JP2009036555A - Simple examination method of skin disease by detection of corneal layer carbonizing protein - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、角層酸化タンパク質を指標とする、詳しくは角層酸化タンパク質のカルボニル化を指標とする皮膚疾患の有無の検査方法を提供する。 The present invention provides a method for examining the presence or absence of a skin disease using horny layer oxidized protein as an index, specifically, carbonylation of horny layer oxidized protein as an index.
近年、皮膚の加齢に伴う老化や光老化との関係で、角層酸化タンパク質の研究が盛んに行われている。酸化タンパク質とは、酸化を受けた結果角層酸化タンパク質のカルボニル基の導入されたタンパク質をいい、一般に、タンパク質におけるLys、Arg、Proといったアミノ酸残基のNH2基が直接酸化されて角層酸化タンパク質のカルボニル基となった結果生成されたものと、脂質が酸化して過酸化脂質、更には分解して反応性の高いアルデヒドとなり、それがタンパク質と結合することで生成されたものとがある。酸化タンパク質は老化関連での研究が豊富にされており、加齢（脳、肝、線維芽細胞）、アルツハイマー病、早老症（Werner症候群）等において増加することが認められている。 In recent years, stratum corneum oxidized protein has been actively researched in relation to aging and photoaging with skin aging. Oxidized protein refers to a protein in which the carbonyl group of oxidized stratum corneum has been introduced as a result of oxidation. Generally, the NH 2 group of amino acid residues such as Lys, Arg, and Pro in the protein is directly oxidized to oxidize the stratum corneum. Some are produced as a result of becoming a carbonyl group of a protein, and some are produced by the oxidation of lipids to lipid peroxides, and further degradation into highly reactive aldehydes that bind to proteins. . Oxidized proteins have abundant research on aging, and it is recognized that they increase in aging (brain, liver, fibroblasts), Alzheimer's disease, progeria (Werner syndrome) and the like.
皮膚においては、光線性弾力線維症の真皮でのカルボニル化の増加（Arch. Dermatol. Res. 2001,; 293:363-367)、紫外線による角層のカルボニル化の増加（FEBS Letter 1998 Feb 6, 422(3), 403-406)などが報告されている。さらには、アトピー皮疹部の角層、真皮においてもカルボニル化の増加が報告されている（Br. J. Dermatol. 2003; 149, 248-254)。 In the skin, increased carbonylation in the dermis of photoelastic fibrosis (Arch. Dermatol. Res. 2001 ,; 293: 363-367), increased carbonylation of stratum corneum by ultraviolet rays (FEBS Letter 1998 Feb 6, 422 (3), 403-406) have been reported. Furthermore, increased carbonylation has also been reported in the stratum corneum and dermis of atopic rash (Br. J. Dermatol. 2003; 149, 248-254).
前述の通り、角層酸化タンパク質に関する研究が多々行われ、角層酸化タンパク質の様々な検出方法が記載されている。FEBS Letter 1998 （前掲）では、粘着テープを皮膚表層に貼付け、剥がすといったいわゆるテープストリッピング操作を行うことで角層の付着したテープ（「テープ角層」）を獲得し、酸化タンパク質をELISAにて検出する方法が開示されている。 J. Invest. Dermatol. 1999, Sep, 113(3), 335-359においては、テープ角層からタンパク質抽出を行い、可溶性成分をDNPH標識し、SDS-PAGEにかけ、抗DNP抗体を用いてウェスタンブロットを行うことで酸化タンパク質の検出を行っている。 J. Invest. Dermatol. 2002, Apr, 118(4), 618-625においては、ヒト皮膚組織切片をDNPHで標識し、抗DNPで染色することで酸化タンパク質の検出を行っている。これらの方法はいずれも、角層試料を採取し、タンパク質抽出に付し、そのタンパク質抽出物にDNPHを作用させて酸化タンパク質をDNPで標識し、SDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜に転写し、抗DNP抗体を作用させてからパーオキシダーゼ標識二次抗体を結合させ、そしてケミルミネッセンス試薬（ECL基質）で発色させるといった手間暇のかかる工程を包含するものであった。 As described above, many studies on horny layer oxidized protein have been conducted, and various detection methods for horny layer oxidized protein are described. In FEBS Letter 1998 (supra), a tape with a stratum corneum (“tape stratum corneum”) is obtained by performing a so-called tape stripping operation in which adhesive tape is applied to the skin surface and peeled off, and oxidized protein is detected by ELISA. A method is disclosed. In J. Invest. Dermatol. 1999, Sep, 113 (3), 335-359, protein extraction from the tape stratum corneum, DNPH labeling of soluble components, SDS-PAGE, Western blotting using anti-DNP antibody In this way, the oxidized protein is detected. In J. Invest. Dermatol. 2002, Apr, 118 (4), 618-625, human skin tissue sections are labeled with DNPH, and oxidized protein is detected by staining with anti-DNP. In each of these methods, a stratum corneum sample is collected, subjected to protein extraction, DNPH is allowed to act on the protein extract, oxidized protein is labeled with DNP, separated by SDS-PAGE, and transferred to a nitrocellulose membrane. However, this method involves a time-consuming process of allowing an anti-DNP antibody to act, binding a peroxidase-labeled secondary antibody, and developing a color with a chemiluminescence reagent (ECL substrate).
これに対して特開2004-340935号公報は、皮膚から採取した角層試料中の角層酸化タンパク質のカルボニル基を、角層酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光染色して検出することで角層酸化タンパク質の角層上での性状を評価する簡略化された方法を開示している。 In contrast, Japanese Patent Laid-Open No. 2004-340935 discloses that a carbonyl group of a horny layer oxidized protein in a horny layer sample collected from the skin is detected by specifically fluorescently staining the carbonyl group of the horny layer oxidized protein. A simplified method for evaluating the properties of stratum corneum oxidized protein on the stratum corneum is disclosed.
本発明者は、特開2004-340935号公報の記載乃至それに準じた方法を利用し、皮膚疾患を有する患者における角層のカルボニル化を調べたところ、アトピー性皮膚炎や乾癬といった皮膚疾患を有する部位におけるカルボニル化度が有意に増大していることがわかった。よって、このような皮膚疾患の有無の判定に角層のカルボニル化を指標とすることができることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventor examined the carbonylation of the stratum corneum in a patient with skin disease using a method described in JP-A-2004-340935 or a method similar thereto, and has skin diseases such as atopic dermatitis and psoriasis. It was found that the degree of carbonylation at the site was significantly increased. Therefore, it has been found that the carbonylation of the stratum corneum can be used as an index for determining the presence or absence of such skin diseases, and the present invention has been completed.
従って、本願は以下の発明を包含する：
（１）皮膚疾患の有無の検査方法であって、皮膚から採取した角層試料中の酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に標識し、検出することで評価を行うことを特徴とする方法。
（２）前記皮膚疾患が乾癬又はアトピー性皮膚炎である、（１）の方法。
（３）前記標識が蛍光標識である、請求項１又は２記載の方法。
（４）前記蛍光標識をヒドラジノ基含有蛍光物質で行う、（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）前記角層試料が皮膚に対するテープストリッピングにより採取されたテープ角層である、（１）〜（４）のいずれかの方法。
（６）前記皮膚から採取した角層試料を角層酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識するための蛍光物質を含むゲルに直接接触させる工程、及び当該蛍光を検出する工程、を含んで成る、（１）〜（５）のいずれかの方法。
（７）前記接触工程において、室温で５分〜３０分間維持される、（６）の方法。
（８）前記検出を蛍光顕微鏡下で行い、それにより得た検出結果を画像化する、（１）〜（７）のいずれかの方法。
Accordingly, this application includes the following inventions:
(1) A method for examining the presence or absence of a skin disease, wherein the evaluation is performed by specifically labeling and detecting a carbonyl group of an oxidized protein in a stratum corneum sample collected from the skin.
(2) The method according to (1), wherein the skin disease is psoriasis or atopic dermatitis.
(3) The method according to claim 1 or 2, wherein the label is a fluorescent label.
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the fluorescent labeling is performed with a hydrazino group-containing fluorescent substance.
(5) The method according to any one of (1) to (4), wherein the stratum corneum sample is a tape stratum corneum collected by tape stripping on the skin.
(6) a step of directly contacting the stratum corneum sample collected from the skin with a gel containing a fluorescent substance for specifically fluorescently labeling the carbonyl group of the stratum corneum oxidized protein, and a step of detecting the fluorescence The method according to any one of (1) to (5).
(7) The method according to (6), wherein the contacting step is maintained at room temperature for 5 to 30 minutes.
(8) The method according to any one of (1) to (7), wherein the detection is performed under a fluorescence microscope, and the detection result obtained thereby is imaged.
本発明により、乾癬やアトピー性皮膚炎といった不不疾患の簡略化された検査が可能となる。 The present invention allows for a simplified test for non-disordered diseases such as psoriasis and atopic dermatitis.
本発明でいう皮膚疾患は、特に乾癬及びアトピー性皮膚炎である。乾癬とは、表皮細胞の増殖・分化異常と炎症細胞浸潤を特徴とする慢性、再発性の炎症性不全角化症をいい、典型疹は境界が明確な紅斑上に厚い鱗屑が付着した状態にある。乾癬は遺伝的素因に種々の環境因子が加わって発症すると考えられる。アトピー性皮膚炎とは、アトピー素因を有し、消退と再燃を繰り返すかゆみの強い湿疹をいい、かくことで掻破痕が観察される。かゆみの客観的な評価は困難であるが、掻破行動の観察、ビジュアルアナローグスケールを用いた数値化により診断される。 The skin diseases referred to in the present invention are particularly psoriasis and atopic dermatitis. Psoriasis is a chronic and recurrent inflammatory keratosis characterized by abnormal proliferation / differentiation of epidermal cells and infiltration of inflammatory cells. Typical eruptions have thick scales attached to erythema with well-defined boundaries. is there. Psoriasis is thought to develop by adding various environmental factors to a genetic predisposition. Atopic dermatitis is an itchy eczema that has a predisposition for atopy and repeats disappearance and relapse, and scratch marks are observed. Although it is difficult to evaluate itching objectively, it is diagnosed by observing scratching behavior and quantifying it using a visual analog scale.
本発明の検査方法は、皮膚から採取した角層試料中の酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に標識し、検出することで評価を行うことを特徴とする。本発明の方法に従えば、乾癬やアトピー性皮膚炎といった皮膚疾患の有無を、極めて簡略化かつ客観化された方法で判定することが可能となる。 The test method of the present invention is characterized in that the evaluation is performed by specifically labeling and detecting the carbonyl group of the oxidized protein in the stratum corneum sample collected from the skin. According to the method of the present invention, the presence or absence of a skin disease such as psoriasis or atopic dermatitis can be determined by a very simplified and objective method.
角層は表皮角化細胞が終末分化して形成された角質細胞と、それをとりまく細胞間脂質から構成される。角質細胞は構造タンパク質たるケラチンを主成分とし、それを包むコーニファイドエンベロープ（「角質肥厚膜」）から構成される。角層タンパク質は酸化を受けた結果カルボニル基が導入される。このような酸化には、タンパク質におけるLys、Arg、Proといったアミノ酸残基のNH2基が直接酸化されてカルボニル基となる場合と、脂質が酸化して過酸化脂質、更には分解して反応性の高いアルデヒドとなり、それがタンパク質と結合することで起こる場合とが考えられる。 The stratum corneum is composed of keratinocytes formed by terminal differentiation of epidermal keratinocytes and intercellular lipids surrounding them. Keratinocytes are composed of keratin, a structural protein, as the main component, and are composed of a cornified envelope ("keratinous thickened membrane") that wraps them. As a result of oxidation of the stratum corneum protein, a carbonyl group is introduced. For such oxidation, NH 2 groups of amino acid residues such as Lys, Arg, and Pro in proteins are directly oxidized to carbonyl groups, and lipids are oxidized to lipid peroxides and further decomposed to be reactive. This may be caused by the formation of a high aldehyde that binds to a protein.
本発明において、皮膚由来の角層試料は、所謂、外科的手段等の侵襲的な方法により取得されたものであってもよいが、簡易さを理由に、非侵襲的な方法により皮膚から取得されるものであることが好ましい。非侵襲的な方法としては、当該技術分野で常用されているテープストリッピングや擦過法等を挙げることができる。 In the present invention, the skin-derived stratum corneum sample may be obtained by an invasive method such as a so-called surgical means, but for simplicity, it is obtained from the skin by a non-invasive method. It is preferable that Non-invasive methods include tape stripping and rubbing methods that are commonly used in the art.
テープストリッピングは、皮膚表層に粘着テープ片を貼付、剥がすことを実施することで、皮膚の二次元的状態をその粘着テープにそのまま転写させることができるため、本発明において特に好ましい。テープストリッピングによりテープ角層を採取し、裁断せずにそのままの状態で酸化タンパク質を特異的に蛍光染色すれば、実際の皮膚の二次元的性状に対応した酸化タンパク質の二次元的情報が得られることとなる。 Tape stripping is particularly preferred in the present invention because the two-dimensional state of the skin can be directly transferred to the adhesive tape by applying and removing the adhesive tape piece on the skin surface layer. If tape stratum corneum is collected by tape stripping, and the oxidized protein is specifically fluorescently stained without being cut, two-dimensional information of the oxidized protein corresponding to the two-dimensional properties of the actual skin can be obtained. It will be.
テープストリッピングの好ましい方法は、まず皮膚の表層を例えばエタノールなどで浄化して皮脂、汚れ等を取り除き、適当なサイズ（例えば5×5cm）に切った粘着テープ片を皮膚表面の上に軽く載せ、テープ全体に均等な力を加えて平たく押さえ付け、その後均等な力で粘着テープを剥ぎ取ることで行われる。粘着テープは市販のセロファンテープなどであってよく、例えばScotch Superstrength Mailing Tape (3M社製）等が使用できる。 The preferred method of tape stripping is to first clean the surface of the skin with, for example, ethanol to remove sebum, dirt, etc., and lightly place an adhesive tape piece cut to an appropriate size (for example, 5 × 5 cm) on the skin surface, This is done by applying a uniform force to the entire tape and pressing it flat, and then peeling off the adhesive tape with a uniform force. The adhesive tape may be a commercially available cellophane tape, for example, Scotch Superstrength Mailing Tape (manufactured by 3M) or the like.
本発明において利用できる酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識する蛍光物質は、酸化タンパク質のカルボニル基に結合できるヒドラジノ基
―ＮＨＮＨ2
を有するものが好ましい。そのような蛍光物質の例には、フルオレセイン−５−チオセミカルバジド、テキサスレッドヒドラジド、ルシファーイエローヒドラシド等が挙げられる。
A fluorescent substance that specifically fluorescently labels a carbonyl group of an oxidized protein that can be used in the present invention is a hydrazino group that can bind to the carbonyl group of the oxidized protein.
-NHNH 2
Those having the following are preferred. Examples of such fluorescent materials include fluorescein-5-thiosemicarbazide, Texas red hydrazide, lucifer yellow hydraside and the like.
このようなヒドラジノ基含有蛍光物質を使用する場合、酸化タンパク質の検出は例えば以下のようにして実施できる：
(1)角層試料を、例えばテープストリッピングにより、採取する；
(2)これに適当な緩衝液（例えば100mMのMES-Na緩衝液（pH5.5））中のヒドラジノ基含有蛍光物質を室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(3)反応終了後に適当な生理溶液（例えば緩衝液リン酸緩衝生理食塩液（PBS)）にて十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡にて酸化タンパク質を検出する；
(4)任意的に、蛍光顕微鏡撮影する。
When such a hydrazino group-containing fluorescent substance is used, detection of oxidized protein can be carried out, for example, as follows:
(1) taking a stratum corneum sample, for example by tape stripping;
(2) A hydrazino group-containing fluorescent substance in an appropriate buffer (for example, 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5)) is reacted for several hours (for example, 1 hour) at room temperature;
(3) After the reaction is completed, the protein is thoroughly washed with an appropriate physiological solution (for example, buffered phosphate buffered saline (PBS)), and then the oxidized protein is detected with a fluorescence microscope;
(4) Optionally, take a fluorescence microscope image.
酸化タンパク質の特異的な蛍光標識は、ビオチンヒドラジドと蛍光標識アビジンとの組合わせを用いることもできる。ビオチンヒドラジドもヒドラジノ基を有するため、タンパク質のカルボニル基に結合できる。この場合、まず酸化タンパク質にビオチンヒドラジドを結合させ、しかる後に蛍光標識アビジンをビオチンーアビジン結合を介してビオチンヒドラジドに結合させ、その結果酸化タンパク質は蛍光標識される。ビオチンヒドラジドは当業界においてよく知られ、例えばピアース社から製造販売されているものを使用することができる。また、蛍光アビジンは、例えばフルオレセインアビジンなどが使用できる。 As a specific fluorescent label for oxidized protein, a combination of biotin hydrazide and fluorescently labeled avidin can be used. Since biotin hydrazide also has a hydrazino group, it can bind to the carbonyl group of the protein. In this case, biotin hydrazide is first bound to the oxidized protein, and then fluorescently labeled avidin is bound to biotin hydrazide via a biotin-avidin bond, so that the oxidized protein is fluorescently labeled. Biotin hydrazide is well known in the art, and for example, those manufactured and sold by Pierce can be used. As the fluorescent avidin, for example, fluorescein avidin can be used.
このようなヒドラジノ基含有蛍光物質を使用する場合、酸化タンパク質の検出は例えば以下のようにして実施できる：
(1)角層試料を、例えばテープストリッピングにより、採取する；
(2)これに適当な緩衝液（例えば100mMのMES-Na緩衝液（pH5.5））中のビオチンヒドラジドを室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(3)反応終了後に適当な生理溶液（例えば緩衝液リン酸緩衝生理食塩液（PBS)）にて十分に洗浄した後、蛍光標識アビジンを室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(4)蛍光顕微鏡にて酸化タンパク質を検出する；
(5)任意的に、蛍光顕微鏡撮影する。
When such a hydrazino group-containing fluorescent substance is used, detection of oxidized protein can be carried out, for example, as follows:
(1) taking a stratum corneum sample, for example by tape stripping;
(2) A biotin hydrazide in an appropriate buffer (for example, 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5)) is reacted for several hours (for example, 1 hour) at room temperature;
(3) After completion of the reaction, after thoroughly washing with an appropriate physiological solution (for example, buffered phosphate buffered saline (PBS)), the fluorescently labeled avidin is reacted at room temperature for several hours (for example, 1 hour);
(4) Detect oxidized protein with a fluorescence microscope;
(5) Optionally, take a photomicrograph.
酸化タンパク質の特異的な蛍光標識は、酸化タンパク質のカルボニル基にジニトロフェニルヒドラジンを作用・結合させ、そのジニトロフェニル部分を蛍光色素で標識することで行うこともできる。従って、本発明の更なる好適な態様では、酸化タンパク質のカルボニル基に結合させたジニトロフェニルヒドラジンのジニトロフェニル部分を蛍光免疫測定法等で検出することができる。 Specific fluorescent labeling of oxidized protein can also be performed by allowing dinitrophenylhydrazine to act and bind to the carbonyl group of oxidized protein and labeling the dinitrophenyl moiety with a fluorescent dye. Therefore, in a further preferred embodiment of the present invention, the dinitrophenyl moiety of dinitrophenylhydrazine bound to the carbonyl group of oxidized protein can be detected by a fluorescence immunoassay or the like.
このようなジニトロフェニルヒドラジンを利用して蛍光標識する場合、酸化タンパク質の検出は例えば以下のようにして実施できる：
(1)角層試料を、例えばテープストリッピングにより、採取する；
(2)これに適当な緩衝液（例えば100mMのMES-Na緩衝液（pH5.5）中のジニトロフェニルヒドラジン（DNPH)を室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(3)反応終了後に適当な生理溶液（例えば緩衝液リン酸緩衝生理食塩液（PBS)）にて十分に洗浄した後、抗DNP抗体、例えばウサギDNP抗体（ZYMED社製）の同生理溶液を室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(4)反応終了後に同生理溶液にて十分に洗浄し、上記抗DNP抗体に特異的な蛍光標識抗二次抗体、例えばフルオレセイン標識抗ウサギIg（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等を室温にて数時間（例えば１時間）反応させる；
(5)蛍光顕微鏡にて酸化タンパク質を検出する；
(6)任意的に、蛍光顕微鏡撮影する。
In the case of fluorescent labeling using such dinitrophenylhydrazine, detection of oxidized protein can be performed, for example, as follows:
(1) taking a stratum corneum sample, for example by tape stripping;
(2) This is reacted with a suitable buffer (for example, dinitrophenylhydrazine (DNPH) in 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5) at room temperature for several hours (for example, 1 hour);
(3) After the reaction is complete, wash thoroughly with an appropriate physiological solution (eg, buffered phosphate buffered saline (PBS)), and then add the same physiological solution of anti-DNP antibody, eg, rabbit DNP antibody (manufactured by ZYMED). React at room temperature for several hours (eg 1 hour);
(4) After completion of the reaction, thoroughly wash with the same physiological solution, and add fluorescent labeled anti-secondary antibody specific to the anti-DNP antibody such as fluorescein labeled anti-rabbit Ig (Amersham Pharmacia Biotech) at room temperature. React for a time (eg 1 hour);
(5) Detect oxidized protein with a fluorescence microscope;
(6) Optionally, take a fluorescent microscope image.
本発明の検査方法のより好適な態様において、角層試料を角層酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識するための蛍光物質を含むゲルに直接接触させることによって、接触表面上で酸化タンパク質を蛍光標識させることにより、一層迅速で簡便な検出が可能となる。一般に、蛍光物質を用いてタンパク質又は核酸などの標的物質を検出する方法は、試料から標的物質を抽出するという煩雑な操作を行い、その後、検出媒体（例えば、アクリルアミドゲル等）に転写することにより行わる。これは一般的に、標的物質が試料の表面には存在せず、測定物質中の内部に存在することにより染色が困難であるためである。しかしながら、この好適な態様においては標的物質が角層試料の表面に存在している角層タンパク質であるために、角層タンパク質を角層試料から抽出する必要がなく、更に試料タンパク質をゲル中に転写させずに、試料を染色用ゲルと直接接触させることによって試料側にゲル中の蛍光物質を移行させることにより、容易かつ迅速に染色することができる。また、角層試料を蛍光染色溶液に接触させる方法では、染色後の試料中のバックグランドが高くなることから、蛍光化された角層試料をリンスし、乾燥させる操作が必要であり、さらに溶液中に試料を接触させる操作において、染色溶液に気泡が入らないように注意しなければならなかったため、時間及び労力を必要とするといった欠点があるが、この態様ではそのような問題は解消される。 In a more preferred embodiment of the test method of the present invention, the stratum corneum sample is directly contacted with a gel containing a fluorescent substance for fluorescently labeling the carbonyl group of the stratum corneum oxidized protein, whereby the oxidized protein on the contact surface. By fluorescently labeling, more rapid and simple detection becomes possible. In general, a method of detecting a target substance such as a protein or nucleic acid using a fluorescent substance is performed by performing a complicated operation of extracting the target substance from a sample and then transferring it to a detection medium (for example, an acrylamide gel). To do. This is because, in general, the target substance does not exist on the surface of the sample but is difficult to stain because it exists inside the measurement substance. However, in this preferred embodiment, since the target substance is a stratum corneum protein present on the surface of the stratum corneum sample, it is not necessary to extract the stratum corneum protein from the stratum corneum sample, and the sample protein is further contained in the gel. By transferring the fluorescent substance in the gel to the sample side by bringing the sample into direct contact with the staining gel without transferring it, it is possible to stain easily and rapidly. In addition, in the method in which the stratum corneum sample is brought into contact with the fluorescent staining solution, since the background in the sample after staining becomes high, an operation of rinsing and drying the fluorescent stratum corneum sample is required. In the operation of bringing the sample into contact, care must be taken so that bubbles do not enter the staining solution, so there is a disadvantage that time and labor are required, but this problem is solved in this aspect. .
この態様における染色用ゲルは、アガロースゲル、又はポリアクリルアミドゲルが好ましいが、特に好ましくはアガロースゲルである。これは以下のとおり調製することができる。例えば、３ｇのアガロースを、ｐＨを約３．０〜７．０、好ましくは約５．０に調整した１００ｍｌのＭＥＳバッファーに添加し、そして良く撹拌し、生じた混合物を加熱する。加熱した混合物が固まらないうちに、所望の最終濃度、好ましくは、５〜５０μＭとなるようにカルボニル基を特異的に検出するための蛍光物質を良く撹拌しながら添加し、それからセットしたガラスケースに混合溶液を流し込み、室温にて冷却することによりゲルを固める。 The staining gel in this embodiment is preferably an agarose gel or a polyacrylamide gel, and particularly preferably an agarose gel. This can be prepared as follows. For example, 3 g of agarose is added to 100 ml of MES buffer adjusted to a pH of about 3.0-7.0, preferably about 5.0, and stirred well and the resulting mixture is heated. Before the heated mixture has solidified, a fluorescent substance for specifically detecting the carbonyl group is added with good stirring so that the desired final concentration, preferably 5 to 50 μM, is added to the glass case set. The mixed solution is poured, and the gel is hardened by cooling at room temperature.
染色用ゲルに含まれる、角層酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識する蛍光物質は、角層酸化タンパク質のカルボニル基に結合できるヒドラジノ基を有するものが好ましく、その例としてフルオレセイン−５−チオセミカルバジド、テキサスレッドヒドラジド、ルシファーイエローヒドラシド等が挙げられる。 The fluorescent substance that specifically fluorescently labels the carbonyl group of the stratum corneum oxidized protein contained in the staining gel preferably has a hydrazino group that can bind to the carbonyl group of the stratum corneum oxidized protein. Examples thereof include fluorescein-5- Examples include thiosemicarbazide, Texas red hydrazide, and lucifer yellow hydraside.
このようなヒドラジノ基含有蛍光物質を使用する場合、酸化タンパク質の検出は例えば以下のようにして実施できる：
(1)角層試料を例えばテープストリッピングにより、採取する；
(2)前記試料とヒドラジノ基含有蛍光物質を含むゲルとを室温にて約１５分間接触させる；
(3)テープをゲルからはがし、蛍光顕微鏡にてテープ表面上の染色された酸化タンパク質を検出する；
(4)任意的に、蛍光顕微鏡撮影する。
When such a hydrazino group-containing fluorescent substance is used, detection of oxidized protein can be carried out, for example, as follows:
(1) Take a stratum corneum sample, for example by tape stripping;
(2) contacting the sample with a gel containing a hydrazino group-containing fluorescent substance for about 15 minutes at room temperature;
(3) Peel the tape from the gel and detect the stained oxidized protein on the tape surface with a fluorescence microscope;
(4) Optionally, take a fluorescence microscope image.
上記の酸化タンパク質の検出方法を使用することで、酸化タンパク質の皮膚上での二次元的性状、詳しくは存在量、存在箇所、分布状態、例えば散在しているか、局在しているか、等の様々な情報を得ることができ、しかもそれは従来必要とされていたタンパク質の抽出操作、電気泳動操作、ウェスタンブロッティング操作などを必要とせず、更に蛍光標識工程がセミドライなゲルと接触させることにより行われることから、蛍光染色後に試料のリンス及び乾燥工程を必要とせず、また、その反応時間も１５分程度でプラトーに達することから迅速な染色ができるために、一度に大量の酸化タンパク質を染色することが可能となる。更に染色操作も簡便であることから、染色にかかる労力を著しく低減することができる。 By using the above-mentioned method for detecting oxidized protein, two-dimensional properties of the oxidized protein on the skin, specifically, abundance, location, distribution state, such as scattered or localized, etc. Various information can be obtained, and it does not require the protein extraction operation, electrophoresis operation, western blotting operation, etc. which are conventionally required, and the fluorescence labeling process is performed by contacting with a semi-dry gel. Therefore, it is not necessary to rinse and dry the sample after fluorescent staining, and since the reaction time reaches a plateau in about 15 minutes, rapid staining can be performed, so that a large amount of oxidized protein can be stained at once. Is possible. Furthermore, since the dyeing operation is also simple, the labor required for dyeing can be significantly reduced.
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。 The invention is illustrated in more detail by the following examples.
テープストリッピングによる角層試料の採取
アトピー性皮膚炎又は乾癬を有する患者それぞれの皮疹部及び無疹部の表層、又は健常人の皮膚表層をエタノールで浄化して皮脂、汚れ等を取り除き、5×5cmに切った粘着テープ片（資生堂社）を皮膚表面の上に軽く載せ、テープ全体に均等な力を加えて平たく押さえ付け、その後均等な力で粘着テープ直ちに剥がし、角層最外層を非侵襲的に採取し、角層試料とした。
Collection of stratum corneum sample by tape stripping Remove the sebum, dirt, etc. by purifying the surface of the rash and non-rash areas of each patient with atopic dermatitis or psoriasis or the skin of a healthy person with ethanol, 5 × 5 cm A piece of pressure-sensitive adhesive tape (Shiseido Co., Ltd.) is placed lightly on the surface of the skin, pressed evenly over the entire tape with equal force, and then peeled off immediately with equal force, and the outermost stratum corneum is non-invasive To obtain a stratum corneum sample.
染色用ゲル（３％アガロースゲル）の調製
３ｇのアガロース２１（ワコー社）を１００ｍｌのＭＥＳバッファー（ｐＨ５．０）（和光純薬社）に添加し、そして良く撹拌した。生じた混合物を電子レンジにおいて、１分間加熱した。加熱された混合物が固まらないうちに、最終濃度が２μＭとなるように、蛍光ヒドラジド／ＤＭＳＯ（モレキュラ・プローブ社）を添加し、セットしたガラスケースに混合溶液を流し込み、室温にて３０分間冷却して染色用ゲルを調製した。
Preparation of staining gel (3% agarose gel) 3 g of agarose 21 (Wako) was added to 100 ml of MES buffer (pH 5.0) (Wako Pure Chemical Industries) and stirred well. The resulting mixture was heated in a microwave for 1 minute. Before the heated mixture solidifies, add fluorescent hydrazide / DMSO (Molecular Probes) so that the final concentration is 2 μM, pour the mixed solution into the set glass case, and cool at room temperature for 30 minutes. A gel for staining was prepared.
ゲル染色プロトコル及び蛍光顕微鏡における測定
前記試料中の酸化タンパク質に蛍光ヒドラジドを結合させるために前記の角層が付着したテープを前述のとおり調製した染色用ゲルに接触させ、遮光条件下において、室温で１５分間維持して、角層酸化タンパク質を蛍光染色させた。その後テープをゲルからはがし、テープに付着した蛍光染色された角質試料中の酸化タンパク質を蛍光顕微鏡（オリンパス社）で撮影した（図１）。さらに、画像から背景と細胞を分離し、それぞれの平均輝度を求めることで酸化タンパク質の量を数値化した（図２）。
Gel staining protocol and measurement in fluorescent microscope The tape with the stratum corneum attached to the oxidized protein in the sample was brought into contact with the staining gel prepared as described above, at room temperature under light-shielding conditions. The stratum corneum oxidized protein was fluorescently stained for 15 minutes. Thereafter, the tape was peeled off from the gel, and the oxidized protein in the fluorescently stained keratin sample adhering to the tape was photographed with a fluorescence microscope (Olympus) (FIG. 1). Furthermore, the amount of oxidized protein was quantified by separating the background and cells from the image and determining the average brightness of each (FIG. 2).
図１及び２から、アトピー性皮膚炎や乾癬といった皮膚疾患を有する皮疹部では、無疹部や健常人の皮膚と比べ、角層のカルボニル化が有意に増大していることがわかる。 1 and 2, it can be seen that in the eruption part having skin diseases such as atopic dermatitis and psoriasis, the carbonylation of the stratum corneum is significantly increased as compared with the non-eruption part and the skin of a healthy person.
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