JP2004340935A - Method for evaluating oxidized protein in horny layer - Google Patents
Method for evaluating oxidized protein in horny layer Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004340935A JP2004340935A JP2004089376A JP2004089376A JP2004340935A JP 2004340935 A JP2004340935 A JP 2004340935A JP 2004089376 A JP2004089376 A JP 2004089376A JP 2004089376 A JP2004089376 A JP 2004089376A JP 2004340935 A JP2004340935 A JP 2004340935A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- oxidized
- stratum corneum
- oxidized protein
- protein
- skin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
Description
本発明は、角層酸化タンパク質の角層上での性状を二次元的に評価する方法であって、酸化タンパク質を特異的に蛍光標識することを特徴とする方法、及びその方法を実施するために利用されるキットを提供する。本発明はまた、酸化剤、例えば次亜塩素酸ナトリウムなどによる酸化タンパク質の増加を抑制する薬剤のスクリーニング方法を提供する。本発明は更に、皮膚由来の角層試料における水不溶性物質であるコーニファイドエンベロープの酸化形態を検出する方法にも関連する。 The present invention is a method for two-dimensionally evaluating the properties of a stratum corneum oxidized protein on the stratum corneum, wherein the method comprises specifically labeling the oxidized protein with a fluorescent label, and a method for performing the method. Provide kits used for The present invention also provides a method for screening a drug that suppresses an increase in oxidized protein due to an oxidizing agent such as sodium hypochlorite. The present invention further relates to a method for detecting the oxidized form of the water-insoluble substance, the cornified envelope, in a horny layer sample derived from the skin.
肌質（または皮膚の状態）を的確に把握することは、より健康な皮膚を維持するための的確なスキンケアをする上で重要である。そのため、化粧品によるスキンケアを実施するに際し、例えば、美容技術者による問診などを通じて、化粧品の使用者の肌質が評価されてきた。また、肌質の客観的な評価を目的として、各種の計測機器を使用して、観察又は測定されるパラメーターにより、皮膚の状態または機能を評価することも行われている。 Accurate understanding of skin quality (or skin condition) is important for proper skin care for maintaining healthier skin. Therefore, when performing skin care using cosmetics, the skin quality of the user of the cosmetics has been evaluated through, for example, an interview with a beauty engineer. In addition, for the purpose of objective evaluation of skin quality, various types of measuring devices are used to evaluate the condition or function of the skin based on parameters observed or measured.
近年、皮膚の加齢に伴う老化や光老化との関係で、角層酸化タンパク質の研究が盛んに行われている。酸化タンパク質とは、酸化を受けた結果カルボニル基の導入されたタンパク質をいい、一般に、タンパク質におけるLys、Arg、Proといったアミノ酸残基のNH2基が直接酸化されてカルボニル基となった結果生成されたものと、脂質が酸化して過酸化脂質、更には分解して反応性の高いアルデヒドとなり、それがタンパク質と結合することで生成されたものとがある。酸化タンパク質は老化関連での研究が豊富にされており、加齢（脳、肝、線維芽細胞）、アルツハイマー病、早老症（Werner症候群）等において増加することが認められている。 In recent years, studies on horny layer oxidized proteins have been actively conducted in relation to aging and photoaging associated with skin aging. The oxidized protein refers to the introduced protein results carbonyl group undergoes oxidation, generally, Lys in protein, Arg, are generated as a result of NH 2 groups of the amino acid residues such as Pro becomes directly oxidized to the carbonyl group And those in which lipids are oxidized to lipid peroxide and further decomposed to highly reactive aldehydes, which are formed by binding to proteins. Oxidized proteins have been extensively studied in relation to aging, and have been found to increase in aging (brain, liver, fibroblasts), Alzheimer's disease, progeria (Werner syndrome), and the like.
皮膚においては、皮膚表面の皮脂がフリーラジカルによって酸化し、過酸化脂質が生成することでタンパク質の酸化は開始されるものと考えられる。いったん過酸化脂質が生成されると、酸化は連鎖的に進行し、肌表面に刺激を与えるだけにとどまらず、角質層の奥まで入り込んで細胞にダメージを与える。このようにして、皮脂、皮膚タンパク質の酸化は肌本来がもつうるおい、はり、明るさ等を保つ機能をことごとく低下させると考えられる。従って、表皮の酸化タンパク質の性状、例えば存在量、分布状態等を評価することは、肌質または皮膚の状態を的確に把握し、その後のスキンケア法の方針決定や化粧品の選定のために極めて重要であるものと考えられる。 In the skin, it is considered that the sebum on the skin surface is oxidized by free radicals, and the oxidation of proteins is initiated by the generation of lipid peroxide. Once lipid peroxide is produced, the oxidation proceeds in a chain and not only stimulates the skin surface, but also penetrates deep into the stratum corneum and damages cells. In this way, it is considered that the oxidation of sebum and skin proteins degrades all functions of the skin, such as moisturizing, abrasion, and brightness. Therefore, evaluating the properties of the oxidized protein in the epidermis, such as its abundance and distribution state, is extremely important for accurately grasping the skin quality or skin condition, and subsequently determining the policy of the skin care method and selecting cosmetics. It is considered that it is.
前述の通り、角層酸化タンパク質に関する研究が多々行われている。J.J.Thiele et al. FEBS Letter 1998 Feb 6, 422(3), 403-406には、角層酸化タンパク質の検出方法が記載されている。それには、粘着テープを皮膚表層に貼付け、剥がすといったいわゆるテープストリッピング操作を行うことで角層の付着したテープ（「テープ角層」）を獲得し、酸化タンパク質をELISAにて検出する方法が開示されている。Thieleらによれば、テープ角層に紫外線照射を施したところ、酸化タンパク質の増加が認められ、また酸化タンパク質の存在量は、上腕等の非露光部角層よりも顔面等の露光部角層において多い、とのことである。 As described above, many studies have been conducted on the stratum corneum oxidized protein. J.J. Thiele et al. FEBS Letter 1998 Feb 6, 422 (3), 403-406 describes a method for detecting stratum corneum oxidized protein. To this end, a method is disclosed in which a so-called tape stripping operation of attaching and peeling an adhesive tape to the skin surface layer to obtain a tape with a stratum corneum ("tape stratum corneum") and detecting oxidized proteins by ELISA. ing. According to Thiele et al., When UV irradiation was performed on the tape horny layer, an increase in oxidized protein was observed, and the abundance of oxidized protein was higher in the exposed horny layer of the face than in the unexposed horny layer of the upper arm. It is said that there are many in.
J.J.Thiele et al. J. Invest. Dermatol. 1999, Sep, 113(3), 335-359においては、テープ角層からタンパク質抽出を行い、可溶性成分をDNPH標識し、SDS-PAGEにかけ、抗DNP抗体を用いてウェスタンブロットを行うことで酸化タンパク質の検出を行っている。それにおいては、酸化タンパク質は角層の中層や下層よりも上層において多く存在することが報告されている。 In JJThiele et al. J. Invest. Dermatol. 1999, Sep, 113 (3), 335-359, protein extraction was performed from the tape stratum corneum, the soluble component was DNPH-labeled, subjected to SDS-PAGE, and the anti-DNP antibody was detected. The oxidized protein is detected by performing Western blotting using. In that case, it is reported that oxidized proteins are present more in the upper layer than in the middle and lower layers of the stratum corneum.
C.S.Sander et al. J. Invest. Dermatol. 2002, Apr, 118(4), 618-625においては、ヒト皮膚組織切片をDNPHで標識し、抗DNPで染色することで酸化タンパク質の検出を行っている。それにおいては、光老化皮膚では主に真皮において酸化タンパク質の量が増大することが認められ、また、紫外線を連日照射することで角層酸化タンパク質の量が増加し、またその増加の割合は紫外線の照射量に依存して増大することが報告されている。 In CSSander et al. J. Invest. Dermatol. 2002, Apr, 118 (4), 618-625, human skin tissue sections were labeled with DNPH and stained with anti-DNP to detect oxidized proteins. I have. In that case, it is recognized that the amount of oxidized protein increases in the photo-aged skin mainly in the dermis, and the amount of stratum corneum oxidized protein increases with daily irradiation of ultraviolet rays, and the rate of the increase is Is reported to increase depending on the irradiation dose.
このように、角層酸化タンパク質に関する研究は盛んに行われ、皮膚の加齢による老化、紫外線照射などによる光老化との関連性も示唆されている。従って、皮膚の酸化タンパク質の性状の評価は、皮膚老化の予防又は改善を目的とする適切なスキンケア法、治療法、化粧品、医薬品の選定などのために有効な情報を提供するものと予想される。 Thus, studies on the horny layer oxidized protein have been actively conducted, and it has been suggested that the aging of the skin is associated with photoaging due to ultraviolet irradiation and the like. Therefore, evaluation of the properties of oxidized proteins in the skin is expected to provide effective information for selecting appropriate skin care methods, treatment methods, cosmetics, pharmaceuticals, etc. for the purpose of preventing or improving skin aging. .
従来技術における酸化タンパク質の検出はいずれも角層試料を採取し、タンパク質抽出に付し、そのタンパク質抽出物にDNPHを作用させて酸化タンパク質をDNPで標識し、SDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜に転写し、抗DNP抗体を作用させてからパーオキシダーゼ標識二次抗体を結合させ、そしてケミルミネッセンス試薬（ECL基質）で発色させるといった手間暇のかかる工程を包含するものであった。しかも、得られる情報は酸化タンパク質の量に関するものに限られ、それが肌上でどのように分布し、顕在化しているかといった二次元的な詳細な情報は一切提供しないものであった。従って、酸化タンパク質の検出は肌質の評価に有用であると示唆されているにもかかわらず、その操作が面倒であり、また得られる情報も限られる、などといった理由であまり活用されるものではなかった。しかしながら、その簡易化が図られ、またその情報内容もより詳細なものとなれば、例えば近年における化粧品業界などで行われている適切なスキンケア法などのアドバイスを目的とするカウンセリングサービスの提供のための有力な手段ともなり得るものと考えられる。 In the detection of oxidized proteins in the prior art, a sample of the stratum corneum is collected, subjected to protein extraction, DNPH is applied to the protein extract, the oxidized proteins are labeled with DNP, and separated by SDS-PAGE. This involved a time-consuming step of transferring to a membrane, allowing an anti-DNP antibody to act, binding a peroxidase-labeled secondary antibody, and developing a color with a chemiluminescence reagent (ECL substrate). Moreover, the information obtained is limited to information on the amount of oxidized protein, and does not provide any two-dimensional detailed information on how it is distributed and manifested on the skin. Therefore, although it is suggested that the detection of oxidized protein is useful for evaluating skin quality, its operation is cumbersome and the information obtained is limited, so it is not often used because it is limited. Did not. However, if it is simplified and the information content becomes more detailed, for example, in order to provide a counseling service for the purpose of giving advice such as appropriate skin care methods performed in the cosmetics industry in recent years, etc. It is thought that it can also be an effective means.
本発明者は、皮膚角質層の酸化タンパク質の皮膚上での性状の二次元的な情報を簡易に獲得し、特に化粧品等の販売の際のカウンセリングサービスにおけるかかる酸化タンパク質の情報の活用を図ることを可能とすることを課題とする。従来において、皮膚角質層の酸化タンパク質の皮膚上での性状の二次元的な情報を獲得しようとする試みは全くもってなされてきていなかった。 The present inventor easily obtains two-dimensional information on the properties of oxidized proteins in the stratum corneum of the skin on the skin, and aims to utilize such information of oxidized proteins in a counseling service particularly when selling cosmetics and the like. The task is to make it possible. Conventionally, no attempt has been made to obtain two-dimensional information on the properties of oxidized proteins in the stratum corneum on the skin.
従って、本発明は、角層酸化タンパク質の角層上での性状を二次元的に評価する方法であって、皮膚から採取した角層試料中の当該酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識し、その蛍光を検出することで評価を行うことを特徴とする方法を提供する。好ましくは、前記検出は蛍光顕微鏡下で行われる。更に好ましくは、前記蛍光顕微鏡により得た検出結果は画像化される。 Therefore, the present invention is a method for two-dimensionally evaluating the properties of a stratum corneum oxidized protein on the stratum corneum, wherein the carbonyl group of the oxidized protein in a stratum corneum sample collected from the skin is specifically fluorescently labeled. And a method characterized by performing the evaluation by detecting the fluorescence. Preferably, said detection is performed under a fluorescence microscope. More preferably, the detection result obtained by the fluorescence microscope is imaged.
好適な態様において、前記酸化タンパク質のカルボニル基の特異的な蛍光標識は、前記酸化タンパク質にヒドラジノ基含有蛍光物質を作用・結合させることにより実施する。好ましくは、前記ヒドラジノ基含有蛍光物質はフルオレセイン−５−チオセミカルバジド及びテキサスレッドヒドラジドから成る群から選ばれる。 In a preferred embodiment, the specific fluorescent labeling of the carbonyl group of the oxidized protein is performed by allowing a hydrazino group-containing fluorescent substance to act on and bind to the oxidized protein. Preferably, the hydrazino group-containing fluorescent substance is selected from the group consisting of fluorescein-5-thiosemicarbazide and Texas Red hydrazide.
別の好適な態様において、前記酸化タンパク質のカルボニル基の特異的な蛍光標識は、前記酸化タンパク質にビオチンヒドラジドを作用・結合させ、次いでそれに蛍光標識アビジンを作用・結合させてビオチンヒドラジドと蛍光標識アビジンとの複合体を形成させることにより実施する。好ましくは、前記蛍光標識アビジンはフルオレセイン標識アビジンである。 In another preferred embodiment, the specific fluorescent labeling of the carbonyl group of the oxidized protein is such that biotin hydrazide acts on and binds to the oxidized protein, and then fluorescently labeled avidin acts and binds to the biotin hydrazide and the fluorescently labeled avidin. This is performed by forming a complex with Preferably, said fluorescently labeled avidin is fluorescein labeled avidin.
別の好適な態様において、前記酸化タンパク質のカルボニル基の特異的な蛍光標識は、前記酸化タンパク質にジニトロフェニルヒドラジンを作用・結合させ、次いでそれに抗ジニトロフェニル抗体を作用・結合させ、しかる後それに当該抗ジニトロフェニル抗体に特異的な蛍光標識抗体を作用・結合させることにより実施する。 In another preferred embodiment, the specific fluorescent labeling of the carbonyl group of the oxidized protein comprises reacting and binding dinitrophenylhydrazine to the oxidized protein, and then reacting and binding thereto an anti-dinitrophenyl antibody, and then applying the This is performed by allowing a specific fluorescently labeled antibody to act and bind to the anti-dinitrophenyl antibody.
好ましくは、前記角層試料は皮膚に対するテープストリッピングにより採取されたテープ角層である。 Preferably, the stratum corneum sample is a tape stratum corneum collected by tape stripping on the skin.
本発明は更に、角層酸化タンパク質の角層上での存在を二次元的に評価する方法に利用するためのキットであって、
テープストリッピングにより角層試料を採取するための粘着テープ；及び
酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識するための蛍光物質；
を含んで成ることを特徴とするキットを提供する。好ましくは、前記評価は蛍光顕微鏡下で行われる。更に好ましくは、前記蛍光顕微鏡により得た検出結果は画像化される。
The present invention further provides a kit for use in a method for two-dimensionally evaluating the presence of a stratum corneum oxidized protein on the stratum corneum,
Adhesive tape for collecting a stratum corneum sample by tape stripping; and a fluorescent substance for specifically fluorescently labeling a carbonyl group of an oxidized protein;
And a kit comprising: Preferably, said evaluation is performed under a fluorescence microscope. More preferably, the detection result obtained by the fluorescence microscope is imaged.
好適な態様において、前記蛍光物質はヒドラジノ基含有蛍光物質であり、前記酸化タンパク質のカルボニル基の特異的な蛍光標識は、前記酸化タンパク質にヒドラジノ基含有蛍光物質を作用・結合させることにより実施する。好ましくは、前記ヒドラジノ基含有蛍光物質はフルオレセイン−５−チオセミカルバジド及びテキサスレッドヒドラジドから成る群から選ばれる。
別の好適な態様において、前記蛍光物質は蛍光標識アビジンであり、前記酸化タンパク質のカルボニル基の特異的な蛍光標識は、前記酸化タンパク質にビオチンヒドラジドを作用・結合させ、次いでそれに蛍光標識アビジンを作用・結合させてビオチンヒドラジドと蛍光標識アビジンとの複合体を形成させることにより実施する。好ましくは、前記蛍光標識アビジンはフルオレセイン標識アビジンである。
In a preferred embodiment, the fluorescent substance is a hydrazino group-containing fluorescent substance, and the specific fluorescent labeling of the carbonyl group of the oxidized protein is performed by causing the hydrazino group-containing fluorescent substance to act on and bind to the oxidized protein. Preferably, the hydrazino group-containing fluorescent substance is selected from the group consisting of fluorescein-5-thiosemicarbazide and Texas Red hydrazide.
In another preferred embodiment, the fluorescent substance is a fluorescent-labeled avidin, and the specific fluorescent labeling of the carbonyl group of the oxidized protein causes biotin hydrazide to act on and bind to the oxidized protein, and then causes the fluorescent-labeled avidin to act on the oxidized protein. Performed by binding to form a complex of biotin hydrazide and fluorescently labeled avidin. Preferably, said fluorescently labeled avidin is fluorescein labeled avidin.
別の好適な態様において、前記蛍光物質は蛍光標識抗体であり、前記酸化タンパク質の蛍光物質による特異的な蛍光標識は、前記酸化タンパク質にジニトロフェニルヒドラジンを作用・結合させ、次いでそれに抗ジニトロフェニル抗体を作用・結合させ、しかる後それに当該抗ジニトロフェニル抗体に特異的な蛍光標識抗体を作用・結合させることにより実施する。 In another preferred embodiment, the fluorescent substance is a fluorescent-labeled antibody, and the specific fluorescent labeling of the oxidized protein with the fluorescent substance is performed by allowing dinitrophenylhydrazine to act on and bind to the oxidized protein, and then applying an anti-dinitrophenyl antibody thereto. And then a fluorescently labeled antibody specific to the anti-dinitrophenyl antibody is allowed to act and bind.
別の観点において、本発明は酸化タンパク質の増加を抑制する薬剤のスクリーニング方法を提供する。この方法は、角層、例えば皮膚から採取した角層試料又は皮膚そのものを適当な酸化剤及び候補薬剤で処理し、しかる後に角層上の酸化されたタンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識し、その蛍光を検出することで、当該薬剤の酸化タンパク質の増加を抑制する活性を評価することを特徴とする。 In another aspect, the present invention provides a method for screening a drug that suppresses an increase in oxidized protein. In this method, a stratum corneum, for example, a stratum corneum sample collected from the skin or the skin itself is treated with an appropriate oxidizing agent and a candidate agent, and then the carbonyl group of the oxidized protein on the stratum corneum is specifically fluorescently labeled. By detecting the fluorescence, the activity of suppressing the increase of the oxidized protein of the drug is evaluated.
好適な態様において、前記酸化タンパク質のカルボニル基の特異的な蛍光標識は、前記酸化タンパク質にヒドラジノ基含有蛍光物質を作用・結合させることにより実施する。好ましくは、前記ヒドラジノ基含有蛍光物質はフルオレセイン−５−チオセミカルバジド及びテキサスレッドヒドラジドから成る群から選ばれる。 In a preferred embodiment, the specific fluorescent labeling of the carbonyl group of the oxidized protein is performed by allowing a hydrazino group-containing fluorescent substance to act on and bind to the oxidized protein. Preferably, the hydrazino group-containing fluorescent substance is selected from the group consisting of fluorescein-5-thiosemicarbazide and Texas Red hydrazide.
別の好適な態様において、前記酸化タンパク質のカルボニル基の特異的な蛍光標識は、前記酸化タンパク質にビオチンヒドラジドを作用・結合させ、次いでそれに蛍光標識アビジンを作用・結合させてビオチンヒドラジドと蛍光標識アビジンとの複合体を形成させることにより実施する。好ましくは、前記蛍光標識アビジンはフルオレセイン標識アビジンである。 In another preferred embodiment, the specific fluorescent labeling of the carbonyl group of the oxidized protein is such that biotin hydrazide acts on and binds to the oxidized protein, and then fluorescently labeled avidin acts and binds to the biotin hydrazide and the fluorescently labeled avidin. This is performed by forming a complex with Preferably, said fluorescently labeled avidin is fluorescein labeled avidin.
別の好適な態様において、前記酸化タンパク質のカルボニル基の特異的な蛍光標識は、前記酸化タンパク質にジニトロフェニルヒドラジンを作用・結合させ、次いでそれに抗ジニトロフェニル抗体を作用・結合させ、しかる後それに当該抗ジニトロフェニル抗体に特異的な蛍光標識抗体を作用・結合させることにより実施する。 In another preferred embodiment, the specific fluorescent labeling of the carbonyl group of the oxidized protein comprises reacting and binding dinitrophenylhydrazine to the oxidized protein, and then reacting and binding thereto an anti-dinitrophenyl antibody, and then applying the This is performed by allowing a specific fluorescently labeled antibody to act and bind to the anti-dinitrophenyl antibody.
好ましくは、前記角層試料は皮膚に対するテープストリッピングにより採取されたテープ角層である。 Preferably, the stratum corneum sample is a tape stratum corneum collected by tape stripping on the skin.
本発明は更に、皮膚由来の角層試料における水不溶性物質であるコーニファイドエンベロープ（角質肥厚膜）の酸化形態を検出する方法であって、当該酸化形態のコーニファイドエンベロープにおけるカルボニル基を特異的に蛍光標識し、その蛍光を検出することで評価を行うことを特徴とする方法を提供する。 The present invention further provides a method for detecting an oxidized form of a water-insoluble substance, a cornified envelope (keratin hyperplasia), in a horny layer sample derived from skin, wherein the carbonyl group in the oxidized form of the cornified envelope is specifically detected. There is provided a method characterized by performing an evaluation by fluorescently labeling and detecting the fluorescence.
好適な態様において、前記酸化形態のコーニファイドエンベロープにおけるカルボニル基の特異的な蛍光標識は、前記酸化形態のコーニファイドエンベロープにヒドラジノ基含有蛍光物質を作用・結合させることにより実施する。好ましくは、前記ヒドラジノ基含有蛍光物質はフルオレセイン−５−チオセミカルバジド及びテキサスレッドヒドラジドから成る群から選ばれる。 In a preferred embodiment, the specific fluorescent labeling of the carbonyl group in the oxidized form of the conified envelope is carried out by allowing a hydrazino group-containing fluorescent substance to act on and bind to the oxidized form of the conified envelope. Preferably, the hydrazino group-containing fluorescent substance is selected from the group consisting of fluorescein-5-thiosemicarbazide and Texas Red hydrazide.
別の好適な態様において、前記酸化形態のコーニファイドエンベロープにおけるカルボニル基の特異的な蛍光標識は、前記酸化形態のコーニファイドエンベロープにビオチンヒドラジドを作用・結合させ、次いでそれに蛍光標識アビジンを作用・結合させてビオチンヒドラジドと蛍光標識アビジンとの複合体を形成させることにより実施する。好ましくは、前記蛍光標識アビジンはフルオレセイン標識アビジンである。 In another preferred embodiment, the specific fluorescent labeling of the carbonyl group in the oxidized form of the conifinated envelope is such that biotin hydrazide acts on and binds to the oxidized form of the conifined envelope, and then the fluorescently labeled avidin acts and binds thereto. This is performed by forming a complex of biotin hydrazide and fluorescently labeled avidin. Preferably, said fluorescently labeled avidin is fluorescein labeled avidin.
別の好適な態様において、前記酸化形態のコーニファイドエンベロープにおけるカルボニル基の特異的な蛍光標識は、前記酸化形態のコーニファイドエンベロープにジニトロフェニルヒドラジンを作用・結合させ、次いでそれに抗ジニトロフェニル抗体を作用・結合させ、しかる後それに当該抗ジニトロフェニル抗体に特異的な蛍光標識抗体を作用・結合させることにより実施する。 In another preferred embodiment, the specific fluorescent labeling of the carbonyl group in the oxidized form of the cornified envelope is such that dinitrophenylhydrazine acts on and binds to the oxidized form of the cornified envelope, and then an anti-dinitrophenyl antibody is applied thereto. The binding is carried out, and thereafter, a fluorescent-labeled antibody specific to the anti-dinitrophenyl antibody is allowed to act and bind.
更に好ましくは、前記方法は、前記コーニファイドエンベロープの疎水性領域を選択的に染色できる色素で染色して検出する及び／又は当該コーニファイドエンベロープの抗原性を検出することを含んで成る。好ましくは、前記色素はナイルレッドであり、前記抗原性は抗ヒトインボルクリン抗体を使用して検出される。 More preferably, the method comprises detecting the hydrophobic regions of the conified envelope by staining with a dye that can be selectively stained and / or detecting the antigenicity of the conified envelope. Preferably, the dye is Nile Red and the antigenicity is detected using an anti-human involucrin antibody.
更に好ましくは、前記検出は蛍光顕微鏡で行われる。 More preferably, said detection is performed with a fluorescence microscope.
本発明により、皮膚角質層の酸化タンパク質の皮膚上での性状の二次元的な情報を簡易に獲得し、特に化粧品等の販売の際のカウンセリングサービスにおけるかかる酸化タンパク質の情報の活用が図れる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the two-dimensional information of the property of the oxidized protein of the skin stratum corneum on the skin can be easily obtained, and the information of the oxidized protein can be utilized in a counseling service particularly when selling cosmetics and the like.
本発明は、角層酸化タンパク質の角層上での性状を二次元的に評価する方法であって、皮膚から採取した角層試料中の当該酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識し、その蛍光を検出することで評価を行うことを特徴とする方法及びその方法を実施するためのキットを提供する。本発明の方法に従えば、以降の実施例にも示す通り、酸化タンパク質の特異的な蛍光標識が可能となる。 The present invention is a method for two-dimensionally evaluating the properties of the stratum corneum oxidized protein on the stratum corneum, specifically fluorescently labeling the carbonyl group of the oxidized protein in the stratum corneum sample collected from the skin, Provided are a method characterized by performing an evaluation by detecting the fluorescence and a kit for performing the method. According to the method of the present invention, specific fluorescent labeling of an oxidized protein becomes possible as shown in the following examples.
角層は表皮角化細胞が終末分化して形成された角質細胞と、それをとりまく細胞間脂質から構成される。角質細胞は構造タンパク質たるケラチンを主成分とし、それを包むコーニファイドエンベロープ（「角質肥厚膜」）から構成される。角層タンパク質は紫外光、化学系酸化剤、大気汚染物質などの様々な因子に対する暴露や加齢に伴い、酸化を受けた結果カルボニル基が導入される。このような酸化には、タンパク質におけるLys、Arg、Proといったアミノ酸残基のNH2基が直接酸化されてカルボニル基となる場合と、脂質が酸化して過酸化脂質、更には分解して反応性の高いアルデヒドとなり、それがタンパク質と結合することで起こる場合とが考えられる。 The stratum corneum is composed of keratinocytes formed by terminal differentiation of keratinocytes and intercellular lipids surrounding them. Keratinocytes are composed mainly of keratin, a structural protein, and are composed of a cornified envelope ("keratin hyperplasia") that encloses it. The stratum corneum protein is oxidized and introduced with a carbonyl group as a result of oxidation and exposure to various factors such as ultraviolet light, chemical oxidizing agents, and air pollutants, and aging. Such oxidation includes the case where the NH 2 group of amino acid residues such as Lys, Arg, and Pro in the protein is directly oxidized to a carbonyl group, and the case where lipid is oxidized to lipid peroxide and further decomposed to become reactive. Aldehyde, which may be caused by binding to a protein.
本発明において、皮膚由来の角層試料は、身体のいずれの部分に由来する試料でもよく、また、かような試料（組織もしくは細胞）の培養物であってもよい。該試料の由来する身体の部位または領域の典型例としては、顔面の頬、額、手甲および体幹などを挙げることができる。 In the present invention, the skin-derived stratum corneum sample may be a sample derived from any part of the body, or may be a culture of such a sample (tissue or cell). Typical examples of the body part or region from which the sample is derived include the cheeks of the face, forehead, back of hand, and trunk.
このような試料は、所謂、外科的手段等の侵襲的な方法により取得されたものであってもよいが、殊に肌質の評価を目的とする場合には、簡易さを理由に、非侵襲的な方法により皮膚から取得されるものであることが好ましい。非侵襲的な方法としては、当該技術分野で常用されているテープストリッピングや擦過法等を挙げることができる。 Such a sample may be obtained by an invasive method such as a so-called surgical method, but especially for the purpose of evaluating skin quality, it is difficult to use a non-invasive sample because of its simplicity. Preferably, it is obtained from the skin by an invasive method. Non-invasive methods include tape stripping and scraping methods commonly used in the art.
テープストリッピングは、皮膚表層に粘着テープ片を貼付、剥がすことを実施することで、皮膚の二次元的状態をその粘着テープにそのまま転写させることができるため、本発明において特に好ましい。テープストリッピングによりテープ角層を採取し、裁断せずにそのままの状態で酸化タンパク質を特異的に蛍光染色すれば、実際の皮膚の二次元的性状に対応した酸化タンパク質の二次元的情報が得られることとなる。 The tape stripping is particularly preferable in the present invention, since the two-dimensional state of the skin can be transferred to the adhesive tape as it is by applying and peeling the adhesive tape piece to the skin surface layer. If the horny layer of the tape is collected by tape stripping and the oxidized protein is specifically fluorescently stained without cutting, two-dimensional information on the oxidized protein corresponding to the actual two-dimensional properties of the skin can be obtained. It will be.
テープストリッピングの好ましい方法は、まず皮膚の表層を例えばエタノールなどで浄化して皮脂、汚れ等を取り除き、適当なサイズ（例えば5×5cm）に切った粘着テープ片を皮膚表面の上に軽く載せ、テープ全体に均等な力を加えて平たく押さえ付け、その後均等な力で粘着テープを剥ぎ取ることで行われる。粘着テープは市販のセロファンテープなどであってよく、例えばScotch Superstrength Mailing Tape (3M社製）等が使用できる。 A preferred method of tape stripping is to first clean the surface layer of the skin with, for example, ethanol to remove sebum, dirt, etc., and lightly place an adhesive tape piece cut into an appropriate size (for example, 5 × 5 cm) on the skin surface, This is performed by applying a uniform force to the entire tape and pressing it flat, and then peeling off the adhesive tape with an even force. The adhesive tape may be a commercially available cellophane tape, for example, Scotch Superstrength Mailing Tape (manufactured by 3M) or the like can be used.
本発明において利用できる酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識する蛍光物質は、酸化タンパク質のカルボニル基に結合できるヒドラジノ基
―ＮＨＮＨ2
を有するものが好ましい。そのような蛍光物質の例には、フルオレセイン−５−チオセミカルバジド、テキサスレッドヒドラジド、ルシファーイエローヒドラシド等が挙げられる。
The fluorescent substance that specifically fluorescently labels the carbonyl group of the oxidized protein that can be used in the present invention is a hydrazino group that can bind to the carbonyl group of the oxidized protein.
―NHNH 2
Are preferred. Examples of such fluorescent materials include fluorescein-5-thiosemicarbazide, Texas Red hydrazide, Lucifer yellow hydraside, and the like.
このようなヒドラジノ基含有蛍光物質を使用する場合、酸化タンパク質の検出は例えば以下のようにして実施できる：
(1)角層試料を、例えばテープストリッピングにより、採取する；
(2)これに適当な緩衝液（例えば100mMのMES-Na緩衝液（pH5.5））中のヒドラジノ基含有蛍光物質を室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(3)反応終了後に適当な生理溶液（例えば緩衝液リン酸緩衝生理食塩液（PBS)）にて十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡にて酸化タンパク質を検出する；
(4)任意的に、蛍光顕微鏡撮影する。
When such a hydrazino group-containing fluorescent substance is used, detection of an oxidized protein can be performed, for example, as follows:
(1) taking a stratum corneum sample, for example, by tape stripping;
(2) Reaction with a hydrazino group-containing fluorescent substance in a suitable buffer (eg, 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5)) for several hours (eg, 1 hour) at room temperature;
(3) After the reaction is completed, after sufficiently washing with an appropriate physiological solution (for example, a buffered phosphate buffered saline (PBS)), an oxidized protein is detected by a fluorescence microscope;
(4) Optionally, photograph with a fluorescence microscope.
酸化タンパク質の特異的な蛍光標識は、ビオチンヒドラジドと蛍光標識アビジンとの組合わせを用いることもできる。ビオチンヒドラジドもヒドラジノ基を有するため、タンパク質のカルボニル基に結合できる。この場合、まず酸化タンパク質にビオチンヒドラジドを結合させ、しかる後に蛍光標識アビジンをビオチンーアビジン結合を介してビオチンヒドラジドに結合させ、その結果酸化タンパク質は蛍光標識される。ビオチンヒドラジドは当業界においてよく知られ、例えばピアース社から製造販売されているものを使用することができる。また、蛍光アビジンは、例えばフルオレセインアビジンなどが使用できる。 As the specific fluorescent labeling of the oxidized protein, a combination of biotin hydrazide and fluorescently labeled avidin can be used. Since biotin hydrazide also has a hydrazino group, it can bind to a carbonyl group of a protein. In this case, first, biotin hydrazide is bound to the oxidized protein, and then the fluorescently labeled avidin is bound to biotin hydrazide via a biotin-avidin bond, so that the oxidized protein is fluorescently labeled. Biotin hydrazide is well known in the art, and for example, those manufactured and sold by Pierce can be used. As the fluorescent avidin, for example, fluorescein avidin can be used.
このようなヒドラジノ基含有蛍光物質を使用する場合、酸化タンパク質の検出は例えば以下のようにして実施できる：
(1)角層試料を、例えばテープストリッピングにより、採取する；
(2)これに適当な緩衝液（例えば100mMのMES-Na緩衝液（pH5.5））中のビオチンヒドラジドを室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(3)反応終了後に適当な生理溶液（例えば緩衝液リン酸緩衝生理食塩液（PBS)）にて十分に洗浄した後、蛍光標識アビジンを室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(4)蛍光顕微鏡にて酸化タンパク質を検出する；
(5)任意的に、蛍光顕微鏡撮影する。
When such a hydrazino group-containing fluorescent substance is used, detection of an oxidized protein can be performed, for example, as follows:
(1) taking a stratum corneum sample, for example, by tape stripping;
(2) This is reacted with biotin hydrazide in a suitable buffer (eg, 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5)) at room temperature for several hours (eg, 1 hour);
(3) After completion of the reaction, the plate is sufficiently washed with an appropriate physiological solution (for example, a buffer solution of phosphate buffered saline (PBS)), and reacted with fluorescently labeled avidin at room temperature for several hours (for example, 1 hour);
(4) detecting oxidized proteins with a fluorescence microscope;
(5) Optionally, photograph with a fluorescence microscope.
酸化タンパク質の特異的な蛍光標識は、酸化タンパク質のカルボニル基にジニトロフェニルヒドラジンを作用・結合させ、そのジニトロフェニル部分を蛍光色素で標識することで行うこともできる。従って、本発明の更なる好適な態様では、酸化タンパク質のカルボニル基に結合させたジニトロフェニルヒドラジンのジニトロフェニル部分を蛍光免疫測定法等で検出することができる。 Specific fluorescent labeling of the oxidized protein can also be performed by allowing dinitrophenylhydrazine to act on and bind to the carbonyl group of the oxidized protein, and labeling the dinitrophenyl portion with a fluorescent dye. Therefore, in a further preferred embodiment of the present invention, the dinitrophenyl portion of dinitrophenylhydrazine bound to the carbonyl group of the oxidized protein can be detected by a fluorescent immunoassay or the like.
このようなジニトロフェニルヒドラジンを利用して蛍光標識する場合、酸化タンパク質の検出は例えば以下のようにして実施できる：
(1)角層試料を、例えばテープストリッピングにより、採取する；
(2)これに適当な緩衝液（例えば100mMのMES-Na緩衝液（pH5.5）中のジニトロフェニルヒドラジン（DNPH)を室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(3)反応終了後に適当な生理溶液（例えば緩衝液リン酸緩衝生理食塩液（PBS)）にて十分に洗浄した後、抗DNP抗体、例えばウサギDNP抗体（ZYMED社製）の同生理溶液を室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(4)反応終了後に同生理溶液にて十分に洗浄し、上記抗DNP抗体に特異的な蛍光標識抗二次抗体、例えばフルオレセイン標識抗ウサギIg（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等を室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(5)蛍光顕微鏡にて酸化タンパク質を検出する；
(6)任意的に、蛍光顕微鏡撮影する。
In the case of fluorescent labeling using such dinitrophenylhydrazine, detection of an oxidized protein can be performed, for example, as follows:
(1) taking a stratum corneum sample, for example, by tape stripping;
(2) Reaction with dinitrophenylhydrazine (DNPH) in a suitable buffer (eg, 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5)) at room temperature for several hours (eg, 1 hour);
(3) After completion of the reaction, the plate is sufficiently washed with an appropriate physiological solution (for example, a buffered phosphate buffered saline (PBS)), and then an anti-DNP antibody, for example, a rabbit DNP antibody (manufactured by ZYMED) is diluted with the same physiological solution. React for several hours (eg, one hour) at room temperature;
(4) After the completion of the reaction, the plate is sufficiently washed with the same physiological solution, and a fluorescent-labeled anti-secondary antibody specific to the anti-DNP antibody, for example, fluorescein-labeled anti-rabbit Ig (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) or the like is added at room temperature. React for a time (eg, 1 hour);
(5) detecting the oxidized protein with a fluorescence microscope;
(6) Optionally, take a fluorescence microscope image.
本発明に係るキットは、上述の粘着テープ及び蛍光物質の他に、上述の各種評価方法の実施に必要な試薬、例えば各種緩衝剤も一緒に含んでよい。 The kit according to the present invention may contain, in addition to the above-mentioned adhesive tape and fluorescent substance, reagents necessary for carrying out the above-mentioned various evaluation methods, for example, various buffers.
上記の酸化タンパク質の検出方法及びキットを使用することで、酸化タンパク質の皮膚上での二次元的性状、詳しくは存在量、存在箇所、分布状態、例えば散在しているか、局在しているか、等の様々な情報を得ることができ、しかもそれは従来必要とされていたタンパク質の抽出操作、電気泳動操作、ウェスタンブロッティング操作などを必要とせず、高価な機器として蛍光顕微鏡さえあれば実施可能となる。従って、上記の酸化タンパク質の検出方法及びキットは、肌質の評価にとって有力な情報を簡単な操作及び設備で実施できるものとし、例えば化粧品販売の店頭でも簡単に実施することが可能である。 By using the above-described method and kit for detecting an oxidized protein, the two-dimensional properties of the oxidized protein on the skin, specifically the abundance, location, distribution state, for example, scattered or localized, And various other information, such as protein extraction, electrophoresis, western blotting, etc., which were conventionally required, and can be performed with a fluorescence microscope as an expensive device. . Therefore, the above-described method and kit for detecting an oxidized protein can carry out information that is invaluable for skin quality evaluation with simple operation and equipment, and can be easily carried out, for example, at a store selling cosmetics.
本発明は酸化タンパク質の増加を抑制する薬剤のスクリーニング方法も提供する。この方法は、角層、例えば皮膚から採取した角層試料又は皮膚そのものを適当な酸化剤及び候補薬剤で処理し、しかる後に角層上の酸化されたタンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識し、その蛍光を検出することで、当該薬剤の酸化タンパク質の増加を抑制する活性を評価することを特徴とする。酸化剤としては、当業者に周知の様々な酸化剤、例えば次亜塩素酸ナトリウム、不飽和脂肪酸、例えばリノール酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、アルデヒド類、例えばアクロレイン等を使用してよい。角層試料の酸化剤による処理は、候補薬剤による処理と同時に行うか、又は候補薬剤による処理の後に行ってよい。好ましい態様において、角層試料を酸化剤及び候補薬剤で同時に処理する。 The present invention also provides a method for screening a drug that suppresses an increase in oxidized protein. In this method, a stratum corneum, for example, a stratum corneum sample collected from the skin or the skin itself is treated with an appropriate oxidizing agent and a candidate agent, and then the carbonyl group of the oxidized protein on the stratum corneum is specifically fluorescently labeled. By detecting the fluorescence, the activity of suppressing the increase of the oxidized protein of the drug is evaluated. As oxidizing agents, various oxidizing agents well known to those skilled in the art, such as sodium hypochlorite, unsaturated fatty acids such as linoleic acid, oleic acid, palmitoleic acid, aldehydes such as acrolein and the like may be used. The treatment of the stratum corneum sample with the oxidizing agent may be performed simultaneously with the treatment with the candidate agent, or after the treatment with the candidate agent. In a preferred embodiment, the stratum corneum sample is treated simultaneously with the oxidizing agent and the candidate agent.
酸化タンパク質の増加を抑制する薬剤のスクリーニング方法は具体的には、例えば下記のとおりにして実施することができる。
健常人の皮膚、例えば非露光部位たる腹部に粘着テープを貼付して直ちにはがし、角層最外層を非侵襲的に採取する。角層の付着したテープを、酸化剤と一定濃度の候補薬剤が混合した水溶液中でインキュベートする。インキュベート終了後に十分に洗浄した後、酸化されたタンパク質のカルボニル基を上記のとおり特異的に蛍光標識し、十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡などにて観察することで、候補薬剤が、酸化剤による酸化タンパク質の増加をどの程度抑制するかを評価する。評価は、例えば酸化剤のみでインキュベートした時の値と水のみでインキュベートした時の値の中間値まで酸化タンパクの増加を抑制する薬剤の濃度を基準に選定してよく、例えばその濃度が１ｍＭ以下、好ましくは５００μＭ以下、より好ましくは２５０μＭ以下の場合、酸化タンパク質の増加を抑制する薬剤とすることができる。また、酸化タンパク質の増加を抑制する薬剤の効果は、ヒト皮膚へ酸化剤と同時に塗布した後に採取した角層試料の酸化タンパク質の値に基づき評価することもできる。
Specifically, a method for screening a drug that suppresses an increase in oxidized protein can be carried out, for example, as follows.
An adhesive tape is applied to the skin of a healthy person, for example, the abdomen which is a non-exposed site, and immediately peeled off, and the outermost layer of the stratum corneum is collected noninvasively. The tape with the stratum corneum is incubated in an aqueous solution in which an oxidizing agent and a certain concentration of a candidate agent are mixed. After sufficient washing after completion of the incubation, the carbonyl group of the oxidized protein is specifically fluorescently labeled as described above, and after sufficient washing, the candidate agent is identified by the oxidizing agent by observing with a fluorescence microscope or the like. Evaluate how much the increase in oxidized protein is suppressed. For example, the evaluation may be selected based on the concentration of the drug that suppresses the increase of the oxidized protein up to an intermediate value between the value when incubated only with the oxidizing agent and the value when incubated only with water, for example, when the concentration is 1 mM or less. When it is preferably 500 μM or less, more preferably 250 μM or less, it can be used as an agent for suppressing an increase in oxidized protein. In addition, the effect of a drug that suppresses an increase in oxidized protein can also be evaluated based on the value of oxidized protein in a stratum corneum sample collected after being simultaneously applied to human skin with an oxidant.
更に、本発明は皮膚由来の角層試料における水不溶性物質であるコーニファイドエンベロープ（角質肥厚膜）の酸化形態を検出する方法であって、当該酸化形態のコーニファイドエンベロープ、詳しく酸化形態のコーニファイドエンベロープ中の酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識し、その蛍光を検出することで評価を行うことを特徴とする方法を提供する。 Furthermore, the present invention relates to a method for detecting the oxidized form of a conified envelope (keratinous thickened membrane), which is a water-insoluble substance, in a horny layer sample derived from the skin, comprising the oxidized form of the cornified envelope, and in particular, the oxidized form of cornified. Provided is a method characterized in that a carbonyl group of an oxidized protein in an envelope is specifically labeled with a fluorescence, and the fluorescence is detected for evaluation.
上述した通り、角質細胞は、ケラチン線維を主成分とし、それを包むコーニファイドエンベロープから構成される。コーニファイドエンベロープは、表皮角化細胞が分化するにしたがって産生される複数のコーニファイドエンベロープ前駆体タンパクが、酵素トランスグルタミナーゼにより架橋され不溶化して形成されるものである。さらに、その一部には、セラミドなどが共有結合し、疎水的な構造をとることで、前述した細胞間脂質のラメラ構造の土台を供給し角層バリアー機能の基礎を形成することが示唆されている。コーニファイドエンベロープは、皮膚組織または培養皮膚細胞などを、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤およびメルカプトエタノールなどの還元剤を含む溶液中で煮沸し、遠心分離などの手段により可溶性成分を除去した不溶性画分を得ることにより調製できる。これを顕微鏡で形態観察することにより、その性状を評価することができる。Michel らは、角層の最外層に比較して角層の深部においては、脆弱な構造のコーニファイドエンベロープが多いことを報告している（J. Invest. Dermatol 91：11-15，1988）。一方、乾癬や葉状魚鱗癬などでは最外層においても脆弱なコーニファイドエンベロープが認められるとしている（Br. J. Dermatol. 122：15-21、1990）。 As described above, keratinocytes are composed of a keratin fiber as a main component and a cornified envelope surrounding the keratin fiber. The cornified envelope is formed by cross-linking and insolubilizing a plurality of cornified envelope precursor proteins produced as epidermal keratinocytes are differentiated by the enzyme transglutaminase. Furthermore, it is suggested that ceramide and the like covalently bind to some of them, and that they take on a hydrophobic structure, providing the basis for the lamellar structure of intercellular lipids and forming the basis of the stratum corneum barrier function. ing. Cornified envelope is obtained by boiling skin tissue or cultured skin cells in a solution containing a surfactant such as sodium dodecyl sulfate and a reducing agent such as mercaptoethanol, and removing soluble components by means such as centrifugation. Can be prepared. By observing the form with a microscope, its properties can be evaluated. Michel et al. Report that there is more cornified envelope with a weak structure deep in the stratum corneum than in the outermost layer of the stratum corneum (J. Invest. Dermatol 91: 11-15, 1988). On the other hand, in psoriasis and ichthyosis, a weak cornified envelope is also found in the outermost layer (Br. J. Dermatol. 122: 15-21, 1990).
角層バリアー機能、殊に、体内からの水分の蒸散や外界からの異物の混入を防ぐ機能の主体をなすと考えられている脂質とコーニファイドエンベロープとの関連性、あるいはコーニファイドエンベロープの性状が注目され、その評価方法も開示されている（特開2001-91514号公報）。しかしながら、従来技術において、コーニファイドエンベロープの酸化形態の評価に関する報告はされていなかった。上述の通りコーニファイドエンベロープもタンパク質から構成されるため、本発明に係る角層酸化タンパク質の検出方法を適用することにより、その酸化形態が同様にして検出できた。 The relationship between the lipid and the cornified envelope, which is considered to be the main function of the stratum corneum barrier function, especially the function of preventing the evaporation of water from the body and the contamination of foreign matter from the outside, or the properties of the cornified envelope Attention has been paid, and its evaluation method is also disclosed (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-91514). However, there was no report in the prior art regarding the evaluation of the oxidized form of the conified envelope. As described above, the cornified envelope is also composed of a protein. Therefore, by applying the method for detecting a stratum corneum oxidized protein according to the present invention, its oxidized form can be similarly detected.
コーニファイドエンベロープの酸化形態の具体的な評価方法は、例えば以下のようにして実施できる：
(1)角層試料を、例えばテープストリッピングにより、採取する；
(2)これに適当な緩衝液（例えば100mMのMES-Na緩衝液（pH5.5））中のビオチンヒドラジドを室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(3)反応終了後に、水不溶性画分たるコーニファイドエンベロープを、水性抽出液（例えば2％のドデシル硫酸ナトリウム、20mMのジチオスレイトール、5mMのEDTAを含む0.1Mのトリス塩酸塩緩衝液（pH8.5））を加えて加熱処理し（例えば100℃にて10分）、不溶物を遠心分離（例えば4,000g、10分間）して、コーニファイドエンベロープとして集める；
(4)(3)の操作を任意に繰り返して、可溶性成分を徹底的に除去する；
(5)コーニファイドエンベロープ浮遊液をスライドガラスに滴下し、風乾、アセトン固定の後、適当な生理溶液（例えば緩衝液リン酸緩衝生理食塩液（PBS)）にて十分に洗浄し、次に蛍光標識アビジンを室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(6)反応終了後に同生理溶液で十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡にて酸化コーニファイドエンベロープを検出する；
(7)任意的に、蛍光顕微鏡撮影する。
A specific method for evaluating the oxidized form of the conified envelope can be carried out, for example, as follows:
(1) taking a stratum corneum sample, for example, by tape stripping;
(2) This is reacted with biotin hydrazide in a suitable buffer (eg, 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5)) at room temperature for several hours (eg, 1 hour);
(3) After completion of the reaction, the water-insoluble fraction, the cornified envelope, was added to an aqueous extract (eg, 0.1 M Tris hydrochloride buffer (pH 8) containing 2% sodium dodecyl sulfate, 20 mM dithiothreitol, and 5 mM EDTA. .5)) and heat-treated (eg, at 100 ° C. for 10 minutes), and the insoluble matter is centrifuged (eg, 4,000 g, 10 minutes) to collect as a conified envelope;
(4) optionally repeating step (3) to thoroughly remove soluble components;
(5) Drop the suspended suspension of Cornified Envelope onto a slide glass, air-dry, fix with acetone, wash thoroughly with an appropriate physiological solution (for example, buffered phosphate buffered saline (PBS)), and then Reacting labeled avidin at room temperature for several hours (eg 1 hour);
(6) After completion of the reaction, after sufficiently washing with the same physiological solution, an oxidized conified envelope is detected by a fluorescence microscope;
(7) Optionally, photograph with a fluorescence microscope.
上記酸化コーニファイドエンベロープの検出方法において、任意的に、コーニファイドエンベロープ成熟形態を評価するため、疎水的領域を選択的に染色する色素による染色を行ったり、またコーニファイドエンベロープ未熟形態を評価するため、インボルクリン抗体に対する抗原性の検出を併せて実施してもよい。 In the method for detecting an oxidized corniform envelope, optionally, in order to evaluate the mature form of the corniform envelope, to perform staining with a dye that selectively stains the hydrophobic region, or to evaluate the immature form of the corniform envelope Alternatively, the antigenicity of the involucrin antibody may be detected.
疎水性領域（特に、生物組織における）を選択的に染色できる色素としては、各種疎水性領域の染色に使用されているものが使用することができる。このような色素の具体的なものとしては、ナイルレッド（Nile Red）、オイルレッドＯ（Oil Red Ｏ）、スダンIII（Sudan III）を挙げることができる。特にナイルレッドを好適に使用することができる。ナイルレッドは、その還元型であるナイルブルーとの混合物であってもよい。このような混合物には、ナイルブルーの水溶液中でナイルブルーの一部が自然に酸化されてナイルレッドに転化している状態のものも包含される。 As a dye capable of selectively staining a hydrophobic region (particularly, in a biological tissue), those used for staining various hydrophobic regions can be used. Specific examples of such dyes include Nile Red, Oil Red O, and Sudan III. In particular, Nile Red can be suitably used. Nile red may be a mixture with its reduced form, Nile Blue. Such mixtures include those in which a part of Nile Blue is naturally oxidized and converted to Nile Red in an Nile Blue aqueous solution.
コーニファイドエンベロープの構成タンパク質の抗原性を検出するための対象となるタンパク質としては、インボルクリン、ロリクリンなどの脂質が共有結合しうるタンパク質やタンパク質間の架橋結合であるイソペプチド、シュウドイソペプチドを挙げることができる。これらの抗原性は、これらのタンパク質またはペプチドに対する抗体を使用して検出することができる。検出方法は、上記タンパク質またはペプチドへの抗体の結合を検出できる方法であれば、いかなる方法であってもよいが、組織標本中の酵素、構造タンパク質などの抗原物質を標識または染色するのに使用されている蛍光抗体法が好適である。抗体の蛍光標識としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）などを使用するのがよい。 Examples of the target protein for detecting the antigenicity of the constituent proteins of the conified envelope include proteins to which lipids such as involucrin and loricrin can be covalently bonded, isopeptides that are cross-links between proteins, and pseudoisopeptides. be able to. These antigenicities can be detected using antibodies against these proteins or peptides. The detection method may be any method as long as it can detect the binding of the antibody to the protein or peptide, and may be used for labeling or staining an antigenic substance such as an enzyme or a structural protein in a tissue specimen. The fluorescent antibody method described is preferred. As the fluorescent label of the antibody, for example, fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) and the like are preferably used.
コーニファイドエンベロープの性状の評価方法によれば、例えば、抗原性の検出方法により角層試料におけるコーニファイドエンベロープのインボルクリンが有意に検出できる場合は、有意量（または識別可能な程度）までには、脂質がインボルクリンに共有結合していないか、あるいは架橋反応が十分でなく抗原性を保持していることを意味し、角層試料におけるコーニファイドエンベロープは未熟な状態にあると評価できる。逆に、例えば、インボルクリンが有意には検出できない場合には、脂質のインボルクリンへの共有結合がかなり生じているか、あるいは架橋反応が十分に進み抗原性が消失しており、コーニファイドエンベロープは成熟した状態にあると評価できる。また、例えば、ナイルレッドで強陽性に染色されるコーニファイドエンベロープが角層試料中に検出（または観察）される場合には、コーニファイドエンベロープは強靭な状態であると評価できる。逆に、ナイルレッドによる染色性に多様性が認められる場合には、コーニファイドエンベロープ形成過程にばらつきがあると評価できる。以上の評価は培養した表皮角化細胞におけるコーニファイドエンベロープ形成過程にも同様に適用できる。 According to the method for evaluating the properties of the conified envelope, for example, when involucrin of the conified envelope in the stratum corneum sample can be significantly detected by the antigenicity detection method, a significant amount (or a recognizable degree) This means that the lipid is not covalently bound to involucrin or the cross-linking reaction is not sufficient and the antigenicity is maintained, and it can be evaluated that the conified envelope in the stratum corneum sample is in an immature state. Conversely, if, for example, involucrin is not significantly detectable, the covalent binding of the lipid to involucrin has occurred considerably, or the cross-linking reaction has proceeded sufficiently and the antigenicity has disappeared, and the conified envelope has matured. We can evaluate that we are in state. In addition, for example, when a cornified envelope that stains strongly positively with Nile Red is detected (or observed) in a stratum corneum sample, the cornified envelope can be evaluated as being in a tough state. Conversely, if there is diversity in the dyeability with Nile Red, it can be evaluated that there is variation in the process of forming the cornified envelope. The above evaluation can be similarly applied to the formation process of the conified envelope in cultured epidermal keratinocytes.
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
ビオチンヒドラジドによる角層酸化タンパク質の検出
健常人の顔面及び上腕内側に、透明な粘着テープを貼付して直ちに剥がし、角層最外層を非侵襲的に採取した。これに5ｍＭのビオチンヒドラジド（PIERCE社製）の100ｍＭのMES-Na緩衝液（pH5.5）を室温にて１時間反応させた。反応終了後にリン酸緩衝生理食塩液（PBS)にて十分に洗浄し、次にフルオレセイン標識アビジン（アマシャムファルマシアバイオテク社製；PBSにて1：100容量に希釈）を室温にて１時間反応させた。反応終了後にPBSにて十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡（オリンパス社BX52）にて観察した。図１にその観察像を示す。
図１に示す通り、上腕内側及び顔面のいずれにおいても蛍光が観察され、ビオチンヒドラジド−フルオレセイン標識アビジンにより酸化タンパク質は十分に標識され、検出可能であることが示唆された。
The present invention is described in more detail by the following examples.
Example 1
Detection of stratum corneum oxidized protein using biotin hydrazide A transparent adhesive tape was applied to the face and the inner side of the upper arm of a healthy person and immediately peeled off, and the outermost layer of the stratum corneum was noninvasively collected. This was reacted with 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5) containing 5 mM biotin hydrazide (manufactured by PIERCE) at room temperature for 1 hour. After the completion of the reaction, the plate was sufficiently washed with a phosphate buffered saline (PBS), and then reacted with fluorescein-labeled avidin (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech; diluted 1: 100 in PBS) at room temperature for 1 hour. . After the reaction was completed, the cells were sufficiently washed with PBS, and observed with a fluorescence microscope (Olympus BX52). FIG. 1 shows the observed image.
As shown in FIG. 1, fluorescence was observed on both the inside of the upper arm and the face, suggesting that the oxidized protein was sufficiently labeled with biotin hydrazide-fluorescein-labeled avidin and was detectable.
実施例２
テキサスレッドヒドラジドによる角層酸化タンパク質の検出
健常人の顔面（頬）及び上腕内側に、透明な粘着テープを貼付して直ちに剥がし、角層最外層を非侵襲的に採取した。これに20μＭのテキサスレッドヒドラジド（モレキュラープローブス社製）の100ｍＭのMES-Na緩衝液（pH5.5）を室温にて１時間反応させた。反応終了後にリン酸緩衝生理食塩液（PBS)にて十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡にて観察した。図２にその観察像を示す。
図２に示す通り、上腕内側及び顔面のいずれにおいても蛍光が観察され、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドと同様に酸化タンパク質はテキサスレッドヒドラジドによっても標識されることが明らかとなった。
Example 2
Detection of stratum corneum oxidized protein by Texas Red Hydrazide A transparent adhesive tape was applied to the face (cheek) and the inner side of the upper arm of a healthy person and immediately peeled off, and the outermost layer of the stratum corneum was noninvasively collected. This was reacted with 20 μM of Texas Red Hydrazide (Molecular Probes) 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5) for 1 hour at room temperature. After the completion of the reaction, the cells were sufficiently washed with a phosphate buffered saline (PBS) and then observed with a fluorescence microscope. FIG. 2 shows the observed image.
As shown in FIG. 2, fluorescence was observed both on the inner side of the upper arm and on the face, which revealed that the oxidized protein was also labeled with Texas Red Hydrazide, similarly to fluorescein-5-thiosemicarbazide.
実施例３
ジニトロフェニルヒドラジン（DNPH)による角層酸化タンパク質の検出
健常人の顔面及び上腕内側に、透明な粘着テープを貼付して直ちに剥がし、角層最外層を非侵襲的に採取した。これに200μＭのジニトロフェニルヒドラジン（和光純薬工業（株）社製）の100ｍＭのMES-Na緩衝液（pH5.5）を室温にて１時間反応させた。反応終了後にリン酸緩衝生理食塩液（PBS)にて十分に洗浄し、次にウサギDNP抗体（ZYMED社製）のPBS溶液（1μg/ml）を室温にて１時間反応させた。反応終了後にPBSにて十分に洗浄し、フルオレセイン標識抗ウサギIg（アマシャムファルマシアバイオテク社製；PBSにて1：100に希釈）を室温にて１時間反応させた。反応終了後にPBSにて十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡にて観察した。図３にその観察像を示す。
図３に示す通り、上腕内側及び顔面のいずれにおいても蛍光が観察され、ジニトロフェニルヒドラジンを用いても、ビオチンヒドラジド、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドやテキサスレッドヒドラジドと同様に、酸化タンパク質を特異的に標識できることがわかった。
Example 3
Detection of stratum corneum oxidized protein by dinitrophenylhydrazine (DNPH) A transparent adhesive tape was applied to the face and inner side of the upper arm of a healthy person and immediately peeled off, and the outermost layer of the stratum corneum was noninvasively collected. This was reacted with a 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5) of 200 μM dinitrophenylhydrazine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, the plate was sufficiently washed with phosphate buffered saline (PBS), and then reacted with a rabbit DNP antibody (ZYMED) in PBS (1 μg / ml) at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, the plate was sufficiently washed with PBS, and reacted with fluorescein-labeled anti-rabbit Ig (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech; diluted 1: 100 with PBS) at room temperature for 1 hour. After the reaction was completed, the cells were sufficiently washed with PBS and then observed with a fluorescence microscope. FIG. 3 shows the observation image.
As shown in FIG. 3, fluorescence was observed both on the inner side of the upper arm and on the face. It turned out that it could be labeled.
実施例４
アセトン処理した角層の酸化タンパク質の評価
４人の健常人の顔面に透明な粘着テープを貼付して直ちに剥がし、角層最外層を非侵襲的に採取し、一人当たり三つの試料を用意した。一つの試料は30分アセトン処理を施し、他の二つの試料は処理を施さなかった（ここでアセトン処理した試料を「アセトン→標識」試料とし、他の二つは「標識のみ」又は「標識→アセトン」試料とする）。それぞれに20μＭのフルオレセイン−５−チオセミカルバジド（モレキュラープローブス社製）の100ｍＭのMES-Na緩衝液（pH5.5）を室温にて１時間反応させた。反応終了後にリン酸緩衝生理食塩液（PBS)にて十分に洗浄し、「標識→アセトン」試料のみアセトンで30分処理した。次いで、それぞれの試料について蛍光顕微鏡にて観察した。画像から背景と細胞を分離し、それぞれの平均輝度を求めることで酸化タンパク質の量を数値化した。図４にその数値化したグラフを示す。
図４から、テープ角層をアセトン処理してもシグナル強度に有意な変化が認められないことがわかった。従って、蛍光ヒドラジドが標識するカルボニル基は、大部分が酸化タンパク質由来であり、角層に存在する過酸化脂質の割合は小さいことが示唆された。
よって、本願発明は角層中の酸化タンパク質を検出するのに極めて有利であることが示唆された。
Example 4
Evaluation of oxidized protein in the stratum corneum treated with acetone A transparent adhesive tape was applied to the faces of four healthy persons and immediately peeled off, and the outermost layer of the stratum corneum was non-invasively collected to prepare three samples per person. One sample was treated with acetone for 30 minutes, and the other two samples were not treated (here, the sample treated with acetone was referred to as “acetone → labeled” sample, and the other two were labeled “label only” or “labeled”). → "Acetone" sample). A 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5) containing 20 μM of fluorescein-5-thiosemicarbazide (manufactured by Molecular Probes) was reacted for 1 hour at room temperature. After the completion of the reaction, the sample was sufficiently washed with a phosphate buffered saline (PBS), and only the “labeled → acetone” sample was treated with acetone for 30 minutes. Next, each sample was observed with a fluorescence microscope. The amount of oxidized protein was quantified by separating the background and the cells from the image and calculating the average brightness of each. FIG. 4 shows a graph of the numerical value.
From FIG. 4, it was found that no significant change was observed in the signal intensity even when the tape horny layer was treated with acetone. Therefore, it was suggested that most of the carbonyl groups labeled by the fluorescent hydrazide were derived from oxidized proteins, and that the proportion of lipid peroxide present in the stratum corneum was small.
Therefore, it was suggested that the present invention is extremely advantageous for detecting an oxidized protein in the stratum corneum.
実施例５
フルオレセイン−５−チオセミカルバジドによる角層酸化タンパク質の部位差の検出
健常人の顔面（頬）及び上腕内側に、透明な粘着テープを貼付して直ちに剥がし、角層最外層を非侵襲的に採取した。これに20μＭのフルオレセイン−５−チオセミカルバジド（モレキュラープローブス社製）の100ｍＭのMES-Na緩衝液（pH5.5）を室温にて１時間反応させた。反応終了後にリン酸緩衝生理食塩液（PBS)にて十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡にて観察した。数値化し際しては、画像から背景と細胞を分離し、それぞれの平均輝度を求めた。図５にその観察像と数値化したグラフを示す。
図５に示す通り、上腕内側及び顔面のいずれにおいても蛍光が観察され、観察像からも、数値化したグラフからも、頬、即ち、露光部における酸化タンパク質の量が、上腕内側、即ち非露光部よりも多いことが明らかであり、J.J.Thiele et al. FEBS Letter 1998 Feb 6, 422(3), 403-406の見解と一致した。従って、ビオチンヒドラジド−フルオレセイン標識アビジンにより酸化タンパク質は十分に標識され、検出可能であることが明らかとなった。
Example 5
Detection of site difference of stratum corneum oxidized protein by fluorescein-5-thiosemicarbazide A transparent adhesive tape was applied to the face (cheek) and the inner side of the upper arm of a healthy person and immediately peeled off, and the outermost layer of the stratum corneum was noninvasively collected . A 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5) containing 20 μM fluorescein-5-thiosemicarbazide (manufactured by Molecular Probes) was reacted at room temperature for 1 hour. After the completion of the reaction, the cells were sufficiently washed with a phosphate buffered saline (PBS) and then observed with a fluorescence microscope. When digitizing, the background and the cells were separated from the image, and the average luminance of each was determined. FIG. 5 shows the observation image and a digitized graph.
As shown in FIG. 5, fluorescence was observed both on the inner side of the upper arm and on the face. From the observed image and the digitized graph, the amount of oxidized protein in the cheek, ie, the exposed area, was lower than the inner arm, It is clear that the number is higher than that of the FEBS Letter, JJ Thiele et al. FEBS Letter 1998 Feb 6, 422 (3), 403-406. Therefore, it was revealed that the oxidized protein was sufficiently labeled with biotin hydrazide-fluorescein-labeled avidin and was detectable.
実施例６
フルオレセイン−５−チオセミカルバジドによる角層最外層と内層の酸化タンパク質の検出
健常人の上腕内側に、透明な粘着テープを貼付して直ちに剥がし、これを20回繰り返し、角層最外層と20枚目の角層を採取した。これに20μＭのフルオレセイン−５−チオセミカルバジド（モレキュラープローブス社製）の100ｍＭのMES-Na緩衝液（pH5.5）を室温にて１時間反応させた。反応終了後にリン酸緩衝生理食塩液（PBS)にて十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡にて観察した。数値化し際しては、画像から背景と細胞を分離し、それぞれの平均輝度を求めた。図６にその観察像と数値化したグラフを示す。
図６に示す通り、観察像からも、数値化したグラフからも、酸化タンパク質は最外層のほうが20枚目の角層よりも多く、従って酸化タンパク質は角層上層ほど多いことが認められ、J.J.Thiele et al. J. Invest. Dermatol. 1999, Sep, 113(3), 335-359の所見と一致した。
Example 6
Fluorescein-5-thiosemicarbazide for detection of oxidized proteins in the outermost layer and inner layer of the stratum corneum A transparent adhesive tape was applied to the inside of the upper arm of a healthy person and immediately peeled off. Was collected. A 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5) containing 20 μM fluorescein-5-thiosemicarbazide (manufactured by Molecular Probes) was reacted at room temperature for 1 hour. After the completion of the reaction, the cells were sufficiently washed with a phosphate buffered saline (PBS) and then observed with a fluorescence microscope. When digitizing, the background and the cells were separated from the image, and the average luminance of each was determined. FIG. 6 shows the observed image and a digitized graph.
As shown in FIG. 6, both the observation image and the digitized graph show that the outermost layer has more oxidized protein than the twentieth stratum corneum, and that the oxidized protein is more in the upper stratum corneum. et al. J. Invest. Dermatol. 1999, Sep, 113 (3), 335-359.
実施例７
紫外線照射による角層酸化タンパク質の増加
健常人の上腕内側に、透明な粘着テープを貼付して直ちに剥がし、角層最外層を非侵襲的に採取した。角層の付着したテープは、UVA（240J/cm2)及びUVB（77J/cm2)照射した後に、20μＭのフルオレセイン−５−チオセミカルバジド（モレキュラープローブス社製）の100ｍＭのMES-Na緩衝液（pH5.5）を室温にて１時間反応させた。反応終了後にリン酸緩衝生理食塩液（PBS)にて十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡にて観察した。図７にその観察像を示す。紫外線照射による酸化タンパク質の増加が認められ、その結果はC.S.Sander et al. J. Invest. Dermatol. 2002, Apr, 118(4), 618-625のものと一致した。
Example 7
Increase of stratum corneum oxidized protein by ultraviolet irradiation A transparent adhesive tape was applied to the inside of the upper arm of a healthy person and immediately peeled off, and the outermost layer of the stratum corneum was noninvasively collected. The tape with the stratum corneum adhered thereto was irradiated with UVA (240 J / cm 2 ) and UVB (77 J / cm 2 ), and then irradiated with 20 μM fluorescein-5-thiosemicarbazide (Molecular Probes) in 100 mM MES-Na buffer. (PH 5.5) for 1 hour at room temperature. After the completion of the reaction, the cells were sufficiently washed with a phosphate buffered saline (PBS) and then observed with a fluorescence microscope. FIG. 7 shows the observed image. An increase in oxidized proteins due to UV irradiation was observed, and the results were consistent with those of CSSander et al. J. Invest. Dermatol. 2002, Apr, 118 (4), 618-625.
実施例８
紫外線照射による角層酸化タンパク質の増加
健常人の背中に２MEDのUVBを照射してから１０日後に、照射部位に透明な粘着テープを貼付して直ちにはがし、角層最外層を非侵襲的に採取した。角層の付着したテープは、２０μＭ フルオレセイン−５−チオセミカルバジド（モレキュラープローブズ社製）の100 ｍＭ MES-Na緩衝液（ｐＨ５．５）を室温にて１時間反応させた。反応終了後にリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）にて十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡にて観察した。図８にその観察像と数値化したグラフを示す。照射前と比較して、紫外線照射による酸化タンパク質の増加が認められた。
Example 8
Increase of stratum corneum oxidized protein by ultraviolet irradiation Ten days after irradiating 2MED UVB to the back of a healthy person, apply a transparent adhesive tape to the irradiated area and immediately peel off, non-invasively collecting the outermost layer of the stratum corneum did. The tape with the stratum corneum attached thereto was reacted with a 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5) containing 20 µM fluorescein-5-thiosemicarbazide (manufactured by Molecular Probes) at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, the cells were sufficiently washed with a phosphate buffered saline (PBS), and then observed with a fluorescence microscope. FIG. 8 shows the observed image and a digitized graph. An increase in oxidized protein due to ultraviolet irradiation was observed as compared to before irradiation.
実施例９
次亜塩素酸ナトリウムと不飽和脂肪酸による角層酸化タンパク質の増加
健常人の腹部に、透明な粘着テープを貼付して直ちにはがし、角層最外層を非侵襲的に採取した。角層の付着したテープは、２００μg／ｃｍ2の量の不飽和脂肪酸（リノール酸、オレイン酸、パルミトレイン酸）を塗布後、０．２ｍＭの次亜塩素酸ナトリウム水溶液中で３７℃、１８時間インキュベートした。インキュベート終了後にリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）にて十分に洗浄した後、２０μＭ フルオレセイン−５−チオセミカルバジド（モレキュラープローブズ社製）の100 ｍＭ MES-Na緩衝液（ｐＨ５．５）を室温にて１時間反応させた。反応終了後にリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）にて十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡にて観察した。図９にその観察像と数値化したグラフを示す。水でインキュベートした場合と比較して、次亜塩素酸ナトリウムによるインキュベートでは酸化タンパク質の増加が認められた。また、不飽和脂肪酸を角層付着テープに塗布して次亜塩素酸ナトリウム中でインキュベートすることにより、酸化タンパク質の更なる増加が認められた。
Example 9
Increase of horny layer oxidized protein by sodium hypochlorite and unsaturated fatty acid A transparent adhesive tape was stuck to the abdomen of a healthy person, immediately peeled off, and the outermost layer of the horny layer was noninvasively collected. The tape with the stratum corneum adhered thereto was coated with an unsaturated fatty acid (linoleic acid, oleic acid, palmitoleic acid) in an amount of 200 μg / cm 2 and then incubated in a 0.2 mM sodium hypochlorite aqueous solution at 37 ° C. for 18 hours. did. After completion of the incubation, the plate was sufficiently washed with a phosphate buffered saline (PBS), and then a 20 mM fluorescein-5-thiosemicarbazide (manufactured by Molecular Probes) 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5) was added at room temperature. For 1 hour. After completion of the reaction, the cells were sufficiently washed with a phosphate buffered saline (PBS), and then observed with a fluorescence microscope. FIG. 9 shows the observed image and a digitized graph. An increase in oxidized protein was observed in the incubation with sodium hypochlorite as compared to the incubation with water. Further, when the unsaturated fatty acid was applied to the horny layer-adhering tape and incubated in sodium hypochlorite, a further increase in the oxidized protein was observed.
実施例１０
次亜塩素酸ナトリウムによる角層酸化タンパク質の増加
健常人の前腕に２０ｍＭ次亜塩素酸ナトリウム水溶液を２μL／ｃｍ2の量で５日間連日塗布し、透明な粘着テープを貼付して直ちにはがし、角層最外層を非侵襲的に採取した。角層の付着したテープは、２０μＭ フルオレセイン−５−チオセミカルバジド（モレキュラープローブズ社製）の100 ｍＭ MES-Na緩衝液（ｐＨ５．５）を室温にて１時間反応させた。反応終了後にリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）にて十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡にて観察した。図１０にその観察像と数値化したグラフを示す。次亜塩素酸ナトリウム連日塗布による酸化タンパク質の増加が認められた。
Example 10
Increase of horny layer oxidized protein by sodium hypochlorite A 20 mM sodium hypochlorite aqueous solution was applied to the forearm of a healthy person every day for 5 days at a volume of 2 μL / cm 2 , and a transparent adhesive tape was stuck off immediately. The outermost layer was collected non-invasively. The tape with the stratum corneum attached thereto was reacted with a 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5) containing 20 µM fluorescein-5-thiosemicarbazide (manufactured by Molecular Probes) at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, the cells were sufficiently washed with a phosphate buffered saline (PBS), and then observed with a fluorescence microscope. FIG. 10 shows the observed image and a numerical graph. An increase in oxidized protein due to daily application of sodium hypochlorite was observed.
実施例１１
不飽和脂肪酸による角層酸化タンパク質の増加
健常人の前腕に３０％リノール酸エタノール溶液を４０μL／ｃｍ2の量で３日間連日塗布し、透明な粘着テープを貼付して直ちにはがし、角層最外層を非侵襲的に採取した。角層の付着したテープは、２０μＭ フルオレセイン−５−チオセミカルバジド（モレキュラープローブズ社製）の100 ｍＭ MES-Na緩衝液（ｐＨ５．５）を室温にて１時間反応させた。反応終了後にリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）にて十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡にて観察した。図１１にその観察像と数値化したグラフを示す。リノール酸連日塗布による酸化タンパク質の増加が認められた。
Example 11
Increase of stratum corneum oxidized protein by unsaturated fatty acids A 30% linoleic acid ethanol solution is applied to the forearm of a healthy person every day for 3 days at a volume of 40 μL / cm 2 , and a transparent adhesive tape is stuck off immediately, and the outermost layer of the stratum corneum is removed. Were collected non-invasively. The tape with the stratum corneum attached thereto was reacted with a 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5) containing 20 µM fluorescein-5-thiosemicarbazide (manufactured by Molecular Probes) at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, the cells were sufficiently washed with a phosphate buffered saline (PBS), and then observed with a fluorescence microscope. FIG. 11 shows the observed image and a digitized graph. An increase in oxidized protein due to daily application of linoleic acid was observed.
実施例１２
アルデヒドによる角層酸化タンパク質の増加
健常人の腹部に、透明な粘着テープを貼付して直ちにはがし、角層最外層を非侵襲的に採取した。角層の付着したテープは、１ｍＭアクロレイン水溶液中で室温で１８時間インキュベートした。インキュベート終了後にリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）にて十分に洗浄した後、２０μＭ フルオレセイン−５−チオセミカルバジド（モレキュラープローブズ社製）の100 ｍＭ MES-Na緩衝液（ｐＨ５．５）を室温にて１時間反応させた。反応終了後にリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）にて十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡にて観察した。図１２にその観察像と数値化したグラフを示す。アクロレインによる酸化タンパク質の増加が認められた。
Example 12
Increase of horny layer oxidized protein by aldehyde A transparent adhesive tape was stuck to the abdomen of a healthy person, immediately peeled off, and the outermost layer of the horny layer was collected noninvasively. The tape with the stratum corneum was incubated for 18 hours at room temperature in a 1 mM aqueous acrolein solution. After completion of the incubation, the plate was sufficiently washed with a phosphate buffered saline (PBS), and then a 20 mM fluorescein-5-thiosemicarbazide (manufactured by Molecular Probes) 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5) was added at room temperature. For 1 hour. After completion of the reaction, the cells were sufficiently washed with a phosphate buffered saline (PBS), and then observed with a fluorescence microscope. FIG. 12 shows the observed image and a digitized graph. Increase of oxidized protein by acrolein was observed.
実施例１３
薬剤による角層酸化タンパク質の増加の抑制
健常人の腹部に、透明な粘着テープを貼付して直ちにはがし、角層最外層を非侵襲的に採取した。角層の付着したテープは、０．２ｍＭ次亜塩素酸ナトリウムと一定濃度の薬剤が混合した水溶液中で３７℃、１８時間インキュベートした。インキュベート終了後にリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）にて十分に洗浄した後、２０μM フルオレセイン−５−チオセミカルバジド（モレキュラープローブズ社製）の100 ｍＭ MES-Na緩衝液（ｐＨ５．５）を室温にて１時間反応させた。反応終了後にリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）にて十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡にて観察した。薬剤により、次亜塩素酸ナトリウムによる酸化タンパク質の増加が抑制されることが示された。次亜塩素酸ナトリウムのみでインキュベートした時の値と水のみでインキュベートした時の値の中間値まで酸化タンパクの増加が抑制される各種薬剤の濃度を表１に示す。
Example 13
Suppression of increase in horny layer oxidized protein by drug A transparent adhesive tape was applied to the abdomen of a healthy person, immediately peeled off, and the outermost layer of the horny layer was collected noninvasively. The tape with the stratum corneum adhered thereto was incubated at 37 ° C. for 18 hours in an aqueous solution in which 0.2 mM sodium hypochlorite and a certain concentration of a drug were mixed. After completion of the incubation, the plate was sufficiently washed with a phosphate buffered saline (PBS), and a 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5) containing 20 μM fluorescein-5-thiosemicarbazide (manufactured by Molecular Probes) was added to a room temperature. For 1 hour. After completion of the reaction, the cells were sufficiently washed with a phosphate buffered saline (PBS), and then observed with a fluorescence microscope. The drug was shown to suppress the increase in oxidized proteins by sodium hypochlorite. Table 1 shows the concentrations of various drugs that suppress the increase in oxidized protein to an intermediate value between the value when incubated only with sodium hypochlorite and the value when incubated only with water.
実施例１４
ビオチンヒドラジドによる酸化コーニファイドエンベロープの検出
健常人の顔面及び上腕内側に、透明な粘着テープを貼付して直ちに剥がし、角層最外層を非侵襲的に採取した。これに5ｍＭのビオチンヒドラジド（PIERCE社コーニファイドエンベロープ社製）の100ｍＭのMES-Na緩衝液（pH5.5）を室温にて１時間反応させた。反応終了後に2％のドデシル硫酸ナトリウム、20mMのジチオスレイトール、5mMのEDTAを含む0.1Ｍのトリス塩酸塩緩衝液（pH8.5）を加えて100℃にて10分加熱した。不溶物を、4,000g、10分間の遠心分離により集めた。さらに溶出液添加と加熱を繰り返して、可溶性成分を徹底的に除去した。こうして得られた不溶物をコーニファイドエンベロープとした。コーニファイドエンベロープ浮遊液をスライドガラスに滴下し、風乾、アセトン固定の後、リン酸緩衝生理食塩液（PBS)にて十分に洗浄し、次にフルオレセイン標識アビジン（アマシャムファルマシアバイオテク社製；PBSにて1：100に希釈）を室温にて１時間反応させた。反応終了後にPBSにて十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡にて観察した。図１３にその観察像を示す。
図１３より、酸化形態のコーニファイドエンベロープ（酸化コーニファイドエンベロープ)の検出が認められ、それは非露光部たる上腕内側よりも、露光部たる顔面の角層に多く存在することが認められた。
Example 14
Detection of Oxidized Cornified Envelope by Biotin Hydrazide A transparent adhesive tape was applied to the face and the inner side of the upper arm of a healthy person and immediately peeled off, and the outermost layer of the stratum corneum was noninvasively collected. This was reacted with a 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5) containing 5 mM biotin hydrazide (manufactured by PIERCE, Cornified Envelope) at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, 0.1 M Tris hydrochloride buffer (pH 8.5) containing 2% sodium dodecyl sulfate, 20 mM dithiothreitol, and 5 mM EDTA was added, and the mixture was heated at 100 ° C. for 10 minutes. Insolubles were collected by centrifugation at 4,000 g for 10 minutes. Further, the addition of eluate and heating were repeated to thoroughly remove soluble components. The insoluble matter thus obtained was used as a cornified envelope. The cornified envelope suspension was dropped on a slide glass, air-dried, fixed with acetone, washed thoroughly with phosphate buffered saline (PBS), and then fluorescein-labeled avidin (Amersham Pharmacia Biotech; PBS) (Diluted 1: 100) at room temperature for 1 hour. After the reaction was completed, the cells were sufficiently washed with PBS and then observed with a fluorescence microscope. FIG. 13 shows the observed image.
From FIG. 13, it was confirmed that the oxidized corniform envelope (oxidized cornified envelope) was detected, and it was recognized that the cornified envelope was present more in the stratum corneum of the face as the exposed portion than in the upper arm as the non-exposed portion.
実施例１５
コーニファイドエンベロープの酸化度と成熟度との同時比較
健常人の顔面及び上腕内側に、透明な粘着テープを貼付して直ちに剥がし、角層最外層を非侵襲的に採取した。これに200μＭのジニトロフェニルヒドラジン（和光純薬工業（株）社製）の100ｍＭのMES-Na緩衝液（pH5.5）を室温にて１時間反応させた。反応終了後に2％のドデシル硫酸ナトリウム、20mMのジチオスレイトール、5ｍＭのEDTAを含む0.1Ｍのトリス塩酸塩緩衝液（pH8.5）を加えて100℃にて10分加熱した。不溶物を、4,000g、10分間の遠心分離により集めた。さらに溶出液添加と加熱を繰り返して、可溶性成分を徹底的に除去した。こうして得られた不溶物をコーニファイドエンベロープとした。コーニファイドエンベロープ浮遊液をスライドガラスに滴下し、風乾、アセトン固定の後、リン酸緩衝生理食塩液（PBS)にて十分に洗浄した、次に、DNP標識された酸化コーニファイドエンベロープを検出する目的でウサギ抗DNP抗体（ZYMED社製、1μg/ml)を、同時に未熟コーニファイドエンベロープを検出する目的でマウス抗ヒトインボルクリン抗体（NOVOCASTRA社製）を一次抗体として反応させた。余剰の抗体を洗浄により除去した後に、テキサスレッド標識抗ウサギイムノグロブリン及びFITC標識抗マウスイムノグロブリン（各々アマシャムファルマシアバイオテク社製；PBSにて1：100に希釈）を二次抗体として室温にて１時間反応させた。反応終了後にPBSにて十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡にて観察した。図１４にその観察像を示す。
また、同様にしてDNP標識された酸化コーニファイドエンベロープを、ウサギ抗DNP抗体、FITC標識抗マウスイムノグロブリン抗体により検出するとともに、ナイルレッド染色により成熟コーニファイドエンベロープを染色し、蛍光顕微鏡にて観察した。図１５にその観察像を示す。この図において、ナイルレッドにより赤色に染色された成熟コーニファイドエンベロープは白三角で、FITCで黄緑色に染色された酸化形態のコーニファイドエンベロープ（酸化コーニファイドエンベロープ)は黒三角で示す。
図１５より、酸化コーニファイドエンベロープは非露光部たる上腕内側よりも、露光部たる顔面の角層に多く存在することが認められた。
Example 15
Simultaneous comparison of degree of oxidation and maturation of cornified envelope A transparent adhesive tape was applied to the face and the inner side of the upper arm of a healthy person and immediately peeled off, and the outermost layer of the stratum corneum was noninvasively collected. This was reacted with a 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5) of 200 μM dinitrophenylhydrazine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, 0.1 M Tris hydrochloride buffer (pH 8.5) containing 2% sodium dodecyl sulfate, 20 mM dithiothreitol, and 5 mM EDTA was added, and the mixture was heated at 100 ° C. for 10 minutes. Insolubles were collected by centrifugation at 4,000 g for 10 minutes. Further, the addition of eluate and heating were repeated to thoroughly remove soluble components. The insoluble matter thus obtained was used as a cornified envelope. Drop the suspension of Cornified Envelope onto a glass slide, air-dry, fix with acetone, wash thoroughly with phosphate buffered saline (PBS), and then detect the DNP-labeled oxidized Cornified Envelope. Was reacted with a rabbit anti-DNP antibody (manufactured by ZYMED, 1 μg / ml) as a primary antibody simultaneously with a mouse anti-human involucrin antibody (manufactured by NOVOCASTRA) for the purpose of detecting an immature cornified envelope. After removing excess antibody by washing, Texas Red-labeled anti-rabbit immunoglobulin and FITC-labeled anti-mouse immunoglobulin (each manufactured by Amersham Pharmacia Biotech; diluted 1: 100 in PBS) were used as secondary antibodies at room temperature for 1 hour. Allowed to react for hours. After the reaction was completed, the cells were sufficiently washed with PBS and then observed with a fluorescence microscope. FIG. 14 shows the observed image.
Similarly, the oxidized cornified envelope labeled with DNP was detected with a rabbit anti-DNP antibody and a FITC-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody, and the mature cornified envelope was stained with Nile Red and observed with a fluorescence microscope. . FIG. 15 shows the observed image. In this figure, the mature cornified envelope stained red with Nile Red is indicated by open triangles, and the oxidized cornified envelope (oxidized cornified envelope) stained yellowish green by FITC is indicated by black triangles.
From FIG. 15, it was confirmed that the oxidized conified envelope was present more in the stratum corneum of the face as the exposed portion than in the upper arm as the unexposed portion.
Claims (14)
テープストリッピングにより角層試料を採取するための粘着テープ；及び
酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識するための蛍光物質；
を含んで成ることを特徴とするキット。 A kit for use in a method for two-dimensionally evaluating the presence of a stratum corneum oxidized protein on the stratum corneum,
Adhesive tape for collecting a stratum corneum sample by tape stripping; and a fluorescent substance for specifically fluorescently labeling a carbonyl group of an oxidized protein;
A kit comprising:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004089376A JP2004340935A (en) | 2003-04-21 | 2004-03-25 | Method for evaluating oxidized protein in horny layer |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003116157 | 2003-04-21 | ||
| JP2004089376A JP2004340935A (en) | 2003-04-21 | 2004-03-25 | Method for evaluating oxidized protein in horny layer |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004340935A true JP2004340935A (en) | 2004-12-02 |
Family
ID=33543075
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004089376A Pending JP2004340935A (en) | 2003-04-21 | 2004-03-25 | Method for evaluating oxidized protein in horny layer |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2004340935A (en) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005085844A1 (en) * | 2004-03-05 | 2005-09-15 | Shiseido Company, Ltd. | Method of evaluating the transprency and moisture retention of horny layer by using oxidized protein in the horny layer as indication |
| JP2006349372A (en) * | 2005-06-13 | 2006-12-28 | Shiseido Co Ltd | Method for evaluating flexibility, and elasticity of skin using oxidized protein in horny cell layer as index |
| JP2007199053A (en) * | 2005-12-28 | 2007-08-09 | Kose Corp | Horny layer protein detecting method and methods for evaluating epidermis turnover and skin state using same |
| JP2007225547A (en) * | 2006-02-27 | 2007-09-06 | Fujifilm Corp | Detection method of hydrophobic region of target substance |
| JP2008116347A (en) * | 2006-11-06 | 2008-05-22 | Shiseido Co Ltd | Method and kit for inspecting oxidized protein in horny layer |
| JP2009008460A (en) * | 2007-06-27 | 2009-01-15 | Pola Chem Ind Inc | Method of discriminating ages of corneal layer |
| JP2014013201A (en) * | 2012-07-04 | 2014-01-23 | Shiseido Co Ltd | Apparatus, method, and program for visualizing ingredient distribution |
| JP2014206488A (en) * | 2013-04-15 | 2014-10-30 | 株式会社 資生堂 | Analytic method |
| JP2015210199A (en) * | 2014-04-28 | 2015-11-24 | 株式会社ミルボン | Evaluation method for degree of carbonylation |
| JP2015222248A (en) * | 2014-04-28 | 2015-12-10 | 株式会社ミルボン | Method for evaluating carbonylation level, method for screening component reducing carbonylation level and carbonylation level reduction agent |
| EP2947457A4 (en) * | 2013-01-21 | 2016-06-15 | Shiseido Co Ltd | Method for evaluating state of horny layer and method for evaluating horny layer improving effect of cosmetic preparation |
-
2004
- 2004-03-25 JP JP2004089376A patent/JP2004340935A/en active Pending
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7632633B2 (en) | 2004-03-05 | 2009-12-15 | Shiseido Company, Ltd. | Method for determining the degree of protein oxidation in a skin sample using oxidized protein in stratum corneum as an indicator |
| WO2005085844A1 (en) * | 2004-03-05 | 2005-09-15 | Shiseido Company, Ltd. | Method of evaluating the transprency and moisture retention of horny layer by using oxidized protein in the horny layer as indication |
| JP2006349372A (en) * | 2005-06-13 | 2006-12-28 | Shiseido Co Ltd | Method for evaluating flexibility, and elasticity of skin using oxidized protein in horny cell layer as index |
| JP2007199053A (en) * | 2005-12-28 | 2007-08-09 | Kose Corp | Horny layer protein detecting method and methods for evaluating epidermis turnover and skin state using same |
| JP2007225547A (en) * | 2006-02-27 | 2007-09-06 | Fujifilm Corp | Detection method of hydrophobic region of target substance |
| JP2008116347A (en) * | 2006-11-06 | 2008-05-22 | Shiseido Co Ltd | Method and kit for inspecting oxidized protein in horny layer |
| JP2009008460A (en) * | 2007-06-27 | 2009-01-15 | Pola Chem Ind Inc | Method of discriminating ages of corneal layer |
| JP2014013201A (en) * | 2012-07-04 | 2014-01-23 | Shiseido Co Ltd | Apparatus, method, and program for visualizing ingredient distribution |
| EP2947457A4 (en) * | 2013-01-21 | 2016-06-15 | Shiseido Co Ltd | Method for evaluating state of horny layer and method for evaluating horny layer improving effect of cosmetic preparation |
| TWI596338B (en) * | 2013-01-21 | 2017-08-21 | Shiseido Co Ltd | Method of evaluating the stratum corneum state and evaluation method of improving the stratum corneum of the cosmetic material |
| US9970848B2 (en) | 2013-01-21 | 2018-05-15 | Shiseido Company, Ltd. | Method for evaluating state of horny layer and method for evaluating horny layer improvement effect of cosmetic preparation |
| JP2014206488A (en) * | 2013-04-15 | 2014-10-30 | 株式会社 資生堂 | Analytic method |
| JP2015210199A (en) * | 2014-04-28 | 2015-11-24 | 株式会社ミルボン | Evaluation method for degree of carbonylation |
| JP2015222248A (en) * | 2014-04-28 | 2015-12-10 | 株式会社ミルボン | Method for evaluating carbonylation level, method for screening component reducing carbonylation level and carbonylation level reduction agent |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7632633B2 (en) | Method for determining the degree of protein oxidation in a skin sample using oxidized protein in stratum corneum as an indicator | |
| JP5311439B2 (en) | Method for evaluating skin condition and use thereof | |
| JP2004340935A (en) | Method for evaluating oxidized protein in horny layer | |
| KR20060005380A (en) | Method of evaluating oxidized protein in horny cell layer | |
| Lennard | Fingerprint detection: current capabilities | |
| CN1902487B (en) | Method of rating hair damage with use of oxidized protein occurring in hair as indicator | |
| JP2006349372A (en) | Method for evaluating flexibility, and elasticity of skin using oxidized protein in horny cell layer as index | |
| ATE242484T1 (en) | METHOD FOR STUDYING KIDNEY DISEASES | |
| US20100120060A1 (en) | Method for determining molecules or molecule parts in biological samples | |
| JP4469762B2 (en) | Sensitive skin evaluation method and evaluation kit | |
| Bergmann et al. | Development of a skin phantom of the epidermis and evaluation by using fluorescence techniques | |
| JP4781972B2 (en) | Test method and kit for stratum corneum oxidized protein | |
| JPH09127105A (en) | Hair damage diagnosis method | |
| JP4366075B2 (en) | Evaluation method of maturity of keratinocytes | |
| JPWO2020195829A1 (en) | How to evaluate the condition of the skin | |
| JP2001091514A (en) | Evaluation of cornified envelope | |
| JP2010151481A (en) | Method for evaluating skin pigmentation tendency by ultraviolet ray | |
| Musa | Computational optical biomedical spectroscopy and imaging | |
| WO2020195829A1 (en) | Method for evaluating condition of skin | |
| WO2024060018A1 (en) | Non-invasive method for detection, visualization and/or quantification of an endogenous fluorophore such as melanin in a biological tissue | |
| JP2009036555A (en) | Simple examination method of skin disease by detection of corneal layer carbonizing protein | |
| JP2010151482A (en) | Method for evaluation of resistance to sunburn of skin by ultraviolet ray | |
| JPH08178920A (en) | Diagnosis of damage of hair | |
| WO2015038799A1 (en) | Systems and methods for the molecular quantification of skin damage in skin | |
| JP2017216941A (en) | Diagnosis method of skin conditions |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Effective date: 20060711 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Effective date: 20080729 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080819 |
|
| A521 | Written amendment |
Effective date: 20081020 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090303 |