JP2005118014A - Method of analysis and reagent used for the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、酸化還元反応を用いた分析方法に関する。 The present invention relates to an analysis method using a redox reaction.
臨床検査や生化学検査等の分野において、グルコース、コレステロール等の成分分析が行われており、その一手法として、比色分析やバイオセンサ等による電気化学的分析がある。例えば、グルコースの比色分析では、まず第１の酵素であるグルコースオキシダーゼをグルコース（基質）に作用させて、グルコノラクトンおよび過酸化水素を発生させ、前記過酸化水素を、第２の酵素であるペルオキシダーゼの存在下、トリンダー試薬等の発色剤により検出するのが一般的である。このように、過酸化水素を介して間接的に基質濃度を測定するという手法は、グルコースに限らず、コレステロール等の他の成分分析にも適用されている。 In the fields of clinical examination and biochemical examination, component analysis of glucose, cholesterol and the like is performed, and one method includes colorimetric analysis and electrochemical analysis using a biosensor. For example, in the colorimetric analysis of glucose, first, glucose oxidase, which is a first enzyme, is allowed to act on glucose (substrate) to generate gluconolactone and hydrogen peroxide, and the hydrogen peroxide is converted with the second enzyme. In general, detection is performed with a color former such as a Trinder reagent in the presence of a certain peroxidase. Thus, the method of indirectly measuring the substrate concentration via hydrogen peroxide is applied not only to glucose but also to other component analysis such as cholesterol.
さらに近年では、前述のように二段階の酵素反応を行うことなく、メディエータの存在下、一段階の酵素反応により比色分析を行う方法が実現されている。具体的には、分析対象物を酸化還元酵素により酸化することによって、放出される電子が前記メディエータを介して発色基質に伝達され、前記第２の酵素が非存在の条件下で、前記発色基質が発色するのである。このように酵素反応が１段階であるため、反応系が簡単で安定性にも優れ、酵素反応から発色反応までの時間も極めて短縮できる（例えば、特許文献１、非特許文献１等）。
そして、現在では、このような比色分析方法に使用できる様々なメディエータが求められていることから、本発明者らは、例えば、バイオセンサ等を用いた電気化学的分析方法に使用されるメディエータに着目した。しかしながら、比色分析方法においては、一般に吸光度測定を行うため、使用するメディエータは水溶性であることが望まれているのに対し、前記電気化学的分析方法に使用されるメディエータは難溶解性のものが多く、適用できないという問題があった。さらに、従来使用されているメディエータには、酸化還元酵素の種類によってはメディエータとしての機能を果たさず、酸化還元反応が起らないという問題を生じるものもあった。 At present, various mediators that can be used for such a colorimetric analysis method are required. Therefore, the present inventors have used, for example, a mediator used in an electrochemical analysis method using a biosensor or the like. Focused on. However, in the colorimetric analysis method, since the absorbance is generally measured, it is desired that the mediator used is water-soluble, whereas the mediator used in the electrochemical analysis method is hardly soluble. There was a problem that many things were not applicable. In addition, some mediators that have been used in the past do not function as a mediator depending on the type of oxidoreductase, and there is a problem that a redox reaction does not occur.
そこで、本発明の目的は、使用できるメディエータの種類や酸化還元酵素の種類の選択幅を拡大できる分析方法の提供である。 Accordingly, an object of the present invention is to provide an analysis method capable of expanding the selection range of types of mediators and types of oxidoreductases that can be used.
前記目的を達成するために、本発明の分析方法は、分析対象物に対して酸化還元酵素によって酸化還元反応を行い、酸化還元反応検出手段によって前記酸化還元反応を検出することにより、前記分析対象物の定性若しくは定量を行う分析方法であって、
前記酸化還元反応が、電子授受を行うメディエータの存在下で行われ、かつ、前記メディエータが、シクロデキストリンで包接されていることを特徴とする。
In order to achieve the object, the analysis method of the present invention performs an oxidation-reduction reaction on an analyte by an oxidation-reduction enzyme, and detects the oxidation-reduction reaction by an oxidation-reduction reaction detection means, thereby the analysis object. An analysis method for qualitative or quantitative analysis of an object,
The oxidation-reduction reaction is performed in the presence of a mediator that performs electron transfer, and the mediator is included in cyclodextrin.
つぎに、本発明の試薬は、前記本発明の分析方法に使用するメディエータ試薬であって、シクロデキストリンで包接されたメディエータ（以下、「包接メディエータ」という）を含むことを特徴とする。 Next, the reagent of the present invention is a mediator reagent used in the analysis method of the present invention, and includes a mediator included in cyclodextrin (hereinafter referred to as “inclusion mediator”).
このように、シクロデキストリンによってメディエータを包接することによって、例えば、従来、比色分析に使用できなかったメディエータを使用でき、また、メディエータを介した電子授受を触媒できなった酸化還元酵素の使用が可能になった。このため本発明の分析方法によれば、各種メディエータや各種酸化還元酵素の選択の幅が広がり、また、使用できるメディエータの選択幅も広がることにより、例えば、発色を測定する際の波長範囲が選択し易くなる。したがって、様々な分析対象物の定量または定性分析が可能になるという効果を奏する。また、電気化学的分析においても包接メディエータは有用である。 Thus, by including a mediator with cyclodextrin, for example, a mediator that could not be conventionally used for colorimetric analysis can be used, and the use of an oxidoreductase that has failed to catalyze electron transfer via the mediator. It became possible. For this reason, according to the analysis method of the present invention, the selection range of various mediators and various oxidoreductases widens, and the selection range of usable mediators also expands. For example, the wavelength range for measuring color development can be selected. It becomes easy to do. Therefore, there is an effect that quantitative or qualitative analysis of various analysis objects becomes possible. The inclusion mediator is also useful in electrochemical analysis.
また、前記包接メディエータを含む本発明の試薬を使用すれば、前述のような本発明の分析方法が、より一層簡便となる。 Moreover, if the reagent of the present invention containing the inclusion mediator is used, the analysis method of the present invention as described above becomes even simpler.
本発明において、前記シクロデキストリンとしては、特に制限されないが、例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンやγ-シクロデキストリン等が使用できる。また、化学修飾されたシクロデキストリンであってもよく、例えば、ヒドロキシシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、ジメチル-β-シクロデキストリン、カルボキシメチル-β-シクロデキストリン等の化学修飾体があげられ、中でも、ヒドロキシシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンである。これらはいずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。また、市販品を使用してもよいし、例えば、デンプンをアミラーセ゛処理する等の公知の方法によっても調製できる。 In the present invention, the cyclodextrin is not particularly limited, and for example, α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, γ-cyclodextrin and the like can be used. Further, it may be a chemically modified cyclodextrin, and examples thereof include chemically modified compounds such as hydroxycyclodextrin, hydroxypropyl-β-cyclodextrin, dimethyl-β-cyclodextrin, carboxymethyl-β-cyclodextrin and the like. Of these, hydroxycyclodextrin and hydroxypropyl-β-cyclodextrin. Any one of these may be used, or two or more may be used in combination. Moreover, you may use a commercial item, for example, it can prepare also by well-known methods, such as amylase processing.
本発明において、前記メディエータとしては、例えば、α−ナフトキノン、ＴＴＦ（テトラチアフルバレン：Tetrathiafulvalene）、メチルフェロセン、フェロセン、1,1’-フェロセンジカルボン酸等のフェロセンジカルボン酸等が使用できる。これらの中でも、好ましくはα−ナフトキノン、ＴＴＦ等である。これらはいずれか一種類でもよいし、二種類以上の混合物であってもよい。 In the present invention, examples of the mediator include α-naphthoquinone, TTF (Tetrathiafulvalene), ferrocene dicarboxylic acid such as methyl ferrocene, ferrocene, and 1,1′-ferrocene dicarboxylic acid. Among these, α-naphthoquinone, TTF and the like are preferable. Any one of these may be used, or a mixture of two or more may be used.
前記メディエータは前記シクロデキストリンで包接されているが、前記メディエータが、１モルあたり、例えば、１〜４０モルのシクロデキストリンによって包接されていることが好ましく、より好ましくは８〜１８モルであり、特に好ましくは１０〜１４モルである。 The mediator is clathrated with the cyclodextrin, but the mediator is preferably clathrated with, for example, 1 to 40 mol of cyclodextrin per mol, more preferably 8 to 18 mol. Particularly preferred is 10 to 14 mol.
前記包接メディエータの調製は、例えば、シクロデキストリンを用いた従来公知の包接方法によって行うことができる。一例としては、例えば、シクロデキストリンを水性溶媒に溶解したシクロデキストリン溶液と、メディエータを水性溶媒に懸濁したメディエータ懸濁液とを準備し、両者を混合することによって包接メディエータを形成できる。包接メディエータが形成されたか否かは、例えば、目視観察によって確認でき、すなわち、前記シクロデキストリン溶液とメディエータ懸濁液とを混合した際に、混合液に透明性が確認できれば前記包接メディエータが形成されたと判断できる。これは、本来、難溶解性を示す物質が包接されると、前記シクロデキストリンの環状部分に入り込み水和状態になり、溶解するためと考えられます。 The inclusion mediator can be prepared, for example, by a conventionally known inclusion method using cyclodextrin. As an example, an inclusion mediator can be formed by preparing a cyclodextrin solution in which cyclodextrin is dissolved in an aqueous solvent and a mediator suspension in which the mediator is suspended in an aqueous solvent, and mixing them. Whether or not the inclusion mediator is formed can be confirmed by visual observation, for example, that is, when the cyclodextrin solution and the mediator suspension are mixed, if the transparency is confirmed in the mixed solution, the inclusion mediator is It can be judged that it was formed. This is thought to be due to the fact that when a substance with poor solubility is included, it enters the cyclic part of the cyclodextrin and becomes hydrated and dissolves.
前記シクロデキストリン溶液に対するメディエータの割合は、メディエータが溶解できれば特に制限されないが、例えば、以下のような割合に設定できる。メディエータがα-ナフトキノンであり、シクロデキストリンがハイドロキシ-β-シクロデキストリンの場合、例えば、ハイドロキシ-β-シクロデキストリン濃度が２４０ｍＭ以上（好ましくは２４０〜３６０ｍＭ、より好ましくは２８０〜３６０ｍＭ）の溶液に、α-ナフトキノンを２０ｍＭとなるように溶解させることができる。また、メディエータがＴＴＦであり、シクロデキストリンがハイドロキシ-β-シクロデキストリンの場合、例えば、ハイドロキシ-β-シクロデキストリン濃度が１２０ｍＭ以上（好ましくは１２０〜３６０ｍＭ、より好ましくは１６０〜３６０ｍＭ）の溶液に、ＴＴＦを２０ｍＭとなるように溶解させることができる。 The ratio of the mediator to the cyclodextrin solution is not particularly limited as long as the mediator can be dissolved. For example, the ratio can be set to the following ratio. When the mediator is α-naphthoquinone and the cyclodextrin is hydroxy-β-cyclodextrin, for example, in a solution having a hydroxy-β-cyclodextrin concentration of 240 mM or more (preferably 240 to 360 mM, more preferably 280 to 360 mM) α-naphthoquinone can be dissolved to 20 mM. Further, when the mediator is TTF and the cyclodextrin is hydroxy-β-cyclodextrin, for example, in a solution having a hydroxy-β-cyclodextrin concentration of 120 mM or more (preferably 120 to 360 mM, more preferably 160 to 360 mM) TTF can be dissolved to 20 mM.
本発明において、前記酸化還元酵素としては、例えば、分析対象物およびメディエータと酸化還元反応するものであれば特に制限されず、分析対象物の種類等に応じて適宜決定できる。 In the present invention, the oxidoreductase is not particularly limited as long as it undergoes an oxidation-reduction reaction with an analyte and a mediator, and can be appropriately determined according to the type of the analyte.
前記酸化還元酵素としては、例えば、脱水素酵素や酸化酵素があげられ、具体的には、例えば、サルコシンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ピラノースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピリルビン酸オキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、４−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、ウリカーゼ等があげられる。 Examples of the oxidoreductase include dehydrogenase and oxidase. Specific examples include sarcosine oxidase, glucose oxidase (GOD), pyranose oxidase, glucose dehydrogenase (GDH), lactate oxidase, lactate dehydrogenase, Fructose dehydrogenase, galactose oxidase, cholesterol oxidase, cholesterol dehydrogenase, alcohol oxidase, alcohol dehydrogenase, pyruvate oxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, amino acid dehydrogenase, formate dehydrogenase, glycerol dehydrogenase, acyl-CoA oxidase, choline oxidase, 4-hydroxy Benzoate hydroxylase, maleate dehydrogenase Over Ze, uricase, and the like.
前記酸化還元酵素と前記メディエータとの組み合わせとしては、特に制限されないが、例えば、サルコシンオキシダーゼとＴＴＦ、サルコシンオキシダーゼとα-ナフトキノン、ウリカーゼと、1,1’-フェロセンジカルボン酸、ビリルビンオキシダーゼと、1,1’-フェロセンジカルボン酸の組み合わせ等があげられる。 The combination of the oxidoreductase and the mediator is not particularly limited. For example, sarcosine oxidase and TTF, sarcosine oxidase and α-naphthoquinone, uricase, 1,1′-ferrocenedicarboxylic acid, bilirubin oxidase, Examples thereof include combinations of 1′-ferrocene dicarboxylic acid.
本発明において、前記酸化還元反応検出手段は、比色法であっても電気化学的検出方法であってもよい。 In the present invention, the redox reaction detecting means may be a colorimetric method or an electrochemical detection method.
前記比色法は、前記酸化還元反応により発色する基質を用いた方法であって、例えば、前記酸化還元反応により、前記分析対象物からメディエータを介して還元により発色する基質に電子を伝達し、その結果生じる前記基質の発色を測定する方法である。一方、電気化学的検出方法は、例えば、前記酸化還元反応による電子の授受に伴う電流の変化を検出する方法である。なお、電気化学的検出方法によれば、比色法における前述のような発色基質が不要である。 The colorimetric method is a method using a substrate that develops color by the redox reaction.For example, by the redox reaction, electrons are transferred from the analyte to the substrate that develops color by reduction via a mediator. This is a method of measuring the color development of the substrate resulting therefrom. On the other hand, the electrochemical detection method is, for example, a method of detecting a change in current accompanying the transfer of electrons due to the oxidation-reduction reaction. In addition, according to the electrochemical detection method, the chromogenic substrate as described above in the colorimetric method is unnecessary.
本発明において、前記分析対象物は、例えば、クレアチニン、コレステロール、グルコース、乳酸、尿酸、ピルビン酸、クレアチン、血液尿素窒素（ＢＵＮ）、グルタミック−オキサロアセティックトランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミック−ピルビックトランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、ビリルビンが好ましく、これらの物質に応じて前記酸化還元酵素を選択できる。具体的な組み合わせとしては、例えば、クレアチニンに対してサルコシンオキシダーゼ、グルコースに対してグルコースデヒドロゲナーゼ、乳酸に対してラクテートオキシダーゼ、尿酸に対してウリカーゼ、コレステロールに対してコレステロールオキシダーゼ等の組み合わせがあげられる。 In the present invention, the analyte includes, for example, creatinine, cholesterol, glucose, lactic acid, uric acid, pyruvate, creatine, blood urea nitrogen (BUN), glutamic-oxaloacetic transaminase (GOT), glutamic-pyruvic transaminase ( GPT) and bilirubin are preferable, and the oxidoreductase can be selected according to these substances. Specific combinations include sarcosine oxidase for creatinine, glucose dehydrogenase for glucose, lactate oxidase for lactic acid, uricase for uric acid, cholesterol oxidase for cholesterol, and the like.
これらの中でも、クレアチンに対してサルコシンオキシダーゼを使用する組み合わせが特に好ましい。従来のクレアチン分析は、例えば、1)クレアチンをクレアチナーゼで処理してサルコシンを生成させ、2)前記サルコシンをサルコシンオキシダーゼで処理して過酸化水素を生成させ、3)前記過酸化水素をさらにペルオキシダーゼで処理し、過酸化水素量からクレアチン量を換算するという、多段階の酵素反応によって行われていた。しかしながら、例えば、比色法において前述のように包接メディエータを使用すれば、サルコシンを生成させた後、サルコシンオキシダーゼ反応により、サルコシンから電子が放出され、前記電子が後述するようにメディエータに授与され、この電子が前記メディエータから前記発色基質に伝達されることによって、前記基質の発色が生じる。すなわち、少なくともサルコシンオキシダーゼで処理した後は、さらなる酵素反応（例えば、POD反応）が不要になるのである。そして、この酵素反応に使用するメディエータとしては、本発明における「前記包接メディエータ」が必須であり、例えば、α−ナフトキノン、ＴＴＦ、α-ナフトキノン、メチルフェロセン、フェロセン、フェロセンジカルボン酸、ｍ-ＰＭＳ、Meldra Blue、[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl、[Ru(NH3)6]Cl、 [Cu(bpy)3]Cl2、Fe(nitroso-PSAP)3、 Fe(nitroso-ESAP)3、K3[Fe(CN)6]、[Cu(bpy)2]Cl2等の「未包接メディエータ」では発色反応が起らないことは、本発明者らにより確認ずみである。なお、クレアチニンをクレアチニナーゼで処理することによってクレアチンが生成されるため、クレアチニンに対してサルコシンオキシダーゼを組み合わせることも好ましい。また、ＧＯＴの測定においては、オキサロ酢酸脱水粗酵素で処理することによってピルビン酸が生成されるため、ＧＯＴに対してピルビン酸オキシダーゼを組み合わせることも好ましい。 Among these, a combination using sarcosine oxidase with respect to creatine is particularly preferable. Conventional creatine analysis includes, for example, 1) treating creatine with creatinase to produce sarcosine, 2) treating the sarcosine with sarcosine oxidase to produce hydrogen peroxide, and 3) further treating the hydrogen peroxide with peroxidase. It was carried out by a multistage enzymatic reaction in which the amount of creatine was converted from the amount of hydrogen peroxide after treatment. However, for example, if the inclusion mediator is used as described above in the colorimetric method, after generating sarcosine, electrons are released from the sarcosine by the sarcosine oxidase reaction, and the electrons are given to the mediator as described later. The electrons are transferred from the mediator to the chromogenic substrate, whereby the substrate develops color. That is, at least after treatment with sarcosine oxidase, no further enzyme reaction (for example, POD reaction) is required. And as the mediator used for this enzyme reaction, “the inclusion mediator” in the present invention is essential, for example, α-naphthoquinone, TTF, α-naphthoquinone, methylferrocene, ferrocene, ferrocenedicarboxylic acid, m-PMS. , Meldra Blue, [OsCl (Him) (dmbpy) 2 ] Cl, [Ru (NH 3 ) 6 ] Cl, [Cu (bpy) 3 ] Cl 2 , Fe (nitroso-PSAP) 3 , Fe (nitroso-ESAP) It has been confirmed by the present inventors that a coloring reaction does not occur with “uninclusion mediators” such as 3 , K 3 [Fe (CN) 6 ], [Cu (bpy) 2 ] Cl 2 . Since creatine is produced by treating creatinine with creatininase, it is also preferable to combine sarcosine oxidase with creatinine. Moreover, in the measurement of GOT, since pyruvic acid is produced | generated by processing with an oxaloacetic acid dehydration crude enzyme, it is also preferable to combine a pyruvic acid oxidase with respect to GOT.
また、分析する検体としては、特に制限されず、例えば、血液、尿、唾液等の体液等があげられる。 The sample to be analyzed is not particularly limited, and examples thereof include body fluids such as blood, urine, saliva and the like.
前記比色法を利用した本発明の分析方法において、前記発色基質としては、テトラゾリウム塩が好ましい。前記テトラゾリウム塩は、ニトロフェニル基、チアゾリル基およびベンゾチアゾリル基の少なくとも一つの基を有することが好ましい。前記テトラゾリウム塩の具体例としては、例えば、2-(4-iodopheenyl)-3-(4-nitorophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride（ＩＮＴ）、3-(4,5,-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide（ＭＴＴ）、3,3´-(1,1´-Biphenyl-4,4´-diyl)-bis(2,5-diphenyl-2H-tetrazolium chloride)（Neo-ＴＢ）、3,3´-［3,3´-Dimethoxy-(1,1´-biphenyl)-4,4´-diyl］-bis［2-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride（Nitro-ＴＢ）、3,3´-［3,3´-Dimethoxy-(1,1´-biphenyl)-4,4´-diyl］-bis（2,5-diphenyl-2H-tetrazolium chloride）（ＴＢ）、2-(4-lodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium,monosodium salt（ＷＳＴ−１）、2-(4-lodophenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium,monosodium salt（ＷＳＴ−３）、2-Benzothiazoyl-3-(4-carboxy-2-methoxyphenyl)-5-[4-(2-sulfoethylcarbamoyl)phenyl]-2H-tetrazolium（ＷＳＴ−４）2,2´-Dibenzothiazolyl-5,5´-bis[4-di(2-sulfoethyl)carbamoylphenyl]-3,3´-(3,3´-dimethoxy-4,4´-biphenylene)ditetrazolium,disodium salt（ＷＳＴ−５）、2-(2-Methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt（ＷＳＴ−８）、2-(2-Benzothiazolyl)-3,5-diphenyltetrazolium Bromide、2-(2-Benzothiazolyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium Bromide、2,3-Bis(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium Chloride、2,3-Di(4-nitrophenyl)tetrazolium Perchlorate、3-(3-Nitrophenyl)-5-methyl-2-phenyltetrazolium Chloride、3-(4-Nitrophenyl)-5-methyl-2-phenyltetrazolium Chloride、鉄錯体、銅錯体があげられる。前記銅錯体としては、例えば、ビピリジル銅錯体、イミダゾール銅錯体、アミノ酸（例えば、アルギニン等）銅錯体、イミダゾール・ビピリジル銅錯体、イミダゾール・アミノ酸銅錯体等があげられ、電子の伝達により、青色（Ｃｕ2+）から赤褐色（Ｃｕ+）に色調が変化する。 In the analysis method of the present invention using the colorimetric method, the chromogenic substrate is preferably a tetrazolium salt. The tetrazolium salt preferably has at least one of a nitrophenyl group, a thiazolyl group, and a benzothiazolyl group. Specific examples of the tetrazolium salt include, for example, 2- (4-iodopheenyl) -3- (4-nitorophenyl) -5-phenyl-2H-tetrazolium chloride (INT), 3- (4,5, -Dimethyl-2 -thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT), 3,3 ′-(1,1′-Biphenyl-4,4′-diyl) -bis (2,5-diphenyl-2H-tetrazolium chloride) (Neo-TB), 3,3 '-[3,3'-Dimethoxy- (1,1'-biphenyl) -4,4'-diyl] -bis [2- (4-nitrophenyl) -5- phenyl-2H-tetrazolium chloride (Nitro-TB), 3,3 '-[3,3'-Dimethoxy- (1,1'-biphenyl) -4,4'-diyl] -bis (2,5-diphenyl- 2H-tetrazolium chloride) (TB), 2- (4-lodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium, monosodium salt (WST-1), 2- ( 4-lodophenyl) -3- (2,4-dinitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium, monosodium salt (WST-3), 2-Benzothiazoyl-3- (4-carboxy-2- methoxyphenyl) -5- [4- (2-sulfoethylcarbamoyl) phenyl] -2H-tetrazolium (WST-4) 2,2'-Dibenzothiazolyl-5,5'-bis [4-di (2-sulfoethyl) carbamoylphenyl] -3 , 3´- ( 3,3'-dimethoxy-4,4'-biphenylene) ditetrazolium, disodium salt (WST-5), 2- (2-Methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4 -disulfophenyl) -2H-tetrazolium, monosodium salt (WST-8), 2- (2-Benzothiazolyl) -3,5-diphenyltetrazolium Bromide, 2- (2-Benzothiazolyl) -3- (4-nitrophenyl) -5-phenyltetrazolium Bromide, 2,3-Bis (4-nitrophenyl) -5-phenyltetrazolium Chloride, 2,3-Di (4-nitrophenyl) tetrazolium Perchlorate, 3- (3-Nitrophenyl) -5-methyl-2-phenyltetrazolium Chloride, 3- (4-Nitrophenyl) -5-methyl-2-phenyltetrazolium chloride, iron complex, copper complex. Examples of the copper complex include a bipyridyl copper complex, an imidazole copper complex, an amino acid (eg, arginine) copper complex, an imidazole / bipyridyl copper complex, an imidazole / amino acid copper complex, and the like. The color tone changes from ( 2+ ) to reddish brown (Cu + ).
つぎに、本発明の試薬は、前述のように、前記本発明の分析方法に使用する試薬であって、前記包接メディエータを含むことを特徴とし、さらに、前記酸化還元酵素および前記発色基質を含むことが好ましい。なお、前記試薬における前記包接メディエータの割合は、特に制限されない。 Next, as described above, the reagent of the present invention is a reagent used in the analysis method of the present invention, including the inclusion mediator, and further comprising the oxidoreductase and the chromogenic substrate. It is preferable to include. In addition, the ratio of the inclusion mediator in the reagent is not particularly limited.
つぎに、本発明の分析方法について、前記酸化還元反応検出手段が比色法である一例について説明する。なお、本発明の分析方法は、この方法には限定されない。 Next, an example in which the redox reaction detecting means is a colorimetric method will be described with respect to the analysis method of the present invention. Note that the analysis method of the present invention is not limited to this method.
まず、酸化還元酵素、包接メディエータ、発色基質を溶媒に溶解・分散して、試薬液を調製する。 First, a reagent solution is prepared by dissolving and dispersing oxidoreductase, inclusion mediator, and chromogenic substrate in a solvent.
前記溶媒としては、例えば、水、緩衝液等が使用できる。前記前記緩衝液としては、特に制限されないが、例えば、リン酸緩衝液、グッドの緩衝液等があげられ、その濃度は、例えば、５０〜４００ｍＭであり、好ましくは７５〜３００ｍＭ、より好ましくは１００〜３００ｍＭである。また、前記溶媒のｐＨは、例えば、６〜９であることが好ましい。 As said solvent, water, a buffer solution, etc. can be used, for example. The buffer solution is not particularly limited, and examples thereof include a phosphate buffer solution and a Good buffer solution, and the concentration thereof is, for example, 50 to 400 mM, preferably 75 to 300 mM, more preferably 100. ~ 300 mM. Moreover, it is preferable that the pH of the said solvent is 6-9, for example.
前記試薬液における各成分の濃度は、その種類や性質等に応じて適宜決定できるが、例えば、前記包接メディエータの濃度は、例えば、１〜５００ｍＭであり、好ましくは５０〜３５０ｍＭであり、特に好ましくは１００〜２００ｍＭである。 The concentration of each component in the reagent solution can be appropriately determined according to the type, nature, etc. For example, the concentration of the inclusion mediator is, for example, 1 to 500 mM, preferably 50 to 350 mM. Preferably it is 100-200 mM.
前記試薬液における酸化還元酵素の濃度は、例えば、１〜５００Ｕ／ｍｌであり、反応溶液における前記酸化還元酵素の終濃度は、例えば、５〜１０Ｕ／ｍｌであることが好ましい。前記試薬液における発色基質の濃度は、例えば、１〜１００mol/Lであり、反応溶液における前記発色基質の濃度は、例えば、１〜５mol/Lであることが好ましい。具体的に、反応溶液における各成分の終濃度は、包接メディエータがシクロデキストリンで包接されたＴＴＦの場合、例えば、４０ｍＭであり、酸化還元酵素がサルコシンオキシダーゼの場合、例えば、１〜５Ｕ／ｍｌであり、前記発色基質がテトラゾリウム塩の場合、例えば、１〜５mol/Lである。 The concentration of the oxidoreductase in the reagent solution is, for example, 1 to 500 U / ml, and the final concentration of the oxidoreductase in the reaction solution is preferably, for example, 5 to 10 U / ml. The concentration of the chromogenic substrate in the reagent solution is preferably 1 to 100 mol / L, for example, and the concentration of the chromogenic substrate in the reaction solution is preferably 1 to 5 mol / L, for example. Specifically, the final concentration of each component in the reaction solution is, for example, 40 mM when the inclusion mediator is TTF encapsulated with cyclodextrin, and when the oxidoreductase is sarcosine oxidase, for example, 1 to 5 U / When the chromogenic substrate is a tetrazolium salt, the amount is, for example, 1 to 5 mol / L.
そして、この試薬液に分析対象物を含む検体を添加することによって、前記酸化還元酵素による酸化還元反応によって、メディエータを介して、分析対象物と発色基質との間で電子授受が行われる。具体的には、前記酵素反応によって、前記分析対象物が酸化されて電子を放出すると、前記メディエータがこの放出された電子を受け取る。そして、この電子が、前記メディエータから前記発色基質にさらに伝達され、前記発色基質が還元されることによって発色する。この発色は、検体中の分析対象物の濃度と相関関係を示すため、前記発色の程度を測定することによって、前記分析対象物を定性または定量分析できるのである。 Then, by adding a specimen containing the analyte to the reagent solution, an electron exchange is performed between the analyte and the chromogenic substrate via the mediator by the oxidation-reduction reaction by the oxidoreductase. Specifically, when the analyte is oxidized by the enzyme reaction and emits electrons, the mediator receives the emitted electrons. The electrons are further transferred from the mediator to the chromogenic substrate, and the chromogenic substrate is reduced to develop color. Since this color development correlates with the concentration of the analyte in the sample, the analyte can be qualitatively or quantitatively analyzed by measuring the degree of color development.
前記反応溶液は、例えば、前記試薬溶液への前記検体の添加から５秒以内の短時間に、分析対象物の濃度に応じて発色する。この変化は目視で確認しても良いし、分光光度計等の光学系測定装置を用いて測定してもよい。 The reaction solution develops color according to the concentration of the analyte in a short time within 5 seconds from the addition of the specimen to the reagent solution, for example. This change may be confirmed visually or may be measured using an optical measuring device such as a spectrophotometer.
なお、このような本発明の比色分析方法は、前述のような液系での実施には限定されず、後述するような本発明の比色分析用試験片を使用して行うこともできる。 The colorimetric analysis method of the present invention is not limited to the above-described liquid system, and can be performed using the colorimetric test specimen of the present invention as described later. .
本発明の分析用試験片は、前記本発明の分析方法に使用する試験片であって、前記本発明の試薬含むことを特徴とする。このような試験片によれば本発明の比色分析方法が、迅速かつ簡便に実施できる。 The test strip for analysis of the present invention is a test strip used in the analysis method of the present invention, and includes the reagent of the present invention. According to such a test piece, the colorimetric analysis method of the present invention can be carried out quickly and easily.
試験片の形態としては、本発明の試薬を含有していればその形態は特に制限されず、例えば、多孔質材に前記試薬を保持させた試験片、ガラス等の基材上に、前記試薬を含む試薬層が形成された試験片等があげられる。このような試験片は、例えば、従来公知の比色分析用の試験片と同様に製造できる。前記多孔質材に前記試薬を保持させた試験片は、例えば、前記試薬を含む試薬液を準備し、この試薬液を多孔質材に含浸させ、乾燥することによって作製でき、基材上に前記試薬層が形成された試験片は、例えば、前記基材上に、前記試薬液を塗布し乾燥することによって作製できる。また、前記試薬における各成分を一種類は二種以上含む数種の成分液を準備し、各成分液について、多孔質材への含浸および乾燥を繰り返し行ってもよい。 The form of the test piece is not particularly limited as long as it contains the reagent of the present invention. For example, a test piece in which the reagent is held in a porous material, a substrate such as glass, and the reagent. And a test piece in which a reagent layer containing is formed. Such a test piece can be produced in the same manner as a conventionally known test piece for colorimetric analysis, for example. The test piece in which the reagent is held in the porous material can be prepared, for example, by preparing a reagent solution containing the reagent, impregnating the reagent solution in the porous material, and drying the test solution. The test piece on which the reagent layer is formed can be produced, for example, by applying the reagent solution on the substrate and drying it. Moreover, several types of component liquids including one or more of each component in the reagent may be prepared, and the impregnation and drying of the porous material may be repeatedly performed for each component liquid.
前記多孔質材としては、例えば、ろ紙、各種樹脂製多孔質膜等も使用できる。また、その孔径が厚み方向若しくは面方向において均一な対称多孔質膜でもよいし、厚み方向若しくはシート面方向にしたがって、連続的または段階的に変化する非対称多孔質膜であってもよい。 Examples of the porous material that can be used include filter paper and various porous resin membranes. Further, it may be a symmetric porous membrane whose pore diameter is uniform in the thickness direction or the surface direction, or an asymmetric porous membrane that changes continuously or stepwise according to the thickness direction or the sheet surface direction.
また、本発明の分析用試験片を、電気化学的検出方法を利用した本発明の分析方法に適用する場合は、例えば、さらに酸化還元電位を検知するための電極を備えることが好ましい。 Moreover, when applying the test piece for analysis of this invention to the analysis method of this invention using the electrochemical detection method, it is preferable to provide the electrode for detecting a redox potential further, for example.
つぎに、本発明の実施例について説明するが、本発明は、以下の実施例には限定されない。 Next, examples of the present invention will be described, but the present invention is not limited to the following examples.
分析対象物をクレアチニンとして、包接メディエータを用いた本発明の比色分析を行い、吸光度の経時変化を確認した。 The colorimetric analysis of the present invention using an inclusion mediator was performed with the analysis object as creatinine, and the change in absorbance over time was confirmed.
まず、包接メディエータを調製した。メディエータとしては、α−ＴＴＦを使用し、シクロデキストリンとしてはヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンを使用した。 First, an inclusion mediator was prepared. Α-TTF was used as a mediator, and hydroxypropyl-β-cyclodextrin was used as a cyclodextrin.
ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンを蒸留水に溶解して、４０ｍＭのシクロデキストリン溶液を調製した。一方、α-ＴＴＦを蒸留水に懸濁して、２ｍＭのメディエータ懸濁液を調製した。前記シクロデキストリン溶液とメディエータ懸濁液とを、１：１（体積比）の割合で混合することによって、メディエータをシクロデキストリンで包接し、包接メディエータ溶液（２ｍＭ）を調製した。 Hydroxypropyl-β-cyclodextrin was dissolved in distilled water to prepare a 40 mM cyclodextrin solution. On the other hand, α-TTF was suspended in distilled water to prepare a 2 mM mediator suspension. The cyclodextrin solution and the mediator suspension were mixed at a ratio of 1: 1 (volume ratio) to enclose the mediator with cyclodextrin to prepare an inclusion mediator solution (2 mM).
下記サルコシンオキシダーゼ溶液８μｌと、緩衝液１００μｌとを混合し、さらに前記包接メディエータ溶液２００μｌおよび下記発色剤溶液５０μｌを添加して、３７℃でインキュベートを行った。そして、この混合液に下記基質溶液を５０μｌ添加して３７℃で反応を行い、前記基質溶液の添加時を０秒として、３７℃で反応させた際の吸光度の経時変化を測定した（実施例１）。なお、前記吸光度の測定波長は７００ｎｍとした。以下に使用した各種試薬の組成および反応液における各種試薬の終濃度（かっこ書き）を示す。なお、基質として使用したサルコシンは、クレアチニンと相関関係にあり、2ｍＭサルコシンは、濃度2.83ｍｇ/100ｍｌのクレアチンに相当する。
サルコシンオキシダーゼ溶液（4.9U/ml）
サルコシンオキシダーゼ 250U/ml
ウシ血清アルブミン 0.1重量％
リン酸カリウム緩衝液（pH7.0） 50mM
緩衝液（98mmol/l）
ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH7.5） 400mM
またはＣＨＥＳ緩衝液（ｐH9.0） 400mM
包接メディエータ溶液（0.98mmol/L）
包接メディエータ 2mM
発色剤溶液（0.98mmol/l）
商品名WST-5（同仁化学社製） 8mmol/l
基質溶液（123μmol/lまたは245μmol/l）
サルコシン 2mM
蒸留水
また、比較例１としては、前記包接メディエータに代えて、未処理α−ＴＴＦを使用した以外は、前述と同様にして吸光度測定を行った。なお、コントロールは、前記基質溶液無添加の混合液について測定を行った。
8 μl of the following sarcosine oxidase solution and 100 μl of the buffer solution were mixed, 200 μl of the inclusion mediator solution and 50 μl of the color former solution described below were added, and the mixture was incubated at 37 ° C. Then, 50 μl of the following substrate solution was added to this mixed solution and reacted at 37 ° C., and the time course of absorbance at 37 ° C. was measured with the addition of the substrate solution taken as 0 seconds (Example) 1). The absorbance measurement wavelength was 700 nm. The compositions of the various reagents used below and the final concentrations (in parentheses) of the various reagents in the reaction solution are shown below. Sarcosine used as a substrate has a correlation with creatinine, and 2 mM sarcosine corresponds to creatine at a concentration of 2.83 mg / 100 ml.
Sarcosine oxidase solution (4.9 U / ml)
Sarcosine oxidase 250U / ml
Bovine serum albumin 0.1% by weight
Potassium phosphate buffer (pH 7.0) 50 mM
Buffer solution (98mmol / l)
HEPES buffer (pH 7.5) 400 mM
Or CHES buffer (pH 9.0) 400 mM
Inclusion mediator solution (0.98mmol / L)
Inclusion mediator 2mM
Color former solution (0.98mmol / l)
Product name WST-5 (Dojindo) 8mmol / l
Substrate solution (123 μmol / l or 245 μmol / l)
Sarcosine 2mM
Distilled water As Comparative Example 1, absorbance was measured in the same manner as described above except that untreated α-TTF was used instead of the inclusion mediator. As a control, the measurement was performed on the mixed solution without the substrate solution.
これらの結果を図１および図２に示す。図１および図２は、発色基質の発色程度を示す吸光度の経時変化を示すグラフであって、図１がｐＨ7.5の条件、図２がｐＨ9.0の条件であって、両図において（Ａ）が実施例１の結果、（Ｂ）が比較例１の結果であり、○が実施例１または比較例１の結果、●がコントロールを示す。また、図中における矢印は、基質溶液の添加時点を示す（以下同様）。 These results are shown in FIG. 1 and FIG. FIG. 1 and FIG. 2 are graphs showing changes over time in absorbance indicating the degree of color development of the chromogenic substrate, wherein FIG. 1 shows the condition at pH 7.5, and FIG. 2 shows the condition at pH 9.0. A) is the result of Example 1, (B) is the result of Comparative Example 1, ◯ is the result of Example 1 or Comparative Example 1, and ● is the control. Moreover, the arrow in a figure shows the addition time of a substrate solution (hereinafter the same).
図１（Ｂ）および図２（Ｂ）に示すように、未処理のメディエータを使用した比較例１によると、基質添加によっても吸光度に変化がなかったことから、メディエータを介した電子授受がなされず、酸化還元反応が起らなかったことがわかる。これに対して、図１（Ａ）、図２（Ａ）に示すように、包接メディエータを使用した実施例１によれば、基質添加によって吸光度が上昇したことから、包接メディエータを介して電子授受が行われたことがわかる。つまり、メディエータ（α-ＴＦＦ）を包接することによって、サルコシンオキシダーゼを用いたサルコシンの比色分析が可能になったといえる。 As shown in FIG. 1 (B) and FIG. 2 (B), according to Comparative Example 1 using an untreated mediator, there was no change in absorbance even when the substrate was added, so that electron transfer via the mediator was performed. It can be seen that no oxidation-reduction reaction occurred. On the other hand, as shown in FIGS. 1 (A) and 2 (A), according to Example 1 using the inclusion mediator, the absorbance was increased by the addition of the substrate. You can see that electronic transfer was done. In other words, it can be said that the colorimetric analysis of sarcosine using sarcosine oxidase has become possible by including the mediator (α-TFF).
メディエータとしてα−ナフトキノンを使用した以外は、前記実施例１と同様にして包接メディエータを調製し、同様にして吸光度測定を行った。また、メディエータとして未処理α-ナフトキノンを使用した以外は、前記比較例１と同様にして吸光度測定を行ったものを比較例２とした。 An inclusion mediator was prepared in the same manner as in Example 1 except that α-naphthoquinone was used as the mediator, and the absorbance was measured in the same manner. Further, Comparative Example 2 was obtained by measuring absorbance in the same manner as Comparative Example 1 except that untreated α-naphthoquinone was used as a mediator.
これらの結果を図３および図４に示す。図３および図４は、発色基質の発色程度を示す吸光度の経時変化を示すグラフであって、図３がｐＨ7.5の条件、図４がｐＨ9.0の条件であって、両図において（Ａ）が実施例２の結果、（Ｂ）が比較例２の結果であり、○が実施例２または比較例２の結果、●がコントロールを示す。 These results are shown in FIG. 3 and FIG. 3 and 4 are graphs showing changes in absorbance over time indicating the degree of color development of the chromogenic substrate, wherein FIG. 3 is a pH 7.5 condition and FIG. 4 is a pH 9.0 condition. A) is the result of Example 2, (B) is the result of Comparative Example 2, ◯ is the result of Example 2 or Comparative Example 2, and ● is the control.
図３（Ｂ）および図４（Ｂ）に示すように、未処理のメディエータを使用した比較例１によると、基質添加によっても吸光度に変化が少なかったことから、メディエータを介した電子授受の効率が包接メディエータに比べて低く、酸化還元反応が起らなかったことがわかる。これに対して、図３（Ａ）、図４（Ａ）に示すように、包接メディエータを使用した実施例２によれば、基質添加によって吸光度が上昇したことから、包接メディエータを介して電子授受が行われたことがわかる。つまり、メディエータ（α-ナフトキノン）を包接することによって、サルコシンオキシダーゼを用いたサルコシンの比色分析が可能になったといえる。また、実施例２によれば、前記吸光度上昇が著しいことから、測定感度においても優れているといえる。 As shown in FIG. 3 (B) and FIG. 4 (B), according to Comparative Example 1 using an untreated mediator, the change in absorbance was small even when the substrate was added. Is lower than that of the inclusion mediator, indicating that no redox reaction occurred. On the other hand, as shown in FIGS. 3 (A) and 4 (A), according to Example 2 using the inclusion mediator, the absorbance increased due to the addition of the substrate. You can see that electronic transfer was done. In other words, it can be said that the colorimetric analysis of sarcosine using sarcosine oxidase was made possible by inclusion of mediator (α-naphthoquinone). Moreover, according to Example 2, since the said light absorbency raise is remarkable, it can be said that it is excellent also in measurement sensitivity.
分析対象物をクレアチンとして、包接メディエータを用いた本発明の比色分析を行い、クレアチニン濃度に対する吸光度の測定を行った。 The colorimetric analysis of the present invention using the inclusion mediator was performed with the analysis object as creatine, and the absorbance with respect to the creatinine concentration was measured.
包接メディエータとしては、前記実施例１と同じ包接α−ＴＴＦ、および実施例２と同じ包接α-ナフトキノンを使用した。 As the inclusion mediator, the same inclusion α-TTF as in Example 1 and the same inclusion α-naphthoquinone as in Example 2 were used.
所定のクレアチニン濃度（0.1, 0.3, 0.5, 1, 5, 10, 20, 40mg/100ml）に相当する所定濃度（0.078, 0.23, 0.39, 0.78, 3.93, 7.87, 15.7, 31.5mg/100ml）のサルコシン溶液を調製した。この各種サルコシン溶液を基質溶液として使用した以外は、前記実施例１および実施例２と同様にして吸光度測定を行った。また、これらの結果を図５および図６に示す。図５および図６は、クレアチン濃度に対する吸光度の増加を示すグラフであって、図５は、包接ＴＴＦを使用した例、図６は包接α−ナフトキノンを使用した結果であり、両図において（Ａ）はpH7.5の条件、（Ｂ）はｐＨ9.0の条件における結果を示す。なお、両図において■が実施例であり、□がコントロールである。 Sarcosine of the prescribed concentration (0.078, 0.23, 0.39, 0.78, 3.93, 7.87, 15.7, 31.5 mg / 100 ml) corresponding to the prescribed creatinine concentration (0.1, 0.3, 0.5, 1, 5, 10, 20, 40 mg / 100 ml) A solution was prepared. Absorbance was measured in the same manner as in Examples 1 and 2 except that these various sarcosine solutions were used as substrate solutions. These results are shown in FIG. 5 and FIG. 5 and 6 are graphs showing the increase in absorbance with respect to the creatine concentration. FIG. 5 shows an example using inclusion TTF, and FIG. 6 shows the result using inclusion α-naphthoquinone. (A) shows the results at pH 7.5, and (B) shows the results at pH 9.0. In both figures, ■ is an example and □ is a control.
図５（Ａ）および図６（Ａ）に示すように、包接ＴＴＦ包接α−ナフトキノンをメディエータとして使用した場合、クレアチンの増加によって吸光度の増加が見られた。このことより、本発明の比色分析方法によれば、定量的にクレアチニンの分析が行えることがわかる。 As shown in FIG. 5 (A) and FIG. 6 (A), when inclusion TTF inclusion α-naphthoquinone was used as a mediator, an increase in absorbance was observed due to an increase in creatine. This shows that the colorimetric analysis method of the present invention can quantitatively analyze creatinine.
以上のように、本発明の分析方法によれば、例えば、従来、比色分析に適用できなかったメディエータを用いて、比色分析を行うことができる。 As described above, according to the analysis method of the present invention, for example, colorimetric analysis can be performed using a mediator that has not been conventionally applicable to colorimetric analysis.
Claims (22)
前記酸化還元反応が、電子授受を行うメディエータの存在下で行われ、かつ、前記メディエータが、シクロデキストリンで包接されていることを特徴とする分析方法。 An analysis method for qualitatively or quantitatively analyzing the analyte by performing an oxidation-reduction reaction with an oxidoreductase on the analyte and detecting the oxidation-reduction reaction with an oxidation-reduction reaction detection means,
An analysis method, wherein the oxidation-reduction reaction is performed in the presence of a mediator that performs electron transfer, and the mediator is included in cyclodextrin.
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