JP2000189176A - ウシのChediak―Higashi症候群の遺伝子診断法 - Google Patents
ウシのChediak―Higashi症候群の遺伝子診断法Info
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Abstract
ak-Higashi症候群(CH-S)の診断試薬及び診断法を提供す
る。 【解決手段】 ウシCH-Sの原因がLyst遺伝子上の特定の
塩基置換に起因することを見出し、かかる変異により、
該遺伝子上に特定の制限酵素の認識部位が形成されてい
ることなどを利用して、該疾患を遺伝子診断する。具体
的には対象遺伝子を特異的に増幅せしめ、当該変異を検
知することにより、診断を行う。ウシのCH-S及びそのキ
ャリアーを簡便かつ迅速に検出し、診断することが可能
である。
Description
性疾患の遺伝子診断法(又は検出方法)に関し、さらに
詳しくはウシのChediak-Higashi 症候群の遺伝子診断法
(又は検出方法)に関する。
ーストレージプール病 (SPD)の一つに分類され、細胞の
原形質顆粒の形成異常、すなわち巨大顆粒形成にもとづ
く常染色体性劣性遺伝病であり、臨床的には皮膚、毛髪
あるいは眼底の部分的白児症及び感染に対する抵抗の減
弱などを呈し、血液学的特徴として白血球の巨大顆粒を
認める疾患である。本疾患は、ヒト、マウス、ラット、
ミンク、ウシ、ネコ、シャチでの発生が報告され、和牛
においては1978年以降発生が認められている。CH-S
を発症したウシは、血液塗抹標本において好酸球を観察
することで容易に発見することができる。正常ウシの好
酸球顆粒は小型で多数見られるが、本症のウシでは大型
顆粒が少数見られる。しかし、一方の染色体上にのみ異
常に関連した遺伝子を有するヘテロ接合体であるウシ、
すなわち遺伝的にCH-Sのキャリアーであるウシについて
はその異常を知ることが難しい。したがって見かけ上は
異常の認められないウシ同士を交配させた場合でも生ま
れてくる子牛に異常が現れることがあり、本疾患の発生
を未然に防ぐ上では問題を有している。
てはそのcDNAの塩基配列が明らかにされている [文献:
ネイチャージェネティックス (Nature Genetics)、第13
巻、303-308 頁 (1996年);ネイチャージェネティックス
(Nature Genetics)、第14巻、307-311 頁 (1996年)]
が、ウシのLyst遺伝子はこれまで報告されていない。
する手段の1つとして、ヘテロ接合体同士の交配を避け
るという方法が考えられる。そのためにはウシのCH-Sの
診断を遺伝子レベルで行い、疾患遺伝子のキャリアーを
早急に見つけ出す必要がある。異常を持つウシの疾患遺
伝子が正常なものに比べてどのように変異しているかを
明らかにし、様々な遺伝子工学的手法により変異遺伝子
を迅速に検出できる手段を得ることができれば、このよ
うな遺伝子診断法を確立することができる。したがっ
て、本発明の目的はウシのCH-Sの遺伝子診断法(遺伝子
検出法)を提供することである。これにより、CH-Sのキ
ャリアーをスクリーニングすることによって今後の本疾
患の発生を未然に防ぐことができる。
を達成するために研究を重ねた結果、Lyst遺伝子上の特
定の塩基置換が本疾患の原因であることを見出し、さら
に、かかる変異により、該遺伝子上に特定の制限酵素の
認識部位が形成されていることを見出し、本発明を完成
するに至った。
増幅反応に付して、ウシのLyst遺伝子 (Lysosomal Traf
fic Regulator gene) に存在しうる変異部位を含む領域
が増幅された核酸断片を得る工程、及び 工程(c):工程(b)の核酸断片について変異の存在
を調べる工程、を含むウシの Chediak-Higashi症候群
(CH-S)の遺伝子診断法; (2) 変異部位を含む領域がウシLyst遺伝子の塩基配
列中、配列表の配列番号:1に示される塩基配列の第6,
044 位を含む領域である前記(1)記載の遺伝子診断
法; (3) 遺伝子増幅反応がPCR (ポリメラーゼ連鎖反
応)法によって行われる前記(1)又(2)記載の遺伝
子診断法; (4) 変異の存在をASPCR 増幅核酸断片長型を検出し
て調べることを特徴とする前記(1)〜(3)のいずれ
か一記載の遺伝子診断法;
型(RFLP)を検出して調べることを特徴とする前記
(1)〜(3)のいずれか一記載の遺伝子診断法; (6) RFLPを制限酵素Fok I を用いて検出して調べる
ことを特徴とする前記(5)記載の遺伝子診断法; (7) 変異の存在を核酸断片長型を検出して調べるこ
とを特徴とする前記(1)〜(3)のいずれか一記載の
遺伝子診断法; (8) 核酸試料がゲノミックDNA 、cDNA、又はmRNAを
含む試料である前記(1)〜(7)のいずれか一記載の
遺伝子診断法。
するためのキットであって、ウシのLyst遺伝子に存在し
うる変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅す
るのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有
していることを特徴とするキット; (10) オリゴヌクレオチドプライマーが、 (a)配列
表の配列番号:1に示された塩基配列のうちの任意の領
域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び
(b)配列表の配列番号:1に示された塩基配列のうちの
任意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドからなる群から選ばれたものであることを特徴と
する上記(9)記載のキット; (11) オリゴヌクレオチドプライマーが、(1) 配列
表の配列番号:1に示された塩基配列のうちの5’端側
の任意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチド及び (2)配列表の配列番号:1に示された塩基配
列のうちの3’端側の任意の領域に対する相補塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれたも
のであることを特徴とする上記(9)又は(10)記載
のキット;
が、3〜100個のヌクレオチドからなるものであるこ
とを特徴とする上記(9)〜(11)のいずれか一記載
のキット; (13) オリゴヌクレオチドプライマーが、10〜5
0個のヌクレオチドからなるものであることを特徴とす
る上記(9)〜(12)のいずれか一記載のキット; (14) オリゴヌクレオチドプライマーが、15〜3
5個のヌクレオチドからなるものであることを特徴とす
る上記(9)〜(13)のいずれか一記載のキット; (15) オリゴヌクレオチドプライマーが、配列表の
配列番号2〜34に示されたものからなる群から選ばれ
たものであることを特徴とする上記(9)〜(14)の
いずれか一記載のキット;
ak-Higashi症候群の遺伝子に対応するヌクレオチド配列
又はその相補鎖の全体又はその一部; (17) (a) 配列表の配列番号:1で示されたヌクレ
オチド配列又はその相補鎖の全体又はその一部、(b) 前
記配列(a) とハイブリッド形成し、PCR によりウシのLy
st遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅
するのに利用できる一切の配列、(c) 遺伝子コードの縮
退のために前記配列(a) 及び(b) から派生した配列から
なる群から選ばれたものであることを特徴とする上記
(16)記載の配列; (18) 配列表の配列番号:1で示されたヌクレオチ
ド配列又はその相補鎖の全体又はその一部を含むことを
特徴とするヌクレオチド配列; (19) ゲノミックDNA 配列、cDNA配列、RNA 配列、
ハイブリッド配列、合成配列、及び半合成配列からなる
群から選ばれたものであることを特徴とする上記(1
6)〜(18)のいずれか一記載のヌクレオチド配列; (20) 上記(16)〜(18)のいずれか一記載の
配列又は対応するmRNAとハイブリッド形成できることを
特徴とするヌクレオチドプローブ; (21) ウシ Chediak-Higashi症候群を検出するた
め、ウシのLyst遺伝子に存在しうる変異部位を含む配列
を明らかにしたり、及び/又は、単離するための上記
(20)記載のヌクレオチドプローブの使用; (22) 上記(9)〜(15)のいずれか一記載のオ
リゴヌクレオチドプライマー; (23) 上記(22)記載のオリゴヌクレオチドプラ
イマーを含有することを特徴とするウシの Chediak-Hig
ashi症候群(CH-S)用遺伝子診断試薬;及び (24) 制限酵素Fok I 及びそのアイソシゾマーから
なる群から選ばれたものを含有することを特徴とするウ
シの Chediak-Higashi症候群(CH-S)用遺伝子診断試薬
を提供する。
なる群から選ばれたものを含有し、ウシのLyst遺伝子に
存在しうる変異部位の存在あるいは非存在を検知するた
めのものであることを特徴とするウシの Chediak-Higas
hi症候群(CH-S)用遺伝子診断試薬; (26) ウシの Chediak-Higashi症候群(CH-S)を検
出するためのキットであって、(i) ウシのLyst遺伝子に
存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により
増幅するのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマ
ー、及び(ii)制限酵素Fok I 及びそのアイソシゾマーか
らなる群から選ばれたものを含有していることを特徴と
するキット; (27) オリゴヌクレオチドプライマーが、ウシLyst
遺伝子及びウシ Chediak-Higashi症候群の遺伝子に対応
するヌクレオチド配列又はその相補鎖のうちの任意の領
域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから
なる群から選ばれたものであることを特徴とする上記
(26)記載のキット; (28) オリゴヌクレオチドプライマーが、(a) 配列
表の配列番号:1で示されたヌクレオチド配列又はその
相補鎖の全体又はその一部、(b) 前記配列(a) とハイブ
リッド形成し、PCR によりウシのLyst遺伝子に存在しう
る変異部位を含む領域を遺伝子増幅するのに利用できる
一切の配列、(c) 遺伝子コードの縮退のために前記配列
(a) 及び(b) から派生した配列からなる群から選ばれた
もののうちの任意の領域に相当する塩基配列を有するオ
リゴヌクレオチドからなる群から選ばれたものであるこ
とを特徴とする上記(26)又は(27)記載のキッ
ト; (29) オリゴヌクレオチドプライマーが、 (a)配列
表の配列番号:1に示された塩基配列のうちの任意の領
域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び
(b)配列表の配列番号:1に示された塩基配列のうちの
任意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドからなる群から選ばれたものであることを特徴と
する上記(26)〜(28)のいずれか一記載のキッ
ト; (30) オリゴヌクレオチドプライマーが、(1) 配列
表の配列番号:1に示された塩基配列のうちの5’端側
の任意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチド及び (2)配列表の配列番号:1に示された塩基配
列のうちの3’端側の任意の領域に対する相補塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれたも
のであることを特徴とする上記(26)〜(29)のい
ずれか一記載のキット;
が、3〜100個のヌクレオチドからなるものであるこ
とを特徴とする上記(26)〜(30)のいずれか一記
載のキット; (32) オリゴヌクレオチドプライマーが、10〜5
0個のヌクレオチドからなるものであることを特徴とす
る上記(26)〜(31)のいずれか一記載のキット; (33) オリゴヌクレオチドプライマーが、15〜3
5個のヌクレオチドからなるものであることを特徴とす
る上記(26)〜(32)のいずれか一記載のキット; (34) オリゴヌクレオチドプライマーが、配列表の
配列番号2〜34に示されたものからなる群から選ばれ
たものであることを特徴とする上記(26)〜(33)
のいずれか一記載のキット; (35) 工程(a):ウシの核酸試料を得る工程、 工程(b):工程(a)にて得られた核酸試料を遺伝子
増幅反応に付して、ウシのLyst遺伝子 (Lysosomal Traf
fic Regulator gene) に存在しうる変異部位を含む領域
が増幅された核酸断片を得る工程、及び 工程(c):工程(b)の核酸断片について、その少な
くとも一部を制限酵素Fok I 及びそのアイソシゾマーか
らなる群から選ばれたもので処理したものと、当該処理
の施していないものとを比較して、当該変異の存在を調
べる工程、を含むウシの Chediak-Higashi症候群 (CH-
S) の遺伝子診断法; (36) 変異部位を含む領域が、ウシLyst遺伝子の塩
基配列中、配列表の配列番号:1に示される塩基配列の
第 6,044位を含む領域である上記(35)記載の遺伝子
診断法; (37) 遺伝子増幅反応が PCR(ポリメラーゼ連鎖反
応)法によって行われる上記(35)又は(36)記載
の遺伝子診断法; (38) 変異の存在を制限酵素核酸断片長型 (RFLP)
を検出して調べることを特徴とする上記(35)〜(3
7)のいずれか一記載の遺伝子診断法;及び (39) 核酸試料がゲノミックDNA 、cDNA、又はmRNA
を含む試料である上記(35)〜(38)のいずれか一
記載の遺伝子診断法を提供する。 本発明の目的、特徴、利点及びそのアイデアは、本明細
書の記載により当業者には明らかであろう。以下の発明
の実施の形態の項の記載及び具体的な実施例などの記載
は、本発明の好ましい態様を示すためのものであり、説
明のためにのみここにおいて示されているものであるこ
とは理解されるべきであり、本明細書で開示されている
本発明の意図並びに範囲内で様々な改変並びに修飾が、
それらの記載に基づいて当業者に容易に明らかになるで
あろう。
解明され(図1)、この変異を利用して該疾患の診断
(検出)を行うことができる。具体的なウシCH-Sの遺伝
子診断法(検出方法)としては、次のような工程を含む
様態が例示される。すなわち、 工程(a):ウシの核酸試料を得る工程、 工程(b):工程(a)にて得られた核酸試料を遺伝子
増幅反応に付して、ウシのLyst遺伝子 (Lysosomal Traf
fic Regulator gene) に存在しうる変異部位を含む領域
が増幅された核酸断片を得る工程、及び 工程(c):工程(b)の核酸断片について変異の存在
を調べる工程、 である。
明に用いられるウシの核酸試料としては、Lystをコード
するヌクレオチド配列を有するものであれば特に限定さ
れるものではなく、適当な細胞又は組織由来の核酸 (全
ゲノムDNA 及び細胞の全RNAから転写されたcDNAを包含
する) 、例えば、ゲノミックDNA 、cDNA、mRNA等があげ
られる。ウシの核酸試料の調整は、公知の方法、例えば
モレキュラー クローニング、ア ラボラトリー マニ
ュアル、第2版(T.マニアティス他著、コールド ス
プリング ハーバーラボラトリー社、1989年発行)
に記載の方法により行うことができる。
(a)で得られた核酸試料及び適当なプライマーを用い
て、ウシLyst遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域が
増幅され、所望の核酸断片を得ることができる。本工程
で用いられる遺伝子増幅反応の方法としては、該領域を
増幅できる方法であれば特に限定されないが、PCR 法、
RNA ポリメラーゼを利用した核酸増幅法や鎖置換増幅法
のような核酸増幅法を利用することができる。なかでも
PCR 法が好ましく用いられる。増幅の対象となる、変異
部位を含む領域としては、ウシLyst遺伝子の塩基配列の
うち、ウシCH-Sの原因となる変異を含んでいる領域であ
れば特に限定されず、例えば、配列表の配列番号:1に
示される塩基配列の中の第 6,044位を含む領域が挙げら
れる。
は「PCR 」とは、一般的に、米国特許第 4683195号明細
書に記載されたような方法を指し、例えば、所望のヌク
レオチド配列をインビトロで酵素的に増幅するための方
法を指している。一般に、PCR 法は、鋳型核酸と優先的
にハイブリダイズすることのできる2個のオリゴヌクレ
オチドプライマーを使用して、プライマー伸長合成を行
うところのサイクルを繰り返し行うことを含むものであ
る。典型的には、PCR 法で用いられるプライマーは、鋳
型内部の増幅されるべきヌクレオチド配列に対して相補
的なプライマーを使用することができ、例えば、該増幅
されるべきヌクレオチド配列とその両端において相補的
であるか、あるいは該増幅されるべきヌクレオチド配列
に隣接しているものを好ましく使用され得る。
J. J. Snindky, and T. J. White (Ed.), PCR protocol
s: a guide to methods and applications, Academic P
ress, Inc., New York (1990); M. J. McPherson, P. Q
uirke and G. R. Taylor (Ed.), PCR: a practical app
roach, IRL Press, Oxford (1991); R. K. Saiki eta
l., Science, 239, 487-491 (1988); M. A. Frohman et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1
988) などに記載の方法あるいはそれを修飾したり、改
変した方法により行うことができる。また、PCR 法は、
それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キ
ット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにさ
れているプロトコルに従って実施することもできる。
は、比較的短い一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチド
で、好ましくはポリデオキシヌクレオチドが挙げられ、
Agnew.Chem. Int. Ed. Engl., Vol.28, p.716-734 (198
9) に記載されているような既知の方法、例えば、トリ
エステル法、ホスファイト法、ホスホアミダイト法、ホ
スホネート法などの方法により化学合成されることがで
きる。通常合成は、修飾された固体支持体上で合成を便
利に行うことができることが知られており、例えば、自
動化された合成装置を用いて行うことができ、該装置は
市販されている。該オリゴヌクレオチドは、一つ又はそ
れ以上の修飾された塩基を含有していてよく、例えば、
イノシンなどの天然においては普通でない塩基あるいは
トリチル化された塩基などを含有していてよい。
の変異部位を含むDNA 断片を増幅できるものであれば、
特に限定されない。代表的には、プライマーは (a)配列
表の配列番号:1に示された塩基配列のうちの任意の領
域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び
(b)配列表の配列番号:1に示された塩基配列のうちの
任意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドを使用することができ、より好ましくは(1) 配列
表の配列番号:1に示された塩基配列のうちの5’端側
の任意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチド及び (2)配列表の配列番号:1に示された塩基配
列のうちの3’端側の任意の領域に対する相補塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドを使用することができ、例
えば、3〜100個、好ましくは10〜50個、さらに
好ましくは15〜35個のヌクレオチドを含有するもの
が挙げられる。また、PCR 条件も特に限定されず、通常
行われる公知の条件でよく、例えば、上記した文献の記
載を参考に選択することができる。PCR においては、DN
A 鎖の熱変性、プライマーのアニーリング及びポリメラ
ーゼによる相補鎖の合成からなる一つのサイクルが、例
えば、10〜50回、好ましくは20〜35回、より好ましくは
25〜30回繰り返して行われる。
程において、工程(b)で得られる核酸断片について変
異の存在が調べられる。変異の存在の検出方法として
は、特に限定されないが、ASPCR (allele-specific PC
R) 法により得られた DNA断片長を調べることにより検
出される。DNA 断片長を調べる方法は特に限定されない
が、 ABI373A蛍光DNA シークエンサー(ABI社製) を使用
する方法が好まれる。
として制限酵素断片長多型(Restriction Fragment Len
gth Polymorphism: RFLP)を検出して調べる方法も用い
られる。RFLPを調べる際に用いる制限酵素(制限エンド
ヌクレアーゼ)としては、遺伝子の変異が検出可能なも
のであれば特に限定されないが、本発明の場合、変異部
位において制限酵素Fok I の認識部位が消失するので、
制限酵素Fok I やそのアイソシゾマーが挙げられる。制
限酵素Fok I による消化は、Fok I 消化に適した組成、
例えば、10 mM トリス-HCl、pH 7.5、10 mM MgCl2 、50
mM NaCl、1 mMDTT、0.01% BSA(ウシ血清アルブミン)
からなる反応液を使用し、また、消化されるDNA の量に
応じて添加するFok I の量や反応時間を適宜調整して行
われる。
としては、市販品を使用することができる。ある特定の
制限酵素のために適した緩衝液やその基質の量は、当該
分野において知られているか、あるいは酵素製造業者あ
るいは酵素販売業者により明らかにされているものであ
る。また、当該酵素のための反応条件、コファクター、
及びその他の要件などは、酵素製造業者あるいは酵素販
売業者により確立されており、それらをそのまま用いる
ことができる。制限酵素は、一般にそれぞれの制限酵素
を最初に取得することができた微生物を表すところの大
文字とその後に付された他の小文字とからなる記述と、
そしてその次に特定の酵素を指定するところのローマ数
字とからなっている略語で表記されている。
酸試料と同様の処理を行った正常ウシの核酸試料を対照
として、ゲル電気泳動等の公知の方法によって行うこと
ができる。DNA を制限酵素で消化することにより得られ
た制限酵素消化物から、所定のDNA フラグメントを「回
収」あるいは「分離」するには、例えば、ポリアクリル
アミド又はアガロースゲル上の電気泳動により消化生成
物であるDNA フラグメントを分離し、例えば、既知分子
量のマーカーDNA フラグメントの移動度に対してのそれ
の移動度に基づいて、目的のDNA フラグメントを同定
し、所望のDNA フラグメントを含有するゲル部分を切り
出し、そして該DNA を、例えば、電気溶出処理によりゲ
ルから分離抽出することにより達成できる。
れた態様の工程(C)をその他の変異検出方法に変更し
た方法がある。変異の検出には、例えば変異部位を含む
適当なDNA 片をプローブに用いるハイブリダイゼーショ
ン法や、SSCP法(単鎖高次構造多型)のような公知の変
異検出方法が使用できる。さらに、増幅されたDNA を適
当なベクターにクローニングして塩基配列を決定する方
法や、あるいは増幅断片そのものを鋳型としてその塩基
配列を決定する方法によっても変異の検出を行うことが
できる。オリゴヌクレオチドやプローブなどは、検出を
容易にするためのラベル成分により標識されていること
ができる、該ラベル成分は、分光学的手段、光学的手
段、生化学的手段、免疫化学的手段、酵素化学的手段、
放射化学的手段などにより検出できるものであることが
できる。ラベル成分の例としては、ペルオキシダーゼ、
アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、32P などの放射
性ラベル、アイソトープ、ビオチン、螢光色素、発光物
質、発色物質などが挙げられる。
法)により、CH-Sを発病しているウシのみならず、CH-S
のキャリアーのウシについても検出し、診断することが
できる。従って、本発明でいうウシCH-Sとは、遺伝子的
に異常であることを意味し、症状の有無を問わず、また
キャリアーを含めて広義に解釈するものとする。
解析 遺伝子上の変異と本疾患との関連を調べるために、まず
正常なウシのLystをコードする遺伝子(cDNA)を単離
し、その塩基配列を明らかにする。該遺伝子が単離され
た例はこれまで報告されていないが、ヒトLYST遺伝子及
びマウスLyst遺伝子とのホモロジーを利用して単離する
ことが可能である。すなわち、ヒトLYST遺伝子及びマウ
スLyst遺伝子の塩基配列[文献: ネイチャー ジェネテ
ィックス(Nature Genetics) 、第13巻、303-308 頁(199
6 年); ネイチャー ジェネティックス(Nature Geneti
cs) 、第14巻、307-311 頁 (1996年) ]をもとに作製し
たプライマーを用い、和牛より調製したcDNAを鋳型とし
たPCR 反応を行ってヒトLYST遺伝子及びマウスLyst遺伝
子とホモロジーを有するいくつかのDNA 断片を増幅する
ことができる。
定し、これをヒトLYST遺伝子のものと比較して、該断片
がウシのLyst遺伝子をコードするcDNA由来のものである
ことを確認することができる。こうして得られた正常ウ
シのLyst遺伝子をコードするcDNAの全塩基配列を配列表
の配列番号:1に示す。DNA 断片の塩基配列の決定(シ
ークエンシング) は、化学分解法(Maxam & Gilbert法)
、チェーンターミネーション法 (Sangerジデオキシ法)
などにより行うことができる。
ウシ及び発症ウシのLyst遺伝子の塩基配列を比較するこ
とによって明らかにすることができる。すなわち、前記
の正常ウシの場合と同様に発症ウシのLyst遺伝子の塩基
配列を調べ、これを正常ウシ遺伝子と比較することによ
り、該疾患の原因である変異を確認することができる。
配列番号:1に示される正常ウシのLyst遺伝子上の塩基
配列のうち、6,044 番目のアデニン(A) がグアニン(G)
に、変異していることを見出した(図1)。この塩基置
換はヒスチジンをコドンCATがアルギニンをコードする
コドンCGT に変化するミスセンス変異である。
に詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定され
るものではない。以下の記載では、特に説明がない場合
には、D. M. Glover and B. D. Hames (Ed.), DNA Clon
ing 1, Core Techniques (2nd edition), A Practical
Approach, Oxford University Press, 1995; J. Sambro
ok, E. F. Fritsch and T. Maniatis (Ed.), Molecular
cloning, a laboratory manual (2nd edition), Cold
Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,N. Y. (198
9); M. A. Innis, D. M. Gelfaud, J. J. Snindky, and
T. J. White (Ed.), PCR protocols: a guide to meth
ods and applications, Academic Press, Inc., New Yo
rk (1990); M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Ta
ylor(Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, O
xford (1991)に記載の方法あるいはそれを修飾したり、
改変した方法により行われている。また、市販の試薬キ
ットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い
場合、それらに添付のプロトコールの指示に従って行っ
てある。
チオシアン酸グアニジン法により全RNA を調製した。得
られた全RNA を鋳型に用い、スーパースクリプトcDNA合
成キット(BRL 社製)を使用してcDNAを合成した。上記
cDNA中に含まれるウシLystをコードしているcDNA由来の
DNA 断片を増幅するためのプライマーは、ヒトLYST遺伝
子及びマウスLyst遺伝子の塩基配列[文献: ネイチャー
ジェネティックス (Nature Genetics), 第13巻, 303-
308 頁 (1996年);ネイチャー ジェネティックス (Natu
re Genetics), 第14巻, 307ー311 頁 (1996年) ]をもと
に作製した。プライマーの塩基配列をそれぞれ配列表の
配列番号:2〜30に示す。
KARA EX Taq (宝酒造社製)を使用し、PCR の反応は、
TAKARA PCR サーマルサイクラ一(宝酒造社製)を使用
した。反応条件は各プライマーセットに適したもので行
った。得られたDNA 断片について、SuprecTM02 Spin Co
lumns で精製した後、BigDye Rhodamine Dye Terminato
r Cycle Sequencing System (ABI社製) によりABI377蛍
光DNA シークエンサー(ABI社製) を用いてその塩基配列
を決定した。得られた塩基配列を配列表の配列番号:l
に示す。これらの配列を前記のヒトLYST遺伝子の塩基配
列と比較すると、両者間には高い相同性があった。
定 実験例1−(1)記載の方法にしたがって、CH-Sを発症
したウシのLyst遺伝子の塩基配列を決定した。PCR によ
って増幅されたDNA 断片のサイズは、正常ウシ由来のcD
NAを鋳型として増幅されたものとの間に差は見られなか
った。決定された塩基配列を前記の正常ウシについて決
定されたものと比較した結果、CH-SウシのLyst遺伝子で
は、配列表の配列番号:1に示された塩基配列中、6,04
4 番目に存在するアデニン(A) がグアニン(G) に置換さ
れていた。この塩基置換はヒスチジンをコードするコド
ンCAT がアルギニンをコードするコドンCGT に変化する
ミスセンス変異である。
験例2−(2)に示される、CH-Sウシに認められた塩基
置換部位を含むDNA 断片を増幅するためのプライマーCO
MF、COMRを合成した。配列表の配列番号:31、32に
それぞれプライマーCOMF、COMRの塩基配列を示す。
びそのCH-Sウシの母牛の血液(抗擬固剤としてEDTA、ヘ
パリンを含む)より塩化アンモニウム法によって白血球
を分離し、これよりQIAamp Bloodキット (QIAGEN社製)
を用いてゲノミックDNA を調製した。これらのゲノミッ
クDNA を鋳型とし、プライマーCOMF、COMRを用いたPCR
(TAKARA Taq を使用、2%フォルムアミド、94℃で1分
間、61℃で1分間、72℃で30秒間からなる工程を1サイ
クルとした29サイクル反応)を行うと、どのゲノミック
DNA を鋳型とした場合も165bp のDNA 断片の増幅が見ら
れた。次に、これらの増幅DNA 断片をPCR 反応液より回
収し、その塩基配列をダイレクトシークエンス法によっ
て決定した。その結果、配列表の配列番号:1に示され
る塩基配列中の6,044 番目の位置には、正常ウシはアデ
ニン(A) 、CH-Sウシではグアニン(G) 、またCH-Sウシの
母牛ではアデニン、グアニンの両方が存在することが示
された。このことは、CH-SウシのLyst cDNA 上に見出さ
れた塩基置換がゲノミックDNA 上の塩基置換に由来する
ものであること、及び発症ウシの母牛はこの変異に関し
てへテロ接合体であり、CH-Sが染色体性劣性遺伝をする
遺伝性疾患であることが確認された。
び変異遺伝子を増幅するためにプライマーASPCOM (COMF
と同じ、配列番号31)、ASPAFF(配列番号33)、AS
PNOR(配列番号34)を合成した。
ウシ(ホルスタイン)、CH-Sウシ、及びそのCH-Sウシの
母牛の血液(抗擬固剤としてEDTA、ヘパリンを含む)よ
り塩化アンモニウム法によって白血球を分離し、これよ
りQIAamp Bloodキット(QIAGEN社製) を用いてゲノミッ
クDNA を調製した。これらのゲノミックDNA を鋳型と
し、プライマーASPCOM、ASPAFF、ASPNORを用いたASPCR
(TAKARA Taq を使用、2%フォルムアミド、94℃で1分
間、55℃で1分間、72℃で30秒間からなる工程を1サイ
クルとした29サイクル反応)を行った。得られたPCR 反
応液から1μl をとり、これに 2.5μl の変性液を加
え、95℃、5分間加温の後、氷上で急冷した。この溶液
をABI373A 及びABI377蛍光DNA シークエンサー(ABI社
製) を用いて泳動し、GENESCAN及びGenotyper により解
析した。図2に示されるように、正常ウシでは144bp 、
CH-Sウシでは142bp 、またその母牛では両方のDNA 断片
が確認された。CH-Sウシとの遺伝関係の少ない系統のウ
シ35頭(正常ウシ)、CH-Sウシを産子に持つ母牛27頭
(遺伝的キャリアーであるウシ)、CH-Sウシ47頭につ
いて調べ、図2に示されたのと同様な結果を再現するこ
とができた。このようにallele-specific なプライマー
を利用したASPCR 法により、正常ウシ、CH-Sウシ、及び
CH-Sの遺伝的キャリアーであるウシを検出することがで
きた。
上に生じた塩基置換により、遺伝子上の制限酵素Fok I
の認識部位が消失した(図3)。Fok I 認識部位の有無
によるCH-Sウシの遺伝子診断を、以下のようにして行っ
た。
ウシ、CH-Sウシ、及びその母牛のゲノミックDNA を鋳型
とし、プライマーCOMF、COMRを用いた PCR(全量20μl
の反応液を調製)を行い、変異部位を含むDNA 断片を増
幅した。この反応液10μl をとり、1単位のFok I (TAK
ARA)を含む20μl の反応液を調製して37℃で2時間消化
した。反応液を3%ゲル(0.5 x TBE) を用いた電気泳動
に供し、泳動後のゲルをエチジムブロマイド染色して増
幅DNA 断片の切断を確認した。この結果、図4に示され
るように、CH-Sウシ由来の増幅DNA 断片はFok I によっ
て切断されなかったのに対し、正常ウシ由来のものは増
幅DNA 断片が切断されて生じた2本のDNA のバンドが認
められた。また、CH-Sウシの母牛(キャリアー)由来の
ものでは切断されなかった増幅断片と切断によって生じ
た2本のDNA 断片の両方(計3本のバンド)が認められ
た。このようにFok I を利用したPCR-RFLP法により、正
常ウシ、CH-Sウシ、及びCH-Sの遺伝的キャリアーである
ウシを検出することができた。
アーを簡便かつ迅速に検出し、診断することが可能とな
る。
す図である。
SCAN及び Genotyperにより解析した結果である。
I の認識部位を示す図である。
ターン図である。
Claims (15)
- 【請求項1】 制限酵素Fok I 及びそのアイソシゾマー
からなる群から選ばれたものを含有し、ウシのLyst遺伝
子に存在しうる変異部位の存在あるいは非存在を検知す
るためのものであることを特徴とするウシの Chediak-H
igashi症候群(CH-S)用遺伝子診断試薬。 - 【請求項2】 ウシの Chediak-Higashi症候群(CH-S)
を検出するためのキットであって、(i) ウシのLyst遺伝
子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応に
より増幅するのに利用されるオリゴヌクレオチドプライ
マー、及び(ii)制限酵素Fok I 及びそのアイソシゾマー
からなる群から選ばれたものを含有していることを特徴
とするキット。 - 【請求項3】 オリゴヌクレオチドプライマーが、ウシ
Lyst遺伝子及びウシChediak-Higashi症候群の遺伝子に
対応するヌクレオチド配列又はその相補鎖のうちの任意
の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
からなる群から選ばれたものであることを特徴とする請
求項2記載のキット。 - 【請求項4】 オリゴヌクレオチドプライマーが、(a)
配列表の配列番号:1で示されたヌクレオチド配列又は
その相補鎖の全体又はその一部、(b) 前記配列(a) とハ
イブリッド形成し、PCR によりウシのLyst遺伝子に存在
しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅するのに利用で
きる一切の配列、(c) 遺伝子コードの縮退のために前記
配列(a) 及び(b) から派生した配列からなる群から選ば
れたもののうちの任意の領域に相当する塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれたものであ
ることを特徴とする請求項2又は3記載のキット。 - 【請求項5】 オリゴヌクレオチドプライマーが、 (a)
配列表の配列番号:1に示された塩基配列のうちの任意
の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
及び (b)配列表の配列番号:1に示された塩基配列のう
ちの任意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドからなる群から選ばれたものであることを特
徴とする請求項2〜4のいずれか一記載のキット。 - 【請求項6】 オリゴヌクレオチドプライマーが、(1)
配列表の配列番号:1に示された塩基配列のうちの5’
端側の任意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチド及び (2)配列表の配列番号:1に示された塩
基配列のうちの3’端側の任意の領域に対する相補塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれ
たものであることを特徴とする請求項2〜5のいずれか
一記載のキット。 - 【請求項7】 オリゴヌクレオチドプライマーが、3〜
100個のヌクレオチドからなるものであることを特徴
とする請求項2〜6のいずれか一記載のキット。 - 【請求項8】 オリゴヌクレオチドプライマーが、10
〜50個のヌクレオチドからなるものであることを特徴
とする請求項2〜7のいずれか一記載のキット。 - 【請求項9】 オリゴヌクレオチドプライマーが、15
〜35個のヌクレオチドからなるものであることを特徴
とする請求項2〜8のいずれか一記載のキット。 - 【請求項10】 オリゴヌクレオチドプライマーが、配
列表の配列番号2〜34に示されたものからなる群から
選ばれたものであることを特徴とする請求項2〜9のい
ずれか一記載のキット。 - 【請求項11】 工程(a):ウシの核酸試料を得る工
程、 工程(b):工程(a)にて得られた核酸試料を遺伝子
増幅反応に付して、ウシのLyst遺伝子 (Lysosomal Traf
fic Regulator gene) に存在しうる変異部位を含む領域
が増幅された核酸断片を得る工程、及び 工程(c):工程(b)の核酸断片について、その少な
くとも一部を制限酵素Fok I 及びそのアイソシゾマーか
らなる群から選ばれたもので処理したものと、当該処理
の施していないものとを比較して、当該変異の存在を調
べる工程、を含むウシの Chediak-Higashi症候群 (CH-
S) の遺伝子診断法。 - 【請求項12】 変異部位を含む領域が、ウシLyst遺伝
子の塩基配列中、配列表の配列番号:1に示される塩基
配列の第 6,044位を含む領域である請求項11記載の遺
伝子診断法。 - 【請求項13】 遺伝子増幅反応が PCR(ポリメラーゼ
連鎖反応)法によって行われる請求項11又は12記載
の遺伝子診断法。 - 【請求項14】 変異の存在を制限酵素核酸断片長型
(RFLP) を検出して調べることを特徴とする請求項11
〜13のいずれか一記載の遺伝子診断法。 - 【請求項15】 核酸試料がゲノミックDNA 、cDNA、又
はmRNAを含む試料である請求項11〜14のいずれか一
記載の遺伝子診断法。
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JP29461999A JP3222867B2 (ja) | 1998-12-25 | 1999-10-15 | ウシのChediak−Higashi症候群の遺伝子診断法 |
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