JP2000333907A - Measuring method of active oxygen of skin - Google Patents
Measuring method of active oxygen of skinInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、検体に活性酸素と
反応して発光する物質を添加又は塗布して、活性酸素と
の反応の結果発生する発光を検出、定量又は同定するこ
とからなる活性酸素を検出、定量又は同定する方法、そ
のための装置に関する。また、本発明は、活性酸素と反
応して発光する物質を含有してなる生体組織の活性酸素
を検出、定量又は同定するための組成物に関する。さら
に、本発明は検体、好ましくは生体組織中に発生する活
性酸素を中和する作用を有する物質をスクリーニングす
る方法及びそのための装置に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to an activity comprising detecting or quantifying or identifying luminescence generated as a result of a reaction with active oxygen by adding or applying a substance which emits light in response to active oxygen to a specimen. The present invention relates to a method for detecting, quantifying or identifying oxygen, and an apparatus therefor. The present invention also relates to a composition for detecting, quantifying, or identifying active oxygen in living tissue, which contains a substance that emits light by reacting with active oxygen. Further, the present invention relates to a method for screening a substance having an action of neutralizing active oxygen generated in a specimen, preferably a living tissue, and an apparatus therefor.
【０００２】[0002]
【従来の技術】最近のオゾン層の破壊による太陽光紫外
線（ＵＶＡ、ＵＶＢ）の増大は、人を含む地球上の全生
物に相当な皮膚損傷を与えると懸念されており、ＵＶＡ
やＵＶＢによる皮膚傷害に関する多くの知見が蓄積され
てきている。身体の最外層に位置し、人体組織では最大
臓器である皮膚は、紫外線などの環境因子の影響を最も
受けやすい臓器である。皮膚は直接外気とも接触してい
るので、常に酸素と紫外線に暴露されており、紫外線に
より発生する活性酸素の第一の標的部位であり、身体の
内部を活性酸素による傷害から防御する役割を担ってい
る。体内で生成する活性酸素は多くの疾患と関連するこ
とが既に指摘されているが、近年では日焼け、光毒性、
光アレルギーといった紫外線による皮膚損傷やアトピー
性皮膚炎、乾せんなどの皮膚疾患にも関与することが示
唆されている。2. Description of the Related Art Recent increases in solar ultraviolet rays (UVA, UVB) due to destruction of the ozone layer are feared to cause considerable skin damage to all living things on the earth including humans.
Many knowledge on skin injury due to UVB and UVB has been accumulated. Skin, which is the outermost layer of the body and is the largest organ in human body tissue, is the organ most susceptible to environmental factors such as ultraviolet rays. Since the skin is in direct contact with the outside air, it is constantly exposed to oxygen and ultraviolet rays, and is the primary target site for active oxygen generated by ultraviolet rays, and plays a role in protecting the inside of the body from damage caused by active oxygen. ing. It has already been pointed out that active oxygen generated in the body is associated with many diseases, but in recent years, sunburn, phototoxicity,
It has been suggested that it is also involved in skin damage caused by ultraviolet rays such as photoallergy, atopic dermatitis, and psoriasis.
【０００３】したがって、活性酸素を消去する化合物
は、２１世紀には飛躍的な増大が予測されている紫外線
傷害による皮膚疾患の予防や治療に有効であると考えら
れ、新しい医薬品開発の概念としてとらえられている。
しかし、皮膚における活性酸素の産生機構はいまだ明ら
かでなく、生体内（in vivo ）の人や動物の皮膚におい
て紫外線照射下で活性酸素が実際に検出された報告すら
ないのが現状である。また、生体内、特に皮膚において
どのような抗酸化剤が有効であるかを試験する方法も知
られていない。[0003] Therefore, compounds that scavenge active oxygen are considered to be effective in the prevention and treatment of skin diseases caused by ultraviolet damage, which are expected to increase dramatically in the 21st century, and are regarded as a concept for developing new drugs. Have been.
However, the mechanism of active oxygen production in the skin has not yet been elucidated, and it has not been reported that active oxygen was actually detected under ultraviolet irradiation in human or animal skin in vivo. Also, there is no known method for testing what kind of antioxidant is effective in a living body, particularly in the skin.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、生体内、特
に皮膚における活性酸素を検出、定量する方法およびそ
の装置を提供するものであり、かつ生体内、特に皮膚に
おける抗酸化剤をスクリーニングする方法に関する。即
ち、本発明は、新規な微弱光測定システムを用いること
により生体内における動物の皮膚において紫外線照射下
で産生される活性酸素を直接観測できる方法を提供する
ものであり、さらに、この方法を用いた活性酸素の発生
機構の解明と新しい皮膚傷害防御薬の開発方法を提供す
るものである。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a method and an apparatus for detecting and quantifying active oxygen in a living body, especially in the skin, and screening for an antioxidant in the living body, particularly in the skin. About the method. That is, the present invention provides a method for directly observing active oxygen produced under ultraviolet irradiation in the skin of an animal in a living body by using a novel weak light measurement system. The purpose of the present invention is to elucidate the mechanism of generation of active oxygen and to provide a method for developing a new skin injury protective agent.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】本発明は、検体に活性酸
素と反応して発光する物質を添加又は塗布して、活性酸
素との反応の結果発生する発光を検出、定量又は同定す
ることからなる活性酸素を検出、定量又は同定する方法
に関する。本発明は、前記の活性酸素を検出、定量又は
同定する方法を実施するための装置に関し、より詳細に
は、検体に活性酸素と反応して発光する物質を添加又は
塗布した検体を固定することができる装置、活性酸素と
の反応の結果発生する発光を検出、定量又は同定するた
めの装置を包含してなる活性酸素を検出、定量又は同定
するための装置に関する。また、本発明は、検体中に発
生する活性酸素を中和する作用を有する物質を検体に添
加又は塗布した後、検体を活性酸素が発生する状態と
し、次いで当該検体に活性酸素と反応して発光する物質
を添加又は塗布して、活性酸素との反応の結果発生する
発光を検出、定量又は同定することからなる検体中に発
生する活性酸素を中和する作用を有する物質をスクリー
ニングする方法に関する。本発明は、前記したスクリー
ニングする方法を実施するために使用するスクリーニン
グ装置にも関する。さらに、本発明は前記したスクリー
ニング方法やスクリーニング装置を用いてスクリーニン
グされた検体中に発生する活性酸素を中和する作用を有
する物質を含有してなる抗酸化組成物にも関する。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a method for detecting, quantifying or identifying luminescence generated as a result of a reaction with active oxygen by adding or applying a substance which emits light by reacting with active oxygen to a specimen. The present invention relates to a method for detecting, quantifying or identifying active oxygen. The present invention relates to an apparatus for performing the method for detecting, quantifying or identifying active oxygen described above, and more particularly, to immobilize a sample to which a substance that emits light by reacting with active oxygen has been added or coated. The present invention relates to a device for detecting, quantifying or identifying active oxygen, including a device for detecting, quantifying or identifying luminescence generated as a result of reaction with active oxygen. In addition, the present invention, after adding or applying a substance having a function of neutralizing active oxygen generated in the sample to the sample, put the sample in a state where active oxygen is generated, and then react the sample with the active oxygen A method for screening a substance having a function of neutralizing active oxygen generated in a specimen, comprising detecting or quantifying or identifying luminescence generated as a result of a reaction with active oxygen by adding or applying a luminescent substance. . The present invention also relates to a screening device used for performing the above-described screening method. Further, the present invention relates to an antioxidant composition containing a substance having an action of neutralizing active oxygen generated in a sample screened using the above-described screening method or screening apparatus.
【０００６】本発明の他の目的は、活性酸素と反応して
発光する物質を含有してなる生体組織の活性酸素を検
出、定量又は同定するための組成物を提供することでも
ある。本発明のこの組成物は、生体組織に悪影響を及ぼ
さない担体を含有することができる。したがって、本発
明は、活性酸素と反応して発光する物質及び生体組織に
対して許容される担体とからなる生体組織の活性酸素を
検出、定量又は同定するための組成物に関する。Another object of the present invention is to provide a composition for detecting, quantifying or identifying active oxygen in living tissue, which contains a substance which emits light by reacting with active oxygen. This composition of the present invention can contain a carrier that does not adversely affect living tissue. Accordingly, the present invention relates to a composition for detecting, quantifying or identifying active oxygen in living tissue, comprising a substance that emits light in response to active oxygen and a carrier acceptable to living tissue.
【０００７】本発明の活性酸素を検出、定量又は同定す
るための方法は、活性酸素の発生の有無、発生した活性
酸素の量、発生した活性酸素の種類及び／又は活性酸素
の発生した検体上の部位などを検出、定量又は同定する
方法であり、必要に応じてこれらの中の１種類の検出、
定量又は同定をする方法とすることもできるが、これら
の中の２種以上を同時に検出、定量又は同定することも
できる。また、検出、定量又は同定を同時に行うことも
できるが、これらを別々に測定することもできる。The method for detecting, quantifying or identifying active oxygen according to the present invention comprises the steps of detecting the presence or absence of active oxygen, the amount of active oxygen generated, the type of active oxygen generated, and / or the specimen on which active oxygen is generated. It is a method of detecting, quantifying or identifying the site, etc., if necessary, detecting one type of these,
Although a method of quantification or identification can be used, two or more of these methods can be simultaneously detected, quantified or identified. In addition, detection, quantification or identification can be performed simultaneously, but they can also be measured separately.
【０００８】本発明の検体としては、紫外線やストレス
などにより活性酸素を発生することができるものであ
り、例えば、動物の皮膚組織、培養された生体組織など
が挙げられる。動物の皮膚を検体として使用する場合に
は、必要に応じて脱毛したり、テープなどを用いて皮膚
の角質層を除去して使用することができる。本発明の活
性酸素とは、通常の酸素分子に比べて著しく反応性に富
む酸素含有の基又は分子であって、好ましくは生体内に
おいて発生し得るものであり、例えば、スーパーオキシ
ドアニオン（・Ｏ２ −）、ヒドロキシラジカル（・Ｏ
Ｈ）、ペルヒドロキシラジカル（・Ｏ２Ｈ）、一重項酸
素（１Ｏ２）、過酸化水素（Ｈ ２Ｏ２）、脂質過酸化物
（・ＲＯＯ）、窒素酸化物（ＮＯｘ）、イオウ酸化物
（ＳＯｘ）などのフリーラジカルや分子種が挙げられ
る。[0008] The specimen of the present invention includes ultraviolet rays and stress.
It can generate active oxygen by
For example, animal skin tissue, cultured biological tissue, etc.
Is mentioned. When using animal skin as a specimen
If necessary, remove the hair or use tape to remove
Can be used after removing the stratum corneum. Activity of the present invention
Reactive oxygen is significantly more reactive than ordinary oxygen molecules.
Oxygen-containing groups or molecules, preferably in vivo
Such as superoxy
Donion (・ O2 −), Hydroxyl radical (.O
H), perhydroxy radical (.O2H), singlet acid
Element (1O2), Hydrogen peroxide (H 2O2), Lipid peroxide
(.ROO), nitrogen oxide (NOx), sulfur oxide
Free radicals and molecular species such as (SOx)
You.
【０００９】本発明の活性酸素と反応して発光する物質
としては、前記した活性酸素の中の特定の活性酸素種と
反応するものであってもよいが、いずれの活性酸素種と
反応するものであってもよい。また、発光する光として
はＣＣＤカメラなどの検出装置で測定することができる
光又は波動であるならば特に制限はないが、可視光線又
は蛍光による可視又は紫外線領域の光が好ましい。好ま
しいが、活性酸素と反応して発光する物質としては、例
えば、ルミノール又はＣＬＡ（２−メチル−６−フェニ
ル−３，７−ジヒドロイミダゾ−［１，２−ａ］ピラジ
ン−３−オン）などが挙げられる。ＣＬＡは、・０２ −
または１０２の存在下で特異的に強く発光することが化
学系実験において見出したので、・０２ −や１０２の測
定に好ましい。また、ルミノール（Luminol（3-Aminoph
thaloylhydrazine））は、最も発光量子率の大きい化学
発光性有機化合物であり、Ｈ２０２または・ＯＨの存在
下で触媒により酸化されて発光することが化学系実験に
おいて見出したので、Ｈ２０２や・ＯＨの測定に好まし
い。The substance which emits light by reacting with active oxygen of the present invention may be a substance which reacts with a specific active oxygen species in the above-mentioned active oxygen, but may be a substance which reacts with any active oxygen species. It may be. The light to be emitted is not particularly limited as long as it is light or wave that can be measured by a detection device such as a CCD camera, but visible light or light in the visible or ultraviolet region by fluorescence is preferable. As a substance which emits light by reacting with active oxygen, luminol or CLA (2-methyl-6-phenyl-3,7-dihydroimidazo- [1,2-a] pyrazin-3-one) is preferable. Is mentioned. CLA is, - 0 2 -
Or because 1 0 2 of emitting specifically strong presence found in chemistry experiments, 2.0 2 - and preferably in 1 0 2 measurement. In addition, Luminol (3-Aminoph
thaloylhydrazine)) is the greatest chemiluminescent organic compound having a light-emitting quantum ratio, since it was found in the chemical system experiments that emits light after being oxidized by the catalyst in the presence of H 2 0 2 or · OH, H 2 0 It is preferable for measurement of 2 or .OH.
【００１０】したがって、本発明の生体組織の活性酸素
を検出、定量又は同定するための組成物としては、ＣＬ
Ａ及び／又はルミノールを含有するものが好ましい。本
発明のこの組成物は、検体に添加して均一に混合又は分
散されるものが好ましく、そのための溶媒や分散剤など
を含有することができる。また、本発明のこの組成物
は、検体に塗布することができる形態として使用するこ
とができる。この場合には展開剤としての溶剤や粘着性
を付与するために粘着剤などを含有させることもでき
る。Therefore, the composition for detecting, quantifying or identifying active oxygen in living tissue of the present invention is CL
Those containing A and / or luminol are preferred. The composition of the present invention is preferably one that is uniformly mixed or dispersed by being added to a sample, and may contain a solvent or a dispersant for that purpose. Further, the composition of the present invention can be used as a form that can be applied to a specimen. In this case, a solvent as a developing agent or an adhesive for imparting tackiness can be contained.
【００１１】活性酸素と反応して発光する物質が活性酸
素と反応して発光する光を計測するための装置として
は、従来の蛍光分析などに使用されている受光器を用い
ることもできるが、微弱光測定システムを用いることが
好ましい。微弱光測定システムを用いることにより活性
酸素と反応して発光する物質が活性酸素と反応して発光
する光を直接測定することができる。また、発光する部
位などを計測するためにはＣＣＤカメラの使用が好まし
い。ＣＣＤカメラの感度は低感度のものでも本発明の測
定は不可能ではないが、高感度ＣＣＤカメラの使用が好
ましい。また、得られる発光画像はアナログ方式のもの
でもよいが、発光画像の処理をする場合にはデジタル方
式のものが好ましい。As a device for measuring light emitted from a substance which emits light by reacting with active oxygen, light receivers used for conventional fluorescence analysis and the like can be used. It is preferable to use a weak light measurement system. By using the weak light measurement system, light emitted from a substance which emits light by reacting with active oxygen can be directly measured. In addition, in order to measure a light emitting portion, it is preferable to use a CCD camera. Although the measurement of the present invention is not impossible even if the sensitivity of the CCD camera is low, it is preferable to use a high sensitivity CCD camera. Further, the obtained luminescent image may be of an analog type, but in the case of processing the luminescent image, a digital type is preferred.
【００１２】本発明の活性酸素を検出、定量又は同定す
るための装置としては、検体に活性酸素と反応して発光
する物質を添加又は塗布した検体を測定中静止させるた
めの検体を固定することができる装置及び活性酸素との
反応の結果発生する発光を検出、定量又は同定するため
の装置を包含してなる装置であればよい。検体に活性酸
素と反応して発光する物質を添加又は塗布した検体を固
定することができる装置としては、例えば、手や足など
を載せることができる台のようなものであってもよい
し、必要な場合にはこの台にバンドのような固定具を設
けることもできる。また、活性酸素との反応の結果発生
する発光を検出、定量又は同定するための装置として
は、前記したＣＣＤカメラを備えた装置などを挙げるこ
とができ、測定結果を表示するためのディスプレーやプ
リンターや、測定結果を記録しておくための記録装置を
備えたものが好ましい。An apparatus for detecting, quantifying or identifying active oxygen according to the present invention includes a method of adding a substance which emits light by reacting with active oxygen to a sample or fixing a sample for stopping the sample during measurement. Any device may be used as long as it includes a device capable of performing the reaction and a device for detecting, quantifying, or identifying luminescence generated as a result of reaction with active oxygen. As a device that can fix a sample to which a substance that emits light in response to active oxygen has been added or coated, for example, a device such as a table on which a hand or foot can be placed, If necessary, the table can be provided with a fixture such as a band. In addition, examples of an apparatus for detecting, quantifying, or identifying luminescence generated as a result of a reaction with active oxygen include the above-described apparatus including a CCD camera, and a display or a printer for displaying measurement results. Further, it is preferable to provide a recording device for recording the measurement result.
【００１３】本発明の活性酸素を検出、定量又は同定す
るための装置は、必要に応じて測定した結果をデータ処
理することができるデータ処理装置を設置することがで
きる。このようなデータ処理をすることにより肉眼で観
察される発光画像よりもより詳細な発光に関する情報を
得ることが可能となる。画像処理の方法としては従来の
ＣＴ技術を応用することができる。The apparatus for detecting, quantifying or identifying active oxygen according to the present invention may be provided with a data processing device capable of processing the measured result as necessary. By performing such data processing, it is possible to obtain more detailed information on light emission than a light emission image observed with the naked eye. A conventional CT technique can be applied as an image processing method.
【００１４】本発明の方法において、活性酸素の発生の
有無を検出する場合には、ＣＣＤカメラなどにより活性
酸素と反応して発光する物質の発光の有無を検出すれば
よい。発生した活性酸素の量を定量する場合には、活性
酸素と反応して発光する物質が発光する蛍光などの光の
発光量を発光強度として定量したり、標準物質との相対
強度により定量することができる。また、活性酸素の発
生した検体上の部位などを検出又は同定する場合には、
ＣＣＤカメラなどの画像データをディスプレーに直接表
示するか、画像データをデータ処理して出力することに
より行うことができる。In the method of the present invention, in order to detect the presence or absence of generation of active oxygen, the presence or absence of light emission of a substance which reacts with active oxygen and emits light may be detected by a CCD camera or the like. When quantifying the amount of generated active oxygen, the amount of light such as fluorescence emitted from a substance that emits light by reacting with active oxygen should be quantified as luminescence intensity, or quantified by relative intensity with a standard substance. Can be. In addition, when detecting or identifying a site on a sample where active oxygen has been generated,
This can be performed by directly displaying image data from a CCD camera or the like on a display or by processing and outputting the image data.
【００１５】さらに、発生した活性酸素の種類を検出、
定量又は同定しようとする場合には、活性酸素と反応し
て発光する物質として特定の活性酸素種と反応する物質
を使用することもできるが、より簡便には、検体に特定
の活性酸素種と反応して当該活性酸素種を消去する物質
（以下、活性酸素消去物質という。）を添加又は塗布
し、次いで本発明の活性酸素と反応して発光する物質を
添加又は塗布した後、検体をＣＣＤカメラなどで測定
し、これを前記した活性酸素消去物質を添加又は塗布し
ない場合の検体から得られたデータと比較することによ
り行うことができる。本発明で使用し得る活性酸素消去
物質としては、特定の活性酸素種と選択的にに反応し
て、当該活性酸素種を消去することができるものであれ
ばよい。このような活性酸素消去物質として、例えば、
スーパーオキシドアニオン（・Ｏ２ −）を選択的に消去
するＳＯＤ、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）を選択的に
消去するエタノール、過酸化水素（Ｈ２０２）を選択的
に消去するカタラーゼ（Catalase）、一重項酸素（１０
２）を選択的に補足するβ−カロテン（β−calotene）
などが挙げられる。これらの１種又は２種以上を適宜使
用することができる。Further, the type of the generated active oxygen is detected,
When quantification or identification is to be performed, a substance that reacts with a specific active oxygen species can be used as a substance that emits light by reacting with active oxygen. After adding or applying a substance that reacts to eliminate the active oxygen species (hereinafter referred to as an active oxygen eliminating substance), and then adding or applying a substance that emits light by reacting with the active oxygen of the present invention, the specimen is subjected to CCD. It can be measured by measuring with a camera or the like, and comparing this with data obtained from a sample in the case where the active oxygen eliminating substance is not added or applied. The active oxygen scavenging substance that can be used in the present invention may be any substance that can selectively react with a specific active oxygen species to eliminate the active oxygen species. As such an active oxygen eliminating substance, for example,
SOD that selectively eliminates superoxide anion (.O 2 − ), ethanol that selectively eliminates hydroxyl radical (.OH), and catalase that selectively eliminates hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) , Singlet oxygen ( 10
2 ) β-carotene that selectively supplements
And the like. One or more of these can be used as appropriate.
【００１６】また、本発明のスクリーニング方法は、前
記した活性酸素種を検出、定量又は同定する方法と同様
な方法により行うことができる。例えば、活性酸素が発
生している検体にスクリーニング物質を添加又は塗布
し、さらに本発明の活性酸素と反応して発光する物質を
添加又は塗布した後、ＣＣＤカメラなどにより検体を測
定して、活性酸素の発生量を対照検体の測定値と比較す
ることにより、前記スクリーニン物質の有効性を判定す
ることができる。また、前記した活性酸素消去物質の使
用を組み合わせることにより、当該スクリーニング物質
がどの活性酸素種に対して有効であるかということも判
定することが可能となる。本発明のスクリーニング方法
により、簡便かつ正確に生体内で活性な抗酸化剤を見出
すことができることになる。したがって、本発明は当該
スクリーニング方法によって得られた抗酸化剤組成物を
提供するものでもある。Further, the screening method of the present invention can be carried out by a method similar to the method for detecting, quantifying or identifying reactive oxygen species described above. For example, after adding or applying a screening substance to a specimen in which active oxygen is generated, and further adding or applying a substance which emits light by reacting with the active oxygen of the present invention, the specimen is measured by a CCD camera or the like, and the activity is measured. By comparing the amount of generated oxygen with the measured value of the control sample, the effectiveness of the screening substance can be determined. In addition, by combining the use of the above-mentioned active oxygen elimination substance, it is possible to determine which active oxygen species the screening substance is effective against. According to the screening method of the present invention, an active antioxidant in vivo can be easily and accurately found. Therefore, the present invention also provides an antioxidant composition obtained by the screening method.
【００１７】次に本発明をより具体的に説明する。本発
明者らは、紫外線照射後の皮膚において発生する活性酸
素種の検出と同定について検討した。活性酸素と反応し
て発光する物質（以下、単に発光物質という。）として
ＣＬＡを用いた場合、照射終了３０秒後から３０分間に
わたって非常に強い発光が観測された。この惹起された
発光がＳＯＤ前処置によってほぼ完全に抑制され、β−
カロテン（β-calotene ）前処置では若干抑制されたこ
とから、紫外線照射後の皮膚において発生する主な活性
酸素種は・０２ −であり、さらに一部１０２も発生して
いることが示された。Next, the present invention will be described more specifically. The present inventors have studied detection and identification of reactive oxygen species generated in the skin after ultraviolet irradiation. When CLA was used as a substance that emits light by reacting with active oxygen (hereinafter, simply referred to as a light-emitting substance), extremely strong light emission was observed for 30 minutes after 30 seconds from the end of irradiation. This evoked luminescence was almost completely suppressed by SOD pretreatment, and β-
Since the carotene (β-calotene) pretreated was slightly suppressed, the principal active oxygen species generated in the skin after UV irradiation, 0 2 -, and that the further part 1 0 2 also occurs Indicated.
【００１８】図１にその結果を示す。図１の左側の連続
写真は、紫外線（ＵＶＡ）照射時の１分後から２９分後
までの１分間隔の写真であり、最も左側はＣＬＡのみの
場合のものであり、中側はこれにＳＯＤを加えた場合の
ものであり、右側はβ−カロテン（図１では、ｂ−ＣＡ
Ｌとして表示されている。）を加えたものである。紫外
線照射後から、多量の活性酸素が発生していることが画
像データとして示されている。そして、これにＳＯＤを
加えることにより発生した活性酸素のほぼ全てを消滅さ
せることができること、及び、この照射により発生した
活性酸素種のほとんどがＳＯＤによって消去可能な種で
あることがわかる。紫外線照射の右側の写真はβ−カロ
テンを加えたものであり、β−カロテンによっては発生
した活性酸素種を全て消滅させることができないことが
わかる。なお、図１における輝度は発光の強度を示して
いる。FIG. 1 shows the results. The continuous photograph on the left side of FIG. 1 is a photograph at one-minute intervals from 1 minute to 29 minutes after irradiation with ultraviolet light (UVA), the leftmost one is for CLA only, and the middle one is for this. SOD was added, and the right side is β-carotene (b-CA in FIG. 1).
It is displayed as L. ). It is shown as image data that a large amount of active oxygen has been generated after the irradiation with ultraviolet rays. It can be seen that almost all of the active oxygen generated by adding SOD to this can be eliminated, and that most of the active oxygen species generated by this irradiation can be erased by SOD. The photograph on the right side of the ultraviolet irradiation shows that β-carotene was added, and it can be seen that all the generated reactive oxygen species cannot be eliminated by β-carotene. Note that the brightness in FIG. 1 indicates the intensity of light emission.
【００１９】次に正常の皮膚において発生する活性酸素
種の検出と同定を検討した。発光物質としてＣＬＡを用
いた場合、塗布５分後から１５分間にわたって発光が観
測された。ただし、正常皮膚からの発光量は紫外線照射
後の発光量と比較するとかなり弱いものであった。この
場合の発光はＳＯＤ前処置によってほぼ完全に抑制さ
れ、β−カロテンにはほとんど影響されなかったことか
ら、正常の皮膚において発生している主な活性酸素種は
・０２ −であることが示された。この結果を図１の右側
の連続写真として示す。Next, detection and identification of reactive oxygen species generated in normal skin were examined. When CLA was used as the light emitting substance, light emission was observed for 15 minutes from 5 minutes after application. However, the amount of luminescence from normal skin was considerably weaker than the amount of luminescence after ultraviolet irradiation. The emission in this case is almost completely inhibited by SOD pretreatment, since it was not little effect on β- carotene, the principal active oxygen species occurring in normal skin-0 2 - to be Indicated. The result is shown as a continuous photograph on the right side of FIG.
【００２０】ルミノールを使用してもほぼ同様な結果が
得られる。ルミノールの場合には活性酸素種として特に
過酸化水素との反応が強い点において前記したＣＬＡと
は異なる結果となる。本発明者らは、ルミノールやＣＬ
Ａの活性酸素との反応を次のように推定した。Approximately similar results are obtained with luminol. In the case of luminol, the result differs from the above-mentioned CLA in that the reaction with hydrogen peroxide as an active oxygen species is particularly strong. The present inventors have proposed luminol and CL
The reaction of A with active oxygen was estimated as follows.
【００２１】[0021]
【化１】 まず、ルミノールに活性酸素種が作用して脱水素反応が
生起し、さらに酸化されて窒素が遊離し、生成したジエ
ステル体が基底状態に戻るときに波長４２５ｎｍの光を
発生すると考えられる。また、ＣＬＡについては、Embedded image First, it is considered that active oxygen species act on luminol to cause a dehydrogenation reaction, which is further oxidized to release nitrogen, and that light having a wavelength of 425 nm is generated when the generated diester returns to the ground state. As for CLA,
【００２２】[0022]
【化２】 まず、活性酸素の作用によりイミダゾロン環が開裂し、
環状過酸化エステルが生成し、これが活性アミドとなり
このときに波長３８０ｎｍの光を発生すると考えられ
る。Embedded image First, the imidazolone ring is cleaved by the action of active oxygen,
It is considered that a cyclic peroxide ester is formed, which becomes an active amide, and at this time, emits light having a wavelength of 380 nm.
【００２３】この実験に使用した検出装置は、Ｎｉｇｈ
ｔ Ｏｗｌ ＬＥ９８１（ＥＢ＆ＧＢｅｒｔｈｏｌｄ社
製）であり、この装置は、シングルフォトンカウンター
方式による超高感度イメージングＣＣＤカメラを装備し
ており、各種の活性酸素が発光物質と反応して生じる微
弱光を最高感度で検出することができ、さらに画像解析
をも可能とした測定装置である。１分間における発光強
度の積算量を単位時間・単位面積あたりの平均値として
数値化することにより、各種活性酸素の発生量を定量化
することもできる。したがって、このような装置を使用
することにより、測定結果をビジュアル化するだけでな
く、得られた画像の解析結果を数値化することによって
定量できることができ、実験の再現性については統計的
に良好な結果が得られた。The detector used in this experiment was Nigh.
t Owl LE981 (manufactured by EB & GB Arthold), which is equipped with an ultra-high sensitivity imaging CCD camera using a single photon counter system, and is capable of generating the weakest light generated when various active oxygens react with a luminescent substance at the highest sensitivity. This is a measuring device that can detect and can also perform image analysis. By quantifying the integrated amount of luminescence intensity per minute as an average value per unit time / unit area, the amount of generation of various types of active oxygen can be quantified. Therefore, by using such an apparatus, it is possible not only to visualize the measurement results, but also to quantify the analysis results of the obtained images by digitizing them, and the reproducibility of the experiment is statistically good. Results were obtained.
【００２４】図１に示される結果によれば、紫外線照射
などにより発生する活性酸素種としては主として一重項
酸素（１０２）であることがわかり、活性酸素発生を抑
制する物質として一重項酸素（１０２）を消滅させるこ
とができる物質が有望であることが示されている。According to the results shown in Figure 1, we can see that as the active oxygen species generated by an ultraviolet irradiation is mainly singlet oxygen (1 O 2), singlet oxygen active oxygen generated as a substance inhibiting (1 0 2) can be eliminated material is shown promise.
【００２５】本発明によれば、生体内における活性酸素
の生成を直接かつリアルタイムで測定することができ、
また、発生する活性酸素種を特定することができるの
で、生体内における活性酸素の発生機構の解明やその対
処、例えば抗酸化剤の開発などについて極めて重要な方
法、装置及びそのための組成物を提供するものである。According to the present invention, the production of active oxygen in a living body can be measured directly and in real time,
In addition, since active oxygen species to be generated can be specified, a very important method, apparatus and composition for elucidating and coping with the generation mechanism of active oxygen in a living body, for example, developing an antioxidant are provided. Is what you do.
【００２６】[0026]
【実施例】次に実施例により本発明をより詳細に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
【００２７】実施例１ ｄｄｙ系雄性マウス（６−８ ｗｅｅｋｓ）の背部をバ
リカンにより除毛した後、さらに除毛剤（チオグリコー
ル酸ナトリウム）を５分間塗布することで角質層を除去
した。除毛２４時間後ペントバルビタール腹腔内投与に
よる麻酔下のマウスの皮膚に、紫外線（ＵＶＡもしくは
ＵＶＢ）を１分間照射して皮膚傷害を惹起させた。紫外
線照射装置にはラボテック社の ＲＵＶＦ−２０２Ｓを
用いた。照射後直ちにＣＬＡもしくはルミノールを照射
部の皮膚に塗布し、照射終了３０秒後からＮｉｇｈｔ
Ｏｗｌ ＬＥ９８１社製の超高感度イメージングＣＣＤ
カメラを装備した装置により微弱光の連続測定を開始し
た。このときのマウスの発光の結果を図２に示す。Example 1 The back of a ddy male mouse (6-8 weeks) was hair-removed with a hair clipper, and then a hair remover (sodium thioglycolate) was applied for 5 minutes to remove the stratum corneum. Twenty-four hours after depilation, the skin of mice under anesthesia by intraperitoneal administration of pentobarbital was irradiated with ultraviolet light (UVA or UVB) for one minute to induce skin damage. The UV irradiator used was RUBOF-202S manufactured by Labotech. Immediately after irradiation, CLA or luminol is applied to the skin of the irradiated part, and after 30 seconds from the end of irradiation, Night
Ultra high sensitivity imaging CCD manufactured by Owl LE981
Continuous measurement of weak light was started by a device equipped with a camera. FIG. 2 shows the results of the light emission of the mouse at this time.
【００２８】実施例２ さらに、紫外線照射により生体内（in vivo）の皮膚組
織で発生する活性酸素種を同定するために、ＳＯＤ又は
β−カロテンなどの活性酸素消去物質をあらかじめ皮膚
に塗布した後に紫外線を照射して、照射終了後、同様に
微弱光を測定した。前記の実施例１の結果と併せて結果
を図１の左側の連続写真として示す。Example 2 Further, in order to identify active oxygen species generated in skin tissue in vivo by irradiation with ultraviolet rays, an active oxygen eliminating substance such as SOD or β-carotene was applied to the skin in advance. Ultraviolet light was irradiated, and after the irradiation was completed, weak light was measured in the same manner. The result is shown as a continuous photograph on the left side of FIG. 1 together with the result of Example 1 described above.
【００２９】実施例３ 紫外線を照射しない正常状態の皮膚において常在的に発
生している活性酸素種を検出する目的で、ＣＬＡもしく
はルミノールを正常の皮膚に塗布し、３０秒後から微弱
光を連続測定した。結果を図１の右側の連続写真として
示す。Example 3 CLA or luminol was applied to normal skin for the purpose of detecting reactive oxygen species normally occurring in normal skin which was not irradiated with ultraviolet rays. It was measured continuously. The results are shown as a series of photographs on the right side of FIG.
【００３０】[0030]
【発明の効果】本発明は、検体、特に動物の皮膚などに
おける活性酸素の発生の状況を簡便、高精度で且つリア
ルタイムで測定できる方法及び装置を提供する。また、
本発明はそのための組成物を提供するものである。本発
明の方法によれば、生体内における活性酸素の発生の機
構の解明が可能となるばかりでなく、発生する活性酸素
種を特定することもでき、生体内に発生した活性酸素を
効率的に除去し得る物質をスクリーニングすることがで
きる簡便な方法及び装置を提供する。The present invention provides a method and an apparatus which can measure the state of generation of active oxygen in a specimen, particularly in the skin of an animal, in a simple, highly accurate and real-time manner. Also,
The present invention provides a composition therefor. According to the method of the present invention, not only can elucidation of the mechanism of active oxygen generation in a living body be possible, but also active oxygen species generated can be specified, and active oxygen generated in a living body can be efficiently used. Provided is a simple method and device capable of screening for a substance that can be removed.
【図１】図１は、本発明の装置により生体内で発生した
活性酸素を連続的に撮影した図面に代わる写真である。
図１の左側は紫外線（ＵＶＡ）を照射したときのもので
あり、右側は紫外線を照射しないときのものである。FIG. 1 is a photograph replacing a drawing in which active oxygen generated in a living body by the apparatus of the present invention is continuously photographed.
The left side of FIG. 1 is a case where ultraviolet light (UVA) is irradiated, and the right side is a case where no ultraviolet light is irradiated.
【図２】図２は、マウスの皮膚に発生した活性酸素を本
発明の装置により撮影した図面に代わる写真である。FIG. 2 is a photograph instead of a drawing in which active oxygen generated in the skin of a mouse is photographed by the apparatus of the present invention.
Claims (18)
を添加又は塗布して、活性酸素との反応の結果発生する
発光を検出、定量又は同定することからなる活性酸素を
検出、定量又は同定する方法。1. A method for detecting, quantifying or identifying active oxygen, which comprises adding or applying a substance which emits light by reacting with active oxygen to a specimen, and detecting, quantifying or identifying luminescence generated as a result of reaction with active oxygen. How to identify.
記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the specimen is skin tissue of an animal.
ミノール又はＣＬＡ（２−メチル−６−フェニル−３，
７−ジヒドロイミダゾ−［１，２−ａ］ピラジン−３−
オン）である請求項１又は２に記載の方法。3. The substance which emits light by reacting with active oxygen is luminol or CLA (2-methyl-6-phenyl-3,
7-dihydroimidazo- [1,2-a] pyrazine-3-
The method according to claim 1, wherein the method is ON).
が、蛍光である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。4. The method according to claim 1, wherein the luminescence generated as a result of the reaction with active oxygen is fluorescence.
ＣＣＤカメラによるものである請求項１〜４のいずれか
に記載の方法。5. A method for detecting, quantifying or identifying luminescence,
The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the method is performed by a CCD camera.
素の量、発生した活性酸素の種類及び／又は活性酸素の
発生した部位を検出、定量又は同定する方法である請求
項１〜５のいずれかに記載の方法。6. A method for detecting, quantifying or identifying the presence or absence of active oxygen, the amount of active oxygen generated, the type of active oxygen generated and / or the site where active oxygen is generated. The method according to any of the above.
を添加又は塗布した検体を固定することができる装置、
活性酸素との反応の結果発生する発光を検出、定量又は
同定するための装置を包含してなる活性酸素を検出、定
量又は同定するための装置。7. An apparatus capable of fixing a specimen to which a substance which emits light by reacting with active oxygen is added or applied to the specimen.
An apparatus for detecting, quantifying or identifying active oxygen, comprising an apparatus for detecting, quantifying or identifying luminescence generated as a result of reaction with active oxygen.
が、蛍光である請求項７に記載の装置。8. The device according to claim 7, wherein the luminescence generated as a result of the reaction with active oxygen is fluorescence.
検出、定量又は同定するための装置からのデータを処理
する装置をさらに有してなる請求項７又は８に記載の装
置。9. The device according to claim 7, further comprising a device for processing data from a device for detecting, quantifying or identifying luminescence generated as a result of reaction with active oxygen.
を検出、定量又は同定するための装置が、ＣＣＤカメラ
によるものである請求項７〜９のいずれかに記載の装
置。10. The apparatus according to claim 7, wherein the apparatus for detecting, quantifying or identifying luminescence generated as a result of the reaction with active oxygen is based on a CCD camera.
有してなる生体組織の活性酸素を検出、定量又は同定す
るための組成物。11. A composition for detecting, quantifying or identifying active oxygen in a living tissue, comprising a substance which emits light by reacting with active oxygen.
ルミノール又はＣＬＡ（２−メチル−６−フェニル−
３，７−ジヒドロイミダゾ−［１，２−ａ］ピラジン−
３−オン）である請求項１１に記載の組成物。12. A substance which emits light by reacting with active oxygen,
Luminol or CLA (2-methyl-6-phenyl-
3,7-dihydroimidazo- [1,2-a] pyrazine-
The composition according to claim 11, which is 3-one).
項１１又は１２に記載の組成物。13. The composition according to claim 11, which is in a form that can be applied to a living tissue.
作用を有する物質を検体に添加又は塗布した後、検体を
活性酸素が発生する状態とし、次いで当該検体に活性酸
素と反応して発光する物質を添加又は塗布して、活性酸
素との反応の結果発生する発光を検出、定量又は同定す
ることからなる検体中に発生する活性酸素を中和する作
用を有する物質をスクリーニングする方法。14. After adding or applying a substance having an action of neutralizing active oxygen generated in a sample to the sample, the sample is brought into a state in which active oxygen is generated, and then the sample reacts with active oxygen to emit light. A method for screening for a substance having an action of neutralizing active oxygen generated in a specimen, comprising detecting or quantifying or identifying luminescence generated as a result of a reaction with active oxygen by adding or applying a substance to be activated.
載の方法。15. The method according to claim 14, wherein the specimen is a living tissue.
ルミノール又はＣＬＡ（２−メチル−６−フェニル−
３，７−ジヒドロイミダゾ−［１，２−ａ］ピラジン−
３−オン）である請求項１４又は１５に記載の方法。16. A substance which emits light by reacting with active oxygen,
Luminol or CLA (2-methyl-6-phenyl-
3,7-dihydroimidazo- [1,2-a] pyrazine-
The method according to claim 14 or 15, which is 3-one).
スクリーニングする方法を実施するために使用するスク
リーニング装置。17. A screening device used to carry out the screening method according to claim 14. Description:
方法により検体中に発生する活性酸素を中和する作用を
有する物質を含有してなる抗酸化組成物。18. An antioxidant composition comprising a substance having a function of neutralizing active oxygen generated in a specimen by the method according to any one of claims 14 to 16.
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004080449A1 (en) * | 2003-03-13 | 2004-09-23 | Mitsui & Co., Ltd. | Ultraviolet-induced active oxygen inhibitor |
| JP2006244814A (en) * | 2005-03-02 | 2006-09-14 | Toyota Central Res & Dev Lab Inc | Operation method of fuel cell system and solid polymer fuel cell |
| JP2011133417A (en) * | 2009-12-25 | 2011-07-07 | Lvmc Inc | Simple screening method of antioxidation substance for skin cosmetics using sensor for active oxygen species concentration measurement |
| WO2021230852A1 (en) * | 2020-05-11 | 2021-11-18 | Clear LLC | Monitoring activation of stem cells |
| CN114002207A (en) * | 2021-10-29 | 2022-02-01 | 浙江大学 | Application of ascorbic acid peroxidase 1 in catalysis of luminol chemiluminescence reaction |
-
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- 1999-05-31 JP JP15102399A patent/JP3708368B2/en not_active Expired - Fee Related
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| CN114002207A (en) * | 2021-10-29 | 2022-02-01 | 浙江大学 | Application of ascorbic acid peroxidase 1 in catalysis of luminol chemiluminescence reaction |
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