JP2009244014A - Biosensor for measuring neutral fat - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、バイオセンサに関する。詳細には、生体試料などに含まれる中性脂肪を、迅速かつ高精度に定量することができる中性脂肪測定用バイオセンサに関する。 The present invention relates to a biosensor. More specifically, the present invention relates to a biosensor for measuring neutral fat that can quickly and accurately quantify neutral fat contained in a biological sample.
近年、バイオセンサが医療などの分野において応用されている。バイオセンサの測定対象は低分子から高分子に至るまでの様々な化学物質であり、測定対象に応じて、種々の機
能を有するバイオセンサの開発が進められている。
In recent years, biosensors have been applied in fields such as medicine. Biosensors are various chemical substances ranging from low molecules to macromolecules, and biosensors having various functions are being developed according to the measurement objects.
従来、生体試料および食品中に含まれる特定成分（基質）を希釈や撹拌などを行うことなく簡易に定量することができるバイオセンサが知られている。例えば、絶縁性の基板上に少なくとも作用極および対極を有する電極系を形成し、この電極系上に酸化還元酵素および電子受容体を親水性ポリマーなどの固定化剤で固定化させた酵素反応層を設け、次いでこの酵素反応層の上に濾過層（血球除去層）を設け、さらにこの濾過層の上からカバーを被せて一体化したバイオセンサが提案されている。 2. Description of the Related Art Conventionally, biosensors that can easily quantify specific components (substrates) contained in biological samples and foods without dilution or stirring are known. For example, an enzyme reaction layer in which an electrode system having at least a working electrode and a counter electrode is formed on an insulating substrate, and an oxidoreductase and an electron acceptor are immobilized on the electrode system with a fixing agent such as a hydrophilic polymer. Next, a biosensor has been proposed in which a filtration layer (blood cell removal layer) is provided on the enzyme reaction layer, and a cover is covered from the filtration layer.
このバイオセンサは、以下の方法により試料中の基質濃度を定量する。まず、濾過層に血液等の試料溶液を滴下し、その濾過液が酵素反応層に浸透することにより、酸化還元酵素および電子受容体が試料溶液中に溶解し、基質と酵素との間で酵素反応が進行する。この酵素反応によって基質が酸化され、同時に電子受容体が還元される。酵素反応の終了後、還元された電子受容体を電気化学的に酸化し、このとき得られる酸化電流値から試料溶液中の基質濃度を求めるものである。 This biosensor quantifies the substrate concentration in a sample by the following method. First, a sample solution such as blood is dropped onto the filtration layer, and the filtrate penetrates into the enzyme reaction layer, so that the oxidoreductase and the electron acceptor are dissolved in the sample solution, and the enzyme is introduced between the substrate and the enzyme. The reaction proceeds. This enzymatic reaction oxidizes the substrate and simultaneously reduces the electron acceptor. After the completion of the enzyme reaction, the reduced electron acceptor is electrochemically oxidized, and the substrate concentration in the sample solution is obtained from the oxidation current value obtained at this time.
中性脂肪をバイオセンサで測定する方法としては、例えば、以下の方法により試料中の中性脂肪を定量する方法が知られている。まず、試料溶液に含まれる中性脂肪は、例えば、リポプロテインリパーゼにより遊離脂肪酸とグリセロールとに分解される。ここで生じたグリセロールは、下記式（１）および式（２）で示すような、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）とグリセロリン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）またはグリセロリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）とを用いることにより定量することができる。すなわち、下記式において、酸化型電子受容体の減少、還元型電子受容体の増加、ジヒドロキシアセトンリン酸の量を測定することによって、グリセロールを定量することが可能である。 As a method for measuring neutral fat with a biosensor, for example, a method for quantifying neutral fat in a sample by the following method is known. First, the neutral fat contained in the sample solution is decomposed into free fatty acid and glycerol by, for example, lipoprotein lipase. The glycerol produced here can be quantified by using glycerol kinase (GK) and glycerophosphate oxidase (GPO) or glycerophosphate dehydrogenase (GPDH) as shown in the following formulas (1) and (2). it can. That is, in the following formula, glycerol can be quantified by measuring the decrease in the oxidized electron acceptor, the increase in the reduced electron acceptor, and the amount of dihydroxyacetone phosphate.
しかしながら、中性脂肪測定に用いられるリポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）、およびグリセロリン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）の３種の酵素はいずれも高価である。 However, all three enzymes, lipoprotein lipase, glycerol kinase (GK), and glycerophosphate oxidase (GPO), used for measuring neutral fat are expensive.
これに対し、リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）、およびグリセロリン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）を濾紙に含ませた酵素反応層を、作用極の上のみに設け、この酵素反応層の上に電子受容体および界面活性剤を含む保持層を設けた、中性脂肪測定用のバイオセンサが開示されている（特許文献１）。このバイオセンサは、作用極の上にのみ酵素を配置させることにより、酵素の使用量を減少させ、酵素コストを削減している。 In contrast, an enzyme reaction layer containing lipoprotein lipase, glycerol kinase (GK), and glycerophosphate oxidase (GPO) in filter paper is provided only on the working electrode, and an electron acceptor is provided on the enzyme reaction layer. And a biosensor for measuring neutral fat, which is provided with a retaining layer containing a surfactant (Patent Document 1). In this biosensor, an enzyme is disposed only on the working electrode, thereby reducing the amount of the enzyme used and reducing the enzyme cost.
また、中性脂肪分解反応に用いる酵素として、中性脂肪分解酵素とグリセロールデヒドロゲナーゼとの２種類を用いることで、酵素のコストを低下させたバイオセンサも開示されている（特許文献２）。
しかしながら、特許文献１のバイオセンサにおいては、作用極上にのみ酵素を配置させるため、電極構造が複雑であり、その結果、結局は製造コストの上昇は避けられないという問題がある。 However, in the biosensor disclosed in Patent Document 1, the enzyme is arranged only on the working electrode, so that the electrode structure is complicated. As a result, there is a problem that an increase in manufacturing cost is unavoidable.
一方、酸化還元酵素を親水性ポリマーなどとともに固定化することにより電極全面に酵素反応層を設けた従来のバイオセンサにおいて、脂質である中性脂肪を試料とする場合には、酵素コストの問題に加えて、親水性ポリマーへの試料液の浸透性が悪く、酵素反応、電子受容体の還元反応、および電位印加による酸化電流値の測定という一連の反応工程の終了までに非常に時間がかかるという問題がある。 On the other hand, in a conventional biosensor in which an enzyme reaction layer is provided on the entire surface of the electrode by immobilizing oxidoreductase together with a hydrophilic polymer, etc., when neutral fat as a sample is used as a sample, there is a problem of enzyme cost In addition, the permeability of the sample solution to the hydrophilic polymer is poor, and it takes a very long time to complete a series of reaction steps such as enzyme reaction, electron acceptor reduction reaction, and measurement of oxidation current value by applying a potential. There's a problem.
また、特許文献２のバイオセンサにおいても、測定時間および精度が十分であるとはいえず、より一層の高精度化および測定の迅速化が望まれている。
In addition, in the biosensor of
そこで本発明の目的は、測定精度を低下させることなく、酵素コストおよび製造コストを低下させ、かつ短時間で測定できる中性脂肪測定用バイオセンサを提供することである。 Therefore, an object of the present invention is to provide a biosensor for measuring neutral fat that can reduce the enzyme cost and the manufacturing cost and can be measured in a short time without reducing the measurement accuracy.
本発明者らは、上記の問題を解決すべく、鋭意研究を行った。その結果、電極系の上部または近傍に、グリセロールデヒドロゲナーゼ、電子受容体、および親水性ポリマーを含むポリマー層を設け、上記ポリマー層の上に中性脂肪分解酵素を不織布に固定化した不織布層を設けることにより、試料中の中性脂肪濃度が迅速かつ高精度に測定されうることを見出し、本発明を完成させるに至った。 The present inventors have intensively studied to solve the above problems. As a result, a polymer layer containing glycerol dehydrogenase, an electron acceptor, and a hydrophilic polymer is provided on or near the electrode system, and a nonwoven fabric layer in which a neutral lipolytic enzyme is immobilized on the nonwoven fabric is provided on the polymer layer. As a result, it was found that the neutral fat concentration in the sample can be measured quickly and with high accuracy, and the present invention has been completed.
本発明によれば、測定精度が高く、低コストで、そして短時間で測定できる中性脂肪測定用バイオセンサを提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a biosensor for measuring neutral fat that has high measurement accuracy, can be measured at low cost, and can be measured in a short time.
以下、本発明を実施するための好ましい一実施形態について説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみには制限されない。 Hereinafter, a preferred embodiment for carrying out the present invention will be described. However, the technical scope of the present invention is not limited to the following embodiment.
本発明の一形態によれば、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成された、少なくとも作用極および対極を含む電極系と、前記電極系の上部または近傍に形成された、グリセロールデヒドロゲナーゼ、電子受容体、および親水性ポリマーを含むポリマー層と、前記ポリマー層上に形成された、不織布に中性脂肪分解酵素が担持されてなる不織布層とを備える、前記電極系に流れる電流値に基づいて中性脂肪の濃度を測定するためのバイオセンサが提供される。 According to one aspect of the present invention, an insulating substrate, an electrode system including at least a working electrode and a counter electrode formed on the insulating substrate, and glycerol dehydrogenase formed on or near the electrode system, Based on the value of current flowing through the electrode system, comprising: a polymer layer containing an electron acceptor and a hydrophilic polymer; and a nonwoven fabric layer formed on the polymer layer and having a neutral lipolytic enzyme supported on the nonwoven fabric. A biosensor for measuring the concentration of neutral fat is provided.
以下、本発明のバイオセンサを、図１および図２を参照しながら説明する。なお、説明の都合上、図面の寸法比率は誇張されており、図示する形態が実際とは異なる場合がある。 Hereinafter, the biosensor of the present invention will be described with reference to FIGS. 1 and 2. For convenience of explanation, the dimensional ratios in the drawings are exaggerated, and the illustrated form may differ from the actual one.
図１は、本発明の一実施形態に係るバイオセンサを示す分解斜視図である。図２は、図１のＡ−Ａ線に沿って切断したバイオセンサの断面図である。なお、本発明のバイオセンサは、グリセロールデヒドロゲナーゼと電子受容体とを含む親水性のポリマー層と、不織布に中性脂肪分解酵素が担持されてなる不織布層とを備える点、および中性脂肪分解酵素を不織布に固定化する点に特徴があり、他の部材（例えば、絶縁性基板、作用極、参照極、対極などの材質や大きさなど）およびこれらの形成方法については、公知の同様の部材および方法が適用できる。 FIG. 1 is an exploded perspective view showing a biosensor according to an embodiment of the present invention. FIG. 2 is a cross-sectional view of the biosensor cut along line AA in FIG. The biosensor of the present invention includes a hydrophilic polymer layer containing glycerol dehydrogenase and an electron acceptor, and a nonwoven fabric layer in which a neutral lipolytic enzyme is supported on a nonwoven fabric, and the neutral lipolytic enzyme. Other members (for example, materials and sizes of insulating substrate, working electrode, reference electrode, counter electrode, etc.) and methods for forming them are known in the same manner. And methods are applicable.
図１および図２に示すように、バイオセンサ１０においては、絶縁性基板２０上に、作用極３０、参照極４０および対極５０からなる電極系６０が形成される。また、電極系６０を部分的に覆い、各々の電極の電気化学的に作用する部分である作用極作用部分３０ａ、参照極作用部分４０ａ、および対極作用部分５０ａが露出されるように、絶縁性ペーストを塗布／印刷し、加熱処理することにより絶縁層７０が形成される。
As shown in FIGS. 1 and 2, in the
また、作用極作用部分３０ａ、参照極作用部分４０ａ、および対極作用部分５０ａを被覆するように、ポリマー層８０が形成される。さらに、ポリマー層８０の上に不織布層９０が積層される。なお、バイオセンサ１０は、カバーによりさらに覆われた状態で使用および貯蔵される場合があるが、図１および図２においてはかようなカバーの図示は省略されている。
The
バイオセンサ１０は、体液などの試料溶液中の特定成分（以下、「基質」とも称する）
の濃度を測定するための装置である。以下、バイオセンサ１０を構成する各部材について
詳細に説明する。
The
It is an apparatus for measuring the density | concentration of. Hereinafter, each member constituting the
本発明のバイオセンサは、その基体として絶縁性基板を備える。絶縁性基板は、プラスチック、紙、ガラス、セラミックなどの絶縁性材料により構成されうる。上記プラスチックとしては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエステル、ポリスチレン、プリプロピレン、ポリカーボネート、ポリイミド、アクリル樹脂などが挙げられる。絶縁性基板の形状やサイズについては、特に制限されない。 The biosensor of the present invention includes an insulating substrate as its base. The insulating substrate can be made of an insulating material such as plastic, paper, glass, and ceramic. Examples of the plastic include polyethylene terephthalate (PET), polyester, polystyrene, propylene, polycarbonate, polyimide, and acrylic resin. The shape and size of the insulating substrate are not particularly limited.
絶縁性基板上に形成される電極系は、バイオセンサの使用時において、後述するポリマー層中の試料溶液に電位を印加するための電位印加手段、および、試料溶液中に流れる電流を検出するための電流検出手段として機能する。 The electrode system formed on the insulating substrate is used to detect a current flowing in the sample solution and a potential applying means for applying a potential to the sample solution in the polymer layer described later when the biosensor is used. Functions as current detection means.
図１および図２に示すバイオセンサは、絶縁性基板に作用極、参照極および対極が電極系として設けられる、三電極方式センサである。ただし、本発明のバイオセンサは三電極方式のみに制限されず、参照極を含まない電極系を備えた二電極方式センサであってもよい。なお、電極系における電位の制御がより高感度で行われるという観点からは、二電極方式よりも三電極方式が好ましく用いられうる。その他、液量を感知するための感知電極等を含んでいてもよい。 The biosensor shown in FIGS. 1 and 2 is a three-electrode sensor in which an insulating electrode is provided with a working electrode, a reference electrode, and a counter electrode. However, the biosensor of the present invention is not limited to the three-electrode type, and may be a two-electrode type sensor provided with an electrode system that does not include a reference electrode. Note that the three-electrode method can be preferably used rather than the two-electrode method from the viewpoint that the potential control in the electrode system is performed with higher sensitivity. In addition, a sensing electrode for sensing the amount of liquid may be included.
作用極および対極は、バイオセンサの使用時に一対となって、後述するポリマー層中の試料溶液に電位を印加した際に流れる酸化電流（応答電流）を測定するための電流測定手段として機能する。バイオセンサの使用時には、参照極を基準に、対極と作用極との間に所定の電位が印加される。 The working electrode and the counter electrode are paired when the biosensor is used, and function as current measuring means for measuring an oxidation current (response current) that flows when a potential is applied to a sample solution in the polymer layer described later. When the biosensor is used, a predetermined potential is applied between the counter electrode and the working electrode with reference to the reference electrode.
本発明において使用される電極は、測定対象物と試料との反応を電気化学的に検出できるものであれば特に制限されず、バイオセンサの電極系の形成に従来用いられる電極が適宜用いられうる。ただし、バイオセンサの応答感度をより一層向上させるという観点からは、電極系は表面抵抗値のより小さい材料から構成されることが好ましい。具体的な電極の一例としては、カーボン電極、金電極、銀電極、白金電極、パラジウム電極などが挙げられる。各電極（作用極、参照極、対極）を構成する材料は、それぞれ同一であってもよいし、異なっていてもよい。耐腐食性およびコストの観点から、作用極および対極はカーボンを主成分として構成されることが好ましい。また、印加電位の安定性が高いという観点から、参照極は好ましくは銀／塩化銀により構成される。 The electrode used in the present invention is not particularly limited as long as it can electrochemically detect the reaction between the measurement object and the sample, and an electrode conventionally used for forming an electrode system of a biosensor can be appropriately used. . However, from the viewpoint of further improving the response sensitivity of the biosensor, the electrode system is preferably composed of a material having a smaller surface resistance value. Specific examples of the electrode include a carbon electrode, a gold electrode, a silver electrode, a platinum electrode, and a palladium electrode. The materials constituting each electrode (working electrode, reference electrode, counter electrode) may be the same or different. From the viewpoint of corrosion resistance and cost, the working electrode and the counter electrode are preferably composed of carbon as a main component. Further, from the viewpoint of high stability of the applied potential, the reference electrode is preferably composed of silver / silver chloride.
電極系の形成方法は特に制限されず、スクリーン印刷法やスパッタリング法などの従来公知の手法により形成されうる。この際、電極系を構成する材料は、ポリエステル等の樹脂バインダを含むペーストの形態で提供されうる。上記の手法により塗膜を形成した後には、塗膜を硬化させる目的で、加熱処理を施すとよい。 The method for forming the electrode system is not particularly limited, and can be formed by a conventionally known method such as a screen printing method or a sputtering method. At this time, the material constituting the electrode system can be provided in the form of a paste containing a resin binder such as polyester. After forming a coating film by said method, it is good to heat-process in order to harden a coating film.
絶縁層は、電極系を構成する各電極間の短絡を防止するための絶縁手段として機能する。絶縁層を構成する材料は特に制限されないが、例えば、レジストインク、ＰＥＴやポリエチレン等の樹脂、ガラス、セラミックス、紙などにより構成されうる。絶縁層の形成方法についても特に制限はなく、スクリーン印刷法や接着法などの従来公知の手法により形成されうる。 The insulating layer functions as an insulating means for preventing a short circuit between the electrodes constituting the electrode system. Although the material which comprises an insulating layer is not restrict | limited in particular, For example, it can comprise with resist ink, resin, such as PET and polyethylene, glass, ceramics, paper, etc. There is no restriction | limiting in particular also about the formation method of an insulating layer, It can form by conventionally well-known methods, such as a screen printing method and an adhesion method.
バイオセンサの使用時には、ポリマー層および不織布層において後述する酵素反応が進行する。以下、本発明の特徴的な構成要素であるポリマー層および不織布層について詳細に説明する。 When the biosensor is used, an enzyme reaction described later proceeds in the polymer layer and the nonwoven fabric layer. Hereinafter, the polymer layer and the nonwoven fabric layer which are characteristic components of the present invention will be described in detail.
本発明のバイオセンサにおいて、ポリマー層は、グリセロールデヒドロゲナーゼ、電子受容体、および親水性ポリマーを含む。ポリマー層にグリセロールデヒドロゲナーゼおよび電子受容体が存在すると、グリセロールが酸化されるとともに電子受容体が還元される。そのため、得られる電子受容体の酸化電流値から基質の濃度を正確に定量することができる。 In the biosensor of the present invention, the polymer layer includes glycerol dehydrogenase, an electron acceptor, and a hydrophilic polymer. When glycerol dehydrogenase and electron acceptor are present in the polymer layer, glycerol is oxidized and the electron acceptor is reduced. Therefore, the concentration of the substrate can be accurately determined from the oxidation current value of the obtained electron acceptor.
本発明のバイオセンサにおいて、ポリマー層に試料溶液が浸透すると、電極の近傍で速やかにグリセロールデヒドロゲナーゼおよび電子受容体が試料溶液に溶解して反応して電極上に達する。一方、測定の妨害となる試料中のタンパク質等の電極系への吸着が親水性ポリマーにより防止されうる。このため、短時間で精度のよい測定が可能となる。 In the biosensor of the present invention, when the sample solution penetrates into the polymer layer, glycerol dehydrogenase and electron acceptor quickly dissolve in the sample solution in the vicinity of the electrode and react to reach the electrode. On the other hand, adsorption to the electrode system of proteins or the like in the sample that interferes with the measurement can be prevented by the hydrophilic polymer. For this reason, accurate measurement can be performed in a short time.
グリセロールデヒドロゲナーゼは、バイオセンサの使用時において、試料溶液中のグリセロールを酸化して電子受容体を還元するという機能を有する補酵素結合型の酸化還元酵素である。グリセロールデヒドロゲナーゼの種類はかような機能を有するものであれば特に制限されず、従来公知のグリセロールデヒドロゲナーゼであっても、さらにこれを改質して安定性や反応性を向上させたものなど、いずれも好適に使用することができる。 Glycerol dehydrogenase is a coenzyme-linked oxidoreductase having a function of reducing electron acceptor by oxidizing glycerol in a sample solution when a biosensor is used. The type of glycerol dehydrogenase is not particularly limited as long as it has such a function, and even a conventionally known glycerol dehydrogenase may be further modified to improve stability or reactivity. Can also be suitably used.
グリセロールデヒドロゲナーゼに結合する補酵素としては、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）からなる群より選択される少なくとも１種の補酵素を好適に使用することができる。これらの中でも、補酵素はＰＱＱであることが好ましい。ここで、ＰＱＱ結合型グリセロールデヒドロゲナーゼは溶液中の電子受容体のみを反応に使用し、溶存酸素の影響を受けない。したがって、ＰＱＱ結合型グリセロールデヒドロゲナーゼを用いて還元型の電子受容体の酸化電流を測定することにより、試料溶液中の中性脂肪濃度がより正確に測定されうる。 Coenzymes that bind to glycerol dehydrogenase include pyrroloquinoline quinone (PQQ), flavin mononucleotide (FMN), flavin adenine dinucleotide (FAD), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate ( At least one coenzyme selected from the group consisting of NADP) can be suitably used. Among these, the coenzyme is preferably PQQ. Here, PQQ-linked glycerol dehydrogenase uses only the electron acceptor in the solution for the reaction and is not affected by dissolved oxygen. Therefore, the neutral fat concentration in the sample solution can be measured more accurately by measuring the oxidation current of the reduced electron acceptor using PQQ-linked glycerol dehydrogenase.
ポリマー層におけるグリセロールデヒドロゲナーゼの含有量については特に制限はなく、測定する試料の種類や試料溶液の添加量、使用する親水性ポリマーの量や電子受容体の種類などによって適宜選択することができる。一例を挙げると、センサ１枚あたり、通常は０．１〜１０００活性単位、好ましくは０．５〜５００活性単位、より好ましくは１〜１００活性単位のグリセロールデヒドロゲナーゼがポリマー層に含まれるとよい。なお、グリセロールデヒドロゲナーゼの活性単位の定義および測定方法については、後述する実施例の記載が参照されうる。 本形態において用いられるグリセロールデヒドロゲナーゼは、市販の商品を購入して用いてもよいし、自ら調製したものを用いてもよい。当該酵素を自ら調製する手法としては、例えば、当該酵素を産生する細菌を利用する手法がある。当該酵素を産生する細菌としては、例えば、グルコノバクター属、シュードモナス属など様々な属に属する細菌が挙げられる。本実施形態では、特にグルコノバクター属に属する細菌の膜画分に存在するＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼが好ましく用いられうる。さらに、入手の容易さから、グルコノバクター属、特には、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３１７１、３２５３、３２５８、３２８５、３２８９、３２９０、３２９１、グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）ＮＢＲＣ ３２５１、３２６０、３２６４、３２６５、３２６８、３２８６、グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ Ｃｅｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ ３２６２等が用いられうる。このような微生物の代表菌株としては、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３２９１が挙げられる。 There is no restriction | limiting in particular about content of glycerol dehydrogenase in a polymer layer, It can select suitably by the kind of sample to measure, the addition amount of a sample solution, the quantity of the hydrophilic polymer to be used, the kind of electron acceptor, etc. For example, it is preferable that 0.1 to 1000 active units, preferably 0.5 to 500 active units, more preferably 1 to 100 active units of glycerol dehydrogenase per sensor is included in the polymer layer. In addition, for the definition of the activity unit of glycerol dehydrogenase and the measuring method, the description of the Example mentioned later can be referred. As the glycerol dehydrogenase used in this embodiment, a commercially available product may be purchased and used, or one prepared by itself may be used. As a method for preparing the enzyme itself, for example, there is a method using bacteria that produce the enzyme. Examples of the bacteria that produce the enzyme include bacteria belonging to various genera such as Gluconobacter and Pseudomonas. In the present embodiment, PQQ-dependent glycerol dehydrogenase present in the membrane fraction of bacteria belonging to the genus Gluconobacter can be preferably used. Furthermore, due to availability, Gluconobacter genus, in particular, Gluconobacter oxydans NBRC 3171, 3253, 3258, 3285, 3289, 3290, 3291, Gluconobacter frateurii NBRC 3251, 3260, 3264, 3265, 3268, 3286, Gluconobacter Cerinus NBRC 3262, etc. may be used. A representative strain of such a microorganism is Gluconobacter oxydans NBRC 3291.
これらの細菌からＰＱＱ結合型グリセロールデヒドロゲナーゼを得る手法については特に制限されず、従来公知の知見が適宜参照されうる。 The technique for obtaining PQQ-linked glycerol dehydrogenase from these bacteria is not particularly limited, and conventionally known knowledge can be referred to as appropriate.
本形態のバイオセンサにおいて、グリセロールデヒドロゲナーゼがＰＱＱ結合型である場合、当該グリセロールデヒドロゲナーゼは、界面活性剤の存在下、２価性架橋試薬で化学修飾されて得られる修飾グリセロールデヒドロゲナーゼであることが好ましい。かような修飾グリセロールデヒドロゲナーゼにおいては、疎水性の酵素が凝集せずに架橋構造が導入されて構造が強固となっており、熱安定性が向上しうる。従って、上述した実施形態のバイオセンサによれば、試料中の中性脂肪濃度をより高精度で測定することが可能となる。 In the biosensor of this embodiment, when the glycerol dehydrogenase is PQQ-linked, the glycerol dehydrogenase is preferably a modified glycerol dehydrogenase obtained by chemical modification with a bivalent crosslinking reagent in the presence of a surfactant. In such a modified glycerol dehydrogenase, a hydrophobic enzyme is not aggregated and a cross-linked structure is introduced to make the structure strong, and thermal stability can be improved. Therefore, according to the biosensor of the embodiment described above, the neutral fat concentration in the sample can be measured with higher accuracy.
２価性架橋試薬は、ＰＱＱ結合型グリセロールデヒドロゲナーゼに含まれるアミノ基などと反応して架橋構造を導入できるものであれば特に制限はなく、固定化酵素の分野で酵素の架橋剤として使用できるジアルデヒド化合物、ジカルボン酸化合物、ジイソシアネート系化合物、イミデート化合物などを好適に使用することができる。ジアルデヒド化合物としては、グルタルアルデヒド、スクシンジアルデヒド、アジピンアルデヒド等があり、ジカルボン酸化合物としては、アジピン酸、ジメチルアジピン酸等があり、ジイソシアネート系化合物としてはヘキサメチレンジイソシアネート、トルエンジイソシアネートなどがあり、イミデート化合物としては、ジメチルスベルイミデート、ジメチルピメルイミデートなどがある。本発明では、上記２価性架橋試薬の中でも、グルタルアルデヒドが特に好ましい。 The bivalent crosslinking reagent is not particularly limited as long as it can react with an amino group or the like contained in PQQ-linked glycerol dehydrogenase to introduce a crosslinked structure, and can be used as an enzyme crosslinking agent in the field of immobilized enzymes. Aldehyde compounds, dicarboxylic acid compounds, diisocyanate compounds, imidate compounds, and the like can be suitably used. Dialdehyde compounds include glutaraldehyde, succindialdehyde, adipic aldehyde, etc., dicarboxylic acid compounds include adipic acid, dimethyl adipic acid, etc., diisocyanate compounds include hexamethylene diisocyanate, toluene diisocyanate, Examples of imidate compounds include dimethyl suberimidate and dimethyl pmelimidate. In the present invention, glutaraldehyde is particularly preferable among the divalent crosslinking reagents.
一方、界面活性剤としては、一般的に膜タンパク質の可溶化に用いられているものであれば特に制限されず、従来公知の知見が適宜参照されうる。例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、オクチルグルコシド、コール酸ナトリウムなどが挙げられる。 On the other hand, the surfactant is not particularly limited as long as it is generally used for solubilization of membrane proteins, and conventionally known knowledge can be appropriately referred to. For example, Triton (registered trademark) X-100, octyl glucoside, sodium cholate and the like can be mentioned.
架橋反応時の反応温度は、用いる２価性架橋試薬によって適宜選択することができるが、一般には０〜４０℃程度で行うことが好ましく、反応時間は１分〜４時間、好ましくは５分〜２時間程度、特に好ましくは５分〜１時間である。１分を下回ると架橋が十分でなく未架橋酵素量が多くなり、一方、４時間を越えると架橋率が上がりすぎ酵素の活性が失われる場合がある。 The reaction temperature during the cross-linking reaction can be appropriately selected depending on the divalent cross-linking reagent to be used. In general, the reaction temperature is preferably about 0 to 40 ° C., and the reaction time is 1 minute to 4 hours, preferably 5 minutes to About 2 hours, particularly preferably 5 minutes to 1 hour. If it is less than 1 minute, crosslinking is not sufficient and the amount of uncrosslinked enzyme increases, whereas if it exceeds 4 hours, the crosslinking rate increases so that the enzyme activity may be lost.
架橋反応は、グリシン溶液またはトリス塩酸緩衝液のような停止剤を加えて反応させることで停止させることができる。上記架橋処理後、未反応のグリシン、２価性架橋試薬、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、および停止剤と２価性架橋試薬との反応物は、透析法、クロマトグラフィー法、限外濾過法等を行うことで除去することができる。本発明では、特に透析法を行うことが好ましい。その理由は、操作が簡便であり、コストがかからないためである。 The cross-linking reaction can be stopped by adding a stop agent such as a glycine solution or a Tris-HCl buffer to react. After the cross-linking treatment, unreacted glycine, divalent cross-linking reagent, 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol, and the reaction product of the terminator and the divalent cross-linking reagent are dialysis, It can be removed by performing a chromatography method, an ultrafiltration method or the like. In the present invention, it is particularly preferable to perform a dialysis method. The reason is that the operation is simple and does not cost.
電子受容体は、バイオセンサの使用時において、酸化還元酵素の作用によって生成した電子を受け取る、すなわち還元される。そして、還元された電子受容体は、酵素反応の終了後に電極系への電位の印加によって電気化学的に酸化される。この際に流れる電流（以下、「酸化電流」とも称する）の大きさから、試料溶液中の所望の成分の濃度が算出されうる。 The electron acceptor receives, that is, reduced, electrons generated by the action of oxidoreductase during use of the biosensor. The reduced electron acceptor is electrochemically oxidized by applying a potential to the electrode system after completion of the enzyme reaction. The concentration of the desired component in the sample solution can be calculated from the magnitude of the current flowing at this time (hereinafter also referred to as “oxidation current”).
電子受容体の種類については、酸化還元反応により生成した電子を受容できるものであれば特に制限されず、使用される酸化還元酵素や試料などによって適宜選択することができる。具体的には、フェリシアン化カリウム［Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］］などのシアン化合物、フェロセン、フェロセンカルボン酸などのフェロセン誘導体、ｐ−ベンゾキノン、α−ナフトキノン、ｐ−ベンゾキノン誘導体およびα−ナフトキノン誘導体などのキノン誘導体、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、フェナジンメトサルフェート誘導体、２，６−ジクロロインドフェノールナトリウムなどのフェノール誘導体、ルテニウム錯体およびオスミウム錯体などの金属錯体、メチレンブルー、チオニン、インジゴカーミン、ガロシアニン、ならびにサフラニンなどが挙げられる。これらの電子受容体は１種のみが単独で用いられてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。 The type of electron acceptor is not particularly limited as long as it can accept electrons generated by the oxidation-reduction reaction, and can be appropriately selected depending on the oxidoreductase or sample used. Specifically, cyanide compounds such as potassium ferricyanide [K 3 [Fe (CN) 6 ]], ferrocene derivatives such as ferrocene and ferrocenecarboxylic acid, p-benzoquinone, α-naphthoquinone, p-benzoquinone derivatives and α-naphthoquinone derivatives Quinone derivatives such as, phenazine methosulfate (PMS), phenazine methosulfate derivatives, phenol derivatives such as 2,6-dichloroindophenol sodium, metal complexes such as ruthenium and osmium complexes, methylene blue, thionine, indigo carmine, galocyanine, and Examples include safranin. Only one kind of these electron acceptors may be used alone, or two or more kinds may be used in combination.
ここで、フェロセン誘導体、ｐ−ベンゾキノン誘導体、α−ナフトキノン誘導体、フェナジンメトサルフェート誘導体、およびフェノール誘導体としては、それぞれ、フェロセン、ｐ−ベンゾキノン、α−ナフトキノン、フェナジンメトサルフェート、フェノールの少なくとも１個の水素原子が、炭素数１または２のアルキル基、炭素数１または２のアルコキシ、および／またはフッ素原子、塩素原子、臭素原子などのハロゲン原子で置換されたものなどが挙げられる。具体的には、メトキシＰＭＳ（１−Ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ）、２−メチル−ｐ−ベンゾキノン（２−Ｍｅｔｈｙｌ−ｐ−ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ）、２−メチル−α−ナフトキノン（２−Ｍｅｔｈｙｌ−α−Ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ）などが挙げられる。 Here, as the ferrocene derivative, p-benzoquinone derivative, α-naphthoquinone derivative, phenazine methosulfate derivative, and phenol derivative, at least one hydrogen of ferrocene, p-benzoquinone, α-naphthoquinone, phenazine methosulfate, and phenol, respectively. Examples thereof include those in which an atom is substituted with an alkyl group having 1 or 2 carbon atoms, alkoxy having 1 or 2 carbon atoms, and / or a halogen atom such as a fluorine atom, a chlorine atom, or a bromine atom. Specifically, methoxy PMS (1-Methoxy-5-methylphenylsulfate), 2-methyl-p-benzoquinone (2-Methyl-p-benzoquinone), 2-methyl-α-naphthoquinone (2-Methyl-α-Naphthoquinone). ) And the like.
これらの中でも、好ましくはフェリシアン化カリウム、メトキシＰＭＳ、ｐ−ベンゾキノン、フェナジンメトサルフェート、２−メチル−ｐ−ベンゾキノン、α−ナフトキノンであり、より好ましくはフェリシアン化カリウム、メトキシＰＭＳである。 Among these, potassium ferricyanide, methoxy PMS, p-benzoquinone, phenazine methosulfate, 2-methyl-p-benzoquinone and α-naphthoquinone are preferable, and potassium ferricyanide and methoxy PMS are more preferable.
ポリマー層における電子受容体の含有量については特に制限はなく、使用する酸化還元酵素や対象とする試料の種類などによって適宜選択することができる。一例を挙げると、電子受容体の量は、センサ１枚あたり、通常、０．０１〜１０ｍｇ、好ましくは０．０５〜５ｍｇであり、より好ましくは０．１〜２ｍｇである。 There is no restriction | limiting in particular about content of the electron acceptor in a polymer layer, According to the kind of the oxidation-reduction enzyme to be used or the object sample, it can select suitably. As an example, the amount of electron acceptor is usually 0.01 to 10 mg, preferably 0.05 to 5 mg, more preferably 0.1 to 2 mg per sensor.
親水性ポリマーはグリセロールデヒドロゲナーゼや電子受容体などを電極上に固定化する機能を有する。ポリマー層が親水性ポリマーを含むことにより、ポリマー層の成膜性が向上する。また、基板および電極系表面からのからのポリマー層の剥離が防止されうる。また、親水性ポリマーは、ポリマー層表面の割れを防ぐ効果も有しており、バイオセンサの信頼性を高めるのに効果的である。さらに、タンパク質などの吸着性成分の電極系への吸着もまた、抑制されうる。このため、ポリマー層が親水性ポリマーを含むことにより、バイオセンサの測定感度の向上により一層貢献しうる。 The hydrophilic polymer has a function of immobilizing glycerol dehydrogenase or electron acceptor on the electrode. When the polymer layer contains a hydrophilic polymer, the film formability of the polymer layer is improved. Also, peeling of the polymer layer from the substrate and electrode system surfaces can be prevented. The hydrophilic polymer also has an effect of preventing cracks on the surface of the polymer layer, and is effective in enhancing the reliability of the biosensor. Furthermore, adsorption of adsorptive components such as proteins to the electrode system can also be suppressed. For this reason, when a polymer layer contains a hydrophilic polymer, it can further contribute to the improvement of the measurement sensitivity of a biosensor.
ポリマー層が親水性ポリマーを含む形態としては、ポリマー層内に均一に親水性ポリマーが含まれる形態であっても、またはポリマー層の表層に親水性ポリマーが含まれる形態であってもよい。 The form in which the polymer layer contains a hydrophilic polymer may be a form in which the hydrophilic polymer is uniformly contained in the polymer layer, or a form in which the hydrophilic polymer is contained in the surface layer of the polymer layer.
親水性ポリマーは、親水性のポリマーであれば特に制限されず、使用される酸化還元酵素や試料などによって合成品、市販品に関係なく適宜選択することができる。具体的には、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース系化合物、ポリビニルアルコールなどのポリビニル系化合物、ポリアクリル酸ナトリウムなどのポリアクリル酸系化合物、ポリメタクリル酸ナトリウムなどのポリメタクリル酸系化合物、ポリスチレンスルホン酸ナトリウムなどのポリスチレンスルホン酸系化合物、カルボキシメチルスターチなどのスターチ系化合物、ポリアクリルアミドなどのポリアクリルアミド系化合物、ポリビニルピロリドンなどのポリビニルピロリドン系化合物、ポリ酢酸ビニルなどのポリ酢酸ビニル系化合物、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ゼラチン、デンプン、ポリエチレンオキシド、デキストラン、ポリエチレングリコール、プルラン、およびこれらの誘導体などが挙げられる。これらの中でも、好ましくはカルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールであり、より好ましくは、アジド系感光基をポリビニルアルコールにペンダントした水溶性の感光性樹脂として市販されているＢｉｏｓｕｒｆｉｎｅ−ＡＷＰ（東洋合成工業株式会社製）である。なお、上記の親水性ポリマーは、１種のみが単独でポリマー層に含まれてもよいし、２種以上が組み合わされてポリマー層に含まれてもよい。 The hydrophilic polymer is not particularly limited as long as it is a hydrophilic polymer, and can be appropriately selected regardless of a synthetic product or a commercial product depending on the oxidoreductase or sample used. Specifically, cellulose compounds such as carboxymethyl cellulose, polyvinyl compounds such as polyvinyl alcohol, polyacrylic acid compounds such as sodium polyacrylate, polymethacrylic acid compounds such as polysodium methacrylate, sodium polystyrene sulfonate, etc. Polystyrene sulfonic acid compounds, starch compounds such as carboxymethyl starch, polyacrylamide compounds such as polyacrylamide, polyvinyl pyrrolidone compounds such as polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl acetate compounds such as polyvinyl acetate, polyglutamic acid, polyasparagine Examples include acids, gelatin, starch, polyethylene oxide, dextran, polyethylene glycol, pullulan, and derivatives thereof. Among these, carboxymethyl cellulose, polyvinyl alcohol, and polyethylene glycol are preferable, and Biosurfine-AWP (Toyo Gosei Kogyo Co., Ltd.) that is commercially available as a water-soluble photosensitive resin in which an azide-based photosensitive group is pendant to polyvinyl alcohol is more preferable. Company-made). In addition, only 1 type of said hydrophilic polymer may be contained independently in a polymer layer, and 2 or more types may be combined and contained in a polymer layer.
親水性ポリマーの配合量は、特に制限されず、使用する酸化還元酵素の量や対象とする試料の種類などによって適宜選択することができる。一例を挙げると、親水性ポリマーの含有量は、センサ１枚あたり、通常０．００１〜１０ｍｇ、好ましくは０．００５〜５ｍｇであり、より好ましくは０．０１〜１ｍｇである。 The blending amount of the hydrophilic polymer is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the amount of the oxidoreductase used, the type of the target sample, and the like. For example, the content of the hydrophilic polymer is usually 0.001 to 10 mg, preferably 0.005 to 5 mg, more preferably 0.01 to 1 mg per sensor.
さらにポリマー層は、グリセロールデヒドロゲナーゼ、電子受容体、および親水性ポリマーに加えて、他の成分を含みうる。他の成分としては、例えば、酵素安定化剤などが挙げられる。 Furthermore, the polymer layer may contain other components in addition to glycerol dehydrogenase, electron acceptor, and hydrophilic polymer. Examples of other components include enzyme stabilizers.
また、図示する形態において、ポリマー層は電極系の上層に形成されているが、場合によっては、図示する形態とは異なり、電極系の近傍にポリマー層を形成し、電極系とポリマー層とが直接接触しない形態としてもよい。なお、ポリマー層が電極系の「近傍」に形成される形態としては、電極系とポリマー層との間に空間やフィルタが介在する形態などが例示される。 In the illustrated embodiment, the polymer layer is formed on the upper layer of the electrode system. However, in some cases, unlike the illustrated embodiment, a polymer layer is formed in the vicinity of the electrode system, and the electrode system and the polymer layer are separated from each other. It is good also as a form which does not contact directly. The form in which the polymer layer is formed “near” the electrode system includes a form in which a space or a filter is interposed between the electrode system and the polymer layer.
不織布層は中性脂肪分解酵素を含む不織布から形成される。本発明のバイオセンサにおいて、不織布層はリポタンパク中の中性脂肪を分解し、中性脂肪由来のグリセロールを生成する機能を有する。なお、本発明において、「不織布」とは繊維を熱・機械的または化学的な作用によって接着または絡み合わせる事で布にしたものを指し、ＪＩＳ規格Ｌ０２２２に準拠する。 The nonwoven fabric layer is formed from a nonwoven fabric containing a neutral lipolytic enzyme. In the biosensor of the present invention, the nonwoven fabric layer has a function of decomposing neutral fat in lipoprotein and generating glycerol derived from neutral fat. In the present invention, “nonwoven fabric” refers to a fabric obtained by bonding or intertwining fibers by thermal, mechanical or chemical action, and conforms to JIS standard L0222.
不織布層を形成する不織布は、特に制限されず、所望の用途によって適宜選択することができる。具体的には、スパンボンド不織布、ニードルパンチ不織布、サーマルボンド不織布、ケミカルボンド不織布、ステッチボンド不織布などが挙げられる。これらの中でも、高い強度と寸法安定性の点から、スパンボンド不織布であることが好ましい。なお、これらの不織布を、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。 The nonwoven fabric which forms a nonwoven fabric layer is not restrict | limited in particular, It can select suitably by a desired use. Specific examples include spunbond nonwoven fabrics, needle punched nonwoven fabrics, thermal bond nonwoven fabrics, chemical bond nonwoven fabrics, and stitch bond nonwoven fabrics. Among these, a spunbonded nonwoven fabric is preferable from the viewpoint of high strength and dimensional stability. In addition, you may use these nonwoven fabrics individually or in combination of 2 or more types.
不織布の構成材料としては、試料溶液が浸透する材質であれば特に制限されず、所望の用途によって適宜選択することができる。具体的には、ポリアミド繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリエチレン繊維、ポリスルホン繊維、ポリエーテルスルホン繊維、ポリカーボネート繊維、ポリウレタン繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維、ポリオレフィン繊維、アラミド繊維、セルロース繊維、再生セルロース繊維、レーヨン繊維、ビニロン繊維、アクリル繊維、リヨセル繊維、絹繊維、麻繊維、ガラス繊維、キチン・キトサン繊維、炭素繊維、これらの誘導体、およびこれらの混合物が挙げられる。これらの中でも、固定化した中性脂肪分解酵素が試料溶液中に溶出しやすいという点で、不織布の構成材料として、ポリエステル繊維を使用することが好ましい。なお、これらの繊維は１種のみを単独で用いてもよく、２種以上を混合複合化してもよい。 The constituent material of the nonwoven fabric is not particularly limited as long as it is a material that allows the sample solution to permeate, and can be appropriately selected depending on the desired application. Specifically, polyamide fiber, polyvinyl alcohol fiber, polyethylene fiber, polysulfone fiber, polyethersulfone fiber, polycarbonate fiber, polyurethane fiber, polyester fiber, polypropylene fiber, polyolefin fiber, aramid fiber, cellulose fiber, regenerated cellulose fiber, rayon fiber , Vinylon fibers, acrylic fibers, lyocell fibers, silk fibers, hemp fibers, glass fibers, chitin / chitosan fibers, carbon fibers, derivatives thereof, and mixtures thereof. Among these, it is preferable to use a polyester fiber as a constituent material of the nonwoven fabric in that the immobilized neutral lipolytic enzyme is easily eluted into the sample solution. In addition, these fibers may be used alone or in combination of two or more.
不織布層を形成する不織布の厚さについては、上記不織布層の機能を発揮できるものであれば特に制限されず、所望の用途によって適宜選択されうる。一例を挙げると、不織布の厚さは、通常０．０２〜２ｍｍであり、好ましくは０．０２〜１．５ｍｍであり、より好ましくは０．０５〜１ｍｍである。 About the thickness of the nonwoven fabric which forms a nonwoven fabric layer, if the function of the said nonwoven fabric layer can be exhibited, it will not restrict | limit, According to a desired use, it can select suitably. If an example is given, the thickness of a nonwoven fabric is 0.02-2 mm normally, Preferably it is 0.02-1.5 mm, More preferably, it is 0.05-1 mm.
また、不織布の大きさは、電極表面を全て覆うことができる大きさであれば特に制限されず、電極の大きさに応じて適宜調整されうる。不織布の形状も特に制限されず、円形であっても四角形であってもよい。 Moreover, the magnitude | size of a nonwoven fabric will not be restrict | limited especially if it is a magnitude | size which can cover the whole electrode surface, According to the magnitude | size of an electrode, it can adjust suitably. The shape of the nonwoven fabric is not particularly limited, and may be circular or quadrangular.
本発明に用いられる中性脂肪分解酵素としては、リポタンパク質を分解してグリセロールを遊離できるものであれば特に制限はない。具体的には、リポプロテインリパーゼであることが好ましく、従来公知のリポプロテインリパーゼであっても、さらにこれを改質して安定性や反応性を向上させたものなど、所望の用途によって適宜選択することができる。中でも好ましくは、ＬＰＬ−３１１（東洋紡績株式会社製）である。 The neutral lipolytic enzyme used in the present invention is not particularly limited as long as it can decompose lipoprotein and release glycerol. Specifically, it is preferably a lipoprotein lipase, and even a conventionally known lipoprotein lipase is appropriately selected depending on the desired application, such as a modified lipoprotein lipase that has been further modified to improve stability and reactivity. can do. Among them, LPL-311 (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) is preferable.
不織布層におけるこのようなリポプロテインリパーゼの含有量は、用いられる生体試料の種類やその添加量などによって適宜選択することができる。一般には、不織布層に含まれるリポプロテインリパーゼ量は、センサ１枚あたり、通常０．０１〜１０００活性単位、好ましくは０．０５〜５００活性単位、より好ましくは０．１〜１００活性単位である。なお、リポプロテインリパーゼの活性単位の定義および測定方法については、後述する実施例の記載が参照されうる。 The content of such lipoprotein lipase in the non-woven fabric layer can be appropriately selected depending on the type of biological sample used and the amount added. Generally, the amount of lipoprotein lipase contained in the nonwoven fabric layer is usually 0.01 to 1000 active units, preferably 0.05 to 500 active units, more preferably 0.1 to 100 active units per sensor. . In addition, the description of the Example mentioned later can be referred for the definition of the active unit of lipoprotein lipase and the measuring method.
さらに不織布層は、中性脂肪分解酵素、不織布に加えて、他の成分を含みうる。他の成分としては、例えば、酵素安定化剤などが挙げられる。 Furthermore, the nonwoven fabric layer can contain other components in addition to the neutral lipolytic enzyme and the nonwoven fabric. Examples of other components include enzyme stabilizers.
なお、ポリマー層は１層のみからなる層であってもよいし、２層以上からなる層であってもよい。ポリマー層が２層からなる形態としては、例えば、電子受容体および親水性高分子を含み、グリセロールデヒドロゲナーゼを実質的に含まない第１ポリマー層と、前記第１ポリマー層の上層に形成された、グリセロールデヒドロゲナーゼおよび親水性高分子を含み、電子受容体を実質的に含まない第２ポリマー層とから、ポリマー層が構成される形態が挙げられる。 The polymer layer may be a layer composed of only one layer or a layer composed of two or more layers. As a form in which the polymer layer is composed of two layers, for example, a first polymer layer containing an electron acceptor and a hydrophilic polymer and substantially free of glycerol dehydrogenase and an upper layer of the first polymer layer are formed. The form which a polymer layer is comprised from the 2nd polymer layer which contains glycerol dehydrogenase and hydrophilic polymer, and does not contain an electron acceptor substantially is mentioned.
本発明の不織布層は、中性脂肪分解酵素を含む溶液を不織布に含浸／乾燥させることで、中性脂肪分解酵素を不織布に固定化することによって形成されうる。 The nonwoven fabric layer of the present invention can be formed by immobilizing the neutral lipolytic enzyme on the nonwoven fabric by impregnating / drying the nonwoven fabric with a solution containing the neutral lipolytic enzyme.
本発明の不織布層の製造方法（中性脂肪分解酵素の不織布への固定化方法）は、特に制限されず、従来公知の方法が同様にしてもしくは適宜修飾して、またはこれらの方法が適宜組み合わされて適用されうる。好ましくは、不織布に中性脂肪分解酵素を含む溶液を含浸させる工程と、上記酵素が含浸した不織布を乾燥させる工程と、を有する。 The method for producing the nonwoven fabric layer of the present invention (method for immobilizing the neutral lipolytic enzyme to the nonwoven fabric) is not particularly limited, and conventionally known methods are similarly or appropriately modified, or these methods are appropriately combined. And can be applied. Preferably, the method includes a step of impregnating a nonwoven fabric with a solution containing a neutral lipolytic enzyme and a step of drying the nonwoven fabric impregnated with the enzyme.
本発明のバイオセンサにおいて、中性脂肪分解酵素の不織布への固定化は、下記（１）および（２）の工程を含む方法により実現されうる。
（１）不織布に中性脂肪分解酵素を含む溶液（以下、「中性脂肪分解酵素溶液」とも称する）を含浸させる工程
（２）上記工程（１）で形成された中性脂肪分解酵素溶液を含浸した不織布を乾燥する工程
上記工程（１）は、中性脂肪分解酵素溶液を不織布に含浸させることができればよい。具体的には、中性脂肪分解酵素溶液を不織布に滴下して含浸させる方法、不織布を中性脂肪分解酵素溶液に浸漬させて含浸させる方法などがあり、いずれの方法も好適に使用されうる。中でも、適量、好ましくは０．１〜１０μｌの量の中性脂肪分解酵素溶液を、不織布に直接滴下する方法が使用できる。
In the biosensor of the present invention, the neutral lipolytic enzyme can be immobilized on the nonwoven fabric by a method including the following steps (1) and (2).
(1) A step of impregnating a nonwoven fabric with a solution containing a neutral lipolytic enzyme (hereinafter also referred to as “neutral lipolytic enzyme solution”) (2) The neutral lipolytic enzyme solution formed in the above step (1) Step of drying impregnated non-woven fabric The step (1) only needs to allow the non-woven fabric to be impregnated with the neutral lipolytic enzyme solution. Specifically, there are a method in which a neutral lipolytic enzyme solution is dropped and impregnated into a nonwoven fabric, a method in which a nonwoven fabric is impregnated in a neutral lipolytic enzyme solution, and any method can be suitably used. Among them, a method of directly dropping a neutral lipolytic enzyme solution in an appropriate amount, preferably 0.1 to 10 μl, onto the nonwoven fabric can be used.
上記工程（２）は、中性脂肪分解酵素溶液を含浸した不織布を乾燥させることができればよい。中性脂肪分解酵素溶液を含浸した不織布を乾燥させる方法としては、具体的には、真空ポンプを用いて減圧乾燥させる方法、４０〜５０℃の乾燥機内に放置して乾燥させる方法、五酸化二リンなどの不可逆的な脱水剤と密閉容器内で共存させて乾燥させる方法などがあり、いずれの方法も好適に使用されうる。好ましくは、中性脂肪分解酵素溶液を含浸した不織布を真空ポンプで５〜３０分間減圧乾燥させる方法が使用できる。 The said process (2) should just dry the nonwoven fabric impregnated with the neutral lipolytic enzyme solution. As a method for drying the nonwoven fabric impregnated with the neutral lipolytic enzyme solution, specifically, a method of drying under reduced pressure using a vacuum pump, a method of drying in a dryer of 40 to 50 ° C., dipentapentoxide There is a method of drying by coexisting in an airtight container with an irreversible dehydrating agent such as phosphorus, and any method can be suitably used. Preferably, a method of drying a nonwoven fabric impregnated with a neutral lipolytic enzyme solution under reduced pressure with a vacuum pump for 5 to 30 minutes can be used.
不織布層を形成した後、これを電極基板と挟む形で絶縁性のカバーを設置することも可能である。これにより、試料液を毛細管現象で供給できる。このようなバイオセンサは、濃度測定装置（図示せず）に装着した上で試料を供給することによって、濃度測定装置において目的成分の測定を自動で行わせることができる。また、このようなバイオセンサに対する試料溶液の供給は、濃度測定装置に装着する前、あるいは装着した後のいずれであってもよい。 After forming the nonwoven fabric layer, it is also possible to install an insulating cover so as to sandwich the nonwoven fabric layer. Thereby, a sample solution can be supplied by capillary action. Such a biosensor can automatically measure a target component in the concentration measurement device by supplying a sample after being mounted on a concentration measurement device (not shown). In addition, the sample solution may be supplied to such a biosensor either before or after being attached to the concentration measuring device.
以上、本発明のバイオセンサの構成について詳細に説明したが、上記の形態のみに制限されることはなく、従来公知の知見を適宜参照して、種々の改良を施すことも可能である。従来公知の知見としては、例えば、特開平２−０６２９５２号公報、特開平５−８７７６８号公報、特開平１１−２０１９３２号公報などが挙げられる。 As described above, the configuration of the biosensor of the present invention has been described in detail. However, the present invention is not limited to the above-described embodiment, and various improvements can be made by appropriately referring to conventionally known knowledge. Conventionally known findings include, for example, JP-A-2-062952, JP-A-5-87768, JP-A-11-201932 and the like.
続いて、本発明のバイオセンサの動作について説明する。 Subsequently, the operation of the biosensor of the present invention will be described.
まず、濃度の測定を希望する成分（基質）を含む試料溶液の所定量を、バイオセンサの不織布層に供給する。試料溶液の具体的な形態は特に制限されず、バイオセンサに用いられるグリセロールデヒドロゲナーゼの基質である中性脂肪を含む溶液が適宜用いられうる。試料としては、例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液などの生体試料、果物、野菜、加工食品原料などの食品等が用いられうる。ただし、その他の溶液が試料として用いられてもよい。試料溶液は原液をそのまま用いてもよいし、粘度などを調節する目的で適当な溶媒で希釈した溶液を用いてもよい。 First, a predetermined amount of a sample solution containing a component (substrate) whose concentration is desired to be measured is supplied to the non-woven fabric layer of the biosensor. The specific form of the sample solution is not particularly limited, and a solution containing neutral fat that is a substrate for glycerol dehydrogenase used in a biosensor can be used as appropriate. As the sample, for example, biological samples such as blood, serum, plasma, urine, saliva, foods such as fruits, vegetables, processed food materials, and the like can be used. However, other solutions may be used as the sample. As the sample solution, the stock solution may be used as it is, or a solution diluted with an appropriate solvent may be used for the purpose of adjusting the viscosity or the like.
試料溶液を不織布層へ供給する形態は特に制限されず、所定量の試料溶液を不織布層に対して垂直に直接滴下することにより供給してもよいし、別途設けた試料溶液供給手段により、不織布層に対して水平方向から試料溶液を供給してもよい。 The form in particular of supplying a sample solution to a nonwoven fabric layer is not restrict | limited, You may supply by dripping a predetermined amount of sample solutions directly perpendicularly | vertically with respect to a nonwoven fabric layer, and a nonwoven fabric is provided by the sample solution supply means provided separately. The sample solution may be supplied from the horizontal direction with respect to the layer.
不織布層へと試料溶液が供給されると、試料溶液が不織布層上部から下部へ浸透するとともに、試料溶液中の基質である中性脂肪が不織布層に含まれる中性脂肪分解酵素の作用によって分解され、グリセロールおよび脂肪酸が生成する。本発明のバイオセンサにおいては、不織布層上部から下部への試料溶液の浸透とともに上記の中性脂肪分解酵素によるグリセロールの生成反応が行われるため、不織布層に試料溶液が導入された際に、中性脂肪の分解反応が効率よく速やかに進行し、測定時間が短縮されうる。 When the sample solution is supplied to the nonwoven fabric layer, the sample solution penetrates from the upper part to the lower part of the nonwoven fabric layer, and the neutral fat that is the substrate in the sample solution is decomposed by the action of the neutral lipolytic enzyme contained in the nonwoven fabric layer. Glycerol and fatty acids are produced. In the biosensor of the present invention, since the glycerol generation reaction by the neutral lipolytic enzyme is performed along with the penetration of the sample solution from the upper part to the lower part of the nonwoven fabric layer, when the sample solution is introduced into the nonwoven fabric layer, The degradation reaction of sex fat can proceed quickly and efficiently, and the measurement time can be shortened.
例えば、中性脂肪分解酵素がリポプロテインリパーゼである場合には、下記式に示されるように、中性脂肪がリポプロテインリパーゼによりグリセロールと脂肪酸とに変換されうる。 For example, when the neutral lipolytic enzyme is lipoprotein lipase, the neutral fat can be converted into glycerol and fatty acid by the lipoprotein lipase as shown in the following formula.
次いで、生成物であるグリセロールを含む試料溶液が、グリセロールデヒドロゲナーゼおよび電子受容体を含むポリマー層へと浸透する。これにより、試料溶液中のグリセロールは、酸化還元酵素であるグリセロールデヒドロゲナーゼの作用によって酸化され、自身の酸化と同時に電子を放出する。グリセロールから放出された電子は、電子受容体に捕捉され、これに伴って電子受容体は酸化型から還元型へと変化する。 The sample solution containing the product glycerol then penetrates into the polymer layer containing glycerol dehydrogenase and electron acceptor. As a result, glycerol in the sample solution is oxidized by the action of glycerol dehydrogenase, which is an oxidoreductase, and releases electrons simultaneously with its own oxidation. Electrons released from glycerol are captured by the electron acceptor, and the electron acceptor is changed from an oxidized form to a reduced form.
試料溶液の添加後、バイオセンサを所定時間放置することにより、グリセロールデヒドロゲナーゼによって基質が完全に酸化され、一定量の電子受容体が酸化型から還元型へと変換される。グリセロールと酵素との反応を完結させるための放置時間については特に制限はないが、試料溶液を不織布層に添加した後、通常は１０〜３００秒間、好ましくは２０〜２４０秒間、より好ましくは３０〜１２０秒間である。 After adding the sample solution, the biosensor is allowed to stand for a predetermined time, whereby the substrate is completely oxidized by glycerol dehydrogenase, and a certain amount of electron acceptor is converted from the oxidized form to the reduced form. The standing time for completing the reaction between glycerol and the enzyme is not particularly limited, but after adding the sample solution to the nonwoven fabric layer, it is usually 10 to 300 seconds, preferably 20 to 240 seconds, more preferably 30 to 120 seconds.
その後、電極系を介して、作用極と対極との間に、所定の電位を印加することにより、還元型の電子受容体が電気化学的に酸化される。この際に測定される酸化電流の値から、電位印加前の還元型の電子受容体の量が算出され、さらに、グリセロールデヒドロゲナーゼと反応したグリセロールの量が定量されうる。そして、最終的には、試料中の中性脂肪濃度が算出されうる。 Thereafter, a reduced electron acceptor is electrochemically oxidized by applying a predetermined potential between the working electrode and the counter electrode via the electrode system. From the value of the oxidation current measured at this time, the amount of the reduced electron acceptor before the potential application can be calculated, and the amount of glycerol reacted with glycerol dehydrogenase can be quantified. Finally, the neutral fat concentration in the sample can be calculated.
酸化電流を流す際に印加される電位の値は特に制限されず、従来公知の知見を参照して適宜調節されうる。一例を挙げると、−２００〜７００ｍＶ程度、好ましくは０〜６００ｍＶの電位を、対極と作用極との間に印加すればよい。電位を印加するための電位印加手段についても特に制限はなく、従来公知の電位印加手段が適宜用いられうる。 The value of the potential applied when flowing the oxidation current is not particularly limited, and can be appropriately adjusted with reference to known knowledge. For example, a potential of about −200 to 700 mV, preferably 0 to 600 mV may be applied between the counter electrode and the working electrode. The potential applying means for applying the potential is not particularly limited, and a conventionally known potential applying means can be appropriately used.
酸化電流値の測定、および当該電流値から基質濃度への換算の手法としては、所定の電位を印加してから一定時間後の電流値を測定するクロノアンペロメトリー法を用いてもよいし、クロノアンペロメトリー法による電流応答を時間で積分して得られる電荷量を測定するクロノクーロメトリー法を用いてもよい。簡単な装置系により測定されるという点で、クロノアンペロメトリー法が好ましく用いられうる。 As a method for measuring the oxidation current value and converting the current value into the substrate concentration, a chronoamperometry method for measuring a current value after a predetermined time after applying a predetermined potential may be used, A chronocoulometry method that measures the amount of charge obtained by integrating the current response by the chronoamperometry method over time may be used. The chronoamperometry method can be preferably used in that it is measured by a simple apparatus system.
以上、還元型の電子受容体を酸化する際の電流（酸化電流）を測定することにより中性脂肪濃度を算出する形態を例に挙げて説明したが、場合によっては、還元されずに残存している酸化型の電子受容体を還元する際の電流（還元電流）を測定することにより基質濃度を算出する形態を採用してもよい。 As described above, the mode of calculating the neutral fat concentration by measuring the current (oxidation current) when oxidizing the reduced electron acceptor has been described as an example, but in some cases, it remains without being reduced. Alternatively, the substrate concentration may be calculated by measuring the current (reduction current) when reducing the oxidized electron acceptor.
本発明のバイオセンサは、いずれの形態で使用してもよく特に制限されない。例えば、使い捨て用途としてのディスポーザブルタイプのバイオセンサ、少なくとも電極部分を人体に埋め込んで連続的に所定の値を測定するためのバイオセンサなど、様々な用途に使用できる。 The biosensor of the present invention may be used in any form and is not particularly limited. For example, it can be used for various applications such as a disposable biosensor for disposable use, and a biosensor for continuously measuring a predetermined value by embedding at least an electrode part in a human body.
以上のように、本発明のバイオセンサを使用すると、上記のような二段階の反応系によって、中性脂肪を含む試料中の中性脂肪量が定量されうる。精神病治療患者および透析患者においては、中性脂肪測定時に遊離グリセロールが問題になるが、本発明のバイオセンサの中性脂肪分解酵素を省いた反応系を用いてグリセロールを予め消去するか、もしくはその量を測定しておくことで真の中性脂肪値を求めることが可能である。なお、本発明のバイオセンサは溶液中に界面活性剤を含んでいても中性脂肪を正確に定量することができる。 As described above, when the biosensor of the present invention is used, the amount of neutral fat in a sample containing neutral fat can be quantified by the two-stage reaction system as described above. In psychiatric patients and dialysis patients, free glycerol is a problem when measuring triglycerides, but glycerol can be preliminarily erased using a reaction system that omits the neutral lipolytic enzyme of the biosensor of the present invention. It is possible to determine the true triglyceride value by measuring the amount. In addition, even if the biosensor of the present invention contains a surfactant in the solution, the neutral fat can be accurately quantified.
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。なお、本発明において、リポプロテインリパーゼおよびグリセロールデヒドロゲナーゼの活性は、下記方法により測定した。 Next, an Example is given and this invention is demonstrated concretely. However, the technical scope of the present invention is not limited only to the following examples. In the present invention, the activities of lipoprotein lipase and glycerol dehydrogenase were measured by the following methods.
（リポプロテインリパーゼ活性の測定方法）
３７℃で５分間予備加温したオリーブオイルエマルジョン溶液 ２ｍｌに酵素溶液 ０．２ｍｌを添加し、１５分間反応させた。その後、０．２Ｍ ＴＣＡ溶液 ２ｍｌを添加して反応を停止させ、グリセロールおよび遊離脂肪酸を生成させた。なお、「オリーブオイルエマルジョン溶液」とは、オリーブオイル ５ｇおよび５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００ ５ｍｌの混合溶液を１０分間超音波処理し、この混合溶液に４％ ＢＳＡ溶液 ２５ｍｌおよび０．１Ｍ リン酸緩衝液 ｐＨ ７．０ １５ｍｌを添加し、十分に撹拌したものである。
(Method for measuring lipoprotein lipase activity)
0.2 ml of an enzyme solution was added to 2 ml of an olive oil emulsion solution pre-warmed at 37 ° C. for 5 minutes, and allowed to react for 15 minutes. Thereafter, 2 ml of 0.2 M TCA solution was added to stop the reaction, and glycerol and free fatty acids were produced. “Olive oil emulsion solution” means that a mixed solution of 5 g of olive oil and 5 ml of 5% Triton (registered trademark) X-100 is sonicated for 10 minutes, and 25 ml of 4% BSA solution and 0.1 M are added to this mixed solution. Phosphate buffer solution pH 7.0 15 ml was added and stirred thoroughly.
得られた反応溶液の不溶物を濾紙で濾過し、濾液 ０．０５ｍｌと発色試薬 ３ｍｌとを混合した。なお、「発色試薬」は、５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００ ４ｍｌ、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン ４０μｌ、４−アミノアンチピリン ４ｍｇ、ＡＴＰ・Ｎａ２・３Ｈ２Ｏ ２４．４ｍｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ４０．７ｍｇ、グリセロールキナーゼ ２００Ｕ、Ｌ−α―グリセロリン酸オキシダーゼ ５００Ｕ、およびペルオキシダーゼ ３００Ｕを、５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５） ２００ｍｌに溶解させることにより調製した。 The insoluble matter of the obtained reaction solution was filtered with a filter paper, and 0.05 ml of the filtrate and 3 ml of a coloring reagent were mixed. The “coloring reagent” is 4% 5% Triton (registered trademark) X-100, 40 μl of N, N-diethyl-m-toluidine, 4 mg of 4-aminoantipyrine, 24.4 mg of ATP · Na 2 .3H 2 O, MgCl 2 · 6H 2 O 40.7mg, glycerol kinase 200 U, L-alpha-glycerophosphate oxidase 500 U, and the peroxidase 300 U, it was prepared by dissolving 50 mM MES buffer (pH 6.5) 200 ml.
この混合溶液を３７℃で１５分間反応させた。この反応においては、まず、グリセロールがグリセロリン酸に変換され、続いて、生成したグリセロリン酸がジヒドロキシアセトンおよび過酸化水素に変換される。そして、過酸化水素、４−アミノアンチピリン、およびＮ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジンからキノネイミン色素が生成する。このキノネイミン色素を５４５ｎｍの吸光度で測定した（ＯＤ ｔｅｓｔ）。 This mixed solution was reacted at 37 ° C. for 15 minutes. In this reaction, glycerol is first converted to glycerophosphoric acid, and then the produced glycerophosphoric acid is converted to dihydroxyacetone and hydrogen peroxide. And a quinoneimine pigment | dye produces | generates from hydrogen peroxide, 4-aminoantipyrine, and N, N-diethyl-m-toluidine. The quinoneimine dye was measured at an absorbance of 545 nm (OD test).
また、盲検は以下の手順で行った。まず、上記と同様に調整したオリーブオイルエマルジョン液 ２ｍｌを３７℃で１５分間放置させた後、０．２Ｍ ＴＣＡ溶液 ２ｍｌを添加した。次いで、酵素溶液 ０．２ｍｌを添加して混合し、これを反応溶液として上記と同様に濾過し、上記と同様に濾液 ０．０５ｍｌと発色試薬 ３ｍｌとを混合し、反応させた後に、５４５ｎｍの吸光度を測定した（ＯＤ ｂｌａｎｋ）。 The blind test was performed according to the following procedure. First, 2 ml of an olive oil emulsion prepared as described above was allowed to stand at 37 ° C. for 15 minutes, and then 2 ml of a 0.2M TCA solution was added. Next, 0.2 ml of the enzyme solution was added and mixed, and this was filtered as a reaction solution in the same manner as described above. In the same manner as above, 0.05 ml of the filtrate and 3 ml of the coloring reagent were mixed and reacted, and then reacted at 545 nm. Absorbance was measured (OD blank).
得られた２つの吸光度を下記計算式に導入し、酵素活性を求めた。 The obtained two absorbances were introduced into the following formula to determine enzyme activity.
ここで、１分間に１μｍｏｌのグリセロールを生成するリポプロテインリパーゼの量を１活性単位（Ｕ）とした。なお、キノネイミン色素の上記測定条件下でのモル吸光係数は２８．２ｍＭ−１とした。 Here, the amount of lipoprotein lipase that produces 1 μmol of glycerol per minute was defined as 1 activity unit (U). The molar extinction coefficient of the quinoneimine dye under the above measurement conditions was 28.2 mM- 1 .
（グリセロールデヒドロゲナーゼ活性の測定方法）
５０μＭ ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロインドフェノール）、０．２ｍＭ ＰＭＳ（１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェイト）、および４５０ｍＭ グリセロールを含む０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に、酵素溶液を加えた。この溶液中の酵素と基質との反応をＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化によって追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。ここで、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元するグリセロールデヒドロゲナーゼの量を１活性単位（Ｕ）とした。なお、ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係数は１６．３ｍＭ−１とした。
(Method for measuring glycerol dehydrogenase activity)
0.1% Triton® X-100 containing 50 μM DCIP (2,6-dichloroindophenol), 0.2 mM PMS (1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate), and 450 mM glycerol. The enzyme solution was added to the containing 10 mM phosphate buffer (pH 7.0). The reaction between the enzyme and the substrate in this solution was followed by the change in absorbance of DCIP at 600 nm, and the decrease rate of the absorbance was defined as the enzyme reaction rate. Here, the amount of glycerol dehydrogenase that reduces 1 μmol of DCIP per minute was defined as 1 activity unit (U). The molar extinction coefficient of DCIP at pH 7.0 was 16.3 mM- 1 .
［実施例１］
本発明のバイオセンサの一例として、以下の手法により、図１および図２に示す形態の中性脂肪センサを作製した。
[Example 1]
As an example of the biosensor of the present invention, a neutral fat sensor having the form shown in FIGS. 1 and 2 was produced by the following method.
（中性脂肪センサの作製）
電極系が形成されたセンサ基板として、ディスポーザブル印刷電極 ＤＥＰ Ｃｈｉｐ ＥＰ−Ｎ（有限会社バイオデバイステクノロジー製）を使用した。ＤＥＰ Ｃｈｉｐ ＥＰ−Ｎは、絶縁性基板２０の上に、それぞれカーボンからなる作用極３０、参照極４０、対極５０が形成され、絶縁層７０を挟んで、カーボンからなる作用極作用部分３０ａ、銀／塩化銀からなる参照極作用部分４０ａ、カーボンからなる対極作用部分５０ａが形成されている。
(Production of neutral fat sensor)
Disposable printing electrode DEP Chip EP-N (manufactured by Biodevice Technology Co., Ltd.) was used as the sensor substrate on which the electrode system was formed. In the DEP Chip EP-N, a working
ポリマー層８０は以下のようにして作製した。光架橋性の親水性ポリマーであるＢｉｏｓｕｒｆｉｎｅ−ＡＷＰ（東洋合成工業株式会社製）の０．５％溶液 ５μｌに、ＰＱＱ結合型グリセロールデヒドロゲナーゼ １Ｕおよび電子受容体であるシアン化カリウムおよびメトキシＰＭＳを添加し、溶解させて混合溶液を得た。なお、この際、混合溶液中のフェリシアン化カリウムおよびメトキシＰＭＳの濃度が、それぞれ５０ｍＭおよび１ｍＭの濃度となるようにした。
The
上記で得られた混合溶液の全量を、作用極作用部分３０ａ、参照極作用部分４０ａ、および対極作用部分５０ａの表面に塗布し、１０分間の減圧乾燥を行った。その後、３００〜４００ｎｍの紫外線を６０秒間照射することにより、ポリマー層８０を形成させた。
The total amount of the mixed solution obtained above was applied to the surfaces of the working
上記紫外線照射によりポリマー層８０に含まれる光架橋性樹脂が架橋し、グリセロールデヒドロゲナーゼおよび電子受容体が光架橋性樹脂に架橋（固定化）された、流動および膨潤が抑制された安定なゲル層が電極上に形成される。
By the ultraviolet irradiation, the photocrosslinkable resin contained in the
不織布層９０は以下のようにして作成した。中性脂肪分解酵素であるリポプロテインリパーゼ １０Ｕを１０％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭ グリシルグリシンバッファー（ｐＨ８．０） ５μｌに溶解させた。この溶液の全量をポリエステル繊維からなるスパンボンド不織布（大きさ：４ｍｍ×５ｍｍ、厚さ：０．２２ｍｍ）上に滴下し、１０分間減圧乾燥させることにより、不織布層９０を作製した。得られた不織布９０を上記で形成したポリマー層８０の上に積層させた。
The
なお、上記操作は室温（２５℃）で行った。 In addition, the said operation was performed at room temperature (25 degreeC).
（特性評価１：中性脂肪含有標準血清）
試料溶液としては、中性脂肪含有標準血清を用いた。
(Characteristic Evaluation 1: Triglyceride-containing standard serum)
As a sample solution, neutral fat-containing standard serum was used.
試料溶液を不織布層９０に滴下して２分後に、参照極４０を基準として作用極３０に対しアノード方向に＋４５０ｍＶの定電位を印加し、１秒後に作用極と対極との間に流れる電流値を測定した。
Two minutes after dropping the sample solution on the
この電流値は、生成した電子受容体の濃度、すなわち試料溶液中の中性脂肪濃度に比例するため、この電流値から試料中の中性脂肪濃度を求めることができる。 Since this current value is proportional to the concentration of the generated electron acceptor, that is, the neutral fat concentration in the sample solution, the neutral fat concentration in the sample can be obtained from this current value.
すなわち、添加された中性脂肪を含む試料溶液は、まず、不織布層９０に浸透するとともにリポプロテインリパーゼと反応し、グリセロールと遊離脂肪酸を生成する。そして、生成したグリセロールを含む試料溶液がポリマー層８０に浸透する。
That is, the sample solution containing the added neutral fat first penetrates into the
このグリセロールが、ポリマー層８０に含まれるグリセロールデヒドロゲナーゼによって、ポリマー層に含まれる酸化型電子受容体であるメトキシＰＭＳと反応し、還元型電子受容体であるメトキシＰＭＳを生成する。
This glycerol reacts with methoxy PMS, which is an oxidized electron acceptor contained in the polymer layer, by glycerol dehydrogenase contained in the
続いて、この還元型電子受容体であるメトキシＰＭＳと酸化型電子受容体であるフェリシアン化カリウムとの酸化還元反応により、還元型電子受容体であるフェロシアン化カリウムが生成する。 Subsequently, a reduced electron acceptor potassium ferrocyanide is generated by an oxidation-reduction reaction between the reduced electron acceptor methoxy PMS and the oxidized electron acceptor potassium ferricyanide.
したがって、上記のように電極系に電位を印加するにより、生成した電子受容体（フェロシアン化カリウム）の濃度に基づく酸化電流が得られる。 Therefore, by applying a potential to the electrode system as described above, an oxidation current based on the concentration of the generated electron acceptor (potassium ferrocyanide) can be obtained.
上記方法により、中性脂肪含有標準血清を滴下し応答電流を測定したところ、図３に示すように、５００ｍｇ／ｄｌという高濃度領域まで良好な直線が得られた。 When the neutral fat-containing standard serum was dropped by the above method and the response current was measured, as shown in FIG. 3, a good straight line was obtained up to a high concentration region of 500 mg / dl.
（特性評価２：グリセロール標準液）
試料溶液としては、グリセロール標準液を用いた。
(Characteristic evaluation 2: Glycerol standard solution)
A glycerol standard solution was used as the sample solution.
グリセロール標準液を試料溶液として使用すること以外は全て上記と同様にして特性評価を行い、応答電流を測定した。結果を図３に示す。図３に示すように、グリセロール標準液についても、６ｍＭという高濃度領域まで良好な直線が得られた。 Except for using a glycerol standard solution as a sample solution, the characteristics were evaluated in the same manner as described above, and the response current was measured. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 3, a good straight line was obtained up to a high concentration region of 6 mM for the glycerol standard solution.
（考察）
図３に示される結果より、本発明のバイオセンサにおいては、試料溶液として中性脂肪含有標準血清を用いた場合の応答電流値と、グリセロール標準液を用いた場合の応答電流値とはほとんど同じ値を示し、近似直線もほぼ一致した。
(Discussion)
From the results shown in FIG. 3, in the biosensor of the present invention, the response current value when the neutral fat-containing standard serum is used as the sample solution is almost the same as the response current value when the glycerol standard solution is used. The value was shown, and the approximate straight line was almost the same.
この結果から、中性脂肪含有標準血清とグリセロール標準液との良好な相関関係が確認された。これは、本発明のバイオセンサにおいては、不織布層において中性脂肪と中性脂肪分解酵素（リポプロテインリパーゼと）との反応が円滑に進行し、ポリマー層においてグリセロールとグリセロールデヒドロゲナーゼおよび電子受容体との反応が円滑に進むため、精度の高い応答電流が得られたものと考察される。 From this result, a good correlation between the neutral fat-containing standard serum and the glycerol standard solution was confirmed. This is because in the biosensor of the present invention, the reaction between neutral fat and neutral lipolytic enzyme (with lipoprotein lipase) proceeds smoothly in the nonwoven fabric layer, and glycerol, glycerol dehydrogenase and electron acceptor in the polymer layer. It is considered that a high-accuracy response current was obtained because the above reaction proceeded smoothly.
なお、親水性ポリマーおよび不織布については上記実施例に限定されることはなく、本発明の主旨に合致するものであれば使用できる。一方、上記実施例においては、三電極系の場合について述べたが、対極と作用極からなる二電極系でも測定は可能である。 The hydrophilic polymer and the non-woven fabric are not limited to the above examples, and any hydrophilic polymer and non-woven fabric can be used as long as they meet the gist of the present invention. On the other hand, in the above-described embodiment, the case of the three-electrode system has been described, but the measurement can also be performed by a two-electrode system including a counter electrode and a working electrode.
１０ バイオセンサ、
２０ 絶縁性基板、
３０ 作用極、
３０ａ 作用極作用部分、
４０ 参照極、
４０ａ 参照極作用部分、
５０ 対極、
５０ａ 対極作用部分、
６０ 電極系、
７０ 絶縁層、
８０ ポリマー層、
９０ 不織布層。
10 Biosensor,
20 Insulating substrate,
30 working electrode,
30a Working electrode working part,
40 reference pole,
40a Reference electrode working part,
50 counter electrode,
50a counter electrode working part,
60 electrode system,
70 insulation layer,
80 polymer layer,
90 Nonwoven fabric layer.
Claims (7)
前記絶縁性基板上に形成された、少なくとも作用極および対極を含む電極系と、
前記電極系の上部または近傍に形成された、グリセロールデヒドロゲナーゼ、電子受容体、および親水性ポリマーを含むポリマー層と、
前記ポリマー層上に形成された、不織布に中性脂肪分解酵素が担持されてなる不織布層と、
を備える、前記電極系に流れる電流値に基づいて中性脂肪の濃度を測定するためのバイオセンサ。 An insulating substrate;
An electrode system including at least a working electrode and a counter electrode formed on the insulating substrate;
A polymer layer comprising glycerol dehydrogenase, an electron acceptor, and a hydrophilic polymer formed on or near the electrode system;
A nonwoven fabric layer formed on the polymer layer and having a neutral lipolytic enzyme supported on the nonwoven fabric;
A biosensor for measuring the concentration of neutral fat based on the value of current flowing through the electrode system.
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