JP2000262297A - Measurement of substance using enzyme-immobilized electrode - Google Patents
Measurement of substance using enzyme-immobilized electrodeInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の物質の量
を酵素固定化電極を用いて測定する方法に関する。[0001] The present invention relates to a method for measuring the amount of a substance in a sample using an enzyme-immobilized electrode.
【０００２】[0002]
【従来の技術】試料中の物質の量を測定する方法として
は、測定対象物質を基質とする酵素を用いて、分光学的
に測定する方法、光電子倍増管を使用する方法、電極を
用いて電気化学的に測定する方法、放射性同位元素を使
用する方法等が分析分野において使用されている。なか
でも、分光学的測定法は、測定手技、方法の容易さから
広く用いられているが、測定に際し、設備や装置のある
場所でしか測定できない問題がある。同様の問題は光電
子倍増管を使用する方法、放射性同位元素を用いる方法
にもあてはまる。2. Description of the Related Art As a method of measuring the amount of a substance in a sample, a method of spectrophotometric measurement using an enzyme using a substance to be measured as a substrate, a method of using a photomultiplier tube, and a method of using an electrode. Methods for electrochemical measurement, methods using radioisotopes, and the like are used in the field of analysis. Above all, the spectroscopic measurement method is widely used because of the easiness of the measurement technique and method, but there is a problem that the measurement can be performed only at a place where facilities and devices are present. Similar problems apply to the method using a photomultiplier tube and the method using a radioisotope.
【０００３】これらに対し電極を用いる電気化学的測定
方法は、機器が極めてコンパクトで持ち運びが可能であ
るため、測定する場所を選ばない特徴を有する。近年、
このような電気化学的測定方法に使用される電極の一種
として、酵素センサーまたは酵素電極とよばれる酵素固
定化電極が開発されており、糖尿病患者の家庭における
血糖コントロール等に利用されるようになってきてい
る。ところが現状の酵素固定化電極は、試料中に含まれ
る還元物質による干渉を受ける、あるいは酵素の失活に
より繰り返し使用することができない、電極が安定する
までに長時間を要する等の問題がある。On the other hand, the electrochemical measurement method using an electrode has a feature that the instrument is extremely compact and portable, so that it can be used anywhere. recent years,
As one type of electrode used in such an electrochemical measurement method, an enzyme-immobilized electrode called an enzyme sensor or an enzyme electrode has been developed, and has been used for controlling blood sugar in a home of a diabetic patient. Is coming. However, the current enzyme-immobilized electrode has problems that it is interfered by reducing substances contained in the sample, cannot be used repeatedly due to deactivation of the enzyme, and it takes a long time until the electrode is stabilized.
【０００４】現在、小型簡易センサーに応用されている
方法は、過酸化水素の酸化電流を測定する方法である。
この方法は、電極が正電位の時、Ｈ2 Ｏ2 →２Ｈ+ ＋Ｏ
2 ＋２ｅの反応が生じ、電子が電極に取り込まれること
を利用しており、例えば白金電極を用いて、５００〜７
００ｍＶで過酸化水素より生じる酸化電流を測定するも
のである。しかし、電極電位が高くなると多くの物質の
酸化電流が出現するので、基底電流が大きくなり測定に
は好ましくない。これらの影響は、分画分子量の小さい
透析膜で被覆しても完全に阻止することはできない。[0004] At present, a method applied to a small and simple sensor is a method of measuring an oxidation current of hydrogen peroxide.
In this method, when the electrode is at a positive potential, H 2 O 2 → 2H + + O
It utilizes the fact that a 2 + 2e reaction occurs and electrons are taken into the electrode.
It measures the oxidation current generated from hydrogen peroxide at 00 mV. However, when the electrode potential increases, oxidation current of many substances appears, so that the base current increases, which is not preferable for measurement. These effects cannot be completely prevented by coating with a dialysis membrane having a small molecular weight cut-off.
【０００５】他の方法として、過酸化水素の還元電流を
測定する方法も考えられる。これは、電極が負電位の場
合、Ｈ2 Ｏ2 ＋２Ｈ+ ＋２ｅ→２Ｈ2 Ｏの反応が生じ電
子が電極より放出される反応を利用するものである。し
かし、通常の白金や炭素電極では、過酸化水素の還元電
流は、酸素の還元電流が出現する電位よりわずかに正の
電位で出現するので、その測定には溶存酸素の除去が必
要である。従って、溶存酸素を必要とする酸化酵素を作
用させながら過酸化水素の還元電流を測定することは測
定範囲、測定感度の低下をもたらす。[0005] As another method, a method of measuring the reduction current of hydrogen peroxide can be considered. This utilizes a reaction in which a reaction of H 2 O 2 + 2H + + 2e → 2H 2 O occurs when the electrode is at a negative potential and electrons are emitted from the electrode. However, with a normal platinum or carbon electrode, the reduction current of hydrogen peroxide appears at a slightly more positive potential than the potential at which the reduction current of oxygen appears, and thus the measurement requires removal of dissolved oxygen. Therefore, measuring the reduction current of hydrogen peroxide while allowing an oxidase that requires dissolved oxygen to act causes a decrease in measurement range and measurement sensitivity.
【０００６】分光光学的測定方法において、広く利用さ
れている過酸化水素を検出する手段としては、パーオキ
シダーゼ、４−アミノアンチピリン等のカップラー、お
よびフェノール等の還元性色原体を共存させることによ
ってキノンイミン色素を生成させ、その生成量を吸光度
として測定する方法が挙げられる。この方法によれば、
酸化酵素を用いて過酸化水素を生成させる場合、生成し
た過酸化水素と吸光度との間には良好な相関関係が認め
られる。しかし、脱水素酵素と電子伝達物質とを用いて
生成させた過酸化水素を、酸化酵素を用いて生成させた
過酸化水素を測定するのと同様の方法で吸光度測定する
と、生成した過酸化水素に比例した測定感度が得られな
い問題が指摘されている。この原因としては、電子受容
体と還元性色素がパーオキシダーゼ存在下、直接電子の
やり取りを行うため、過酸化水素が生成されなくなり、
十分な発色が得られなくなるためと考えられている。同
様の問題は、パーオキシダーゼを固定化した電極を用い
てその還元電流を測定する方法にも生じる。[0006] In the spectroscopic measurement method, a widely used means for detecting hydrogen peroxide is to coexist with a coupler such as peroxidase and 4-aminoantipyrine and a reducing chromogen such as phenol. A method of producing a quinone imine dye and measuring the produced amount as an absorbance is exemplified. According to this method,
When hydrogen peroxide is produced using an oxidase, a good correlation is observed between the produced hydrogen peroxide and the absorbance. However, if the absorbance of hydrogen peroxide generated using a dehydrogenase and an electron mediator is measured by the same method as that for measuring hydrogen peroxide generated using an oxidase, the generated hydrogen peroxide is obtained. It has been pointed out that a measurement sensitivity in proportion to is not obtained. As a cause of this, hydrogen peroxide is not generated because the electron acceptor and the reducing dye directly exchange electrons in the presence of peroxidase,
It is considered that sufficient coloring cannot be obtained. A similar problem occurs in the method of measuring the reduction current using an electrode on which peroxidase is immobilized.
【０００７】この問題を解決する手段として、特許第２
０４５９０８号には第一段階目の反応で過酸化水素を生
成させ、第二段階目の反応で発色反応を行う方法が記載
されている。しかしながら、この方法は、過酸化水素の
生成が完全に終了した後、発色反応を行う必要があるた
め、反応時間のコントロールが困難であり、手技の問題
があった。As means for solving this problem, Patent No. 2
No. 045908 describes a method in which hydrogen peroxide is generated in a first-stage reaction and a color-forming reaction is performed in a second-stage reaction. However, in this method, it is necessary to carry out a color-forming reaction after the generation of hydrogen peroxide is completely completed, so that it is difficult to control the reaction time and there is a problem in the technique.
【０００８】[0008]
【発明が解決しようとする課題】以上のことから、酵素
固定化電極を用いて試料中の物質の量を過酸化水素に変
換して電気化学的に測定する方法において、過酸化水素
の酸化電流を測定する方法では、溶存酸素、共存物質の
影響を受けるので、電流が安定して測定可能になるまで
長時間を要し、また測定範囲および測定感度が低下する
という問題があり、さらに測定の際の電極電位により電
極に固定化された酵素は失活しやすく、電極を繰り返し
て使用することが困難であるという問題があった。一
方、過酸化水素の還元電流を測定する方法においては、
測定の際は溶存酸素を除去する必要があり、また、脱水
素酵素と電子伝達物質とを用いて試料中の物質より過酸
化水素を生成させる場合は、過酸化水素を定量的に生成
させることが困難であるため、試料中の物質の量に比例
した還元電流が得られないか、または試料中の物質より
過酸化水素を生成させながらその還元電流を測定するこ
とができない等の問題があった。SUMMARY OF THE INVENTION From the above, in the method of electrochemically measuring the amount of a substance in a sample by converting it to hydrogen peroxide using an enzyme-immobilized electrode, the oxidation current of hydrogen peroxide In the method of measuring, it is affected by dissolved oxygen and coexisting substances.Therefore, it takes a long time until the current can be measured stably, and the measurement range and measurement sensitivity are reduced. The enzyme immobilized on the electrode is easily deactivated due to the electrode potential at that time, and there is a problem that it is difficult to repeatedly use the electrode. On the other hand, in the method of measuring the reduction current of hydrogen peroxide,
It is necessary to remove dissolved oxygen during the measurement, and if hydrogen peroxide is generated from the substance in the sample using a dehydrogenase and an electron mediator, quantitatively generate hydrogen peroxide. Are difficult to obtain, a reduction current proportional to the amount of the substance in the sample cannot be obtained, or the reduction current cannot be measured while generating hydrogen peroxide from the substance in the sample. Was.
【０００９】[0009]
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題点
を解決するために鋭意検討した結果、試料中の物質より
過酸化水素を生成させ、電子メディエーターを含有し、
かつ酵素が固定化された電極端子を有する電極であっ
て、該過酸化水素がセルロースアセテート膜またはポリ
カーボネート膜を透過して該酵素と接触するように該膜
が形成されている電極を用いて、該過酸化水素から生じ
る還元電流を測定する場合、試料中の物質を再現性良く
測定でき、かつ様々な物質の測定に応用できること、さ
らにセルロースアセテート膜またはポリカーボネート膜
を用いることによって、通常の透析膜を使用した場合と
比較して高感度で測定できることを見出し、本発明を完
成するに至った。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, produced hydrogen peroxide from a substance in a sample, contained an electron mediator,
And an electrode having an electrode terminal on which the enzyme is immobilized, wherein the electrode is formed such that the hydrogen peroxide passes through a cellulose acetate membrane or a polycarbonate membrane and contacts the enzyme. When measuring the reduction current generated from the hydrogen peroxide, the substance in the sample can be measured with good reproducibility, and it can be applied to the measurement of various substances, and further, by using a cellulose acetate membrane or a polycarbonate membrane, a normal dialysis membrane can be used. It has been found that measurement can be performed with higher sensitivity as compared with the case where is used, and the present invention has been completed.
【００１０】すなわち本発明は以下の通りである： ［１］試料中に含まれる物質より過酸化水素を生成さ
せ、該過酸化水素を、電子メディエーターを含有し、か
つ酵素が固定化された電極端子を有する電極であって、
該過酸化水素がセルロースアセテート膜またはポリカー
ボネート膜を透過して該酵素と接触するように該膜が形
成されている電極を用いて測定することを特徴とする物
質の測定方法。 ［２］上記セルロースアセテート膜またはポリカーボネ
ート膜が、荷電処理を施されている［１］記載の物質の
測定方法。 ［３］上記試料中に含まれる物質より過酸化水素を生成
させる方法が、試料中に含まれる物質に、脱水素酵素、
該酵素の補酵素および電子伝達物質を作用させるか、ま
たは試料中に含まれる脱水素酵素に、該酵素の基質およ
び補酵素、および電子伝達物質を作用させる方法である
［１］または［２］記載の物質の測定方法。 ［４］上記脱水素酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオシド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオシドリ
ン酸およびピロロキノリンキノンからなる群より選ばれ
る補酵素の存在下で作用する酵素、またはトリプトファ
ントリプトフィルキノン酵素である［３］記載の物質の
測定方法。 ［５］上記電子伝達物質が、フェナジンメトサルフェー
ト、１−メトキシ−５−フェナジンメトサルフェート、
メルドラブルーおよびチオニンからなる群より選ばれる
物質である［３］記載の物質の測定方法。 ［６］上記酵素がパーオキシダーゼである［１］または
［２］記載の物質の測定方法。 ［７］上記電子メディエーターが、メタロセン類または
ビピリジン錯体である［１］または［２］記載の物質の
測定方法。That is, the present invention is as follows: [1] Hydrogen peroxide is generated from a substance contained in a sample, and the hydrogen peroxide is converted to an electrode containing an electron mediator and having an enzyme immobilized thereon. An electrode having a terminal,
A method for measuring a substance, comprising using an electrode provided with a membrane so that the hydrogen peroxide passes through a cellulose acetate membrane or a polycarbonate membrane and comes into contact with the enzyme. [2] The method for measuring a substance according to [1], wherein the cellulose acetate film or the polycarbonate film is charged. [3] The method for producing hydrogen peroxide from the substance contained in the sample includes the steps of:
A method in which a coenzyme and an electron transfer substance of the enzyme are allowed to act, or a substrate of the enzyme, a coenzyme, and an electron transfer substance are allowed to act on a dehydrogenase contained in a sample [1] or [2]. Method for measuring the substances described. [4] An enzyme which acts in the presence of a coenzyme selected from the group consisting of nicotinamide adenine dinucleoside, nicotinamide adenine dinucleoside phosphate and pyrroloquinoline quinone, or a tryptophan tryptofilquinone enzyme A method for measuring a substance according to [3]. [5] The electron mediator is phenazine methosulfate, 1-methoxy-5-phenazine methosulfate,
The method for measuring a substance according to [3], which is a substance selected from the group consisting of Meldora Blue and Thionine. [6] The method for measuring a substance according to [1] or [2], wherein the enzyme is peroxidase. [7] The method for measuring a substance according to [1] or [2], wherein the electron mediator is a metallocene or a bipyridine complex.
【００１１】[0011]
【発明の実施の形態】本発明の物質の測定方法に使用さ
れる電極は、電子メディエーターを含有し、かつ酵素が
固定化された電極端子を有する電極であって、試料中の
物質より生成した過酸化水素がセルロースアセテート膜
またはポリカーボネート膜を透過して該酵素と接触する
ように該膜が形成されている電極である。「該過酸化水
素がセルロースアセテート膜またはポリカーボネート膜
を透過して該酵素と接触するように該膜が形成されてい
る」とは、試料中に含まれる物質より生成した過酸化水
素が、セルロースアセテート膜またはポリカーボネート
膜を透過して、過酸化水素の測定に関与する電極端子の
固定化された酵素と接触して測定が行われるように該膜
が形成されていることを意味する。過酸化水素がセルロ
ースアセテート膜またはポリカーボネート膜を透過して
電極端子に固定化された酵素と接触するように該膜が形
成されていることによって、測定に悪影響を及ぼす試料
中の共存物質が酵素に接触する機会が低減されるので、
その影響を抑えることができる。また、セルロースアセ
テート膜またはポリカーボネート膜は、過酸化水素の膜
透過速度が通常の透析膜より速いので、通常の透析膜を
用いた場合に比較して高感度で測定することができる。
また、上記電極は、過酸化水素がセルロースアセテート
膜またはポリカーボネート膜を透過して電極端子に固定
化された酵素と接触するように該膜が形成されている限
り、どのような形態のものでもよいが、例えば、電極全
体がセルロースアセテート膜またはポリカーボネート膜
で覆われたもの、電極の試料と接触する部分がセルロー
スアセテート膜またはポリカーボネート膜で被覆された
もの、電極端子の酵素が固定化された部分がセルロース
アセテート膜またはポリカーボネート膜で被覆されたも
の等が挙げられる。好適には電極端子の酵素が固定化さ
れた部分がセルロースアセテート膜またはポリカーボネ
ート膜で被覆されたものが挙げられる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION An electrode used in the method for measuring a substance according to the present invention is an electrode containing an electron mediator and having an electrode terminal on which an enzyme is immobilized, and is formed from a substance in a sample. An electrode on which the hydrogen peroxide is formed so that the membrane passes through the cellulose acetate membrane or the polycarbonate membrane and comes into contact with the enzyme. "The membrane is formed such that the hydrogen peroxide permeates through the cellulose acetate membrane or the polycarbonate membrane and comes into contact with the enzyme" means that the hydrogen peroxide generated from the substance contained in the sample is cellulose acetate. This means that the membrane is formed such that the measurement is performed by contacting the enzyme immobilized on the electrode terminal involved in the measurement of hydrogen peroxide through the membrane or the polycarbonate membrane. Since the membrane is formed such that hydrogen peroxide passes through the cellulose acetate membrane or the polycarbonate membrane and comes into contact with the enzyme immobilized on the electrode terminal, coexisting substances in the sample that adversely affect the measurement are removed by the enzyme. Because the chance of contact is reduced,
The influence can be suppressed. In addition, the cellulose acetate membrane or the polycarbonate membrane has a higher permeation rate of hydrogen peroxide than a normal dialysis membrane, and thus can be measured with higher sensitivity than when a normal dialysis membrane is used.
Further, the electrode may be of any form as long as the membrane is formed so that hydrogen peroxide passes through a cellulose acetate membrane or a polycarbonate membrane and comes into contact with an enzyme immobilized on an electrode terminal. However, for example, the entire electrode is covered with a cellulose acetate film or a polycarbonate film, the portion of the electrode that contacts the sample is covered with a cellulose acetate film or a polycarbonate film, and the portion of the electrode terminal on which the enzyme is immobilized is immobilized. Examples thereof include those coated with a cellulose acetate film or a polycarbonate film. Preferably, an electrode terminal in which the enzyme-immobilized portion is covered with a cellulose acetate film or a polycarbonate film is used.
【００１２】上記電極に使用されるセルロースアセテー
ト膜またはポリカーボネート膜の種類としては、特に限
定されないが、好ましくは荷電処理を施されているもの
が挙げられる。荷電処理を施されることによって上記膜
にイオン性が付与される。上記膜の荷電処理の方法とし
ては、好ましくはナフィオン（登録商標）を膜に蒸着さ
せる方法であるナフィオン（登録商標）修飾が挙げられ
る。ナフィオン（登録商標）修飾の方法は、特に限定さ
れないが、例えば、ナフィオン（登録商標）のエタノー
ル溶液（１％（ｗ／ｖ））に上記膜を常温、常圧下にお
いて、少なくとも１時間以上浸漬し、次いで溶媒を常温
にて除去することにより行うことができる。また、ナフ
ィオン（登録商標）修飾の程度は、特に限定されない
が、ナフィオン（登録商標）修飾された膜の厚さが５〜
６μｍ程度であることが好ましい。The type of the cellulose acetate film or the polycarbonate film used for the electrode is not particularly limited, but preferably includes those subjected to a charge treatment. The ionicity is imparted to the film by performing the charging treatment. As a method of the charge treatment of the film, Nafion (registered trademark) modification, which is a method of preferably depositing Nafion (registered trademark) on the film, may be mentioned. The method of Nafion (registered trademark) modification is not particularly limited. For example, the membrane is immersed in an ethanol solution of Nafion (registered trademark) (1% (w / v)) at normal temperature and normal pressure for at least one hour. Then, the solvent can be removed at room temperature. The degree of Nafion (registered trademark) modification is not particularly limited, but the thickness of the Nafion (registered trademark) -modified membrane is 5 to 5.
It is preferably about 6 μm.
【００１３】上記膜の分画分子量としては、特に限定さ
れないが、好適には５００以下であり、またその下限も
特に限定されないが１００が好ましい。The molecular weight cut off of the membrane is not particularly limited, but is preferably 500 or less, and the lower limit is not particularly limited, but is preferably 100.
【００１４】上記電極の電極端子としては、カーボンペ
ースト電極端子、パーフルオロカーボン（ＰＦＣ）電極
端子等が挙げられ、好ましくはカーボンペースト電極端
子が挙げられる。Examples of the electrode terminals of the electrodes include a carbon paste electrode terminal and a perfluorocarbon (PFC) electrode terminal, and preferably a carbon paste electrode terminal.
【００１５】上記電極端子は、酵素が固定化されたもの
であれば、その形状、酵素の固定化方法等は特に限定さ
れない。また、電極端子に固定化される酵素は、過酸化
水素を還元する作用を有する酵素であり、例えばパーオ
キシダーゼ等が挙げられる。また、それらの種類、由来
（供給源）等は特に限定されないが、例えば植物（例え
ば西洋ワサビ、ピーナッツ等）、ならびにこれらの遺伝
子を大腸菌その他の微生物に組み込ませた遺伝子組み換
え法により製造されたものおよび遺伝子的に性質を改変
したもの等から由来するものが挙げられる。The shape and the method of immobilizing the enzyme are not particularly limited as long as the enzyme is immobilized on the electrode terminal. The enzyme immobilized on the electrode terminal is an enzyme having an action of reducing hydrogen peroxide, such as peroxidase. The kind, origin (supply source) and the like thereof are not particularly limited. For example, plants (eg, horseradish, peanuts, etc.), and those produced by a genetic recombination method incorporating these genes into Escherichia coli and other microorganisms And those derived from genetically modified properties.
【００１６】上記電極端子は、構成成分として電子メデ
ィエーターを含む。「電子メディエーター」とは、電子
を受け渡す反応に関与するが、その物質自体は変化しな
い物質であって、測定感度を高めるために電極端子に含
有される物質である。上記電極端子に使用される電子メ
ディエーターとしては、上記のような物質である限り特
に限定されないが、例えばメタロセン類（例えばフェロ
センまたはフェロセン類似体等）、およびオスミウム、
ルテニウム、コバルト、ニッケル等の金属とビピリジン
とから形成されるビピリジン錯体（例えばコバルト（Ｉ
ＩＩ）ビピリジン錯体およびニッケル（ＩＩ）ビピリジ
ン錯体等）等が挙げられる。好適には、フェロセンまた
はフェロセン類似体（例えばモノカルボキシレートフェ
ロセン、ヒドロキシフェロセン、ジメチルアミノメチル
フェロセン、１，１’−ジカルボキシレートフェロセン
等）が挙げられ、特に好適にはヒドロキシフェロセンが
挙げられる。また、この電子メディエーターは、上記電
極端子に全構成成分の０．５〜１０重量％、好適には１
〜５重量％含有される。The electrode terminal contains an electron mediator as a constituent. An “electron mediator” is a substance that participates in a reaction of transferring electrons but does not change the substance itself, and is a substance contained in an electrode terminal in order to increase measurement sensitivity. The electron mediator used for the electrode terminal is not particularly limited as long as it is a substance as described above. For example, metallocenes (eg, ferrocene or a ferrocene analog or the like), and osmium,
Bipyridine complexes formed from metals such as ruthenium, cobalt and nickel and bipyridine (for example, cobalt (I
II) bipyridine complexes and nickel (II) bipyridine complexes). Preferably, ferrocene or a ferrocene analog (for example, monocarboxylate ferrocene, hydroxyferrocene, dimethylaminomethylferrocene, 1,1′-dicarboxylate ferrocene, etc.) is used, and hydroxyferrocene is particularly preferable. In addition, the electron mediator may be added to the electrode terminal in an amount of 0.5 to 10% by weight, preferably 1 to 10% by weight, based on all components.
-5% by weight.
【００１７】本発明の方法に使用される電極は、電極端
子に固定化した酵素の作用により過酸化水素を還元し、
その際に生じる還元電流を測定するものである。この電
極は、従来の酸化電流を測定する電極より低電位（例え
ば−２００ｍＶ〜２００ｍＶ、好適には−５０ｍＶ〜１
５０ｍＶ）で測定を行うため、共存物質の影響をほとん
ど受けずに測定でき、また基底電流が一定となる時間も
短いので、短時間で測定可能となる。さらに、この電極
は繰り返して使用することができる。The electrode used in the method of the present invention reduces hydrogen peroxide by the action of an enzyme immobilized on the electrode terminal,
The reduction current generated at that time is measured. This electrode has a lower potential (e.g., -200 mV to 200 mV, preferably -50 mV to 1
Since the measurement is performed at 50 mV), the measurement can be performed with little influence of the coexisting substance, and the time when the base current becomes constant is short, so that the measurement can be performed in a short time. Furthermore, this electrode can be used repeatedly.
【００１８】以下、図面を参照して上記電極の具体例の
一つを説明する。Hereinafter, a specific example of the above electrode will be described with reference to the drawings.
【００１９】図１は電極の試料側の末端付近の模式図で
ある。図１において、電極中の電極端子10の試料側の末
端には酵素11が固定化され、さらに試料中の物質より生
成した過酸化水素がセルロースアセテート膜12を透過し
て該酵素11と接触するように、電極の試料側の末端全体
がセルロースアセテート膜12に覆われる。さらに、該セ
ルロースアセテート膜12を該末端全体に保持するため
に、該末端全体に該セルロースアセテート膜12を覆うよ
うにナイロンネット13が被せられる。さらに、過酸化水
素を含めて試料中の物質が該セルロースアセテート膜12
を透過せずに酵素11と接触することを生じさせる電極の
外壁15とセルロースアセテート膜12との間の隙間を無く
すために、該外壁15と該セルロースアセテート膜12およ
び該ナイロンネット13との接触部分を密着させるように
パラフィルム14が該接触部分全体を覆って巻き付けられ
る。このように電極が構成されることによって、過酸化
水素はセルロースアセテート膜12を透過してのみ酵素11
と接触する。FIG. 1 is a schematic view of the vicinity of the end of the electrode on the sample side. In FIG. 1, an enzyme 11 is immobilized on a sample-side end of an electrode terminal 10 in an electrode, and hydrogen peroxide generated from a substance in the sample permeates through a cellulose acetate membrane 12 and comes into contact with the enzyme 11. Thus, the entire end of the electrode on the sample side is covered with the cellulose acetate film 12. Further, in order to hold the cellulose acetate membrane 12 over the entire end, a nylon net 13 is put over the entire end so as to cover the cellulose acetate membrane 12. In addition, substances in the sample including hydrogen peroxide are
In order to eliminate the gap between the outer wall 15 of the electrode and the cellulose acetate membrane 12 which causes the contact with the enzyme 11 without passing through, the contact between the outer wall 15 and the cellulose acetate membrane 12 and the nylon net 13 is eliminated. A parafilm 14 is wrapped around the entire contact portion so that the portions adhere. With such an electrode configuration, hydrogen peroxide permeates the cellulose acetate membrane 12 only through the cellulose acetate membrane 12.
Contact with.
【００２０】本発明の物質の測定方法は、試料中に含ま
れる物質より過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を、
上記の電極を用いて測定する方法である。本発明におい
て試料中の物質より過酸化水素を生成させる方法として
は、特に限定されず、公知の方法が使用できるが、好適
には脱水素酵素（Ｅ）、基質（Ｓ）、補酵素（Ｎ）およ
び電子伝達物質（Ｍ）を用いる方法が挙げられる。この
方法は、ＮおよびＭの存在下にＥとＳとを反応させるも
のであり、ＥとＳとＮによる脱水素反応によって還元型
Ｎが生成し、還元型ＮよりＭに非酵素的反応により電子
が受け渡され、その結果還元されたＭが溶存酸素と反応
して過酸化水素が生成するものである。この方法の具体
例として、Ｓとしてグルコース、Ｅとしてグルコースデ
ヒドロゲナーゼ、ＮとしてＮＡＤ、Ｍとして１−メトキ
シ−５−フェナジンメトサルフェートを用いる場合を説
明すると、まず、ＮＡＤ存在下でグルコースにグルコー
スデヒドロゲナーゼが作用するとグルコースが酸化され
てＮＡＤＨが生成し、次いで生成したＮＡＤＨより１−
メトキシ−５−フェナジンメトサルフェートに非酵素的
反応により電子が受け渡され、ＮＡＤＨはＮＡＤに酸化
され、還元された１−メトキシ−５−フェナジンメトサ
ルフェートと溶存酸素が反応し、Ｈ2 Ｏ2 が発生する。According to the method for measuring a substance of the present invention, hydrogen peroxide is generated from a substance contained in a sample, and the hydrogen peroxide is
This is a method of measuring using the above electrodes. In the present invention, a method for producing hydrogen peroxide from a substance in a sample is not particularly limited, and a known method can be used. Preferably, dehydrogenase (E), substrate (S), coenzyme (N )) And a method using an electron mediator (M). In this method, E and S are reacted in the presence of N and M. Reduced N is generated by a dehydrogenation reaction between E, S and N, and reduced N is converted to M by a non-enzymatic reaction. Electrons are transferred, and as a result, reduced M reacts with dissolved oxygen to generate hydrogen peroxide. As a specific example of this method, a case where glucose is used as S, glucose dehydrogenase as E, NAD as N, and 1-methoxy-5-phenazine methosulfate as M will be described. First, glucose dehydrogenase acts on glucose in the presence of NAD. Then, glucose is oxidized to generate NADH, and then 1-NHAD is generated from the generated NADH.
Electrons are transferred to methoxy-5-phenazine methosulfate by a non-enzymatic reaction, NADH is oxidized to NAD, and reduced 1-methoxy-5-phenazine methosulfate reacts with dissolved oxygen to form H 2 O 2. appear.
【００２１】上記方法に用いられる補酵素としては、好
ましくはニコチンアミドアデニンジヌクレオシド（ＮＡ
Ｄ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオシドリン酸
（ＮＡＤＰ）、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、トリ
プトファントリプトフィルキノン（ＴＴＱ）等が挙げら
れる。The coenzyme used in the above method is preferably nicotinamide adenine dinucleoside (NA
D), nicotinamide adenine dinucleoside phosphate (NADP), pyrroloquinoline quinone (PQQ), tryptophan tryptofil quinone (TTQ) and the like.
【００２２】上記方法に用いられる脱水素酵素として
は、好ましくはＮＡＤ、ＮＡＤＰまたはＰＱＱの存在下
で作用する酵素（例えば、グルコースデヒドロゲナー
ゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナ
ーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、３α−ヒドロキ
システロイドデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン
酸デヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ等）、およびＴＴＱ酵素等
が挙げられる。The dehydrogenase used in the above method is preferably an enzyme acting in the presence of NAD, NADP or PQQ (eg, glucose dehydrogenase, glycerol dehydrogenase, lactate dehydrogenase, isocitrate dehydrogenase, 3α-hydroxysteroid dehydrogenase, Glucose-6-phosphate dehydrogenase, sorbitol dehydrogenase,
Pyruvate dehydrogenase) and the TTQ enzyme.
【００２３】上記方法に用いられる基質としては、好ま
しくはグルコース、グリセロール、ピルビン酸、イソク
エン酸、胆汁酸、グルコース−６−リン酸、ソルビトー
ル、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ
等が挙げられる。The substrate used in the above method is preferably glucose, glycerol, pyruvate, isocitrate, bile acid, glucose-6-phosphate, sorbitol, Asn-Tyr-Asp, Asn-Tyr-Glu.
And the like.
【００２４】上記方法において、好ましくは脱水素反応
が生じることが公知である脱水素酵素、基質、補酵素の
組み合わせが使用される。このような組み合わせの例と
しては以下のものが挙げられる： （１）補酵素をＮＡＤまたはＮＡＤＰとした場合の脱水
素酵素と基質との組み合わせ グルコースデヒドロゲナーゼとグルコース、グリセロー
ルデヒドロゲナーゼとグリセロール、乳酸デヒドロゲナ
ーゼとピルビン酸、イソクエン酸デヒドロゲナーゼとイ
ソクエン酸、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナ
ーゼと胆汁酸、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼとグルコース−６−リン酸等； （２）補酵素をＰＱＱとした場合の脱水素酵素と基質と
の組み合わせ グルコースデヒドロゲナーゼとグルコース、ソルビトー
ルデヒドロゲナーゼとソルビトール、ピルビン酸デヒド
ロゲナーゼとピルビン酸等； （３）ＴＴＱ酵素とその基質との組み合わせ ＴＴＱ酵素とＡｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ、ＴＴＱ酵素とＡ
ｓｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ等。なおこれらはあくまで例示に
過ぎず、反応機構が同様である他の補酵素、脱水素酵素
および基質の組合わせにおいても適用できる。In the above method, a combination of a dehydrogenase, a substrate and a coenzyme which is known to cause a dehydrogenation reaction is preferably used. Examples of such combinations include the following: (1) Combination of dehydrogenase and substrate when coenzyme is NAD or NADP Glucose dehydrogenase and glucose, glycerol dehydrogenase and glycerol, lactate dehydrogenase and pyrvin Acid, isocitrate dehydrogenase and isocitrate, 3α-hydroxysteroid dehydrogenase and bile acid, glucose-6-phosphate dehydrogenase and glucose-6-phosphate; (2) dehydrogenase and substrate when coenzyme is PQQ Combination of glucose dehydrogenase and glucose, sorbitol dehydrogenase and sorbitol, pyruvate dehydrogenase and pyruvate, etc .; (3) combination of TTQ enzyme and its substrate TTQ enzyme and Asn-T r-Asp, TTQ enzyme and A
sn-Tyr-Glu and the like. These are merely examples, and can be applied to other combinations of coenzymes, dehydrogenases and substrates having the same reaction mechanism.
【００２５】上記方法に使用される電子伝達物質として
は、還元型の補酵素（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＰＱＱＨ
2 等）を（Ｏ1 ）酸化し、過酸化水素を誘導させる作用
を有する物質であれば特に限定されないが、例えば、フ
ェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、１−メトキシ−
５−フェナジンメトサルフェート、メルドラブルーおよ
びチオニン等が挙げられ、好適には１−メトキシ−５−
フェナジンメトサルフェートが挙げられる。The electron mediators used in the above method include reduced coenzymes (NADH, NADPH, PQQH
2 ) is not particularly limited as long as it has a function of oxidizing (O 1 ) and inducing hydrogen peroxide. Examples thereof include phenazine methosulfate (PMS) and 1-methoxy-
5-phenazine methosulfate, Meldora blue, thionin and the like, preferably 1-methoxy-5-
Phenazine methosulfate.
【００２６】本発明の物質の測定方法が対象とする試料
としては、生体由来の成分（例えば、血液、体液、血
清、尿等）、環境試料（地下水、河川水、海水）、また
はそれらの希釈物等が挙げられるが、これらに限定され
ない。また、対象物質としては、公知の手段によって過
酸化水素を生成させることができる物質である。このよ
うな物質としては、代謝物（尿酸、クレアチン等）、脱
水素酵素の基質（例えば、グルコース、グリセロール、
ピルビン酸、イソクエン酸、胆汁酸、グルコース−６−
リン酸、ソルビトール、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ、Ａｓ
ｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ等）、脱水素酵素（例えば、グルコ
ースデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナー
ゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナ
ーゼ、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ソルビトー
ルデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、Ｔ
ＴＱ酵素等）等が挙げられる。なおこれらはあくまでも
例示にすぎず、他の物質も測定対象物質となり得る。The sample to be measured by the method for measuring a substance of the present invention may be a component derived from a living body (eg, blood, body fluid, serum, urine, etc.), an environmental sample (groundwater, river water, seawater), or a dilution thereof. But are not limited to these. The target substance is a substance that can generate hydrogen peroxide by a known means. Such substances include metabolites (uric acid, creatine, etc.), dehydrogenase substrates (eg, glucose, glycerol,
Pyruvate, isocitrate, bile acid, glucose-6-
Phosphate, sorbitol, Asn-Tyr-Asp, As
n-Tyr-Glu, etc.), dehydrogenases (eg, glucose dehydrogenase, glycerol dehydrogenase, lactate dehydrogenase, isocitrate dehydrogenase, 3α-hydroxysteroid dehydrogenase,
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, sorbitol dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase, T
TQ enzyme). Note that these are merely examples, and other substances can also be measured substances.
【００２７】好ましい本発明の物質の測定方法におい
て、測定対象が物質（基質）である場合、試料を脱水素
酵素、補酵素、電子伝達物質と２０〜３７℃にて２〜３
０ｍｉｎ反応させた後、電極を反応溶液に浸漬させ、得
られる電流値を測定し、次いで既知濃度の過酸化水素溶
液を測定した際の電流値と比較することによって試料中
の物質の濃度を測定することができる。また、測定対象
物が酵素である場合、試料を該酵素の基質、補酵素、電
子伝達物質と２０〜３７℃にて２〜３０ｍｉｎ反応させ
ると同時に電極を反応溶液に浸漬させ、経時的に得られ
る電流値を測定することによって試料中の酵素活性を測
定することができる。In a preferred method for measuring a substance according to the present invention, when the object to be measured is a substance (substrate), the sample is mixed with a dehydrogenase, a coenzyme, and an electron transfer substance at 20 to 37 ° C. for 2 to 3 times.
After reacting for 0 min, the electrode is immersed in the reaction solution, the obtained current value is measured, and then the concentration of the substance in the sample is measured by comparing with the current value obtained when measuring a hydrogen peroxide solution having a known concentration. can do. When the measurement object is an enzyme, the sample is reacted with a substrate of the enzyme, a coenzyme, and an electron transfer substance at 20 to 37 ° C. for 2 to 30 minutes, and at the same time, the electrode is immersed in the reaction solution to obtain a sample over time. By measuring the current value obtained, the enzyme activity in the sample can be measured.
【００２８】以下、図面を参照して本発明の物質の測定
方法の一例を具体的に説明する。Hereinafter, an example of the method for measuring a substance of the present invention will be specifically described with reference to the drawings.
【００２９】図２は、本発明の方法を使用する測定機器
の一例の模式図である。図２において、まず試料26を電
極槽22に投入し、次いで試料中の測定対象物質から過酸
化水素を生成させるための試薬を電極槽22内の試料26に
添加した後、攪拌装置25を作動させることによって反応
を開始させる（過酸化水素を生成させる）。次いで、作
用電極20を反応液に浸すことによって、生成した過酸化
水素から得られる還元電流をポテンシオスタット23を用
いて検出し、記録計24にて電流値を測定する。FIG. 2 is a schematic diagram of an example of a measuring instrument using the method of the present invention. In FIG. 2, first, a sample 26 is put into the electrode tank 22, and then a reagent for generating hydrogen peroxide from a substance to be measured in the sample is added to the sample 26 in the electrode tank 22, and then the stirring device 25 is operated. To initiate the reaction (generate hydrogen peroxide). Next, by immersing the working electrode 20 in the reaction solution, a reduction current obtained from the generated hydrogen peroxide is detected using the potentiostat 23, and the current value is measured by the recorder 24.
【００３０】[0030]
【実施例】以下、本発明を実施例をもって詳細に説明す
る。The present invention will be described below in detail with reference to examples.
【００３１】実施例１および２ フェロセン、液体パラフィン、グラファイト粉末を１：
５：１０の重量比で混合したものをカーボンペースト
（ＣＰ）電極端子の容器に詰め、試料側の末端の表面を
滑らかにした後、該末端に２μｌのパーオキシダーゼ溶
液（１０ｍｇ／ｍｌ）を載せ、風乾させた後、ナフィオ
ン（登録商標）修飾されたセルロースアセテート膜を被
覆して作製した（図１参照）。以下の実験には同様の調
製法にて作製した電極を使用した。Examples 1 and 2 Ferrocene, liquid paraffin and graphite powder were prepared as follows:
The mixture at a weight ratio of 5:10 was packed in a container of a carbon paste (CP) electrode terminal, and after smoothing the surface of the end on the sample side, 2 μl of a peroxidase solution (10 mg / ml) was placed on the end. After air-drying, the membrane was coated with a Nafion (registered trademark) -modified cellulose acetate membrane (see FIG. 1). In the following experiments, electrodes manufactured by the same preparation method were used.
【００３２】ｐＨ７．０のＴｒｉｓ緩衝液に、ＰＭＳ１
２μＭ、ＮＡＤＨ３μＭとなるようにこれらを添加し、
この溶液を電極槽に投入した。次いで、上記のように作
製したパーオキシダーゼ−フェロセン電極の試料側の末
端にａ）ナフィオン（登録商標）修飾されたセルロース
アセテート膜（実施例１）またはｂ）ナフィオン（登録
商標）修飾されたポリカーボネート膜（実施例２）をそ
れぞれ被覆した電極を用いて、６０ｍＶにて電流−時間
曲線を調べた（図３中Ａ、Ｂ）。また、過酸化水素を３
μＭとなるように上記緩衝液に添加して同様に測定を行
った（図３中ａ、ｂ）。その結果、ＮＡＤＨを用いた場
合と、過酸化水素を用いた場合とは同じ電流値が計測さ
れた（図３参照）。PMS1 was added to Tris buffer at pH 7.0.
These were added to give 2 μM and 3 μM NADH,
This solution was put into the electrode tank. Next, a) Nafion®-modified cellulose acetate membrane (Example 1) or b) Nafion®-modified polycarbonate membrane was applied to the sample-side end of the peroxidase-ferrocene electrode prepared as described above. Using the electrodes coated with (Example 2), current-time curves were examined at 60 mV (A and B in FIG. 3). In addition, hydrogen peroxide
The solution was added to the above buffer so as to have a concentration of μM, and the same measurement was performed (a and b in FIG. 3). As a result, the same current value was measured when using NADH and when using hydrogen peroxide (see FIG. 3).
【００３３】 実施例３ イソクエン酸脱水素酵素の測定 試薬組成 ｐＨ７．４ Ｔｒｉｓ緩衝液 ４ｍＭ イソクエン酸、 ｌｍＭ ＮＡＤＰ、 ２０ｍＭ 塩化マグネシウム、 ５μＭ ＰＭＳ、 対象物質 イソクエン酸脱水素酵素（ＩＣＤＨ）（ブタ心臓由来） ＩＣＤＨを１Ｕ／ｌ、２Ｕ／ｌまたは１０Ｕ／ｌとなる
ように試薬に添加し、ナフィオン（登録商標）修飾され
たセルロースアセテート膜を試料側の末端に有するパー
オキシダーゼ−フェロセン電極を用いて、３７℃、０．
１Ｖにてそれぞれについて測定を行った。その結果、Ｉ
ＣＤＨ濃度に比例した電流値が、酵素反応の進行と共に
得られた（図４参照）。Example 3 Measurement of isocitrate dehydrogenase Reagent composition pH 7.4 Tris buffer 4 mM isocitrate, 1 mM NADP, 20 mM magnesium chloride, 5 μM PMS, target substance isocitrate dehydrogenase (ICDH) (derived from pig heart) ICDH was added to the reagent at 1 U / l, 2 U / l or 10 U / l, and 37% using a peroxidase-ferrocene electrode having a Nafion (registered trademark) -modified cellulose acetate membrane at the end on the sample side. ° C, 0.
The measurement was performed for each at 1V. As a result, I
A current value proportional to the CDH concentration was obtained with the progress of the enzyme reaction (see FIG. 4).
【００３４】[0034]
【発明の効果】本発明によれば、試料中の物質より過酸
化水素を生成させ、該過酸化水素を、電子メディエータ
ーを含有し、かつ酵素が固定化された電極端子を有する
電極であって、該過酸化水素がセルロースアセテート膜
またはポリカーボネート膜を透過して該酵素と接触する
ように該膜が形成されている電極を用いて過酸化水素の
還元電流を測定することによって、共存物質の影響をほ
とんど受けることなく、短時間で、かつ通常の透析膜を
使用した場合と比較して高感度で試料中の物質を測定す
ることができる。また、本発明の方法において使用され
る電極は、繰り返して使用することができる。According to the present invention, an electrode having an electrode terminal containing an electron mediator and immobilized with an enzyme, wherein hydrogen peroxide is generated from a substance in a sample. By measuring the reduction current of hydrogen peroxide using an electrode on which the hydrogen peroxide passes through a cellulose acetate membrane or a polycarbonate membrane and comes into contact with the enzyme, the influence of coexisting substances is measured. The substance in the sample can be measured in a short time and with high sensitivity as compared with the case where a normal dialysis membrane is used, with almost no influence on the sample. The electrodes used in the method of the present invention can be used repeatedly.
【図１】図１は本発明の方法に使用される電極の構造の
一例を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing an example of the structure of an electrode used in the method of the present invention.
【図２】図２は本発明の方法における測定機器全体の一
例を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing an example of an entire measuring instrument in the method of the present invention.
【図３】図３は実施例１および２の結果を示す時間−電
流グラフである。FIG. 3 is a time-current graph showing the results of Examples 1 and 2.
【図４】図４は実施例３の結果を示す時間−電流グラフ
である。FIG. 4 is a time-current graph showing the results of Example 3.
１０ 電極端子 １１ 酵素 １２ セルロースアセテート膜 １３ ナイロンネット １４ パラフィルム １５ 外壁 ２０ 作用電極 ２１ 照合電極 ２２ 電極槽 ２３ ポテンシオスタット ２４ 記録計 ２５ 攪拌装置 ２６ 試料 DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 Electrode terminal 11 Enzyme 12 Cellulose acetate film 13 Nylon net 14 Parafilm 15 Outer wall 20 Working electrode 21 Reference electrode 22 Electrode tank 23 Potentiostat 24 Recorder 25 Stirrer 26 Sample
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 加納 健司 京都府京都市左京区北白川追分町（番地な し） 京都大学大学院 農学研究科 (72)発明者 池田 篤治 京都府京都市左京区北白川追分町（番地な し） 京都大学大学院 農学研究科 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QQ03 QQ18 QQ24 QQ89 QR02 QR04 QR41 QR42 QR51 QR84 QS07 QS28 QS39 QX04 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuing on the front page (72) Inventor Kenji Kano Kita-Shirakawa Oiwakecho, Sakyo-ku, Kyoto-shi, Kyoto (Nanbanashi) Graduate School of Agriculture, Kyoto University (72) Inventor Atsushi Ikeda Kita-Shirakawa-Oiwakecho, Sakyo-ku, Kyoto-shi, Kyoto (No address) Kyoto University Graduate School of Agriculture F-term (reference) 4B063 QA01 QQ03 QQ18 QQ24 QQ89 QR02 QR04 QR41 QR42 QR51 QR84 QS07 QS28 QS39 QX04
Claims (7)
生成させ、該過酸化水素を、電子メディエーターを含有
し、かつ酵素が固定化された電極端子を有する電極であ
って、該過酸化水素がセルロースアセテート膜またはポ
リカーボネート膜を透過して該酵素と接触するように該
膜が形成されている電極を用いて測定することを特徴と
する物質の測定方法。1. An electrode having an electrode terminal containing an electron mediator and having an enzyme immobilized thereon, wherein said peroxide is produced from a substance contained in a sample. A method for measuring a substance, comprising using an electrode provided with a membrane so that hydrogen permeates a cellulose acetate membrane or a polycarbonate membrane and comes into contact with the enzyme.
カーボネート膜が、荷電処理を施されている請求項１記
載の物質の測定方法。2. The method according to claim 1, wherein the cellulose acetate film or the polycarbonate film has been subjected to a charge treatment.
素を生成させる方法が、試料中に含まれる物質に、脱水
素酵素、該酵素の補酵素および電子伝達物質を作用させ
るか、または試料中に含まれる脱水素酵素に、該酵素の
基質および補酵素、および電子伝達物質を作用させる方
法である請求項１または２記載の物質の測定方法。3. A method for producing hydrogen peroxide from a substance contained in a sample, comprising: reacting a substance contained in the sample with a dehydrogenase, a coenzyme of the enzyme, and an electron transfer substance; The method for measuring a substance according to claim 1 or 2, wherein the method is a method in which a substrate of the enzyme, a coenzyme, and an electron mediator are allowed to act on the dehydrogenase contained therein.
ニンジヌクレオシド、ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オシドリン酸およびピロロキノリンキノンからなる群よ
り選ばれる補酵素の存在下で作用する酵素、またはトリ
プトファントリプトフィルキノン酵素である請求項３記
載の物質の測定方法。4. The enzyme, wherein the dehydrogenase acts in the presence of a coenzyme selected from the group consisting of nicotinamide adenine dinucleoside, nicotinamide adenine dinucleoside phosphate and pyrroloquinoline quinone, or tryptophan tryptofilquinone The method for measuring a substance according to claim 3, which is an enzyme.
ルフェート、１−メトキシ−５−フェナジンメトサルフ
ェート、メルドラブルーおよびチオニンからなる群より
選ばれる物質である請求項３記載の物質の測定方法。5. The method for measuring a substance according to claim 3, wherein the electron mediator is a substance selected from the group consisting of phenazine methosulfate, 1-methoxy-5-phenazine methosulfate, meldra blue and thionine.
項１または２記載の物質の測定方法。6. The method according to claim 1, wherein the enzyme is peroxidase.
類またはビピリジン錯体である請求項１または２記載の
物質の測定方法。7. The method according to claim 1, wherein the electron mediator is a metallocene or a bipyridine complex.
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