JP2000333698A - 糖組成物の単糖分析方法 - Google Patents
糖組成物の単糖分析方法Info
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 糖組成物を構成するシアル酸等の単糖の定量
方法の提供。 【解決手段】 糖組成物を構成する単糖を同時に定量分
析するに際し、(1) 糖組成物からシアリダーゼもしくは
酸によりシアル酸を遊離させ、(2) 遊離したシアル酸を
シアル酸アルドラーゼによりＮ−アシルマンノサミンに
変換し、(3) Ｎ−アシルマンノサミンおよび糖残基を酸
加水分解することを特徴とする糖組成物の単糖分析方
法。 【効果】 試料を単一容器内で前処理でき、一度のＨＰ
ＬＣ等の分析でシアル酸を含めた糖組成を得ることがで
きる。
方法の提供。 【解決手段】 糖組成物を構成する単糖を同時に定量分
析するに際し、(1) 糖組成物からシアリダーゼもしくは
酸によりシアル酸を遊離させ、(2) 遊離したシアル酸を
シアル酸アルドラーゼによりＮ−アシルマンノサミンに
変換し、(3) Ｎ−アシルマンノサミンおよび糖残基を酸
加水分解することを特徴とする糖組成物の単糖分析方
法。 【効果】 試料を単一容器内で前処理でき、一度のＨＰ
ＬＣ等の分析でシアル酸を含めた糖組成を得ることがで
きる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、糖組成物を構成す
るシアル酸等の単糖の定量方法に関する。
るシアル酸等の単糖の定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】糖タンパク質、糖脂質などの糖組成物
は、人体の機能調節機構、特に免疫関連部分を構成する
重要な物質であり、近年、エイズや癌の治療など医療の
先端において研究が盛んになっている。既に、エイズウ
イルスの表面に存在する糖タンパク質の糖鎖が、宿主細
胞表面のＣＤ４分子と結合して感染すると考えられてお
り、また、癌により糖組成物の糖部分が変化することが
多数報告されている。そのなかでも特に、シアル酸を主
とする糖組成物を構成する各種単糖の定量分析は、当該
研究の基本であり、迅速、高感度化分析に向けて、これ
まで、種々の方法が提案されている。
は、人体の機能調節機構、特に免疫関連部分を構成する
重要な物質であり、近年、エイズや癌の治療など医療の
先端において研究が盛んになっている。既に、エイズウ
イルスの表面に存在する糖タンパク質の糖鎖が、宿主細
胞表面のＣＤ４分子と結合して感染すると考えられてお
り、また、癌により糖組成物の糖部分が変化することが
多数報告されている。そのなかでも特に、シアル酸を主
とする糖組成物を構成する各種単糖の定量分析は、当該
研究の基本であり、迅速、高感度化分析に向けて、これ
まで、種々の方法が提案されている。
【０００３】以下に種々の従来法とその利点及び欠点を
示す。例えば、 糖組成物のメタノリシスとトリメチルシリル化によ
り、揮発性糖誘導体化した後、ガスクロマトグラフィー
（ＧＬＣ）によるシアル酸、中性糖、アミノ酸の定量
法：シアル酸、中性糖、アミノ酸の同時定量ができる
が、多量の試料が必要であること（単糖で１０ｎｍｏｌ
以上）、ＧＬＣでの分析が多検体処理に不向きであるこ
と、そして、アスパラギン残基に結合したＮ−アセチル
グルコサミンを定量できない（Anal. Biochem. 119, 17
-24(1982) ）という欠点がある。
示す。例えば、 糖組成物のメタノリシスとトリメチルシリル化によ
り、揮発性糖誘導体化した後、ガスクロマトグラフィー
（ＧＬＣ）によるシアル酸、中性糖、アミノ酸の定量
法：シアル酸、中性糖、アミノ酸の同時定量ができる
が、多量の試料が必要であること（単糖で１０ｎｍｏｌ
以上）、ＧＬＣでの分析が多検体処理に不向きであるこ
と、そして、アスパラギン残基に結合したＮ−アセチル
グルコサミンを定量できない（Anal. Biochem. 119, 17
-24(1982) ）という欠点がある。
【０００４】シアリダーゼもしくは酸で遊離したシア
ル酸を1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene （ＤＭ
Ｂ）誘導体化し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）を用いたシアル酸の定量法：非常に簡便で高感度で
あるが、シアル酸しか分析できず、しかも誘導体化物が
不安定で１２時間以内に分析する必要（“糖蛋白質糖鎖
研究法（生物化学実験法２３）”，学会出版センター，
p.20(1989)）があり限定的である。
ル酸を1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene （ＤＭ
Ｂ）誘導体化し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）を用いたシアル酸の定量法：非常に簡便で高感度で
あるが、シアル酸しか分析できず、しかも誘導体化物が
不安定で１２時間以内に分析する必要（“糖蛋白質糖鎖
研究法（生物化学実験法２３）”，学会出版センター，
p.20(1989)）があり限定的である。
【０００５】アミノ酸分析によるアミノ糖の定量：簡
便で高感度であるが、アミノ糖しか分析できない。 ピリジルアミノ標識化、４−アミノ安息香酸エチル誘
導体化した後ＨＰＬＣによる中性糖、アミノ糖の定量：
高感度ではあるが、シアル酸の分析ができない。 １−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（ＰＭ
Ｐ）誘導体化した後ＨＰＬＣによるシアル酸、中性糖、
アミノ糖の定量：高感度ではあるが、シアル酸および中
性糖とアミノ糖の同時定量ができず不便である。
便で高感度であるが、アミノ糖しか分析できない。 ピリジルアミノ標識化、４−アミノ安息香酸エチル誘
導体化した後ＨＰＬＣによる中性糖、アミノ糖の定量：
高感度ではあるが、シアル酸の分析ができない。 １−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（ＰＭ
Ｐ）誘導体化した後ＨＰＬＣによるシアル酸、中性糖、
アミノ糖の定量：高感度ではあるが、シアル酸および中
性糖とアミノ糖の同時定量ができず不便である。
【０００６】糖のＨＰＬＣによる分離後シアノアセト
アミド誘導体化によるシアル酸、中性糖、アミノ糖の定
量：ポストカラムラベル法で簡便であるが、分析時間が
長く、シアル酸および中性糖とアミノ糖の同時定量がで
きず不便である。 陰イオン交換クロマトグラフィーと電気化学検出器を
用いたシアル酸、中性糖、アミノ糖の定量：標識の手間
は省けるが、特別な装置が必要な上、シアル酸および中
性糖とアミノ糖の同時定量ができず不便である（Method
s in Enzymology, 230, 208-225(1994)）。
アミド誘導体化によるシアル酸、中性糖、アミノ糖の定
量：ポストカラムラベル法で簡便であるが、分析時間が
長く、シアル酸および中性糖とアミノ糖の同時定量がで
きず不便である。 陰イオン交換クロマトグラフィーと電気化学検出器を
用いたシアル酸、中性糖、アミノ糖の定量：標識の手間
は省けるが、特別な装置が必要な上、シアル酸および中
性糖とアミノ糖の同時定量ができず不便である（Method
s in Enzymology, 230, 208-225(1994)）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】このように、従来から
知られている糖組成物の単糖分析方法はそれぞれ一長一
短があり、必ずしも満足のいくものではない。その一方
で、外科的侵襲を伴わずに疾患部位を診断することがで
きる糖組成物の分析方法は、患者に対する負荷が少な
く、最近益々繁用されるようになり、簡便で多検体を処
理できる方法が望まれている。そして、癌などの病態変
化を観測できる指標として注目を集めているシアル酸を
始め、糖組成物の構成をなす各単糖を同時に、迅速且つ
高感度で正確に定量できる方法の開発が焦眉の急となっ
ている。
知られている糖組成物の単糖分析方法はそれぞれ一長一
短があり、必ずしも満足のいくものではない。その一方
で、外科的侵襲を伴わずに疾患部位を診断することがで
きる糖組成物の分析方法は、患者に対する負荷が少な
く、最近益々繁用されるようになり、簡便で多検体を処
理できる方法が望まれている。そして、癌などの病態変
化を観測できる指標として注目を集めているシアル酸を
始め、糖組成物の構成をなす各単糖を同時に、迅速且つ
高感度で正確に定量できる方法の開発が焦眉の急となっ
ている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために、鋭意検討を重ねた結果、糖組成物の
単糖分析において、遊離したシアル酸をＮ−アシルマン
ノサミンに変換した後、酸加水分解することで、各単糖
を同時に定量できることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、糖組成物を同時に定量分析するに際
し、（１）糖組成物からシアリダーゼもしくは酸により
シアル酸を遊離させ、（２）遊離したシアル酸をシアル
酸アルドラーゼによりＮ−アシルマンノサミンに変換
し、（３）Ｎ−アシルマンノサミンおよび糖残基を酸加
水分解することを特徴とする糖組成物の単糖分析方法で
ある。
を達成するために、鋭意検討を重ねた結果、糖組成物の
単糖分析において、遊離したシアル酸をＮ−アシルマン
ノサミンに変換した後、酸加水分解することで、各単糖
を同時に定量できることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、糖組成物を同時に定量分析するに際
し、（１）糖組成物からシアリダーゼもしくは酸により
シアル酸を遊離させ、（２）遊離したシアル酸をシアル
酸アルドラーゼによりＮ−アシルマンノサミンに変換
し、（３）Ｎ−アシルマンノサミンおよび糖残基を酸加
水分解することを特徴とする糖組成物の単糖分析方法で
ある。
【０００９】また、本発明は、Ｎ−アシルマンノサミン
および糖残基を酸加水分解して、各単糖を定量する際
に、加水分解において脱Ｎ−アシル化された単糖をＮ−
アセチル化しておくこと、更には、再度Ｎ−アセチル化
した単糖を４−アミノ安息香酸エチル（ＡＢＥＥ）標識
化することを特徴とする。各単糖はＨＰＬＣ、キャピラ
リー電気泳動、ＧＬＣ等の方法により分析することがで
きるが、多検体処理に適しているＨＰＬＣが特に望まし
い。本発明において、ＨＰＬＣによる各単糖の定量方法
は、逆相カラムを用いており、溶離液にはホウ酸緩衝液
を用いることが望ましい。
および糖残基を酸加水分解して、各単糖を定量する際
に、加水分解において脱Ｎ−アシル化された単糖をＮ−
アセチル化しておくこと、更には、再度Ｎ−アセチル化
した単糖を４−アミノ安息香酸エチル（ＡＢＥＥ）標識
化することを特徴とする。各単糖はＨＰＬＣ、キャピラ
リー電気泳動、ＧＬＣ等の方法により分析することがで
きるが、多検体処理に適しているＨＰＬＣが特に望まし
い。本発明において、ＨＰＬＣによる各単糖の定量方法
は、逆相カラムを用いており、溶離液にはホウ酸緩衝液
を用いることが望ましい。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明によれば、糖組成物の各単
糖を同時に定量することができる。従来法では、中性糖
やアミノ糖を加水分解する条件では、シアル酸は完全に
破壊され検出することができなかった。そのため、シア
ル酸と中性糖とアミノ糖を定量する際に一つの試料に対
して少なくとも２回以上の処理と分析をおこなう必要が
あった。本発明では、シアル酸を予め中性糖やアミノ糖
を加水分解する条件で破壊されない化合物に変換するこ
とによって、シアル酸と中性糖とアミノ糖の定量を一度
におこなうことができるので操作性に優れ、迅速に糖組
成物を構成する各単糖を定量することができる。
糖を同時に定量することができる。従来法では、中性糖
やアミノ糖を加水分解する条件では、シアル酸は完全に
破壊され検出することができなかった。そのため、シア
ル酸と中性糖とアミノ糖を定量する際に一つの試料に対
して少なくとも２回以上の処理と分析をおこなう必要が
あった。本発明では、シアル酸を予め中性糖やアミノ糖
を加水分解する条件で破壊されない化合物に変換するこ
とによって、シアル酸と中性糖とアミノ糖の定量を一度
におこなうことができるので操作性に優れ、迅速に糖組
成物を構成する各単糖を定量することができる。
【００１１】本発明において分析の対象である糖組成物
としては、糖タンパク、糖脂質、オリゴ糖、多糖が挙げ
られる。本発明において使用する試薬としては、シアリ
ダーゼ、シアル酸アルドラーゼ、酸がある。シアリダー
ゼの起源としては、Arthrobacter ureafaciens, Clostr
idium perfringens, Streptococcus sp., Vibrio chole
rae, Salmonella typhimurium,ニューカッスル病ウイル
スなどがあり、望ましくは、取り扱いが容易なArthroba
cter ureafaciens由来のものがよい。シアル酸アルドラ
ーゼの起源としては、大腸菌、Clostridium perfringen
s などがあり、望ましくは、取り扱いの容易な大腸菌由
来のものがよい。酸にはトリフルオロ酢酸、塩酸、硫酸
などが使用でき、望ましくは、除去の容易さからトリフ
ルオロ酢酸が好ましい。
としては、糖タンパク、糖脂質、オリゴ糖、多糖が挙げ
られる。本発明において使用する試薬としては、シアリ
ダーゼ、シアル酸アルドラーゼ、酸がある。シアリダー
ゼの起源としては、Arthrobacter ureafaciens, Clostr
idium perfringens, Streptococcus sp., Vibrio chole
rae, Salmonella typhimurium,ニューカッスル病ウイル
スなどがあり、望ましくは、取り扱いが容易なArthroba
cter ureafaciens由来のものがよい。シアル酸アルドラ
ーゼの起源としては、大腸菌、Clostridium perfringen
s などがあり、望ましくは、取り扱いの容易な大腸菌由
来のものがよい。酸にはトリフルオロ酢酸、塩酸、硫酸
などが使用でき、望ましくは、除去の容易さからトリフ
ルオロ酢酸が好ましい。
【００１２】本発明は、実施にあたり糖組成物からのシ
アル酸の遊離と遊離されたシアル酸のＮ−アシルマンノ
サミンへの変換は、シアリダーゼもしくは酸とシアル酸
アルドラーゼを糖組成物を含む反応容器に順次加えて行
ってもよくまたこれらの試薬を同時に加えて行うことも
できる。その後、酸を加えて、シアル酸の遊離した糖残
基とＮ−アシルマンノサミンを加水分解し、得られた加
水分解物をＨＰＬＣ等で分析することにより構成の各単
糖を定量することができる。単糖の定量分析にあたって
は、前記加水分解によって脱Ｎ−アシル化された単糖を
Ｎ−アセチル化して行ってもよく、また、遊離した各単
糖をＡＢＥＥ標識化した後に定量分析してもよい。本発
明における試料の上記各処理は、容器を変えることなく
単一容器で処理することができる。
アル酸の遊離と遊離されたシアル酸のＮ−アシルマンノ
サミンへの変換は、シアリダーゼもしくは酸とシアル酸
アルドラーゼを糖組成物を含む反応容器に順次加えて行
ってもよくまたこれらの試薬を同時に加えて行うことも
できる。その後、酸を加えて、シアル酸の遊離した糖残
基とＮ−アシルマンノサミンを加水分解し、得られた加
水分解物をＨＰＬＣ等で分析することにより構成の各単
糖を定量することができる。単糖の定量分析にあたって
は、前記加水分解によって脱Ｎ−アシル化された単糖を
Ｎ−アセチル化して行ってもよく、また、遊離した各単
糖をＡＢＥＥ標識化した後に定量分析してもよい。本発
明における試料の上記各処理は、容器を変えることなく
単一容器で処理することができる。
【００１３】
【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、本発明の主
旨はもとよりこれに限定されるものではない。
旨はもとよりこれに限定されるものではない。
【００１４】実施例１ 子牛血清由来フェツイン（シグマ社製）溶液１０μｌ
（５μｇ）をネジ口試験管（４５ｍｍ×９．５ｍｍ
Ｉ．Ｄ．）に加え減圧下で乾固した。これにシアル酸ア
ルドラーゼ溶液５μｌ、シアリダーゼ溶液５μｌを加
え、３７℃、１７時間保温した。更に、８Ｍトリフルオ
ロ酢酸水溶液１０μｌを加え（終濃度４Ｍ）、１２１
℃、２時間保温した。空冷後、減圧乾固した後、充分に
酸を除くために２−プロパノールを１００μｌ添加して
再度、減圧乾固した。これにピリジン／メタノール（５
／９５，容量比（ｖ／ｖ））４０μｌを加え、無水酢酸
１０μｌを添加して、室温で３０分放置してＮ−アセチ
ル化をおこない、減圧乾固した。純水１０μｌとＡＢＥ
Ｅ標識化試薬（生化学工業製）４０μｌを加えて、８０
℃、１時間保温した。純水２００μｌとクロロホルム２
００μｌを加えて、遠心後、上清をＨＰＬＣ分析に供し
た。
（５μｇ）をネジ口試験管（４５ｍｍ×９．５ｍｍ
Ｉ．Ｄ．）に加え減圧下で乾固した。これにシアル酸ア
ルドラーゼ溶液５μｌ、シアリダーゼ溶液５μｌを加
え、３７℃、１７時間保温した。更に、８Ｍトリフルオ
ロ酢酸水溶液１０μｌを加え（終濃度４Ｍ）、１２１
℃、２時間保温した。空冷後、減圧乾固した後、充分に
酸を除くために２−プロパノールを１００μｌ添加して
再度、減圧乾固した。これにピリジン／メタノール（５
／９５，容量比（ｖ／ｖ））４０μｌを加え、無水酢酸
１０μｌを添加して、室温で３０分放置してＮ−アセチ
ル化をおこない、減圧乾固した。純水１０μｌとＡＢＥ
Ｅ標識化試薬（生化学工業製）４０μｌを加えて、８０
℃、１時間保温した。純水２００μｌとクロロホルム２
００μｌを加えて、遠心後、上清をＨＰＬＣ分析に供し
た。
【００１５】＜ＨＰＬＣ分析条件＞ＨＰＬＣ送液ポン
プ、コントローラー、カラムオーブン、蛍光検出器には
島津製作所製のものを使用した。カラムには逆相カラム
であるホーネンパックＣ１８（生化学工業）を用い、流
速１ｍｌ／ｍｉｎで、カラム温度３０℃にておこなっ
た。移動相には０．２Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ
８．９）／アセトニトリル（９３／７，ｖ／ｖ）を使用
した。検出は励起波長３０５ｎｍ，蛍光波長３６０ｎｍ
でおこなった。
プ、コントローラー、カラムオーブン、蛍光検出器には
島津製作所製のものを使用した。カラムには逆相カラム
であるホーネンパックＣ１８（生化学工業）を用い、流
速１ｍｌ／ｍｉｎで、カラム温度３０℃にておこなっ
た。移動相には０．２Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ
８．９）／アセトニトリル（９３／７，ｖ／ｖ）を使用
した。検出は励起波長３０５ｎｍ，蛍光波長３６０ｎｍ
でおこなった。
【００１６】実施例２ 子小牛血清由来フェツイン（シグマ社製）溶液をネジ口
試験管（４５ｍｍ×９．５ｍｍ Ｉ．Ｄ．）に１０μｌ
（５μｇ）加え、０．２Ｍトリフルオロ酢酸１０μｌを
加えて攪拌し、８０℃で１時間保温してシアル酸を遊離
した。減圧下で酸を除去した後、シアル酸アルドラーゼ
溶液１０μｌを加え、３７℃、１７時間保温した。更
に、８Ｍトリフルオロ酢酸水溶液１０μｌを加え（終濃
度４Ｍ）、１２１℃、２時間保温した。空冷後、減圧乾
固した後、充分に酸を除くために２−プロパノールを１
００μｌ添加して再度減圧乾固した。これに、ピリジン
／メタノール（５／９５，ｖ／ｖ）４０μｌ添加し、無
水酢酸１０μｌを添加して、室温で３０分放置し、Ｎ−
アセチル化をおこない、減圧乾固した。純水１０μｌと
ＡＢＥＥ標識化試薬（生化学工業製）４０μｌを加え
て、８０℃、１時間保温した。純水２００μｌとクロロ
ホルム２００μｌを加えて、遠心後、上清をＨＰＬＣ分
析に供した。ＨＰＬＣ分析は実施例１と同じ条件でおこ
なった。
試験管（４５ｍｍ×９．５ｍｍ Ｉ．Ｄ．）に１０μｌ
（５μｇ）加え、０．２Ｍトリフルオロ酢酸１０μｌを
加えて攪拌し、８０℃で１時間保温してシアル酸を遊離
した。減圧下で酸を除去した後、シアル酸アルドラーゼ
溶液１０μｌを加え、３７℃、１７時間保温した。更
に、８Ｍトリフルオロ酢酸水溶液１０μｌを加え（終濃
度４Ｍ）、１２１℃、２時間保温した。空冷後、減圧乾
固した後、充分に酸を除くために２−プロパノールを１
００μｌ添加して再度減圧乾固した。これに、ピリジン
／メタノール（５／９５，ｖ／ｖ）４０μｌ添加し、無
水酢酸１０μｌを添加して、室温で３０分放置し、Ｎ−
アセチル化をおこない、減圧乾固した。純水１０μｌと
ＡＢＥＥ標識化試薬（生化学工業製）４０μｌを加え
て、８０℃、１時間保温した。純水２００μｌとクロロ
ホルム２００μｌを加えて、遠心後、上清をＨＰＬＣ分
析に供した。ＨＰＬＣ分析は実施例１と同じ条件でおこ
なった。
【００１７】実施例３ 実施例２の子牛血清由来フェツインに代えて糖脂質であ
るII3NeuGc α-LacCer （和光純薬工業製）を用いた他
は、実施例２と同様におこなって単糖を分析した。
るII3NeuGc α-LacCer （和光純薬工業製）を用いた他
は、実施例２と同様におこなって単糖を分析した。
【００１８】実施例４ 実施例２の子牛血清由来フェツインに代えて３′−シア
リルラクトース（シグマ社製）を用いた他は、実施例２
と同様にして単糖を分析した。
リルラクトース（シグマ社製）を用いた他は、実施例２
と同様にして単糖を分析した。
【００１９】比較例１ 子牛血清由来フェツイン（シグマ社製）６０μｇを１．
４Ｍ塩酸メタノール１００μｌ中で９０℃、２時間保温
した。酸を窒素気流下で除去し、そこに１０％ピリジン
−メタノール２００μｌと無水酢酸１０μｌを加え、室
温で３０分間放置した。減圧下で溶媒を除去し、トリメ
チルシリル化試薬（Ｔｒｉ−Ｓｉｌ：ピアス社）５０μ
ｌを加えて、４６℃、１０分間保温した。硫酸存在下で
溶媒を減圧除去し、ｎ−ペンタンで抽出し、濃縮後、２
％ ＯＶ−１７（Uniport HP（６０／８０）カラム（Ｇ
Ｌサイエンス社）を装着したガスクロマトグラフィー分
析に供した（“タンパク質の化学・上（続生化学実験講
座２）”，日本生化学会編，東京化学同人，ｐ．215 〜
ｐ．218 （1987））。
４Ｍ塩酸メタノール１００μｌ中で９０℃、２時間保温
した。酸を窒素気流下で除去し、そこに１０％ピリジン
−メタノール２００μｌと無水酢酸１０μｌを加え、室
温で３０分間放置した。減圧下で溶媒を除去し、トリメ
チルシリル化試薬（Ｔｒｉ−Ｓｉｌ：ピアス社）５０μ
ｌを加えて、４６℃、１０分間保温した。硫酸存在下で
溶媒を減圧除去し、ｎ−ペンタンで抽出し、濃縮後、２
％ ＯＶ−１７（Uniport HP（６０／８０）カラム（Ｇ
Ｌサイエンス社）を装着したガスクロマトグラフィー分
析に供した（“タンパク質の化学・上（続生化学実験講
座２）”，日本生化学会編，東京化学同人，ｐ．215 〜
ｐ．218 （1987））。
【００２０】比較例２ 子牛血清由来フェツイン（シグマ社製）１０μｇを６Ｎ
塩酸４０μｌ中、１００℃、６時間保温した後、酸を減
圧下で除去した。得られた処理物を、ＡｃｃＱ標識化試
薬（ウォータース製）を用いて、６−aminoquinolyl −
Ｎ−hydroxysuccinimidyl carbamate 標識をおこない、
付属のマニュアルに従ってＨＰＬＣで分析した。
塩酸４０μｌ中、１００℃、６時間保温した後、酸を減
圧下で除去した。得られた処理物を、ＡｃｃＱ標識化試
薬（ウォータース製）を用いて、６−aminoquinolyl −
Ｎ−hydroxysuccinimidyl carbamate 標識をおこない、
付属のマニュアルに従ってＨＰＬＣで分析した。
【００２１】比較例３ 子牛血清由来フェツイン（シグマ社製）５μｇを０．１
Ｍトリフルオロ酢酸水溶液２０μｌ中、８０℃、１時間
保温した後、ＤＭＢ標識化キット（タカラ酒造製）を用
いて１，２−ジアミノ−４，５−メチレンジオキシベン
ゼン（ＤＭＢ）標識して、付属のマニュアルに従ってＨ
ＰＬＣで分析した。
Ｍトリフルオロ酢酸水溶液２０μｌ中、８０℃、１時間
保温した後、ＤＭＢ標識化キット（タカラ酒造製）を用
いて１，２−ジアミノ−４，５−メチレンジオキシベン
ゼン（ＤＭＢ）標識して、付属のマニュアルに従ってＨ
ＰＬＣで分析した。
【００２２】上記各実施例および比較例で得られた分析
結果を表１および表２に示す。 表１ 子牛血清由来フェツインの単糖組成 (mol/mol)*1 ──────────────────────────────────── 方法 ガラクト マンノー フコース GlcNAc GalNAc シアル酸 ース ース ──────────────────────────────────── 実施例１ 9.5 7.7 n.d.*2 11.2 2.0 10.5 実施例２ 9.5 8.0 n.d. 10.9 2.0 10.3 比較例１ 9.6 7.8 n.d. 8.1 2.5 12.2 比較例２ −*3 − − 10.8 1.9 − 比較例３ − − − − − 10.4 ──────────────────────────────────── 注）＊１： mol/mol ；分子量４８，４００として計算した。 ＊２： n.d. ；検出されなかった。 ＊３： − ；定量できない単糖。 GlcNAc：Ｎ−アセチルグルコサミン GalNAc：Ｎ−アセチルガラクトサミン
結果を表１および表２に示す。 表１ 子牛血清由来フェツインの単糖組成 (mol/mol)*1 ──────────────────────────────────── 方法 ガラクト マンノー フコース GlcNAc GalNAc シアル酸 ース ース ──────────────────────────────────── 実施例１ 9.5 7.7 n.d.*2 11.2 2.0 10.5 実施例２ 9.5 8.0 n.d. 10.9 2.0 10.3 比較例１ 9.6 7.8 n.d. 8.1 2.5 12.2 比較例２ −*3 − − 10.8 1.9 − 比較例３ − − − − − 10.4 ──────────────────────────────────── 注）＊１： mol/mol ；分子量４８，４００として計算した。 ＊２： n.d. ；検出されなかった。 ＊３： − ；定量できない単糖。 GlcNAc：Ｎ−アセチルグルコサミン GalNAc：Ｎ−アセチルガラクトサミン
【００２３】 表２ II3NeuGc α-LacCer と３′−シアリルラクトースの単糖組成 ──────────────────────────────────── ガラクトース グルコース シアル酸 ──────────────────────────────────── (molar ratio)*1 II3NeuGc α-LacCer 実施例３ 1.0 1.0 0.9 既知モル比 1.0 1.0 1.0 ３′−シアリルラクトース 実施例４ 1.0 0.9 1.0 既知モル比 1.0 1.0 1.0 ──────────────────────────────────── ＊１ molar ratio ；ガラクトースを１．０としたときのモル比を示した。
【００２４】表１に示したように、本発明方法を用いた
場合（実施例１および２）、糖組成物のシアル酸、中性
糖、アミノ糖の組成は一度の分析で得ることができる。
一方、比較例１では、Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcN
Ac）について正確な結果を得ることができない。また、
比較例２ではアミノ糖のみしか定量できず、比較例３で
はシアル酸のみの定量値しか得ることができない。つま
り、従来の方法を用いると少なくとも２種類の方法を駆
使しなければ正確な糖組成物のシアル酸、中性糖、アミ
ノ糖の組成を得ることはできない。また、表２に示した
ように、本発明方法を用いて得られた結果（実施例３お
よび４）は、糖脂質やオリゴ糖にも適用できることを示
しているだけでなく、本発明が、非常に正確な結果を得
ることができる方法であることも示している。
場合（実施例１および２）、糖組成物のシアル酸、中性
糖、アミノ糖の組成は一度の分析で得ることができる。
一方、比較例１では、Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcN
Ac）について正確な結果を得ることができない。また、
比較例２ではアミノ糖のみしか定量できず、比較例３で
はシアル酸のみの定量値しか得ることができない。つま
り、従来の方法を用いると少なくとも２種類の方法を駆
使しなければ正確な糖組成物のシアル酸、中性糖、アミ
ノ糖の組成を得ることはできない。また、表２に示した
ように、本発明方法を用いて得られた結果（実施例３お
よび４）は、糖脂質やオリゴ糖にも適用できることを示
しているだけでなく、本発明が、非常に正確な結果を得
ることができる方法であることも示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 31/00 Ｇ０１Ｎ 31/00 Ｖ (72)発明者 荒井 潤子 神奈川県逗子市桜山２−９−17 (72)発明者 西藤 桂子 神奈川県横浜市瀬谷区三ツ境155−13 Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BD20 DA07 EA02 FA07 4B063 QA01 QQ03 QQ68 QR15 QR18 QR41 QR50 QS17 QS28 QX01
Claims (5)
- 【請求項１】 糖組成物を構成する単糖を同時に定量分
析するに際し、（１）糖組成物からシアリダーゼもしく
は酸によりシアル酸を遊離させ、（２）遊離したシアル
酸をシアル酸アルドラーゼによりＮ−アシルマンノサミ
ンに変換し、（３）Ｎ−アシルマンノサミンおよび糖残
基を酸加水分解することを特徴とする糖組成物の単糖分
析方法。 - 【請求項２】 糖組成物を構成する単糖を同時に定量分
析するに際し、（１）糖組成物からシアリダーゼもしく
は酸によりシアル酸を遊離させ、（２）遊離したシアル
酸をシアル酸アルドラーゼによりＮ−アシルマンノサミ
ンに変換し、（３）Ｎ−アシルマンノサミンおよび糖残
基を酸加水分解し、（４）前記加水分解において脱Ｎ−
アシル化された単糖をＮ−アセチル化することを特徴と
する糖組成物の単糖分析方法。 - 【請求項３】 糖組成物を構成する単糖を同時に定量分
析するに際し、（１）糖組成物からシアリダーゼもしく
は酸によりシアル酸を遊離し、（２）遊離したシアル酸
をシアル酸アルドラーゼによりＮ−アシルマンノサミン
に変換し、（３）Ｎ−アシルマンノサミンおよび糖残基
を酸加水分解し、（４）前記加水分解において脱Ｎ−ア
シル化された単糖をＮ−アセチル化し、（５）前記で得
られた単糖を４−アミノ安息香酸エチル（ＡＢＥＥ）標
識化することを特徴とする糖組成物の単糖分析方法。 - 【請求項４】 各単糖の定量分析方法が高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）である請求項１ないし３のい
ずれか１項に記載の糖組成物の単糖分析方法。 - 【請求項５】 ＨＰＬＣによる各単糖の分析が、逆相カ
ラムを用い、溶離液にホウ酸緩衝液を用いる方法である
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の糖組成物の単
糖分析方法。
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| JP14972099A JP3689842B2 (ja) | 1999-05-28 | 1999-05-28 | 糖組成物の単糖分析方法 |
| US09/556,682 US6319680B1 (en) | 1999-05-28 | 2000-04-21 | Method for analyzing monosaccharide in a sugar composition |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14972099A JP3689842B2 (ja) | 1999-05-28 | 1999-05-28 | 糖組成物の単糖分析方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000333698A true JP2000333698A (ja) | 2000-12-05 |
| JP3689842B2 JP3689842B2 (ja) | 2005-08-31 |
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| JP14972099A Expired - Fee Related JP3689842B2 (ja) | 1999-05-28 | 1999-05-28 | 糖組成物の単糖分析方法 |
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| Country | Link |
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| US (1) | US6319680B1 (ja) |
| JP (1) | JP3689842B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013076649A (ja) * | 2011-09-30 | 2013-04-25 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 単糖分析用試料の製造方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2370539C (en) | 1999-04-23 | 2009-01-06 | Massachusetts Institute Of Technology | System and method for notating polymers |
| US20060127950A1 (en) * | 2004-04-15 | 2006-06-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and products related to the improved analysis of carbohydrates |
| US20060057638A1 (en) * | 2004-04-15 | 2006-03-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and products related to the improved analysis of carbohydrates |
| CN105136951A (zh) * | 2015-08-07 | 2015-12-09 | 华中农业大学 | 一种茶叶多糖单糖组成的快速定量方法 |
| KR20230116125A (ko) | 2022-01-27 | 2023-08-04 | 충남대학교산학협력단 | 점액성 물질 유래 중성 단당류 고감도 동시 정량방법 |
-
1999
- 1999-05-28 JP JP14972099A patent/JP3689842B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-04-21 US US09/556,682 patent/US6319680B1/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013076649A (ja) * | 2011-09-30 | 2013-04-25 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 単糖分析用試料の製造方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3689842B2 (ja) | 2005-08-31 |
| US6319680B1 (en) | 2001-11-20 |
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