JP2000316573A - ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのαサブユニットに対するモノクローナル抗体産生細胞株を用いる腹水作製方法、およびそれにより得られる腹水 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒト由来の絨毛性性腺刺激ホルモンのαサブ
ユニット（ｈＣＧ−α）に対するモノクローナル抗体を
産生する工業技術院生命工学工業技術研究所受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ６１０４号のモノクローナル抗体産生細胞
ラインを用いる、効率の良い腹水作製方法を提供するこ
と。 【解決手段】 腹水の作製方法であって、（ａ）実験動
物の腹腔内にプリスタンを投与する工程；（ｂ）プリス
タンの投与後に、ｈＣＧ−αに特異的に結合するモノク
ローナル抗体を産生する細胞ラインＦＥＲＭ ＢＰ６１
０４号を、実験動物の腹腔内に移植する工程；および
（ｃ）腹腔内に腹水が蓄積して、実験動物が弱り死亡す
る直前に腹水を採取する工程；を含む、方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト由来の絨毛性
性腺刺激ホルモンのαサブユニット（ｈＣＧ−α）に対
するモノクローナル抗体を、大量に効率的に産生させる
ための腹水作製方法に関する。本方法を用いることによ
り、抗ｈＣＧ−αモノクローナル抗体を高濃度に含有す
る腹水を得ることが出来る。この抗体は、妊娠時に体液
中に分泌されるｈＣＧの検出に利用することができるの
で、特に医療の分野に有効である。

【０００２】

【従来の技術】従来、モノクローナル抗体を作製するた
めに、大きく分けて２種類の方法が用いられてきた。一
つは、モノクローナル抗体産生細胞ラインをインビトロ
で培養する方法である。もう一つは、モノクローナル抗
体産生細胞ラインをインビボで培養する方法である。

【０００３】一つ目の方法では、モノクローナル抗体産
生細胞ラインを培養液中で培養する。細胞ラインから、
モノクローナル抗体が培養上清中に分泌され、この培養
上清を精製して、モノクローナル抗体を採取することが
できる。

【０００４】しかし、インビトロでの培養方法には、い
くつかの欠点がある。まず、培養上清中に分泌されるモ
ノクローナル抗体の濃度は、一般に、高くても約１００
μｇ／ｍｌ程度である。そのため、モノクローナル抗体
を大量に作製するためには、大量の培地で繰り返し細胞
を培養するか、または培地を少しずつ入れ替えて培養
（つまり灌流培養）する必要がある。

【０００５】低濃度の抗体を培養上清から精製すること
は、非常に手間およびコストがかかる。特に、モノクロ
ーナル抗体産生細胞の培養に用いられる培地は、一般に
血清を含むため、血清由来の不純イムノグロブリンが培
養上清に混入し得る。この不純イムノグロブリンを精製
によって完全に除去することは、きわめて困難である。

【０００６】不純イムノグロブリンの混入を防ぐため
に、無血清培地などを用いる培養方法もある。しかし、
モノクローナル抗体産生細胞を、抗体産生能を落とさず
に、そのような特殊な培地に慣れさせることは、やはり
困難を伴う。従って、多量の抗体を得るためには良い方
法とはいえない。

【０００７】灌流培養を行う場合、必要な培養装置が高
価であるという問題がある。さらに、培養系に雑菌が混
入しやすいため、無菌状態で長期間培養を継続すること
が困難であるという問題もある。

【０００８】二つ目の、インビボでの培養方法では、実
験動物の体内、例えば腹腔内にモノクローナル抗体産生
細胞ラインを導入する。導入され、増殖した細胞ライン
により、モノクローナル抗体が、例えば腹水中に分泌さ
れる。腹水を精製して、モノクローナル抗体を採取する
ことが出来る。

【０００９】抗体産生細胞のインビボでの培養方法によ
れば、腹水中に大量の抗体が産生される可能性がある。
しかし、各モノクローナル抗体産生細胞ラインごとに細
胞の性質は異なる。そのため、一般的に用いられるイン
ビボでの培養条件を任意に選択しても、適切でない場合
がある。

【００１０】例えば、実験動物に形質細胞腫（抗体を産
生する細胞腫）を誘発するための誘導剤として、種々の
薬剤（例えば、プリスタン、不完全フロイントアジュバ
ントなど）が知られている。しかし、使用するモノクロ
ーナル抗体産生細胞ラインによって、適切な誘導剤のタ
イプおよび量は変動し得る。また、誘導剤で処理された
実験動物の腹腔内に抗体産生細胞を注射しても、細胞の
移植が成立しない場合がある。移植が成立しても、移植
された抗体産生細胞が固形ガンとなって増殖するため
に、腹水内に分泌される抗体の量が少ない場合もある。
従って、大量のモノクローナル抗体を産生させるために
は、実験動物の種類、移植される抗体産生細胞の数など
を含む種々の条件を、使用する各モノクローナル抗体産
生細胞について、個別にかつ広範に検討する必要があ
る。

【００１１】ヒト由来の絨毛性性腺刺激ホルモンのαサ
ブユニット（human chorionic gonadotropinαsubuni
t；ｈＣＧ−α）に対するモノクローナル抗体を産生す
る細胞ラインとして、工業技術院生命工学工業技術研究
所受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ６１０４号（受託日平成９年
９月１７日）が付与されたモノクローナル抗体産生細胞
ラインがある。この特定の細胞ラインについて、効率の
良い腹水作製方法を提供することが望まれていた。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
の解決を意図するものであり、モノクローナル抗体産生
細胞ラインＦＥＲＭ ＢＰ６１０４号を用いてｈＣＧ−
αに対するモノクローナル抗体を大量に作製するために
最適化された、効率の良い腹水作製方法を提供すること
を目的とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ｈＣＧ−
αに対するモノクローナル抗体を産生する細胞ラインＦ
ＥＲＭ ＢＰ６１０４号に対して、腹水作製条件の最適
化を試みた。その結果、作製が容易で、コストが安く、
かつその後の精製操作が容易である、腹水作製方法を見
い出した。

【００１４】本発明の腹水の作製方法は、（ａ）実験動
物の腹腔内にプリスタンを投与する工程；（ｂ）プリス
タンの投与後に、ヒト由来の絨毛性性腺刺激ホルモンの
αサブユニット（ｈＣＧ−α）に特異的に結合するモノ
クローナル抗体を産生する、工業技術院生命工学工業技
術研究所受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ６１０４号の細胞ライ
ンを、該実験動物の腹腔内に移植する工程；および
（ｃ）該腹腔内に腹水が蓄積して、該実験動物が弱り死
亡する直前に該腹水を採取する工程；を包含する。

【００１５】一つの実施態様では、上記動物はマウスで
あり、プリスタンの投与量は約０．５〜約１．０ｍｌで
あり、そして上記細胞ラインはプリスタン投与後３〜１
０日目に約１×１０⁶〜約１×１０⁷個移植される。

【００１６】好ましい実施態様では、プリスタンの投与
量は約１．０ｍｌであり、上記細胞ラインはプリスタン
投与後３日目に約１×１０⁷個移植される。

【００１７】別の好ましい実施態様では、プリスタンの
投与量は約１．０ｍｌであり、上記細胞ラインはプリス
タン投与後５日目に約１×１０⁷個移植される。

【００１８】さらに別の好ましい実施態様では、プリス
タンの投与量は約１．０ｍｌであり、上記細胞ラインは
プリスタン投与後１０日目に約１×１０⁷個移植され
る。

【００１９】さらに別の好ましい実施態様では、プリス
タンの投与量は約０．５ｍｌであり、上記細胞ラインは
プリスタン投与後７日目に約１×１０⁶個移植される。

【００２０】本発明の腹水は、上記のいずれかの腹水作
製方法によって作製される。この腹水は、上記モノクロ
ーナル抗体を産生する細胞ラインＦＥＲＭ ＢＰ６１０
４号により産生される抗ｈＣＧ−αモノクローナル抗体
を含有する。

【００２１】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００２２】本発明においては、特に指示のない限り、
当該分野で公知である、タンパク質の分離および分析
法、ならびに免疫学的手法が採用され得る。これらの手
法は、市販の酵素、キット、抗体、標識物質などを使用
して行い得る。

【００２３】本明細書において、「実験動物」とは、そ
の腹腔内にモノクローナル抗体産生細胞ラインが適切に
注入されたとき、その移植が成立し得、腹水中にモノク
ローナル抗体が分泌され得る動物をいう。実験動物は、
代表的には哺乳動物である。哺乳動物の例として、マウ
ス、ラット、ウサギが挙げられる。好ましい哺乳動物の
例は、マウスである。マウスの例として、ＢＡＬＢ／Ｃ
系統、ＳＪＬ系統、ＮＺＢ系統、Ａ／Ｊ系統、Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６系統、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ系統、ＣＢＡ／ＪＮＣｒｊ系
統、ＤＢＡ／２系統のマウスが挙げられる。より好まし
いマウスの例は、ＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスである。実
験動物の齢は特に限定されないが、代表的には６週齢以
上であり、好ましくは１５週齢以上の大型のマウスであ
る。

【００２４】本明細書において、「実験動物が弱り死亡
する直前」とは、実験動物が、その腹腔に腹水が著しく
たまることにより衰弱し、実験動物の心臓は動いている
が、自力で動くのが困難な状態にあることをいう。

【００２５】大量の抗体を効率よく得るための腹水の作
製方法を、以下に実験の流れに沿って説明する。実験条
件は、細胞ラインＦＥＲＭ ＢＰ６１０４号からの抗体
産生のために最適化されている。

【００２６】１．プリスタンの投与 まず実験動物の腹腔内にプリスタンを投与する。プリス
タンの投与は、当該分野で周知の方法に従って行われる
が、通常は腹腔内注射により行われる。

【００２７】「プリスタン」とは、2,6,10,14−テトラ
メチルペンタデカンである。プリスタンは、一般にマウ
スに形質細胞腫を誘発するため、および誘発された形質
細胞腫の増殖を促進させるために用いられる誘導剤であ
る。

【００２８】プリスタンの投与量は、実験動物の種、
齢、性別、および後に移植する抗体産生細胞の性状に依
存して変化し得る。実験動物がマウスである場合、プリ
スタンの投与量は、マウス１匹当たり、約０．３〜約
２．０ｍｌであり得、好ましくは約０．５〜約１．０ｍ
ｌであり、さらにより好ましくは約１．０ｍｌである。

【００２９】２．抗体産生細胞の移植 プリスタン投与の後、モノクローナル抗体産生細胞を実
験動物の腹腔内に移植する。細胞の移植は、当該分野で
周知の方法に従って行われる。例えば、モノクローナル
抗体産生細胞の浮遊液を、実験動物の腹腔内に注射する
ことにより、移植が行われる。

【００３０】抗体産生細胞の移植は、好ましくはプリス
タンの投与後３日目〜１０日目に、より好ましくは３日
目、５日目、７日目、または１０日目に、さらにより好
ましくは５日目に行われる。

【００３１】本発明に用いられるモノクローナル抗体産
生細胞ラインは、工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託された、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ６１０４号の細胞
ラインである。この細胞ラインは、ヒト由来の絨毛性性
腺刺激ホルモンのαサブユニット（ｈＣＧ−α）で免疫
したＢＡＬＢ／Ｃマウスの脾臓細胞を、Ｐ３Ｘ６３−Ａ
ｇ８．６５３というマウス由来のミエローマ細胞と細胞
融合することにより得られた。この細胞ラインは、ｈＣ
ＧおよびｈＣＧ−αに特異的に結合するモノクローナル
抗体を産生する。このモノクローナル抗体のサブクラス
は、ＩｇＧ１である。

【００３２】モノクローナル抗体産生細胞は、通常溶液
に懸濁した状態、つまり細胞浮遊液の状態で移植する。
細胞を懸濁させる溶液の例としては、無菌ＰＢＳ（リン
酸緩衝溶液）が挙げられ得る。

【００３３】実験動物の腹腔内に移植する抗体産生細胞
の数は、代表的には約１×１０⁵〜約１×１０⁸個であ
り、好ましくは約５×１０⁵〜約５×１０⁷個であり、よ
り好ましくは約１×１０⁶〜約１×１０⁷個であり、さら
により好ましくは約１×１０ ⁷個である。

【００３４】３．腹水の採取 モノクローナル抗体産生細胞の移植から１〜２週間後、
実験動物の腹部が肥大し始めたら毎日観察を続ける。実
験動物の腹部が、妊娠した雌性実験動物の出産間際の頃
の膨らみ具合と同程度まで顕著に肥大し、実験動物が著
しく衰弱した時点で、腹腔内から腹水を採取することが
好ましい。腹部に蓄積される腹水量は少ないが、腹水中
のモノクローナル抗体の濃度が濃い場合もある。このよ
うな場合は、実験動物の衰弱の程度により判断し、適切
な時点で腹水を採取する。腹水は、モノクローナル抗体
産生細胞の移植後、代表的には約７〜約２０日目、好ま
しくは約８〜約１８日目、より好ましくは約９〜約１４
日目に採取される。

【００３５】本発明の方法に従って腹水を作製すれば、
実験途中で実験動物が死亡する確率、および移植が成立
しない確率が非常に低い。また、移植が成立した実験動
物における固形ガンの発症頻度も非常に低い。従って、
多量のモノクローナル抗体を含有する腹水を、再現性良
く作製し得る。

【００３６】実験動物からの腹水の採取は、当該分野で
周知の方法に従って行われる。例えば、実験動物をエー
テルで軽く麻酔し、麻酔した実験動物をビーカーの上に
保持し、針を用いて腹部の皮膚と腹壁に穴をあける。こ
の穴から、腹水をビーカーに滴下することにより、腹水
を採取し得る。あるいは、麻酔した実験動物を仰向けに
置き、実験動物の左側から腹腔に針を挿入する。挿入し
た針の先端が脾臓横の上部にくるようにした状態で、腹
水を注射筒にゆっくりと吸引することによって、腹水を
採取し得る。

【００３７】採取した腹水に含まれるモノクローナル抗
体の濃度は、通常は抗体を精製した後に、当該分野で周
知の方法で測定し得る。モノクローナル抗体の濃度の測
定方法の例としては、吸光光度法、酵素免疫測定法、蛍
光抗体法などが挙げられる。吸光光度法では、例えばモ
ノクローナル抗体を含む溶液の２８０ｎｍの吸光度を測
定して、吸光係数から換算することにより濃度を測定す
る。さらに、抗体濃度および腹水量から、腹水中のモノ
クローナル抗体の全量が算出される。

【００３８】本発明の方法に従って作製された腹水か
ら、当該分野で周知の方法で、モノクローナル抗体を精
製し得る。精製のためには、例えばプロテインＡを用い
る精製方法、ＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー
による精製方法、アフィニティークロマトグラフィーに
よる精製方法、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール
分画法が適宜組み合わせて用いられる。

【００３９】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるもの
ではない。

【００４０】各実施例は、表１を参照しながら説明す
る。

【００４１】

【表１】

【００４２】使用した抗体産生細胞は、すべて受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ６１０４号のモノクローナル抗体産生細
胞ラインのものである。使用したマウスは、すべて雌の
ＢＡＬＢ／Ｃ系統（１５週齢）である。

【００４３】採取された腹水に含まれる、ｈＣＧ−αに
対して特異的な抗体は、以下の方法で精製した後に、そ
の濃度を決定した。

【００４４】まず、プロテインＡ（Protein A Sepharos
e 4 Fast Flow；Pharmacia社製）を充填したカラムを、
結合緩衝液（１．５Ｍ グリシン・３Ｍ ＮａＣｌ、ｐ
Ｈ８．９）で平衡化する。マウスから得られた腹水を、
結合緩衝液で３倍に希釈した後、平衡化したカラムにア
プライする。カラムからの溶出液を２８０ｎｍでモニタ
ーしながら、不純物の溶出が終了するまでカラムを結合
緩衝液で洗浄する。洗浄後、溶出緩衝液１（１００ｍＭ
クエン酸、ｐＨ６）、溶出緩衝液２（１００ｍＭ ク
エン酸、ｐＨ５）、および溶出緩衝液３（１００ｍＭ
クエン酸、ｐＨ４）を順次カラムにアプライ（線流速：
約５〜２０ｃｍ／ｈ）し、ＩｇＧ含有溶出液を回収す
る。

【００４５】回収したＩｇＧ含有画分について、吸光光
度計で２８０ｎｍの吸光度を測定した。測定された吸光
度を吸光係数で換算することにより、抗体の濃度を決定
した。なお、この方法により回収されたＩｇＧ含有画分
について、常法に従ってＳＤＳ電気泳動により純度を確
認したところ、不純物の混入は検出限界以下であった。

【００４６】（実施例１）５匹のマウスの腹腔内に、１
ｍｌのプリスタンを注射した。

【００４７】プリスタン投与の３日後、無菌ＰＢＳ中に
抗体産生細胞を懸濁して、１×１０ ⁸個／ｍｌの細胞浮
遊液を調製した。細胞浮遊液１００μｌ（０．１ｍｌ）
を、腹腔内に注射した。これにより、１×１０⁷個の細
胞がマウスの腹腔内に移植された。

【００４８】細胞移植後９日目に、マウスの腹部が顕著
に肥大した。そこで、腹腔内から腹水を採取した。腹部
の膨らみのやや少ないマウスはさらに１日状態を観察
し、１０日目に腹腔内から腹水を採取した。

【００４９】抗体産生細胞を移植したマウスでは、いず
れも移植が成立した。実験途中に死亡したマウスは１匹
存在したが、固形ガンを発症したマウスは存在しなかっ
た。

【００５０】表１に示すように、採取された腹水量は、
マウス１匹当たり平均１．３ｍｌであった。腹水中の抗
体濃度は、平均１．５ｍｇ／ｍｌであった。従って、マ
ウス１匹当たり平均１．９５ｍｇの抗体が得られた。

【００５１】（実施例２）５匹のマウスの腹腔内に、１
ｍｌのプリスタンを注射した。

【００５２】プリスタン投与の５日後、無菌ＰＢＳ中に
抗体産生細胞を懸濁して、１×１０ ⁸個／ｍｌの細胞浮
遊液を調製した。細胞浮遊液１００μｌ（０．１ｍｌ）
を、腹腔内に注射した。これにより、１×１０⁷個の細
胞がマウスの腹腔内に移植された。

【００５３】細胞移植後９日目に、マウスの腹部が顕著
に肥大した。そこで、腹腔内から腹水を採取した。腹部
の膨らみのやや少ないマウスはさらに１日状態を観察
し、１０日目に腹腔内から腹水を採取した。

【００５４】抗体産生細胞を移植したマウスでは、いず
れも移植が成立した。実験途中に死亡したマウスは１匹
存在したが、固形ガンを発症したマウスは存在しなかっ
た。

【００５５】表１に示すように、採取された腹水量は、
マウス１匹当たり平均１．８ｍｌであった。腹水中の抗
体濃度は、平均１．７ｍｇ／ｍｌであった。従って、マ
ウス１匹当たり平均３．０６ｍｇの抗体が得られた。

【００５６】（実施例３）５匹のマウスの腹腔内に、１
ｍｌのプリスタンを注射した。

【００５７】プリスタン投与の１０日後、無菌ＰＢＳ中
に抗体産生細胞を懸濁して、１×１０⁸個／ｍｌの細胞
浮遊液を調製した。細胞浮遊液１００μｌ（０．１ｍ
ｌ）を、腹腔内に注射した。これにより、１×１０⁷個
の細胞がマウスの腹腔内に移植された。

【００５８】細胞移植後９日目に、マウスの腹部が顕著
に肥大し始めた。そこで、腹部の肥大が顕著なマウスの
腹腔内から腹水を採取した。腹部の膨らみのやや少ない
マウスはさらに状態を観察し、１０日目および１１日目
に腹腔内から腹水を採取した。

【００５９】抗体産生細胞を移植したマウスでは、移植
が成立しなかったマウスが１匹存在した。実験途中に死
亡したマウスは１匹存在した。固形ガンを発症したマウ
スは存在しなかった。

【００６０】表１に示すように、採取された腹水量は、
マウス１匹当たり平均１．０ｍｌであった。腹水中の抗
体濃度は、平均１．１ｍｇ／ｍｌであった。従って、マ
ウス１匹当たり平均１．１０ｍｇの抗体が得られた。

【００６１】（実施例４）５匹のマウスの腹腔内に、
０．５ｍｌのプリスタンを注射した。

【００６２】プリスタン投与の７日後、無菌ＰＢＳ中に
抗体産生細胞を懸濁して、１×１０ ⁷個／ｍｌの細胞浮
遊液を調製した。細胞浮遊液１００μｌ（０．１ｍｌ）
を、腹腔内に注射した。これにより、１×１０⁶個の細
胞がマウスの腹腔内に移植された。

【００６３】細胞移植後１１日目に、マウスの腹部が顕
著に肥大し始めた。そこで、腹部の肥大が顕著なマウス
の腹腔内から腹水を採取した。腹部の膨らみのやや少な
いマウスはさらに状態を観察し、１４日目までに腹腔内
から腹水を採取した。

【００６４】抗体産生細胞を移植したマウスでは、いず
れも移植が成立した。実験途中に死亡したマウスは１匹
存在したが、固形ガンを発症したマウスは存在しなかっ
た。

【００６５】表１に示すように、採取された腹水量は、
マウス１匹当たり平均１．１ｍｌであった。腹水中の抗
体濃度は、平均２．３ｍｇ／ｍｌであった。従って、マ
ウス１匹当たり平均２．５３ｍｇの抗体が得られた。

【００６６】以上のように、本実施例の方法によって、
マウス１匹当たり１．１ｍｇから３．０６ｍｇのモノク
ローナル抗体を含む腹水が得られた。

【００６７】

【発明の効果】本発明によれば、工業技術院生命工学工
業技術研究所 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ６１０４号のモ
ノクローナル抗体産生細胞ラインを用いる、効率的な腹
水作製方法が提供される。さらに、腹水の作製が容易で
あり、コストが低く、かつ腹水からの抗体の精製が容易
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 宮▲崎▼ 仁誠 大阪府門真市大字門真1006番地 松下電器 産業株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA44 BA61 HA03 HA20 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 腹水の作製方法であって、 （ａ）実験動物の腹腔内にプリスタンを投与する工程； （ｂ）プリスタンの投与後に、ヒト由来の絨毛性性腺刺
   激ホルモンのαサブユニット（ｈＣＧ−α）に特異的に
   結合するモノクローナル抗体を産生する、工業技術院生
   命工学工業技術研究所受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ６１０４
   号の細胞ラインを、該実験動物の腹腔内に移植する工
   程；および （ｃ）該腹腔内に腹水が蓄積して、該実験動物が弱り死
   亡する直前に該腹水を採取する工程；を包含する方法。
2. 【請求項２】 前記実験動物がマウスであり、プリスタ
   ンの投与量が約０．５〜約１．０ｍｌであり、そして前
   記細胞ラインがプリスタン投与後３〜１０日目に約１×
   １０⁶〜約１×１０⁷個移植される、請求項１に記載の腹
   水作製方法。
3. 【請求項３】 プリスタンの投与量が約１．０ｍｌであ
   り、そして前記細胞ラインがプリスタン投与後３日目に
   約１×１０⁷個移植される、請求項２に記載の腹水作製
   方法。
4. 【請求項４】 プリスタンの投与量が約１．０ｍｌであ
   り、そして前記細胞ラインがプリスタン投与後５日目に
   約１×１０⁷個移植される、請求項２に記載の腹水作製
   方法。
5. 【請求項５】 プリスタンの投与量が約１．０ｍｌであ
   り、そして前記細胞ラインがプリスタン投与後１０日目
   に約１×１０⁷個移植される、請求項２に記載の腹水作
   製方法。
6. 【請求項６】 プリスタンの投与量が約０．５ｍｌであ
   り、そして前記細胞ラインがプリスタン投与後７日目に
   約１×１０⁶個移植される、請求項２に記載の腹水作製
   方法。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１項に記載の腹
   水作製方法によって作製された腹水。