長期間の培養では抑制効果を示
さない。更に、血清存在下ではほとんど抑制効果を示さ
ない。また、脱分化型動脈平滑筋細胞を分化型にもどす
培養条件はほとんど知られていない。これまでに動脈硬
化症、動脈再狭窄の治療方法として脱分化型動脈平滑筋
細胞の増殖抑制、アポトーシスの誘導、また、脱分化型
動脈平滑筋細胞のＩ型コラーゲン蛋白の産生抑制（Ｉ型
コラーゲンや、ＴＧＦベータのアンチセンスＤＮＡの利
用）および、Ｉ型コラーゲン修飾酵素またはプロッセシ
ング酵素の阻害によるコラーゲン線維の形成阻害等が試
みられている。
テント留置後の動脈再狭窄は、Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｒｏｓ
ｓの提唱する障害血管モデル仮説（Ｎａｔｕｒｅ（１９
９３）３６２：８０１−８０９，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．（１９８６）１４：１１５−１
２６）に従って生じると考えられている。すなわち、動
脈壁に加えられる様々な刺激・傷害による血管内皮細胞
の剥離などを契機として、一部の動脈平滑筋細胞は、そ
の形質が分化型から脱分化型に変化し（形質転換）、血
管内腔に向かい遊走し増殖し、Ｉ型コラーゲンなどの細
胞外マトリックス蛋白の過剰生産、コラーゲン線維の沈
着の結果、新生内膜の肥厚を引き起こすというものであ
る。従って、動脈平滑筋細胞の脱分化型への抑制および
脱分化型筋線維芽細胞の再分化を誘導することが、動脈
硬化症、動脈再狭窄の防止、治療に役立つと考えられ
る。現在までのところインビトロの培養系において動脈
平滑筋細胞の脱分化型への抑制効果があるものとして
は、ＩＧＦ１、インスリン、Ｉ型コラーゲンゲル等が知
られている。しかしながらこれらの抑制効果は一時的で
あり、１週間、１０日の長期間の培養では抑制効果を示
さない。更に、血清存在下ではほとんど抑制効果を示さ
ない。また、脱分化型動脈平滑筋細胞を分化型にもどす
培養条件はほとんど知られていない。これまでに動脈硬
化症、動脈再狭窄の治療方法として脱分化型動脈平滑筋
細胞の増殖抑制、アポトーシスの誘導、また、脱分化型
動脈平滑筋細胞のＩ型コラーゲン蛋白の産生抑制（Ｉ型
コラーゲンや、ＴＧＦベータのアンチセンスＤＮＡの利
用）および、Ｉ型コラーゲン修飾酵素またはプロッセシ
ング酵素の阻害によるコラーゲン線維の形成阻害等が試
みられている。
【０００３】腎糸球体硬化症では、種々の原因で糸球体
が障害されると腎臓糸球体メサンギウム細胞が形質転換
し、増殖し、糸球体内に過剰な細胞外マトリックス蛋白
の沈着を起こすことが観察されている。その結果とし
て、糸球体の硬化をもたらし、最終的には糸球体濾過機
能の廃絶から慢性腎不全の病態をもたらすことが知られ
ている。肝硬変では、肝星細胞が形質転換し、増殖し、
また細胞外マトリックス蛋白の過剰産生およびマトリッ
クス蛋白の沈着を生じる。その結果として、肝類洞壁の
変化を生み、肝機能の低下をもたらすことが知られてい
る。
が障害されると腎臓糸球体メサンギウム細胞が形質転換
し、増殖し、糸球体内に過剰な細胞外マトリックス蛋白
の沈着を起こすことが観察されている。その結果とし
て、糸球体の硬化をもたらし、最終的には糸球体濾過機
能の廃絶から慢性腎不全の病態をもたらすことが知られ
ている。肝硬変では、肝星細胞が形質転換し、増殖し、
また細胞外マトリックス蛋白の過剰産生およびマトリッ
クス蛋白の沈着を生じる。その結果として、肝類洞壁の
変化を生み、肝機能の低下をもたらすことが知られてい
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】現在、病巣部位で形質
転換を起こした動脈平滑筋細胞、腎臓糸球体メサンギウ
ム細胞、肝星細胞等の筋線維芽細胞に起因する動脈硬化
症、腎糸球体硬化症、肝硬変の予防、進展防止および治
療には有効な治療薬がないかもしくは更なる治療薬が望
まれている。
転換を起こした動脈平滑筋細胞、腎臓糸球体メサンギウ
ム細胞、肝星細胞等の筋線維芽細胞に起因する動脈硬化
症、腎糸球体硬化症、肝硬変の予防、進展防止および治
療には有効な治療薬がないかもしくは更なる治療薬が望
まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意検討し
た結果、細胞外マトリックスを用いて動脈平滑筋細胞、
腎臓糸球体メサンギウム細胞、肝星細胞を分化型で維持
する方法、および形質転換して脱分化した動脈平滑筋細
胞、腎臓糸球体メサンギウム細胞、肝星細胞を再分化さ
せる方法を見いだした。これらのことは病巣部位での筋
線維芽細胞の増殖抑制と細胞外マトリックス蛋白の過剰
生産、沈着を抑制できることを示す。すなわち形質転換
した動脈平滑筋細胞、腎臓糸球体メサンギウム細胞、肝
星細胞の示す個々の変化、例えば増殖能、細胞外マトリ
ックス蛋白質生産能などを治療の標的にするのではな
く、脱分化する前のこれら細胞などの血管周皮細胞ある
いは平滑筋関連細胞の分化を維持するかまたは脱分化し
た筋線維芽細胞を再分化誘導することによりもとの分化
状態の細胞に戻すことにより、ＰＴＣＡ術後もしくはス
テント留置後の動脈再狭窄、動脈硬化症、腎糸球体硬化
症、肝硬変の予防、進展防止、治療することを見いだし
た。例えばＩＶ型コラーゲンゲルを用いて培養すると、
動脈平滑筋細胞、腎臓糸球体メサンギウム細胞、肝星細
胞の形質を維持することができる。また、ＩＶ型コラー
ゲンゲルを用いて培養すると、形質転換した細胞をもと
の分化状態の細胞に戻すことができる。このような作用
を持つ物質を病巣部位に投与することで、病巣部位に存
在し、病態を進展させる形質転換細胞を正常な細胞に戻
すことができる。これによって、病状を回復、または悪
化を防ぐことができる。すなわち、本発明は下記の
（１）〜（５）に関するものである。 （１）血管周皮細胞あるいは平滑筋関連細胞の分化を維
持するかもしくは脱分化した筋線維芽細胞の再分化を誘
導して病巣部位を修復する機能を有する細胞外マトリッ
クスを、有効成分として含有する筋線維芽細胞系疾患の
予防または治療剤。 （２）筋線維芽細胞系疾患が、ＰＴＣＡ術後もしくはス
テント留置後の動脈再狭窄、動脈硬化症、腎糸球体硬化
症または肝硬変である上記（１）記載の予防または治療
剤。 （３）筋線維芽細胞系疾患が脳頚動脈硬化症または肺線
維症である上記（１）記載の予防または治療剤。 （４）細胞外マトリックスがＩＶ型コラーゲンゲルまた
はＩ型コラーゲンゲルである上記（１）から（３）のい
ずれかに記載の予防または治療剤。 （５）ＩＶ型コラーゲンが会合し、平均直径５〜３５ｎ
ｍのポアサイズを持つ多角編み目構造を持つゲルである
上記（４）記載の予防または治療剤。
た結果、細胞外マトリックスを用いて動脈平滑筋細胞、
腎臓糸球体メサンギウム細胞、肝星細胞を分化型で維持
する方法、および形質転換して脱分化した動脈平滑筋細
胞、腎臓糸球体メサンギウム細胞、肝星細胞を再分化さ
せる方法を見いだした。これらのことは病巣部位での筋
線維芽細胞の増殖抑制と細胞外マトリックス蛋白の過剰
生産、沈着を抑制できることを示す。すなわち形質転換
した動脈平滑筋細胞、腎臓糸球体メサンギウム細胞、肝
星細胞の示す個々の変化、例えば増殖能、細胞外マトリ
ックス蛋白質生産能などを治療の標的にするのではな
く、脱分化する前のこれら細胞などの血管周皮細胞ある
いは平滑筋関連細胞の分化を維持するかまたは脱分化し
た筋線維芽細胞を再分化誘導することによりもとの分化
状態の細胞に戻すことにより、ＰＴＣＡ術後もしくはス
テント留置後の動脈再狭窄、動脈硬化症、腎糸球体硬化
症、肝硬変の予防、進展防止、治療することを見いだし
た。例えばＩＶ型コラーゲンゲルを用いて培養すると、
動脈平滑筋細胞、腎臓糸球体メサンギウム細胞、肝星細
胞の形質を維持することができる。また、ＩＶ型コラー
ゲンゲルを用いて培養すると、形質転換した細胞をもと
の分化状態の細胞に戻すことができる。このような作用
を持つ物質を病巣部位に投与することで、病巣部位に存
在し、病態を進展させる形質転換細胞を正常な細胞に戻
すことができる。これによって、病状を回復、または悪
化を防ぐことができる。すなわち、本発明は下記の
（１）〜（５）に関するものである。 （１）血管周皮細胞あるいは平滑筋関連細胞の分化を維
持するかもしくは脱分化した筋線維芽細胞の再分化を誘
導して病巣部位を修復する機能を有する細胞外マトリッ
クスを、有効成分として含有する筋線維芽細胞系疾患の
予防または治療剤。 （２）筋線維芽細胞系疾患が、ＰＴＣＡ術後もしくはス
テント留置後の動脈再狭窄、動脈硬化症、腎糸球体硬化
症または肝硬変である上記（１）記載の予防または治療
剤。 （３）筋線維芽細胞系疾患が脳頚動脈硬化症または肺線
維症である上記（１）記載の予防または治療剤。 （４）細胞外マトリックスがＩＶ型コラーゲンゲルまた
はＩ型コラーゲンゲルである上記（１）から（３）のい
ずれかに記載の予防または治療剤。 （５）ＩＶ型コラーゲンが会合し、平均直径５〜３５ｎ
ｍのポアサイズを持つ多角編み目構造を持つゲルである
上記（４）記載の予防または治療剤。
【０００６】
【発明の実施の形態】動脈硬化病巣部位では動脈平滑筋
細胞が収縮型から合成型へと変化していることが知られ
ている。病巣部位での動脈平滑筋細胞は、形態の変化、
激しい増殖性、過剰な線維状コラーゲンの生産、コラー
ゲン線維の沈着を伴う形質変化を示し、全て線維芽細胞
様の形質となる。このような観察から病理学者は平滑筋
由来のこの細胞をｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（筋線維
芽細胞）と称している。平滑筋細胞の形質の制御は様々
な臓器でみられる線維症または硬化症の発症に深く関わ
っていると考えられている。動脈平滑筋細胞で生じる線
維芽細胞様への形質変化と同様な変化が、血清を含む培
地を用いたインビトロの初代培養系でも起きる。すなわ
ち培養系で生じる形質転換細胞は動脈硬化病巣部位でみ
られる筋線維芽細胞の特徴と同じ特徴を獲得する。
細胞が収縮型から合成型へと変化していることが知られ
ている。病巣部位での動脈平滑筋細胞は、形態の変化、
激しい増殖性、過剰な線維状コラーゲンの生産、コラー
ゲン線維の沈着を伴う形質変化を示し、全て線維芽細胞
様の形質となる。このような観察から病理学者は平滑筋
由来のこの細胞をｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（筋線維
芽細胞）と称している。平滑筋細胞の形質の制御は様々
な臓器でみられる線維症または硬化症の発症に深く関わ
っていると考えられている。動脈平滑筋細胞で生じる線
維芽細胞様への形質変化と同様な変化が、血清を含む培
地を用いたインビトロの初代培養系でも起きる。すなわ
ち培養系で生じる形質転換細胞は動脈硬化病巣部位でみ
られる筋線維芽細胞の特徴と同じ特徴を獲得する。
【０００７】細胞の接着はもとより、細胞の増殖、分化
の維持、遺伝子発現、遊走といった、細胞の基本的な機
能は、細胞をとりまく細胞外基質の影響を受ける。直接
的な証拠は、細胞培養系で基質の細胞への影響を調べ
る、インビトロの研究から得られている。培養系におい
ては、動脈平滑筋細胞の機能は培養基質として固定化さ
れた細胞外基質の影響を受け、制御される。
の維持、遺伝子発現、遊走といった、細胞の基本的な機
能は、細胞をとりまく細胞外基質の影響を受ける。直接
的な証拠は、細胞培養系で基質の細胞への影響を調べ
る、インビトロの研究から得られている。培養系におい
ては、動脈平滑筋細胞の機能は培養基質として固定化さ
れた細胞外基質の影響を受け、制御される。
【０００８】本発明においては、筋線維芽細胞系疾患と
は線維症または硬化症に係わる疾患を示し、上記したＰ
ＴＣＡ術後もしくはステント留置後の動脈再狭窄、動脈
硬化とともに、腎糸球体硬化症および肝硬変、さらには
脳頚動脈硬化症、肺線維症が挙げられる。また、本発明
において血管周皮細胞あるいは平滑筋関連細胞とは、筋
線維芽細胞になる前の分化状態の細胞を示し、即ち、例
えば動脈平滑筋細胞、肝星細胞、腎臓糸球体メサンギウ
ム細胞などの血管内皮細胞の裏打ちにある周皮細胞ある
いは平滑筋関連細胞を示す。また、本発明において細胞
外マトリックスとは生体内にあるのとほぼ同じ構造、機
能を有する細胞外マトリックスを示し、例えば生体内に
存在するコラーゲンがこれに相当し、特にＩ型コラーゲ
ン、ＩＶ型コラーゲンが好ましくＩＶ型コラーゲンが特
に好ましい。本発明において具体的にはＩＶ型コラーゲ
ンおよびＩ型コラーゲンともゲルタイプが好ましく、特
にＩＶ型コラーゲンゲルが好ましい。また、ＩＶ型コラ
ーゲンゲルでは平均直径５〜３５ｎｍ、好ましくは１０
〜２５ｎｍのポアサイズを持つ多角編み目構造のものが
好ましく、これはＫｏｉｃｈｉ Ｎａｋａｚａｔｏら、
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２０，８８９−８９
４（１９９６）に記載の方法によって得ることができ
る。従来生体内と同様な構造を持ったＩＶ型コラーゲン
ゲルを製造することは困難であったが最近上記のＫｏｉ
ｃｈｉ Ｎａｋａｚａｔｏらの方法によって製造が可能
となり、本発明への適用も可能となった。例えば生体か
ら単離したＩＶ型コラーゲン分子から造ったゲルは直径
１８ｎｍのポアサイズを持つ多角編み目構造を持ち、こ
れがラミナデンサの骨格構造と同じである。上記文献に
は特定の食塩濃度、温度の条件下でＩＶ型コラーゲン溶
液はゲル化して、多角編み目構造をつくり（平均直径１
５．５ｎｍのポアサイズ）、ゲルの硬さは特に蛋白濃度
と温度、インキュベーション時間に依存することが報告
されている。
は線維症または硬化症に係わる疾患を示し、上記したＰ
ＴＣＡ術後もしくはステント留置後の動脈再狭窄、動脈
硬化とともに、腎糸球体硬化症および肝硬変、さらには
脳頚動脈硬化症、肺線維症が挙げられる。また、本発明
において血管周皮細胞あるいは平滑筋関連細胞とは、筋
線維芽細胞になる前の分化状態の細胞を示し、即ち、例
えば動脈平滑筋細胞、肝星細胞、腎臓糸球体メサンギウ
ム細胞などの血管内皮細胞の裏打ちにある周皮細胞ある
いは平滑筋関連細胞を示す。また、本発明において細胞
外マトリックスとは生体内にあるのとほぼ同じ構造、機
能を有する細胞外マトリックスを示し、例えば生体内に
存在するコラーゲンがこれに相当し、特にＩ型コラーゲ
ン、ＩＶ型コラーゲンが好ましくＩＶ型コラーゲンが特
に好ましい。本発明において具体的にはＩＶ型コラーゲ
ンおよびＩ型コラーゲンともゲルタイプが好ましく、特
にＩＶ型コラーゲンゲルが好ましい。また、ＩＶ型コラ
ーゲンゲルでは平均直径５〜３５ｎｍ、好ましくは１０
〜２５ｎｍのポアサイズを持つ多角編み目構造のものが
好ましく、これはＫｏｉｃｈｉ Ｎａｋａｚａｔｏら、
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２０，８８９−８９
４（１９９６）に記載の方法によって得ることができ
る。従来生体内と同様な構造を持ったＩＶ型コラーゲン
ゲルを製造することは困難であったが最近上記のＫｏｉ
ｃｈｉ Ｎａｋａｚａｔｏらの方法によって製造が可能
となり、本発明への適用も可能となった。例えば生体か
ら単離したＩＶ型コラーゲン分子から造ったゲルは直径
１８ｎｍのポアサイズを持つ多角編み目構造を持ち、こ
れがラミナデンサの骨格構造と同じである。上記文献に
は特定の食塩濃度、温度の条件下でＩＶ型コラーゲン溶
液はゲル化して、多角編み目構造をつくり（平均直径１
５．５ｎｍのポアサイズ）、ゲルの硬さは特に蛋白濃度
と温度、インキュベーション時間に依存することが報告
されている。
【０００９】本発明による細胞外マトリックスによって
細胞の分化を維持または再分化誘導を起こす点について
の作用機序は次の通りである。組織中のコラーゲン会合
体とその場に存在する細胞のタイプとの関係では、コラ
ーゲン会合体がその場の細胞の形質分化を維持するとい
った生物学的な意義があると考えられる。以後に記述す
る実施例で述べるように、例えば組織中ではＩＶ型コラ
ーゲンと接して存在している動脈平滑筋細胞が、組織中
ではＩＶ型コラーゲンとは接していない皮膚の線維芽細
胞と同様の形態、増殖能をもってプラスティック培養皿
の上では生育するが、ＩＶ型コラーゲンゲル上では全く
異なった形態、増殖能を示す。
細胞の分化を維持または再分化誘導を起こす点について
の作用機序は次の通りである。組織中のコラーゲン会合
体とその場に存在する細胞のタイプとの関係では、コラ
ーゲン会合体がその場の細胞の形質分化を維持するとい
った生物学的な意義があると考えられる。以後に記述す
る実施例で述べるように、例えば組織中ではＩＶ型コラ
ーゲンと接して存在している動脈平滑筋細胞が、組織中
ではＩＶ型コラーゲンとは接していない皮膚の線維芽細
胞と同様の形態、増殖能をもってプラスティック培養皿
の上では生育するが、ＩＶ型コラーゲンゲル上では全く
異なった形態、増殖能を示す。
【００１０】様々な細胞外マトリックスを用いてインビ
トロで細胞を培養すると、細胞の形態、増殖能、蛋白発
現能などが異なることがよく知られている。また、同じ
コラーゲンタイプ、例えばＩ型コラーゲンであっても、
分子状のＩ型コラーゲンと線維状のＩ型コラーゲンでは
細胞に与える作用が異なる事も知られている。このよう
な細胞外マトリックスの細胞に対する異なった作用は、
インテグリンに代表される細胞表面の細胞外マトリック
ス受容体を介して起きると考えられている。本発明の細
胞外マトリックスが持つ細胞の分化維持または再分化誘
導作用についても細胞表面の受容体を介して発現してい
ることも考えられ、特にゲル化したＩＶ型コラーゲンを
認識する１種または複数種の受容体によると推測され
る。
トロで細胞を培養すると、細胞の形態、増殖能、蛋白発
現能などが異なることがよく知られている。また、同じ
コラーゲンタイプ、例えばＩ型コラーゲンであっても、
分子状のＩ型コラーゲンと線維状のＩ型コラーゲンでは
細胞に与える作用が異なる事も知られている。このよう
な細胞外マトリックスの細胞に対する異なった作用は、
インテグリンに代表される細胞表面の細胞外マトリック
ス受容体を介して起きると考えられている。本発明の細
胞外マトリックスが持つ細胞の分化維持または再分化誘
導作用についても細胞表面の受容体を介して発現してい
ることも考えられ、特にゲル化したＩＶ型コラーゲンを
認識する１種または複数種の受容体によると推測され
る。
【００１１】次に本発明の細胞外マトリックス、特にＩ
Ｖ型コラーゲンゲルを用いての上記疾患に対する治療法
について説明する。本発明のＩＶ型コラーゲンゲルを製
剤として用いるには、単独でもよいが必要に応じ薬学的
に許容される安定化剤、保存剤、賦形剤などや、成型性
や徐放性を調節するための添加剤を必要に応じて加える
ことができる。このようにして得られたものを目的に応
じて適宜加工する。例えば、通常の粉砕器を用いて粒径
に粉砕し、これを圧縮成型してペレット、ズポ等の皮下
投与、生体内埋め込みまたは体腔内挿入して用いること
ができる。また、粉砕して得た粉末を手術時に病巣部位
に添布して治療効果を得ることができる。また、ＩＶ型
コラーゲンゲルを含む懸濁性注射剤として患部に局所注
入することも可能であり、この場合の注射用溶媒として
は例えば落花生油、ゴマ油、ひまし油、オリーブ油等の
植物油が挙げられる。
Ｖ型コラーゲンゲルを用いての上記疾患に対する治療法
について説明する。本発明のＩＶ型コラーゲンゲルを製
剤として用いるには、単独でもよいが必要に応じ薬学的
に許容される安定化剤、保存剤、賦形剤などや、成型性
や徐放性を調節するための添加剤を必要に応じて加える
ことができる。このようにして得られたものを目的に応
じて適宜加工する。例えば、通常の粉砕器を用いて粒径
に粉砕し、これを圧縮成型してペレット、ズポ等の皮下
投与、生体内埋め込みまたは体腔内挿入して用いること
ができる。また、粉砕して得た粉末を手術時に病巣部位
に添布して治療効果を得ることができる。また、ＩＶ型
コラーゲンゲルを含む懸濁性注射剤として患部に局所注
入することも可能であり、この場合の注射用溶媒として
は例えば落花生油、ゴマ油、ひまし油、オリーブ油等の
植物油が挙げられる。
【００１２】本発明の細胞外マトリックス、特にＩＶ型
コラーゲンゲルを動脈再狭窄、動脈硬化症、腎糸球体硬
化症、肝硬変症に適用させるに当たっては、投与経路お
よび投与される患者の年齢、体重等によって投与量が異
なり、適宜増減される。通常ＩＶ型コラーゲンゲル又は
Ｉ型コラーゲンゲルとして１０ｍｇ〜１０ｇ／体重の範
囲の投与量であり、これを適宜増減させながら投与す
る。例えばＰＴＣＡ術時、または術後、患部に当該ＩＶ
型コラーゲンゲルペレットを留置、ステント留置時には
ステントとともに患部に当該ＩＶ型コラーゲンゲルペレ
ットを留置する。ＩＶ型コラーゲンゲルペレットはＩＶ
型コラーゲン溶液とリン酸緩衝液の混合液を金型に入
れ、４℃で保温し、成型することができる。この際、製
剤の形状としては、円筒状、球状、円柱状、針状、ボタ
ン状など使用する部位に適合した形に成型し、患部に留
置することができる。また、ステントの血管壁との接触
部位にＩＶ型コラーゲンゲルを成型する際には、ステン
トと金型の組み合わせにより、ステント、ＩＶ型コラー
ゲンゲルの一体成型をすることができる。ＰＴＣＡ術
時、または術後の患部には例えば、円筒状のＩＶ型コラ
ーゲンゲルを患部の動脈内に留置する。
コラーゲンゲルを動脈再狭窄、動脈硬化症、腎糸球体硬
化症、肝硬変症に適用させるに当たっては、投与経路お
よび投与される患者の年齢、体重等によって投与量が異
なり、適宜増減される。通常ＩＶ型コラーゲンゲル又は
Ｉ型コラーゲンゲルとして１０ｍｇ〜１０ｇ／体重の範
囲の投与量であり、これを適宜増減させながら投与す
る。例えばＰＴＣＡ術時、または術後、患部に当該ＩＶ
型コラーゲンゲルペレットを留置、ステント留置時には
ステントとともに患部に当該ＩＶ型コラーゲンゲルペレ
ットを留置する。ＩＶ型コラーゲンゲルペレットはＩＶ
型コラーゲン溶液とリン酸緩衝液の混合液を金型に入
れ、４℃で保温し、成型することができる。この際、製
剤の形状としては、円筒状、球状、円柱状、針状、ボタ
ン状など使用する部位に適合した形に成型し、患部に留
置することができる。また、ステントの血管壁との接触
部位にＩＶ型コラーゲンゲルを成型する際には、ステン
トと金型の組み合わせにより、ステント、ＩＶ型コラー
ゲンゲルの一体成型をすることができる。ＰＴＣＡ術
時、または術後の患部には例えば、円筒状のＩＶ型コラ
ーゲンゲルを患部の動脈内に留置する。
【００１３】
【実施例】実施例１ 次に本発明の実施例としてＩＶ型コラーゲンゲル及びＩ
型コラーゲンゲルを細胞培養の基質として用い、１０％
血清存在下での筋線維芽細胞様の動脈平滑筋細胞の基本
的な細胞機能、即ち形態、増殖能やマーカー蛋白の発現
に対するＩＶ型コラーゲンゲル及びＩ型コラーゲンゲル
の作用を調べた。 （１）細胞培養 ヒト動脈平滑筋細胞は、３代継代したものをＣｌｏｎｅ
ｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．（米国、サンディエゴ）より購入
した。この細胞は改変ＭＣＤＢ１３１培地（Ｃｌｏｎｅ
ｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．）に１０％ウシ胎児血清（以下Ｆ
ＢＳとする）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．）、１
０ｎｇ／ｍｌの組み換え上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、
２ｎｇ／ｍｌの組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ
ＦＧＦ）、５μｇ／ｍｌのインスリン、５０μｇ／ｍｌ
のゲンタマイシン、５０ｎｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ
を加えたもの（以下増殖培地とする）を用いて３７℃、
５％ＣＯ2 下で培養した。増殖因子、インスリン、抗生
物質はＣｌｏｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐ．より購入した。細
胞は通常直径１００ｍｍの培養皿で維持した。細胞が密
に生育した時に、０．２５％ トリプシン、０．０２％
ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（Ｍｇ++，Ｃａ
++を含まない、以下ＰＢＳ（−）とする）に細胞を接触
させ、細胞を皿よりはがした後、１：４の分割割合で、
継代した。筋線維芽平滑筋細胞（以下Ｍ−ＳＭＣとす
る）は動脈平滑筋細胞（以下Ａ−ＳＭＣとする）を１０
０ｍｍ培養皿で３〜５回継代し、９〜１３回分裂を繰り
返させることによって得、様々な基質上で培養した。
型コラーゲンゲルを細胞培養の基質として用い、１０％
血清存在下での筋線維芽細胞様の動脈平滑筋細胞の基本
的な細胞機能、即ち形態、増殖能やマーカー蛋白の発現
に対するＩＶ型コラーゲンゲル及びＩ型コラーゲンゲル
の作用を調べた。 （１）細胞培養 ヒト動脈平滑筋細胞は、３代継代したものをＣｌｏｎｅ
ｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．（米国、サンディエゴ）より購入
した。この細胞は改変ＭＣＤＢ１３１培地（Ｃｌｏｎｅ
ｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．）に１０％ウシ胎児血清（以下Ｆ
ＢＳとする）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．）、１
０ｎｇ／ｍｌの組み換え上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、
２ｎｇ／ｍｌの組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ
ＦＧＦ）、５μｇ／ｍｌのインスリン、５０μｇ／ｍｌ
のゲンタマイシン、５０ｎｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ
を加えたもの（以下増殖培地とする）を用いて３７℃、
５％ＣＯ2 下で培養した。増殖因子、インスリン、抗生
物質はＣｌｏｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐ．より購入した。細
胞は通常直径１００ｍｍの培養皿で維持した。細胞が密
に生育した時に、０．２５％ トリプシン、０．０２％
ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（Ｍｇ++，Ｃａ
++を含まない、以下ＰＢＳ（−）とする）に細胞を接触
させ、細胞を皿よりはがした後、１：４の分割割合で、
継代した。筋線維芽平滑筋細胞（以下Ｍ−ＳＭＣとす
る）は動脈平滑筋細胞（以下Ａ−ＳＭＣとする）を１０
０ｍｍ培養皿で３〜５回継代し、９〜１３回分裂を繰り
返させることによって得、様々な基質上で培養した。
【００１４】（２）基質の調製と細胞培養 Ｉ型コラーゲンは、Ｙａｍａｔｏら、Ｃｏｎｎｅｃｔｉ
ｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ２４，１５７−１６２，１９９２に
記載された方法に従って、ラット尾の腱の酸抽出によっ
て得た。Ｉ型コラーゲンゲルの調製と、そのゲル上での
細胞培養も上記文献に記載された方法に従って行った。
即ち、Ｉ型コラーゲン溶液（３ｍｇ／ｍｌ）６倍容に対
し、３倍容の３倍濃度の増殖培地（ＦＢＳを含まない）
と、１倍容のＦＢＳを４℃で混合し、最終コラーゲン濃
度が１ｍｇ／ｍｌとなるようにした。そのうち一部（５
００μｌ）を２４穴の培養皿に加え、ゲル化のため、３
７℃で保温した。７．２ｘ１０3 個の細胞を含む１ｍｌ
の細胞懸濁液をそれぞれのゲル上に撒布し、５％ＣＯ2
下、３７℃で培養した。培地は３日おきに交換した。Ｉ
Ｖ型コラーゲンゲルの調製は、４℃で９倍容のＩＶ型コ
ラーゲン溶液（２ｍｇ／ｍｌ、１ｍＭ塩酸）に１倍容の
２００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７．３、（１．５Ｍ食
塩を含む）を混ぜ、最終濃度１．８ｍｇ／ｍｌとした。
得られた溶液の一部（５００μｌ）を２４穴培養皿に加
えた。培養皿は少なくとも５日間は４℃で保温し、細胞
がゲル表面にのるまで十分に固くゲル化した。培地は３
日おきに交換した。細胞の形態は位相差顕微鏡で拡大率
１００倍で観察した。
ｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ２４，１５７−１６２，１９９２に
記載された方法に従って、ラット尾の腱の酸抽出によっ
て得た。Ｉ型コラーゲンゲルの調製と、そのゲル上での
細胞培養も上記文献に記載された方法に従って行った。
即ち、Ｉ型コラーゲン溶液（３ｍｇ／ｍｌ）６倍容に対
し、３倍容の３倍濃度の増殖培地（ＦＢＳを含まない）
と、１倍容のＦＢＳを４℃で混合し、最終コラーゲン濃
度が１ｍｇ／ｍｌとなるようにした。そのうち一部（５
００μｌ）を２４穴の培養皿に加え、ゲル化のため、３
７℃で保温した。７．２ｘ１０3 個の細胞を含む１ｍｌ
の細胞懸濁液をそれぞれのゲル上に撒布し、５％ＣＯ2
下、３７℃で培養した。培地は３日おきに交換した。Ｉ
Ｖ型コラーゲンゲルの調製は、４℃で９倍容のＩＶ型コ
ラーゲン溶液（２ｍｇ／ｍｌ、１ｍＭ塩酸）に１倍容の
２００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７．３、（１．５Ｍ食
塩を含む）を混ぜ、最終濃度１．８ｍｇ／ｍｌとした。
得られた溶液の一部（５００μｌ）を２４穴培養皿に加
えた。培養皿は少なくとも５日間は４℃で保温し、細胞
がゲル表面にのるまで十分に固くゲル化した。培地は３
日おきに交換した。細胞の形態は位相差顕微鏡で拡大率
１００倍で観察した。
【００１５】（３）細胞増殖の検定 細胞増殖の定量化を次のようにして行った。即ち、Ｉ型
コラーゲンゲルまたはＩＶ型コラーゲンゲル上で培養し
た細胞をＰＢＳ（−）で洗い、そこに細胞を懸濁するた
めに０．２％ バクテリアルコラゲナーゼ（和光純薬）
及び１ｍＭ 塩化カルシウムを含むＰＢＳ（−）を５０
０μｌ加え、３７℃、２時間保温した。ばらばらになっ
た細胞の数をコールターカウンターで計測した。測定
は、培養２日、５日、１０日目にそれぞれ３連で行っ
た。
コラーゲンゲルまたはＩＶ型コラーゲンゲル上で培養し
た細胞をＰＢＳ（−）で洗い、そこに細胞を懸濁するた
めに０．２％ バクテリアルコラゲナーゼ（和光純薬）
及び１ｍＭ 塩化カルシウムを含むＰＢＳ（−）を５０
０μｌ加え、３７℃、２時間保温した。ばらばらになっ
た細胞の数をコールターカウンターで計測した。測定
は、培養２日、５日、１０日目にそれぞれ３連で行っ
た。
【００１６】（４）免疫細胞化学的解析 Ｉ型コラーゲンゲルまたはＩＶ型コラーゲンゲルで３日
および７日間培養したＭ−ＳＭＣを４℃、１８時間４％
パラホルムアルデヒドで固定後、０．５％ トライトン
Ｘ−１００を含むＰＢＳ（−）溶液で２５℃、９０分間
処理し、浸透を容易にした。そして、非特異的結合を防
ぐために３０分間、０．２％ ＢＳＡを含むＰＢＳ
（−）溶液に浸した後、５００倍に希釈した抗平滑筋ミ
オシン重鎖モノクローナル抗体（クローン ｈＳＭ−
Ｖ、シグマ、米国）または抗ヒトβ１インテグリンモノ
クローナル抗体（ＭＡＢ １９７７，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ
Ｉｎｔ．Ｉｎｃ．、米国）とともに４℃にて１８時間
保温した。１５０倍希釈したＦＩＴＣ標識ヒツジ抗マウ
スＩｇＧ抗体（Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌ．、米
国）にさらした後、細胞を共焦点レーザー走査型顕微鏡
で拡大率４００倍で観察した。非免疫マウスＩｇＧ（Ｉ
ＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、米
国）を抗平滑筋ミオシン重鎖モノクローナル抗体や抗ヒ
トβ１インテグリンモノクローナル抗体の代わりにコン
トロールとして用いた。
および７日間培養したＭ−ＳＭＣを４℃、１８時間４％
パラホルムアルデヒドで固定後、０．５％ トライトン
Ｘ−１００を含むＰＢＳ（−）溶液で２５℃、９０分間
処理し、浸透を容易にした。そして、非特異的結合を防
ぐために３０分間、０．２％ ＢＳＡを含むＰＢＳ
（−）溶液に浸した後、５００倍に希釈した抗平滑筋ミ
オシン重鎖モノクローナル抗体（クローン ｈＳＭ−
Ｖ、シグマ、米国）または抗ヒトβ１インテグリンモノ
クローナル抗体（ＭＡＢ １９７７，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ
Ｉｎｔ．Ｉｎｃ．、米国）とともに４℃にて１８時間
保温した。１５０倍希釈したＦＩＴＣ標識ヒツジ抗マウ
スＩｇＧ抗体（Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌ．、米
国）にさらした後、細胞を共焦点レーザー走査型顕微鏡
で拡大率４００倍で観察した。非免疫マウスＩｇＧ（Ｉ
ＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、米
国）を抗平滑筋ミオシン重鎖モノクローナル抗体や抗ヒ
トβ１インテグリンモノクローナル抗体の代わりにコン
トロールとして用いた。
【００１７】（５）エンドセリン−１処理 Ｉ型コラーゲンゲルまたはＩＶ型コラーゲンゲルの上で
Ｍ−ＳＭＣを３日間増殖培地で培養した。その細胞を１
ｎＭのヒトエンドセリン−１（ＰｅｐｔｉｄｅＩｎｓ
ｔ．，Ｉｎｃ．、大阪）で処理し、位相差顕微鏡で３７
℃下で１５分間観察した。顕微鏡写真を１分おきに撮影
した。ヒトエンドセリン−１を添加しない細胞をコント
ロールとして用いた。
Ｍ−ＳＭＣを３日間増殖培地で培養した。その細胞を１
ｎＭのヒトエンドセリン−１（ＰｅｐｔｉｄｅＩｎｓ
ｔ．，Ｉｎｃ．、大阪）で処理し、位相差顕微鏡で３７
℃下で１５分間観察した。顕微鏡写真を１分おきに撮影
した。ヒトエンドセリン−１を添加しない細胞をコント
ロールとして用いた。
【００１８】（６）結果 培養下のＭ−ＳＭＣの形態： １０％ＦＢＳ存在下で、継
代数３のＡ−ＳＭＣを９〜１３回分裂回数までプラスチ
ック上で繰り返し継代を行うと、Ａ−ＳＭＣは高い増殖
能を獲得した。これらの細胞を筋線維芽様平滑筋細胞、
Ｍ−ＳＭＣと表記する。Ｍ−ＳＭＣをＩＶ型コラーゲン
ゲルで培養すると、細胞はＩ型コラーゲンゲルで培養し
たのと同様に、細胞が広がり伸長するのが遅くなった。
一度細胞が伸長し始めると、およそ２日間は伸長を続け
た。その後、よく伸びた細胞の先端は周りのやはり伸長
した細胞との細胞−細胞間の接合点の明白な形成によっ
ては区別がつかなくなった。細胞間の接合は培養してい
る細胞全体に及び、ついには図１で示すような編み目様
の多細胞構造を形成した。編み目構造の形成は、培養開
始３日目に完成し、１４日を過ぎても維持された。ＩＶ
型コラーゲンゲルを用いて培養した動脈平滑筋細胞の３
日目の形態を図１に示した。多細胞からなる編み目構造
はバクテリアルコラゲナーゼ処理により破壊すると、細
胞は互いに離れ、最後は丸くなった。しかし、丸くなっ
た細胞を集めて再びプラスチックの培養皿に蒔くと、細
胞は増殖能を高じたスピンドル様の形態を再びとり始め
た。これらのことは、ＩＶ型コラーゲンゲル上で抑制さ
れたＭ−ＳＭＣの増殖は可逆的であることを示してい
る。
代数３のＡ−ＳＭＣを９〜１３回分裂回数までプラスチ
ック上で繰り返し継代を行うと、Ａ−ＳＭＣは高い増殖
能を獲得した。これらの細胞を筋線維芽様平滑筋細胞、
Ｍ−ＳＭＣと表記する。Ｍ−ＳＭＣをＩＶ型コラーゲン
ゲルで培養すると、細胞はＩ型コラーゲンゲルで培養し
たのと同様に、細胞が広がり伸長するのが遅くなった。
一度細胞が伸長し始めると、およそ２日間は伸長を続け
た。その後、よく伸びた細胞の先端は周りのやはり伸長
した細胞との細胞−細胞間の接合点の明白な形成によっ
ては区別がつかなくなった。細胞間の接合は培養してい
る細胞全体に及び、ついには図１で示すような編み目様
の多細胞構造を形成した。編み目構造の形成は、培養開
始３日目に完成し、１４日を過ぎても維持された。ＩＶ
型コラーゲンゲルを用いて培養した動脈平滑筋細胞の３
日目の形態を図１に示した。多細胞からなる編み目構造
はバクテリアルコラゲナーゼ処理により破壊すると、細
胞は互いに離れ、最後は丸くなった。しかし、丸くなっ
た細胞を集めて再びプラスチックの培養皿に蒔くと、細
胞は増殖能を高じたスピンドル様の形態を再びとり始め
た。これらのことは、ＩＶ型コラーゲンゲル上で抑制さ
れたＭ−ＳＭＣの増殖は可逆的であることを示してい
る。
【００１９】Ｍ−ＳＭＣの増殖：プラスチック培養皿で
９回分裂回数まで繰り返し継代されたＭ−ＳＭＣ は強
い増殖能を獲得した。ＩＶ型コラーゲンゲルではＭ−Ｓ
ＭＣは２１日間の培養でも全く増殖しなかった。他の増
殖因子を加えても固化したＩＶ型コラーゲンゲルで抑え
られた増殖は全く回復しなかった。細胞増殖の停止は細
胞のアポトーシスによるものではない。なぜならば増殖
を停止したＭ−ＳＭＣをバクテリアルコラゲナーゼ処理
し、プラスチック上で再培養すると細胞増殖を開始した
からである。
９回分裂回数まで繰り返し継代されたＭ−ＳＭＣ は強
い増殖能を獲得した。ＩＶ型コラーゲンゲルではＭ−Ｓ
ＭＣは２１日間の培養でも全く増殖しなかった。他の増
殖因子を加えても固化したＩＶ型コラーゲンゲルで抑え
られた増殖は全く回復しなかった。細胞増殖の停止は細
胞のアポトーシスによるものではない。なぜならば増殖
を停止したＭ−ＳＭＣをバクテリアルコラゲナーゼ処理
し、プラスチック上で再培養すると細胞増殖を開始した
からである。
【００２０】培養下での収縮型Ａ−ＳＭＣのマーカー蛋
白の発現：Ａ−ＳＭＣの分化は通常α−平滑筋アクチン
（α−ＳＭＡ）、平滑筋ミオシン重鎖（ＳＭＨ）、ｃａ
ｌｄｅｓｍｏｎなどの平滑筋特異的細胞骨格蛋白が発現
しているか否かを調べることで評価する。これらのマー
カー蛋白のうち、ＳＭＨは一般的に収縮型Ａ−ＳＭＣに
最も特異的で信頼性が高いと考えられている（Ｂｉｒｕ
ｋｏｖ，Ｋ．Ｇ．ら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０
４，４６−５３，１９９３）。解析には骨格筋、心筋、
非筋肉細胞のミオシンと交雑反応しない抗体であること
が重要である（Ｌｏｎｇｔｉｎｅ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｈ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３３，１７９−
１８４，１９８５）。そのような抗ＳＭＨモノクローナ
ル抗体を使って、異なった基質で１３回分裂回数のＭ−
ＳＭＣについてＳＭＨの発現を免疫細胞化学的に解析し
た。ＳＭＨはＩＶ型コラーゲンゲルで３日間培養したＭ
−ＳＭＣで強く染まり、再分化構築が確認された。この
現象について図２に示した。Ｉ型コラーゲンゲルで培養
した細胞では、ＳＭＨは発現しているようだがほんのわ
ずかであった。培養７日目になると、ぼんやりとした、
弱いＳＭＨの反応がＩ型コラーゲンゲルで培養した細胞
で認められた。対照的に、強い免疫染色はＩＶ型コラー
ゲンゲルで培養したＭ−ＳＭＣで見られ、７日目でもＳ
ＭＨの強い発現の維持を示した。非特異的ＩｇＧを用い
た場合は、培養３日目、７日目とも蛍光発色は認められ
なかった。
白の発現：Ａ−ＳＭＣの分化は通常α−平滑筋アクチン
（α−ＳＭＡ）、平滑筋ミオシン重鎖（ＳＭＨ）、ｃａ
ｌｄｅｓｍｏｎなどの平滑筋特異的細胞骨格蛋白が発現
しているか否かを調べることで評価する。これらのマー
カー蛋白のうち、ＳＭＨは一般的に収縮型Ａ−ＳＭＣに
最も特異的で信頼性が高いと考えられている（Ｂｉｒｕ
ｋｏｖ，Ｋ．Ｇ．ら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０
４，４６−５３，１９９３）。解析には骨格筋、心筋、
非筋肉細胞のミオシンと交雑反応しない抗体であること
が重要である（Ｌｏｎｇｔｉｎｅ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｈ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３３，１７９−
１８４，１９８５）。そのような抗ＳＭＨモノクローナ
ル抗体を使って、異なった基質で１３回分裂回数のＭ−
ＳＭＣについてＳＭＨの発現を免疫細胞化学的に解析し
た。ＳＭＨはＩＶ型コラーゲンゲルで３日間培養したＭ
−ＳＭＣで強く染まり、再分化構築が確認された。この
現象について図２に示した。Ｉ型コラーゲンゲルで培養
した細胞では、ＳＭＨは発現しているようだがほんのわ
ずかであった。培養７日目になると、ぼんやりとした、
弱いＳＭＨの反応がＩ型コラーゲンゲルで培養した細胞
で認められた。対照的に、強い免疫染色はＩＶ型コラー
ゲンゲルで培養したＭ−ＳＭＣで見られ、７日目でもＳ
ＭＨの強い発現の維持を示した。非特異的ＩｇＧを用い
た場合は、培養３日目、７日目とも蛍光発色は認められ
なかった。
【００２１】エンドセリン−１を添加した培養でのＭ−
ＳＭＣの収縮：培養３日目の１３分裂回数のＭ−ＳＭＣ
に終濃度１ｎｍ／ｍｌとなるようにエンドセリン−１を
添加し、Ｍ−ＳＭＣがエンドセリン−１によって収縮す
るのか否かを調べた。エンドセリン−１を添加すると、
ＩＶ型コラーゲンゲルで培養したＭ−ＳＭＣのみがわず
かに、また緩やかに多細胞ネットワーク構造のなかで形
態を変化させた。１分おきに撮影した１５枚の写真はわ
ずかではあるが明らかな細胞編み目構造の一部の動きを
捉えていた。細胞の動きは１５分後には観察されなくな
った。形態の変化はＭ−ＳＭＣの収縮によるものと思わ
れた。
ＳＭＣの収縮：培養３日目の１３分裂回数のＭ−ＳＭＣ
に終濃度１ｎｍ／ｍｌとなるようにエンドセリン−１を
添加し、Ｍ−ＳＭＣがエンドセリン−１によって収縮す
るのか否かを調べた。エンドセリン−１を添加すると、
ＩＶ型コラーゲンゲルで培養したＭ−ＳＭＣのみがわず
かに、また緩やかに多細胞ネットワーク構造のなかで形
態を変化させた。１分おきに撮影した１５枚の写真はわ
ずかではあるが明らかな細胞編み目構造の一部の動きを
捉えていた。細胞の動きは１５分後には観察されなくな
った。形態の変化はＭ−ＳＭＣの収縮によるものと思わ
れた。
【００２２】製剤例１ ＩＶ型コラーゲンゲルを粉砕し、この微粒子１ｇをゴマ
油１０ｍｌに懸濁させ油性懸濁型製剤を得た。
油１０ｍｌに懸濁させ油性懸濁型製剤を得た。
【００２３】製剤例２ ＩＶ型コラーゲンゲルを粉砕し、得られた粉末１ｇを金
型によって圧縮成型を行いステント一体型製剤を得た。
型によって圧縮成型を行いステント一体型製剤を得た。
【００２４】
【発明の効果】ＩＶ型コラーゲンゲル等の細胞外マトリ
ックスを用いて、分化維持を保つかもしくは脱分化した
動脈平滑筋細胞を再分化させることにより動脈再狭窄等
の筋線維芽細胞系疾患を予防、治療することが期待され
る。
ックスを用いて、分化維持を保つかもしくは脱分化した
動脈平滑筋細胞を再分化させることにより動脈再狭窄等
の筋線維芽細胞系疾患を予防、治療することが期待され
る。
【図１】図１は、生物（細胞）の形態を示す写真であ
り、具体的にはＩＶ型コラーゲンゲル上で培養した動脈
平滑筋細胞の培養３日目の形態を示した写真である。
り、具体的にはＩＶ型コラーゲンゲル上で培養した動脈
平滑筋細胞の培養３日目の形態を示した写真である。
【図２】図２は、生物（細胞）の形態を示す写真であ
り、具体的にはＩＶ型コラーゲンゲルで培養した時の培
養３日目の動脈平滑筋細胞のＳＭＨの発現を調べたもの
であり、ＩＶ型コラーゲンゲルが動脈平滑筋細胞の再分
化を誘導する効果を示した写真である。
り、具体的にはＩＶ型コラーゲンゲルで培養した時の培
養３日目の動脈平滑筋細胞のＳＭＨの発現を調べたもの
であり、ＩＶ型コラーゲンゲルが動脈平滑筋細胞の再分
化を誘導する効果を示した写真である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 13/12 Ａ６１Ｐ 13/12 // Ｃ０７Ｋ 14/78 Ｃ０７Ｋ 14/78 Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (72)発明者 中里 浩一 神奈川県川崎市高津区北見方１−20−24− 302 (72)発明者 林 利彦 東京都練馬区中村北10−17−307 Ｆターム(参考） 4B065 AA93X AC20 BB19 BB23 BC46 CA44 4C084 AA01 BA50 DA40 MA67 MA70 NA14 ZA361 ZA451 ZA591 ZA751 ZA811 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 EA28 FA65 HA06
Claims (5)
- 【請求項１】 血管周皮細胞あるいは平滑筋関連細胞の
分化維持を保つかもしくは脱分化した筋線維芽細胞の再
分化を誘導して病巣部位を修復する機能を有する細胞外
マトリックスを、有効成分として含有する筋線維芽細胞
系疾患の予防または治療剤。 - 【請求項２】 筋線維芽細胞系疾患が、ＰＴＣＡ術後も
しくはステント留置後の動脈再狭窄、動脈硬化症、腎糸
球体硬化症または肝硬変症である請求項１記載の予防ま
たは治療剤。 - 【請求項３】 筋線維芽細胞系疾患が脳頚動脈硬化症ま
たは肺線維症である請求項１記載の予防または治療剤。 - 【請求項４】 細胞外マトリックスがＩＶ型コラーゲン
ゲルまたはＩ型コラーゲンゲルである請求項１〜３いず
れかに記載の予防または治療剤。 - 【請求項５】 ＩＶ型コラーゲンが会合し、平均直径５
〜３５ｎｍのポアサイズを持つ多角編み目構造を持つゲ
ルである請求項４記載の予防または治療剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14949399A JP5030319B2 (ja) | 1999-05-28 | 1999-05-28 | 筋線維芽細胞系疾患の予防または治療剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14949399A JP5030319B2 (ja) | 1999-05-28 | 1999-05-28 | 筋線維芽細胞系疾患の予防または治療剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000336040A true JP2000336040A (ja) | 2000-12-05 |
| JP5030319B2 JP5030319B2 (ja) | 2012-09-19 |
Family
ID=15476364
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14949399A Expired - Fee Related JP5030319B2 (ja) | 1999-05-28 | 1999-05-28 | 筋線維芽細胞系疾患の予防または治療剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5030319B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001031586A (ja) * | 1999-07-14 | 2001-02-06 | Sunstar Inc | 動脈硬化症及び動脈硬化症に起因する疾患の予防又は治療組成物 |
| WO2002100427A1 (fr) * | 2001-06-07 | 2002-12-19 | Sankyo Company, Limited | Promoteur de generation de foie |
| WO2006004076A1 (ja) * | 2004-06-30 | 2006-01-12 | Hiroshima Industrial Promotion Organization | 生理活性バイオマテリアル |
-
1999
- 1999-05-28 JP JP14949399A patent/JP5030319B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001031586A (ja) * | 1999-07-14 | 2001-02-06 | Sunstar Inc | 動脈硬化症及び動脈硬化症に起因する疾患の予防又は治療組成物 |
| WO2002100427A1 (fr) * | 2001-06-07 | 2002-12-19 | Sankyo Company, Limited | Promoteur de generation de foie |
| US7074756B2 (en) | 2001-06-07 | 2006-07-11 | Sankyo Company, Limited | Liver generation promoter |
| US7375189B2 (en) | 2001-06-07 | 2008-05-20 | Sankyo Company, Limited | Liver regeneration promoting agent |
| WO2006004076A1 (ja) * | 2004-06-30 | 2006-01-12 | Hiroshima Industrial Promotion Organization | 生理活性バイオマテリアル |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5030319B2 (ja) | 2012-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sun et al. | Differentiation of adipose-derived stem cells into Schwann cell-like cells through intermittent induction: potential advantage of cellular transient memory function | |
| KR101650957B1 (ko) | 세포외 기질 조성물 | |
| KR101422689B1 (ko) | 콜라겐, 히알루론산 유도체 및 포유류의 탯줄 유래 줄기세포를 포함하는 연골세포치료제 | |
| KR102319899B1 (ko) | 상처 치유 및 조직 공학 | |
| US5328695A (en) | Muscle morphogenic protein and use thereof | |
| JP5607176B2 (ja) | 新規ペプチドおよびその用途 | |
| JPH09501932A (ja) | ヒト・骨形態形成蛋白を用いる神経再生 | |
| JP2008526762A (ja) | 組織再生および創傷治癒のための脂肪由来幹細胞 | |
| JP2004537998A (ja) | 細胞培養および組織工学のためのリシルオキシダーゼ阻害剤の使用 | |
| JP2006519865A (ja) | 組織の修復および器官欠損の処置のための脱細胞化された肝臓 | |
| JPH07504650A (ja) | 細胞外マトリックスの蓄積を防止するためのトランスフォーミング増殖因子βの阻害 | |
| JP2006519681A (ja) | 細胞増殖および分化のための骨格 | |
| JP2021511833A (ja) | 低酸素条件下にて培養された細胞に由来する細胞外小胞およびその使用方法 | |
| US20070041955A1 (en) | Hedgehog signaling promotes the formation of three dimensional cartilage matrices | |
| KR20210040908A (ko) | 인간 유도 만능 줄기세포로부터 연골세포의 펠렛을 제조하는 방법 및 이의 용도 | |
| KR102203925B1 (ko) | 줄기세포의 치료 효능 개선을 위한 조성물 및 방법 | |
| JP2018512061A (ja) | 骨関節炎処置のための間葉幹細胞の使用 | |
| US20200061124A1 (en) | Methods for making and using dedifferentiated and stem-like human cells | |
| JPWO2006112390A1 (ja) | 脂肪由来前駆細胞およびその利用 | |
| US6211157B1 (en) | Protein mixtures to induce therapeutic angiogenesis | |
| JP5030319B2 (ja) | 筋線維芽細胞系疾患の予防または治療剤 | |
| EP1481055A1 (de) | Verfahren zur behandlung von erkranktem, degeneriertem oder geschädigtem gewebe unter verwendung von in vitro hergestelltem dreidimensionalem gewebe in kombination mit gewebezellen und/oder exogenen faktoren | |
| JP2000509377A (ja) | 骨形成を誘発するための方法 | |
| WO2024053721A1 (ja) | 急性期から亜急性期までを対象とする脊髄損傷治療剤 | |
| US9833481B2 (en) | Method for articular cartilage and joint formation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060420 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090619 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20090728 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090810 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20090728 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090824 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090824 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20091127 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100225 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100225 |
|
| A911 | Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20100506 |
|
| A912 | Removal of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20100702 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120626 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150706 Year of fee payment: 3 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |