JP3708368B2

JP3708368B2 - Method for measuring active oxygen in skin

Info

Publication number: JP3708368B2
Application number: JP15102399A
Authority: JP
Inventors: 弘桜井
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1999-05-31
Filing date: 1999-05-31
Publication date: 2005-10-19
Anticipated expiration: 2019-05-31
Also published as: JP2000333907A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、検体に活性酸素と反応して発光する物質を添加又は塗布して、活性酸素との反応の結果発生する発光を検出、定量又は同定することからなる活性酸素を検出、定量又は同定する方法、そのための装置に関する。また、本発明は、活性酸素と反応して発光する物質を含有してなる生体組織の活性酸素を検出、定量又は同定するための組成物に関する。さらに、本発明は検体、好ましくは生体組織中に発生する活性酸素を中和する作用を有する物質をスクリーニングする方法及びそのための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近のオゾン層の破壊による太陽光紫外線（ＵＶＡ、ＵＶＢ）の増大は、人を含む地球上の全生物に相当な皮膚損傷を与えると懸念されており、ＵＶＡやＵＶＢによる皮膚傷害に関する多くの知見が蓄積されてきている。身体の最外層に位置し、人体組織では最大臓器である皮膚は、紫外線などの環境因子の影響を最も受けやすい臓器である。皮膚は直接外気とも接触しているので、常に酸素と紫外線に暴露されており、紫外線により発生する活性酸素の第一の標的部位であり、身体の内部を活性酸素による傷害から防御する役割を担っている。体内で生成する活性酸素は多くの疾患と関連することが既に指摘されているが、近年では日焼け、光毒性、光アレルギーといった紫外線による皮膚損傷やアトピー性皮膚炎、乾せんなどの皮膚疾患にも関与することが示唆されている。
【０００３】
したがって、活性酸素を消去する化合物は、２１世紀には飛躍的な増大が予測されている紫外線傷害による皮膚疾患の予防や治療に有効であると考えられ、新しい医薬品開発の概念としてとらえられている。しかし、皮膚における活性酸素の産生機構はいまだ明らかでなく、生体内（in vivo ）の人や動物の皮膚において紫外線照射下で活性酸素が実際に検出された報告すらないのが現状である。
また、生体内、特に皮膚においてどのような抗酸化剤が有効であるかを試験する方法も知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、生体内、特に皮膚における活性酸素を検出、定量する方法およびその装置を提供するものであり、かつ生体内、特に皮膚における抗酸化剤をスクリーニングする方法に関する。
即ち、本発明は、新規な微弱光測定システムを用いることにより生体内における動物の皮膚において紫外線照射下で産生される活性酸素を直接観測できる方法を提供するものであり、さらに、この方法を用いた活性酸素の発生機構の解明と新しい皮膚傷害防御薬の開発方法を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、検体に活性酸素と反応して発光する物質を添加又は塗布して、活性酸素との反応の結果発生する発光を検出、定量又は同定することからなる活性酸素を検出、定量又は同定する方法に関する。本発明は、前記の活性酸素を検出、定量又は同定する方法を実施するための装置に関し、より詳細には、検体に活性酸素と反応して発光する物質を添加又は塗布した検体を固定することができる装置、活性酸素との反応の結果発生する発光を検出、定量又は同定するための装置を包含してなる活性酸素を検出、定量又は同定するための装置に関する。
また、本発明は、検体中に発生する活性酸素を中和する作用を有する物質を検体に添加又は塗布した後、検体を活性酸素が発生する状態とし、次いで当該検体に活性酸素と反応して発光する物質を添加又は塗布して、活性酸素との反応の結果発生する発光を検出、定量又は同定することからなる検体中に発生する活性酸素を中和する作用を有する物質をスクリーニングする方法に関する。本発明は、前記したスクリーニングする方法を実施するために使用するスクリーニング装置にも関する。さらに、本発明は前記したスクリーニング方法やスクリーニング装置を用いてスクリーニングされた検体中に発生する活性酸素を中和する作用を有する物質を含有してなる抗酸化組成物にも関する。
【０００６】
本発明の他の目的は、活性酸素と反応して発光する物質を含有してなる生体組織の活性酸素を検出、定量又は同定するための組成物を提供することでもある。本発明のこの組成物は、生体組織に悪影響を及ぼさない担体を含有することができる。したがって、本発明は、活性酸素と反応して発光する物質及び生体組織に対して許容される担体とからなる生体組織の活性酸素を検出、定量又は同定するための組成物に関する。
【０００７】
本発明の活性酸素を検出、定量又は同定するための方法は、活性酸素の発生の有無、発生した活性酸素の量、発生した活性酸素の種類及び／又は活性酸素の発生した検体上の部位などを検出、定量又は同定する方法であり、必要に応じてこれらの中の１種類の検出、定量又は同定をする方法とすることもできるが、これらの中の２種以上を同時に検出、定量又は同定することもできる。また、検出、定量又は同定を同時に行うこともできるが、これらを別々に測定することもできる。
【０００８】
本発明の検体としては、紫外線やストレスなどにより活性酸素を発生することができるものであり、例えば、動物の皮膚組織、培養された生体組織などが挙げられる。動物の皮膚を検体として使用する場合には、必要に応じて脱毛したり、テープなどを用いて皮膚の角質層を除去して使用することができる。
本発明の活性酸素とは、通常の酸素分子に比べて著しく反応性に富む酸素含有の基又は分子であって、好ましくは生体内において発生し得るものであり、例えば、スーパーオキシドアニオン（・Ｏ_２ ⁻）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）、ペルヒドロキシラジカル（・Ｏ_２Ｈ）、一重項酸素（^１Ｏ_２）、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、脂質過酸化物（・ＲＯＯ）、窒素酸化物（ＮＯｘ）、イオウ酸化物（ＳＯｘ）などのフリーラジカルや分子種が挙げられる。
【０００９】
本発明の活性酸素と反応して発光する物質としては、前記した活性酸素の中の特定の活性酸素種と反応するものであってもよいが、いずれの活性酸素種と反応するものであってもよい。また、発光する光としてはＣＣＤカメラなどの検出装置で測定することができる光又は波動であるならば特に制限はないが、可視光線又は蛍光による可視又は紫外線領域の光が好ましい。好ましいが、活性酸素と反応して発光する物質としては、例えば、ルミノール又はＣＬＡ（２−メチル−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ−［１，２−ａ］ピラジン−３−オン）などが挙げられる。
ＣＬＡは、・０_２ ⁻または^１０_２の存在下で特異的に強く発光することが化学系実験において見出したので、・０_２ ⁻や^１０_２の測定に好ましい。
また、ルミノール（Luminol（3-Aminophthaloylhydrazine））は、最も発光量子率の大きい化学発光性有機化合物であり、Ｈ_２０_２または・ＯＨの存在下で触媒により酸化されて発光することが化学系実験において見出したので、Ｈ_２０_２や・ＯＨの測定に好ましい。
【００１０】
したがって、本発明の生体組織の活性酸素を検出、定量又は同定するための組成物としては、ＣＬＡ及び／又はルミノールを含有するものが好ましい。本発明のこの組成物は、検体に添加して均一に混合又は分散されるものが好ましく、そのための溶媒や分散剤などを含有することができる。また、本発明のこの組成物は、検体に塗布することができる形態として使用することができる。この場合には展開剤としての溶剤や粘着性を付与するために粘着剤などを含有させることもできる。
【００１１】
活性酸素と反応して発光する物質が活性酸素と反応して発光する光を計測するための装置としては、従来の蛍光分析などに使用されている受光器を用いることもできるが、微弱光測定システムを用いることが好ましい。微弱光測定システムを用いることにより活性酸素と反応して発光する物質が活性酸素と反応して発光する光を直接測定することができる。また、発光する部位などを計測するためにはＣＣＤカメラの使用が好ましい。ＣＣＤカメラの感度は低感度のものでも本発明の測定は不可能ではないが、高感度ＣＣＤカメラの使用が好ましい。また、得られる発光画像はアナログ方式のものでもよいが、発光画像の処理をする場合にはデジタル方式のものが好ましい。
【００１２】
本発明の活性酸素を検出、定量又は同定するための装置としては、検体に活性酸素と反応して発光する物質を添加又は塗布した検体を測定中静止させるための検体を固定することができる装置及び活性酸素との反応の結果発生する発光を検出、定量又は同定するための装置を包含してなる装置であればよい。
検体に活性酸素と反応して発光する物質を添加又は塗布した検体を固定することができる装置としては、例えば、手や足などを載せることができる台のようなものであってもよいし、必要な場合にはこの台にバンドのような固定具を設けることもできる。また、活性酸素との反応の結果発生する発光を検出、定量又は同定するための装置としては、前記したＣＣＤカメラを備えた装置などを挙げることができ、測定結果を表示するためのディスプレーやプリンターや、測定結果を記録しておくための記録装置を備えたものが好ましい。
【００１３】
本発明の活性酸素を検出、定量又は同定するための装置は、必要に応じて測定した結果をデータ処理することができるデータ処理装置を設置することができる。このようなデータ処理をすることにより肉眼で観察される発光画像よりもより詳細な発光に関する情報を得ることが可能となる。画像処理の方法としては従来のＣＴ技術を応用することができる。
【００１４】
本発明の方法において、活性酸素の発生の有無を検出する場合には、ＣＣＤカメラなどにより活性酸素と反応して発光する物質の発光の有無を検出すればよい。発生した活性酸素の量を定量する場合には、活性酸素と反応して発光する物質が発光する蛍光などの光の発光量を発光強度として定量したり、標準物質との相対強度により定量することができる。また、活性酸素の発生した検体上の部位などを検出又は同定する場合には、ＣＣＤカメラなどの画像データをディスプレーに直接表示するか、画像データをデータ処理して出力することにより行うことができる。
【００１５】
さらに、発生した活性酸素の種類を検出、定量又は同定しようとする場合には、活性酸素と反応して発光する物質として特定の活性酸素種と反応する物質を使用することもできるが、より簡便には、検体に特定の活性酸素種と反応して当該活性酸素種を消去する物質（以下、活性酸素消去物質という。）を添加又は塗布し、次いで本発明の活性酸素と反応して発光する物質を添加又は塗布した後、検体をＣＣＤカメラなどで測定し、これを前記した活性酸素消去物質を添加又は塗布しない場合の検体から得られたデータと比較することにより行うことができる。
本発明で使用し得る活性酸素消去物質としては、特定の活性酸素種と選択的にに反応して、当該活性酸素種を消去することができるものであればよい。このような活性酸素消去物質として、例えば、スーパーオキシドアニオン（・Ｏ_２ ⁻）を選択的に消去するＳＯＤ、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）を選択的に消去するエタノール、過酸化水素（Ｈ_２０_２）を選択的に消去するカタラーゼ（Catalase）、一重項酸素（^１０_２）を選択的に補足するβ−カロテン（β−calotene）などが挙げられる。これらの１種又は２種以上を適宜使用することができる。
【００１６】
また、本発明のスクリーニング方法は、前記した活性酸素種を検出、定量又は同定する方法と同様な方法により行うことができる。例えば、活性酸素が発生している検体にスクリーニング物質を添加又は塗布し、さらに本発明の活性酸素と反応して発光する物質を添加又は塗布した後、ＣＣＤカメラなどにより検体を測定して、活性酸素の発生量を対照検体の測定値と比較することにより、前記スクリーニン物質の有効性を判定することができる。また、前記した活性酸素消去物質の使用を組み合わせることにより、当該スクリーニング物質がどの活性酸素種に対して有効であるかということも判定することが可能となる。
本発明のスクリーニング方法により、簡便かつ正確に生体内で活性な抗酸化剤を見出すことができることになる。したがって、本発明は当該スクリーニング方法によって得られた抗酸化剤組成物を提供するものでもある。
【００１７】
次に本発明をより具体的に説明する。
本発明者らは、紫外線照射後の皮膚において発生する活性酸素種の検出と同定について検討した。
活性酸素と反応して発光する物質（以下、単に発光物質という。）としてＣＬＡを用いた場合、照射終了３０秒後から３０分間にわたって非常に強い発光が観測された。この惹起された発光がＳＯＤ前処置によってほぼ完全に抑制され、β−カロテン（β-calotene ）前処置では若干抑制されたことから、紫外線照射後の皮膚において発生する主な活性酸素種は・０_２ ⁻であり、さらに一部^１０_２も発生していることが示された。
【００１８】
図１にその結果を示す。図１の左側の連続写真は、紫外線（ＵＶＡ）照射時の１分後から２９分後までの１分間隔の写真であり、最も左側はＣＬＡのみの場合のものであり、中側はこれにＳＯＤを加えた場合のものであり、右側はβ−カロテン（図１では、ｂ−ＣＡＬとして表示されている。）を加えたものである。
紫外線照射後から、多量の活性酸素が発生していることが画像データとして示されている。そして、これにＳＯＤを加えることにより発生した活性酸素のほぼ全てを消滅させることができること、及び、この照射により発生した活性酸素種のほとんどがＳＯＤによって消去可能な種であることがわかる。紫外線照射の右側の写真はβ−カロテンを加えたものであり、β−カロテンによっては発生した活性酸素種を全て消滅させることができないことがわかる。
なお、図１における輝度は発光の強度を示している。
【００１９】
次に正常の皮膚において発生する活性酸素種の検出と同定を検討した。
発光物質としてＣＬＡを用いた場合、塗布５分後から１５分間にわたって発光が観測された。ただし、正常皮膚からの発光量は紫外線照射後の発光量と比較するとかなり弱いものであった。この場合の発光はＳＯＤ前処置によってほぼ完全に抑制され、β−カロテンにはほとんど影響されなかったことから、正常の皮膚において発生している主な活性酸素種は・０_２ ⁻であることが示された。
この結果を図１の右側の連続写真として示す。
【００２０】
ルミノールを使用してもほぼ同様な結果が得られる。ルミノールの場合には活性酸素種として特に過酸化水素との反応が強い点において前記したＣＬＡとは異なる結果となる。
本発明者らは、ルミノールやＣＬＡの活性酸素との反応を次のように推定した。
【００２１】
【化１】

まず、ルミノールに活性酸素種が作用して脱水素反応が生起し、さらに酸化されて窒素が遊離し、生成したジエステル体が基底状態に戻るときに波長４２５ｎｍの光を発生すると考えられる。また、ＣＬＡについては、
【００２２】
【化２】

まず、活性酸素の作用によりイミダゾロン環が開裂し、環状過酸化エステルが生成し、これが活性アミドとなりこのときに波長３８０ｎｍの光を発生すると考えられる。
【００２３】
この実験に使用した検出装置は、ＮｉｇｈｔＯｗｌＬＥ９８１（ＥＢ＆ＧＢｅｒｔｈｏｌｄ社製）であり、この装置は、シングルフォトンカウンター方式による超高感度イメージングＣＣＤカメラを装備しており、各種の活性酸素が発光物質と反応して生じる微弱光を最高感度で検出することができ、さらに画像解析をも可能とした測定装置である。１分間における発光強度の積算量を単位時間・単位面積あたりの平均値として数値化することにより、各種活性酸素の発生量を定量化することもできる。
したがって、このような装置を使用することにより、測定結果をビジュアル化するだけでなく、得られた画像の解析結果を数値化することによって定量できることができ、実験の再現性については統計的に良好な結果が得られた。
【００２４】
図１に示される結果によれば、紫外線照射などにより発生する活性酸素種としては主として一重項酸素（^１０_２）であることがわかり、活性酸素発生を抑制する物質として一重項酸素（^１０_２）を消滅させることができる物質が有望であることが示されている。
【００２５】
本発明によれば、生体内における活性酸素の生成を直接かつリアルタイムで測定することができ、また、発生する活性酸素種を特定することができるので、生体内における活性酸素の発生機構の解明やその対処、例えば抗酸化剤の開発などについて極めて重要な方法、装置及びそのための組成物を提供するものである。
【００２６】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２７】
実施例１
ｄｄｙ系雄性マウス（６−８ｗｅｅｋｓ）の背部をバリカンにより除毛した後、さらに除毛剤（チオグリコール酸ナトリウム）を５分間塗布することで角質層を除去した。除毛２４時間後ペントバルビタール腹腔内投与による麻酔下のマウスの皮膚に、紫外線（ＵＶＡもしくはＵＶＢ）を１分間照射して皮膚傷害を惹起させた。紫外線照射装置にはラボテック社のＲＵＶＦ−２０２Ｓを用いた。照射後直ちにＣＬＡもしくはルミノールを照射部の皮膚に塗布し、照射終了３０秒後からＮｉｇｈｔＯｗｌＬＥ９８１社製の超高感度イメージングＣＣＤカメラを装備した装置により微弱光の連続測定を開始した。
このときのマウスの発光の結果を図２に示す。
【００２８】
実施例２
さらに、紫外線照射により生体内（in vivo）の皮膚組織で発生する活性酸素種を同定するために、ＳＯＤ又はβ−カロテンなどの活性酸素消去物質をあらかじめ皮膚に塗布した後に紫外線を照射して、照射終了後、同様に微弱光を測定した。
前記の実施例１の結果と併せて結果を図１の左側の連続写真として示す。
【００２９】
実施例３
紫外線を照射しない正常状態の皮膚において常在的に発生している活性酸素種を検出する目的で、ＣＬＡもしくはルミノールを正常の皮膚に塗布し、３０秒後から微弱光を連続測定した。
結果を図１の右側の連続写真として示す。
【００３０】
【発明の効果】
本発明は、検体、特に動物の皮膚などにおける活性酸素の発生の状況を簡便、高精度で且つリアルタイムで測定できる方法及び装置を提供する。また、本発明はそのための組成物を提供するものである。
本発明の方法によれば、生体内における活性酸素の発生の機構の解明が可能となるばかりでなく、発生する活性酸素種を特定することもでき、生体内に発生した活性酸素を効率的に除去し得る物質をスクリーニングすることができる簡便な方法及び装置を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の装置により生体内で発生した活性酸素を連続的に撮影した図面に代わる写真である。図１の左側は紫外線（ＵＶＡ）を照射したときのものであり、右側は紫外線を照射しないときのものである。
【図２】図２は、マウスの皮膚に発生した活性酸素を本発明の装置により撮影した図面に代わる写真である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention detects, quantifies, or identifies active oxygen by adding or applying a substance that reacts with active oxygen to emit light and detecting, quantifying, or identifying luminescence generated as a result of the reaction with active oxygen. And a device for the method. The present invention also relates to a composition for detecting, quantifying or identifying active oxygen in a living tissue containing a substance that reacts with active oxygen to emit light. Furthermore, the present invention relates to a method for screening a substance having an action of neutralizing active oxygen generated in a specimen, preferably living tissue, and an apparatus therefor.
[0002]
[Prior art]
The recent increase in sunlight ultraviolet rays (UVA, UVB) due to the destruction of the ozone layer is feared to cause considerable skin damage to all living organisms on the earth including humans, and there are many findings regarding skin damage caused by UVA and UVB. Has been accumulated. Skin, which is located in the outermost layer of the body and is the largest organ in human tissue, is the organ most susceptible to environmental factors such as ultraviolet rays. Since the skin is also in direct contact with the outside air, it is always exposed to oxygen and ultraviolet rays, and is the primary target site for active oxygen generated by ultraviolet rays and plays a role in protecting the inside of the body from injury caused by active oxygen. ing. It has already been pointed out that active oxygen produced in the body is associated with many diseases, but in recent years it has also been involved in skin damage such as sunburn, phototoxicity, photoallergy due to ultraviolet rays, atopic dermatitis, and psoriasis. It has been suggested that
[0003]
Therefore, a compound capable of eliminating active oxygen is considered to be effective for the prevention and treatment of skin diseases caused by ultraviolet ray injury, which is expected to increase dramatically in the 21st century, and is regarded as a concept of new drug development. . However, the production mechanism of active oxygen in the skin is still unclear, and there is no report that active oxygen was actually detected in human or animal skin in vivo under ultraviolet irradiation.
Also, there is no known method for testing what kind of antioxidant is effective in vivo, particularly in the skin.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides a method and apparatus for detecting and quantifying active oxygen in a living body, particularly in the skin, and a method for screening an antioxidant in the living body, particularly in the skin.
That is, the present invention provides a method for directly observing active oxygen produced under ultraviolet irradiation in the skin of an animal in a living body by using a novel faint light measurement system. It is intended to elucidate the mechanism of generation of active oxygen and to develop new skin injury protection methods.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present invention detects, quantifies, or identifies active oxygen by adding or applying a substance that reacts with active oxygen to emit light and detecting, quantifying, or identifying luminescence generated as a result of the reaction with active oxygen. On how to do. The present invention relates to an apparatus for carrying out the above-described method for detecting, quantifying or identifying active oxygen, and more specifically, immobilizing a sample to which a substance that reacts with active oxygen and emits light is applied or applied to the sample. The present invention relates to an apparatus for detecting, quantifying or identifying active oxygen, including an apparatus capable of detecting, quantifying or identifying luminescence generated as a result of reaction with active oxygen.
In addition, the present invention adds or applies a substance having an action of neutralizing active oxygen generated in a specimen to the specimen, then places the specimen in a state where active oxygen is generated, and then reacts the specimen with active oxygen. The present invention relates to a method for screening a substance having an action of neutralizing active oxygen generated in a sample comprising adding or applying a luminescent substance and detecting, quantifying or identifying luminescence generated as a result of reaction with active oxygen. . The present invention also relates to a screening apparatus used for carrying out the screening method described above. Furthermore, the present invention also relates to an antioxidant composition comprising a substance having an action of neutralizing active oxygen generated in a specimen screened using the screening method or screening apparatus described above.
[0006]
Another object of the present invention is to provide a composition for detecting, quantifying or identifying active oxygen in a living tissue containing a substance that emits light by reacting with active oxygen. The composition of the present invention may contain a carrier that does not adversely affect living tissue. Therefore, the present invention relates to a composition for detecting, quantifying or identifying active oxygen in a living tissue comprising a substance that reacts with active oxygen to emit light and a carrier that is acceptable for living tissue.
[0007]
The method for detecting, quantifying or identifying active oxygen according to the present invention includes the presence / absence of generation of active oxygen, the amount of generated active oxygen, the type of generated active oxygen and / or the site on the specimen where active oxygen is generated, etc. Can be a method for detecting, quantifying or identifying one of these as needed, but two or more of these can be detected, quantified or identified simultaneously. It can also be identified. Moreover, although detection, quantification, or identification can also be performed simultaneously, these can also be measured separately.
[0008]
The specimen of the present invention is capable of generating active oxygen by ultraviolet rays or stress, and examples thereof include animal skin tissue and cultured biological tissue. When animal skin is used as a specimen, hair can be removed as necessary, or the skin stratum corneum can be removed using a tape or the like.
The active oxygen of the present invention is an oxygen-containing group or molecule that is significantly more reactive than ordinary oxygen molecules, and preferably can be generated in vivo. For example, superoxide anion (.O ₂ ^-), hydroxy radicals (· OH), per hydroxy radical (· _O 2 H), singlet oxygen ⁽¹ _O 2), hydrogen peroxide _(H _{2 O} 2), lipid peroxide (· ROO), nitrogen Examples include free radicals and molecular species such as oxide (NOx) and sulfur oxide (SOx).
[0009]
The substance that reacts with the active oxygen of the present invention to emit light may react with a specific active oxygen species in the active oxygen described above, but reacts with any active oxygen species. Also good. The light to be emitted is not particularly limited as long as it is light or wave that can be measured by a detection device such as a CCD camera, but light in the visible or ultraviolet region due to visible light or fluorescence is preferable. Preferred examples of the substance that emits light by reacting with active oxygen include luminol and CLA (2-methyl-6-phenyl-3,7-dihydroimidazo- [1,2-a] pyrazin-3-one). Is mentioned.
CLA _{is-0 2} ^- the and ¹ 0 ₂ of emitting specifically strong presence found in chemistry experiments, _{2.0 2} ^- preferred and ¹ 0 ₂ measurement.
Luminol (3-Aminophthaloylhydrazine) is a chemiluminescent organic compound with the largest emission quantum rate, and it is a chemical system experiment that it emits light when oxidized by a catalyst in the presence of H ₂ O ₂ or .OH. Is preferable for the measurement of H ₂ 0 ₂ and .OH.
[0010]
Therefore, as a composition for detecting, quantifying or identifying active oxygen in the living tissue of the present invention, a composition containing CLA and / or luminol is preferable. This composition of the present invention is preferably added to a specimen and uniformly mixed or dispersed, and can contain a solvent, a dispersant, and the like. Moreover, this composition of this invention can be used as a form which can be apply | coated to a test substance. In this case, a solvent as a developing agent or a pressure-sensitive adhesive can be contained in order to impart tackiness.
[0011]
As a device for measuring the light emitted from a substance that reacts with active oxygen and emits light, it is possible to use a light receiver that is used in conventional fluorescence analysis, etc. It is preferable to use a system. By using the faint light measurement system, it is possible to directly measure light emitted from a substance that reacts with active oxygen and emits light. Further, it is preferable to use a CCD camera in order to measure a portion that emits light. Even if the sensitivity of the CCD camera is low, the measurement of the present invention is not impossible, but it is preferable to use a high sensitivity CCD camera. The obtained luminescent image may be an analog type, but a digital type is preferable when processing the luminescent image.
[0012]
As an apparatus for detecting, quantifying or identifying active oxygen according to the present invention, an apparatus capable of immobilizing a specimen for allowing a specimen to which a substance that reacts with active oxygen and emits light is applied or applied to the specimen to be stationary during measurement is used. And a device including a device for detecting, quantifying or identifying luminescence generated as a result of the reaction with active oxygen.
As a device that can fix a sample to which a sample that reacts with active oxygen and emits light is applied or fixed, for example, a device such as a table on which hands or feet can be placed, If necessary, a fixture such as a band can be provided on the table. An apparatus for detecting, quantifying or identifying luminescence generated as a result of reaction with active oxygen can include an apparatus equipped with the CCD camera described above, and a display or printer for displaying measurement results. In addition, those equipped with a recording device for recording the measurement results are preferable.
[0013]
The apparatus for detecting, quantifying or identifying the active oxygen of the present invention can be provided with a data processing apparatus capable of data processing of the measurement results as necessary. By performing such data processing, it is possible to obtain more detailed information about light emission than a light emission image observed with the naked eye. Conventional CT technology can be applied as an image processing method.
[0014]
In the method of the present invention, when detecting the presence or absence of generation of active oxygen, the presence or absence of light emission of a substance that reacts with active oxygen and emits light may be detected by a CCD camera or the like. When quantifying the amount of active oxygen generated, the amount of light emitted from the substance that reacts with active oxygen to emit light, such as fluorescence, is quantified as the luminescence intensity, or it is quantified based on the relative intensity to the standard substance. Can do. Further, when detecting or identifying a site on a specimen where active oxygen is generated, it can be performed by directly displaying image data such as a CCD camera on a display or by processing and outputting the image data. .
[0015]
Furthermore, when detecting, quantifying, or identifying the type of active oxygen generated, a substance that reacts with a specific active oxygen species can be used as a substance that emits light by reacting with active oxygen. In the sample, a substance that reacts with a specific reactive oxygen species to erase the reactive oxygen species (hereinafter referred to as an active oxygen scavenging substance) is added or applied to the specimen, and then reacts with the active oxygen of the present invention to emit light. After adding or applying the substance, the specimen is measured with a CCD camera or the like, and this is compared with the data obtained from the specimen when the active oxygen eliminating substance is not added or applied.
The active oxygen scavenging substance that can be used in the present invention may be any material that can selectively react with a specific active oxygen species to erase the active oxygen species. Examples of such active oxygen scavengers include, for example, SOD that selectively erases superoxide anions (.O ₂ ⁻ ), ethanol that selectively erases hydroxy radicals (.OH), and hydrogen peroxide (H ₂ 0 _2). ) Are selectively eliminated, and β-calotene that selectively supplements singlet oxygen ( ¹⁰ ₂ ) is included. These 1 type (s) or 2 or more types can be used suitably.
[0016]
In addition, the screening method of the present invention can be performed by a method similar to the method for detecting, quantifying or identifying the reactive oxygen species described above. For example, after adding or applying a screening substance to a specimen in which active oxygen is generated, and adding or applying a substance that emits light by reacting with the active oxygen of the present invention, the specimen is measured by a CCD camera or the like, The effectiveness of the screening material can be determined by comparing the amount of oxygen generated with the measured value of the control sample. In addition, by combining the use of the active oxygen scavenger described above, it is possible to determine to which active oxygen species the screening substance is effective.
By the screening method of the present invention, it is possible to easily and accurately find an active antioxidant in vivo. Therefore, the present invention also provides an antioxidant composition obtained by the screening method.
[0017]
Next, the present invention will be described more specifically.
The present inventors examined the detection and identification of reactive oxygen species generated in the skin after ultraviolet irradiation.
When CLA was used as a substance that reacts with active oxygen and emits light (hereinafter simply referred to as a luminescent substance), very strong luminescence was observed for 30 minutes after 30 seconds from the end of irradiation. This induced luminescence was almost completely suppressed by the SOD pretreatment, and was slightly suppressed by the β-calotene pretreatment. Therefore, the main reactive oxygen species generated in the skin after the ultraviolet irradiation was. ₂ ^- was shown to be further a part ¹ 0 ₂ occurred.
[0018]
The result is shown in FIG. The left-hand side continuous photo in FIG. 1 is a one-minute interval from 1 minute to 29 minutes after ultraviolet (UVA) irradiation, and the leftmost is for CLA only, and the middle is This is the case where SOD is added, and the right side is added with β-carotene (shown as b-CAL in FIG. 1).
It is shown as image data that a large amount of active oxygen has been generated after the ultraviolet irradiation. It can be seen that almost all of the active oxygen generated by adding SOD can be eliminated, and that most of the active oxygen species generated by this irradiation are erasable by SOD. The photograph on the right side of the ultraviolet irradiation is obtained by adding β-carotene, and it can be seen that all the active oxygen species generated by β-carotene cannot be eliminated.
Note that the luminance in FIG. 1 indicates the intensity of light emission.
[0019]
Next, we investigated the detection and identification of reactive oxygen species generated in normal skin.
When CLA was used as the luminescent material, luminescence was observed for 15 minutes from 5 minutes after coating. However, the amount of light emitted from normal skin was considerably weaker than the amount of light emitted after UV irradiation. The emission in this case is almost completely inhibited by SOD pretreatment, since it was not little effect on β- carotene, the principal active oxygen species occurring in normal skin-0 ₂ ^- to be Indicated.
The result is shown as a continuous photograph on the right side of FIG.
[0020]
Similar results can be obtained using luminol. In the case of luminol, the result is different from the above-mentioned CLA in that the reaction with hydrogen peroxide is particularly strong as an active oxygen species.
The present inventors estimated the reaction of luminol and CLA with active oxygen as follows.
[0021]
[Chemical 1]

First, it is considered that reactive oxygen species act on luminol to cause a dehydrogenation reaction, which is further oxidized to liberate nitrogen, and light having a wavelength of 425 nm is generated when the produced diester body returns to the ground state. For CLA,
[0022]
[Chemical formula 2]

First, it is considered that the imidazolone ring is cleaved by the action of active oxygen to generate a cyclic peroxide ester, which becomes an active amide and generates light having a wavelength of 380 nm.
[0023]
The detection device used in this experiment is Night Owl LE981 (manufactured by EB & GBerhold), which is equipped with an ultra-sensitive imaging CCD camera using a single photon counter system, and various active oxygens react with luminescent substances. Thus, it is a measuring apparatus that can detect the weak light generated at the highest sensitivity and can also perform image analysis. By quantifying the integrated amount of luminescence intensity per minute as an average value per unit time / unit area, the amount of generation of various active oxygens can be quantified.
Therefore, by using such a device, not only can the measurement results be visualized, but also the analysis results of the obtained images can be quantified, and the experimental reproducibility is statistically good. Results were obtained.
[0024]
According to the results shown in Figure 1, we can see that as the active oxygen species generated by an ultraviolet irradiation is mainly singlet oxygen ^{(1 O} _2), singlet oxygen active oxygen generated as a substance inhibiting ⁽¹ 0 ₂ ) It has been shown that a substance capable of extinguishing is promising.
[0025]
According to the present invention, the production of active oxygen in a living body can be measured directly and in real time, and the generated reactive oxygen species can be specified. It provides a very important method, device and composition therefor for dealing with it, for example the development of antioxidants.
[0026]
【Example】
EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these Examples.
[0027]
Example 1
After the hair of the back of ddy male mice (6-8 weeks) was removed with a clipper, the hair layer (sodium thioglycolate) was further applied for 5 minutes to remove the stratum corneum. After 24 hours of hair removal, the skin of anesthetized mice by intraperitoneal administration of pentobarbital was irradiated with ultraviolet rays (UVA or UVB) for 1 minute to induce skin injury. RUVF-202S manufactured by Labotech was used as the ultraviolet irradiation device. Immediately after irradiation, CLA or luminol was applied to the skin of the irradiated part, and after 30 seconds from the end of irradiation, continuous measurement of faint light was started by an apparatus equipped with an ultra-sensitive imaging CCD camera manufactured by Night Owl LE981.
The result of light emission of the mouse at this time is shown in FIG.
[0028]
Example 2
Furthermore, in order to identify reactive oxygen species generated in skin tissue in vivo by ultraviolet irradiation, an active oxygen-eliminating substance such as SOD or β-carotene is applied to the skin in advance and then irradiated with ultraviolet rays. After the irradiation, the weak light was measured in the same manner.
The result is shown as a continuous photograph on the left side of FIG. 1 together with the result of Example 1.
[0029]
Example 3
CLA or luminol was applied to normal skin for the purpose of detecting active oxygen species resident in normal skin not irradiated with ultraviolet rays, and faint light was continuously measured after 30 seconds.
The results are shown as a continuous photograph on the right side of FIG.
[0030]
【The invention's effect】
The present invention provides a method and apparatus capable of measuring the state of generation of active oxygen in a specimen, particularly an animal skin, etc. in a simple, highly accurate and real time manner. The present invention also provides a composition therefor.
According to the method of the present invention, it becomes possible not only to elucidate the mechanism of the generation of active oxygen in the living body, but also to specify the generated active oxygen species, and to efficiently generate the active oxygen generated in the living body. A simple method and apparatus capable of screening a substance that can be removed are provided.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photograph replacing a drawing in which active oxygen generated in a living body is continuously photographed by the apparatus of the present invention. The left side of FIG. 1 is when ultraviolet rays (UVA) are irradiated, and the right side is when ultraviolet rays are not irradiated.
FIG. 2 is a photograph replacing a drawing in which active oxygen generated in the skin of a mouse is photographed by the apparatus of the present invention.

Claims

Add or apply luminol or CLA (2-methyl-6-phenyl-3,7-dihydroimidazo- [1,2-a] pyrazin-3-one) to the skin tissue of animals (except humans), A method for detecting, quantifying or identifying active oxygen, comprising detecting, quantifying or identifying luminescence generated as a result of a reaction with active oxygen by an ultrasensitive imaging CCD camera using a single photon counter system.

The method according to claim 1, wherein the luminescence generated as a result of the reaction with active oxygen is fluorescence.

The method according to claim 1 or 2, which is a method for detecting, quantifying or identifying the presence or absence of generation of active oxygen, the amount of generated active oxygen, the type of generated active oxygen, and / or the site where active oxygen is generated.

Fixing the skin tissue of animals (except humans) to which luminol or CLA (2-methyl-6-phenyl-3,7-dihydroimidazo- [1,2-a] pyrazin-3-one) has been added or applied Detecting, quantifying or identifying active oxygen, including a device that has an ultra-sensitive imaging CCD camera with a single photon counter system for detecting, quantifying or identifying luminescence generated as a result of reaction with active oxygen Device to do.

The apparatus according to claim 4, wherein the luminescence generated as a result of the reaction with active oxygen is fluorescence.

6. The device according to claim 4 or 5, further comprising a device for processing data from a device for detecting, quantifying or identifying luminescence generated as a result of reaction with active oxygen.

Superimposing active oxygen in living tissue containing luminol or CLA (2-methyl-6-phenyl-3,7-dihydroimidazo- [1,2-a] pyrazin-3-one) by a single photon counter system A composition for detection, quantification or identification by a high sensitivity imaging CCD camera.

The composition according to claim 7, which is in a form that can be applied to a living tissue.

After a substance having an action of neutralizing active oxygen generated in the sample is added or applied to the sample (excluding humans), the sample is brought into a state where active oxygen is generated, and then luminol or CLA (2- Methyl-6-phenyl-3,7-dihydroimidazo- [1,2-a] pyrazin-3-one) is added or applied, and the luminescence generated as a result of the reaction with active oxygen is increased by a single photon counter system. A method for screening a substance having an action of neutralizing active oxygen generated in a specimen, comprising detection, quantification or identification by a high-sensitivity imaging CCD camera.

The method according to claim 9, wherein the specimen is a living tissue.