JP2000083662A - ヒトグリコ―ゲンホスホリラ―ゼを阻害する方法 - Google Patents
ヒトグリコ―ゲンホスホリラ―ゼを阻害する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 グリコーゲンホスホリラーゼとグリコーゲン
ホスホリラーゼインヒビターとの新規な結合体。 【解決手段】 グリコーゲンホスホリラーゼと、化１に
示すグリコーゲンホスホリラーゼインヒビターとの結合
体。 【化１】
ホスホリラーゼインヒビターとの新規な結合体。 【解決手段】 グリコーゲンホスホリラーゼと、化１に
示すグリコーゲンホスホリラーゼインヒビターとの結合
体。 【化１】
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、グリコーゲンホス
ホリラーゼ（ＧＰ）の特定の残基と相互作用する、ある
種の構造的、物理的および空間的特性を有する化合物を
投与することによって、この酵素を阻害する方法に関す
る。本発明はまた、グリコーゲンホスホリラーゼの新規
な結晶形態、ＧＰのインヒビターのために新規な結合部
位、および新規結合部位に結合するインヒビターの設計
および選択を可能とする方法に関する。
ホリラーゼ（ＧＰ）の特定の残基と相互作用する、ある
種の構造的、物理的および空間的特性を有する化合物を
投与することによって、この酵素を阻害する方法に関す
る。本発明はまた、グリコーゲンホスホリラーゼの新規
な結晶形態、ＧＰのインヒビターのために新規な結合部
位、および新規結合部位に結合するインヒビターの設計
および選択を可能とする方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】インスリンの初期の発見および引き続く
糖尿病の治療における広範な使用、およびスルホニル尿
素（例えば、クロロプロパンアミド、トルブタミド、ア
セトヘキサミド、トラザミド）およびビグアニド（例え
ば、フェンホルミン、メトホルミン）、アルファ−グル
コシダーゼインヒビター（例えば、グルコファージ）お
よびインスリン増感剤（例えば、Ｒｅｚｕｌｉｎ）の後
の発見および経口低血糖剤としての使用にかかわらず、
糖尿病の治療における改善が要求されている。合成低血
糖剤が有効ではない糖尿病患者の約１０％（糖尿病１
型、インスリン依存性真性糖尿病）において必要であ
る、インスリンの使用は通常、自己注射による、多数回
の毎日の投与を必要とする。
糖尿病の治療における広範な使用、およびスルホニル尿
素（例えば、クロロプロパンアミド、トルブタミド、ア
セトヘキサミド、トラザミド）およびビグアニド（例え
ば、フェンホルミン、メトホルミン）、アルファ−グル
コシダーゼインヒビター（例えば、グルコファージ）お
よびインスリン増感剤（例えば、Ｒｅｚｕｌｉｎ）の後
の発見および経口低血糖剤としての使用にかかわらず、
糖尿病の治療における改善が要求されている。合成低血
糖剤が有効ではない糖尿病患者の約１０％（糖尿病１
型、インスリン依存性真性糖尿病）において必要であ
る、インスリンの使用は通常、自己注射による、多数回
の毎日の投与を必要とする。
【０００３】インスリンの適切な投与量の決定は、尿ま
たは血液中の糖の頻繁な推定を必要とする。インスリン
の過剰投与量の投与は、低血糖症を引き起こし、血液グ
ルコースの軽度の異常から昏睡、または死さえまでの範
囲の作用を伴う。非インスリン依存性真性糖尿病（糖尿
病２型、ＮＩＤＤＭ）の治療は、通常、食事、運動、経
口剤、例えば、スルホニル尿素、およびいっそう重度の
症例において、インスリンの組合わせから成る。しかし
ながら、臨床的に利用可能な低血糖剤は、不都合なこと
には、使用を制限する、他の望ましくない発現を伴う。
いずれの場合においても、これらの低血糖剤の１つは個
々の症例において有効でない場合、他のものは成功する
ことがある。いっそう安全であるか、あるいは他のもの
が不成功である場合に、成功する、低血糖剤が要求され
続けている。
たは血液中の糖の頻繁な推定を必要とする。インスリン
の過剰投与量の投与は、低血糖症を引き起こし、血液グ
ルコースの軽度の異常から昏睡、または死さえまでの範
囲の作用を伴う。非インスリン依存性真性糖尿病（糖尿
病２型、ＮＩＤＤＭ）の治療は、通常、食事、運動、経
口剤、例えば、スルホニル尿素、およびいっそう重度の
症例において、インスリンの組合わせから成る。しかし
ながら、臨床的に利用可能な低血糖剤は、不都合なこと
には、使用を制限する、他の望ましくない発現を伴う。
いずれの場合においても、これらの低血糖剤の１つは個
々の症例において有効でない場合、他のものは成功する
ことがある。いっそう安全であるか、あるいは他のもの
が不成功である場合に、成功する、低血糖剤が要求され
続けている。
【０００４】肝臓のグルコース生産は糖尿病２型の療法
のための重要な潜在的目標である。肝臓は吸収（飢餓）
後の状態における血漿グルコースレベルの主要な調節器
官であり、そして糖尿病２型の患者における肝臓のグル
コースの生産速度は正常の個体に関して有意に増加す
る。同様に、肝臓が全体の血漿グルコース供給において
比例的により小さい役割を有する、食後（供給後）の状
態において、肝臓のグルコース生産は糖尿病２型患者に
おいて異常に高い（Gerich、J. E. 、Horm. Met.Res. 1
992、26、18）。
のための重要な潜在的目標である。肝臓は吸収（飢餓）
後の状態における血漿グルコースレベルの主要な調節器
官であり、そして糖尿病２型の患者における肝臓のグル
コースの生産速度は正常の個体に関して有意に増加す
る。同様に、肝臓が全体の血漿グルコース供給において
比例的により小さい役割を有する、食後（供給後）の状
態において、肝臓のグルコース生産は糖尿病２型患者に
おいて異常に高い（Gerich、J. E. 、Horm. Met.Res. 1
992、26、18）。
【０００５】グリコーゲン分解（glycogenolysis）は肝
臓のグルコース生産の重要な目標である。肝臓は、グリ
コーゲン分解（グルコースポリマーのグリコーゲンの破
壊）および糖新生（２−および３−炭素の前駆体からの
グルコースの合成）により、グルコースを生産する。グ
リコーゲン分解は糖尿病２型において肝臓のグルコース
の生産量に対する重要な寄与をなすことがいくつかの証
拠が示唆している。第１に、正常の吸収後の人間におい
て、肝臓のグルコース生産の７５％はグリコーゲン分解
から生ずると推定される（Barret、E.J.およびLiu 、Cl
in. Endocrin.Metab.、1993、7 、875 ）。
臓のグルコース生産の重要な目標である。肝臓は、グリ
コーゲン分解（グルコースポリマーのグリコーゲンの破
壊）および糖新生（２−および３−炭素の前駆体からの
グルコースの合成）により、グルコースを生産する。グ
リコーゲン分解は糖尿病２型において肝臓のグルコース
の生産量に対する重要な寄与をなすことがいくつかの証
拠が示唆している。第１に、正常の吸収後の人間におい
て、肝臓のグルコース生産の７５％はグリコーゲン分解
から生ずると推定される（Barret、E.J.およびLiu 、Cl
in. Endocrin.Metab.、1993、7 、875 ）。
【０００６】第２に、肝臓のグリコーゲン貯蔵の疾患、
ハーズ病（Hers'disease）（グリコーゲンホスホリラー
ゼ欠乏症）を包含する肝臓のグリコーゲン貯蔵の疾患を
有する患者は、エピソード的低血糖症を表示する（Gori
n 、F. A. 、et al.、J. Neurogenetics 1987 、4 、29
3 ）。これらの観察が示唆するように、グリコーゲン分
解は肝臓のグルコース生産の有意なプロセスであること
がある。
ハーズ病（Hers'disease）（グリコーゲンホスホリラー
ゼ欠乏症）を包含する肝臓のグリコーゲン貯蔵の疾患を
有する患者は、エピソード的低血糖症を表示する（Gori
n 、F. A. 、et al.、J. Neurogenetics 1987 、4 、29
3 ）。これらの観察が示唆するように、グリコーゲン分
解は肝臓のグルコース生産の有意なプロセスであること
がある。
【０００７】グリコーゲン分解は、肝臓、筋肉、および
脳において、酵素のグリコーゲンホスホリラーゼの組織
特異的イソ型により触媒される。この酵素はグリコーゲ
ン高分子を切断して、グルコース−１−ホスフェートお
よび新しい短縮されたグリコーゲン分子を解放する。グ
リコーゲンホスホリラーゼインヒビター（ＧＰＩ）のい
くつかの型が今日まで報告されてきている（Martin、J.
L. 、et al.、Biochemistry 1991 、30、10101; Kasvi
nsky、P. J. 、et al.、J. Biol. Chem. 1978、253 、3
343; Zographos 、S. E. 、et al.、Structure 、199
7、11: 1413-1425 ）。
脳において、酵素のグリコーゲンホスホリラーゼの組織
特異的イソ型により触媒される。この酵素はグリコーゲ
ン高分子を切断して、グルコース−１−ホスフェートお
よび新しい短縮されたグリコーゲン分子を解放する。グ
リコーゲンホスホリラーゼインヒビター（ＧＰＩ）のい
くつかの型が今日まで報告されてきている（Martin、J.
L. 、et al.、Biochemistry 1991 、30、10101; Kasvi
nsky、P. J. 、et al.、J. Biol. Chem. 1978、253 、3
343; Zographos 、S. E. 、et al.、Structure 、199
7、11: 1413-1425 ）。
【０００８】一般に、これらの化合物、およびグリコー
ゲンホスホリラーゼインヒビターは、肝臓のグルコース
生産を減少し、糖血を低下することによって、糖尿病２
型の治療のための可能性を有することが仮定された。イ
ンヒビターのための酵素上の報告された結合部位は活性
部位、カフェインまたはプリン結合部位およびＡＴＰま
たはヌクレオチド結合部位である。本出願に記載されて
いる新規な結合部位は、活性部位、カフェイン部位また
はＡＴＰ部位と区別される。
ゲンホスホリラーゼインヒビターは、肝臓のグルコース
生産を減少し、糖血を低下することによって、糖尿病２
型の治療のための可能性を有することが仮定された。イ
ンヒビターのための酵素上の報告された結合部位は活性
部位、カフェインまたはプリン結合部位およびＡＴＰま
たはヌクレオチド結合部位である。本出願に記載されて
いる新規な結合部位は、活性部位、カフェイン部位また
はＡＴＰ部位と区別される。
【０００９】ヒトの肝臓のグリコーゲンホスホリラーゼ
（ＨＬＧＰ）は２つの同一サブユニットから構成されて
おり、そしてその活性は単一のアミノ酸および各サブユ
ニット（セリン１４）におけるリン酸化により調節され
る。リン酸化された形態において、ＨＬＧＰは活性であ
りそして、非リン酸化形態において、酵素は非常に低い
活性を有する。したがって、セリン１４へのホスフェー
ト基の結合はタンパク質中の構造転移を誘発し、活性を
増加させる。
（ＨＬＧＰ）は２つの同一サブユニットから構成されて
おり、そしてその活性は単一のアミノ酸および各サブユ
ニット（セリン１４）におけるリン酸化により調節され
る。リン酸化された形態において、ＨＬＧＰは活性であ
りそして、非リン酸化形態において、酵素は非常に低い
活性を有する。したがって、セリン１４へのホスフェー
ト基の結合はタンパク質中の構造転移を誘発し、活性を
増加させる。
【００１０】このコンフォメーションの変化の特徴は、
ウサギ筋肉グリコーゲンホスホリラーゼの場合において
結晶学的に同定された（Sprang et al. 、1988、Nature
336、215-221 ）。実験的に決定されたＨＬＧＰ：ＧＰ
Ｉ構造によれば、この部位における結合はリン酸化の局
所的構造的効果を逆転し、これによりリン酸化された
「活性」酵素は「不活性化」非リン酸化形態タンパク質
のコンフォメーションを採用することが明らかになっ
た。本明細書に記載する新規な結合部位は、また、リン
酸化部位と区別される。
ウサギ筋肉グリコーゲンホスホリラーゼの場合において
結晶学的に同定された（Sprang et al. 、1988、Nature
336、215-221 ）。実験的に決定されたＨＬＧＰ：ＧＰ
Ｉ構造によれば、この部位における結合はリン酸化の局
所的構造的効果を逆転し、これによりリン酸化された
「活性」酵素は「不活性化」非リン酸化形態タンパク質
のコンフォメーションを採用することが明らかになっ
た。本明細書に記載する新規な結合部位は、また、リン
酸化部位と区別される。
【００１１】図１は、ヒトの肝臓のグリコーゲンホスホ
リラーゼの完全なポリペプチドの三次構造である。前述
の残基に対応する酵素の部分を有する二量体が同定され
た。１つのサブユニットに属する新規な結合部位の部分
は紫色に着色されており、そして２倍の対称の関係する
サブユニットの部分は青色に着色されている。双方のサ
ブユニットからの生理学的二量体（新規な結合部位以
外）の残基は黄金色に着色されている。この図面はプロ
グラムRibbons (Carson 、M. (1991) 、Ribbons2.0 、
J. Appl. Cryst. 24: 958-961 ）を使用して作られた。
リラーゼの完全なポリペプチドの三次構造である。前述
の残基に対応する酵素の部分を有する二量体が同定され
た。１つのサブユニットに属する新規な結合部位の部分
は紫色に着色されており、そして２倍の対称の関係する
サブユニットの部分は青色に着色されている。双方のサ
ブユニットからの生理学的二量体（新規な結合部位以
外）の残基は黄金色に着色されている。この図面はプロ
グラムRibbons (Carson 、M. (1991) 、Ribbons2.0 、
J. Appl. Cryst. 24: 958-961 ）を使用して作られた。
【００１２】図２は、ＧＰＩと複合体化した最も好まし
い新規な結合部位の残基を示す。新規な結合部位は双方
のサブユニットからの残基から成る。１つのサブユニッ
トからの二次構造の要素は青色に着色されており、関係
する対称の関係するサブユニットからのものは紫色に着
色されている。新規な結合部位を形成する残基の側鎖は
クラスにより着色されている：青色、正に帯電；緑色、
極性；黄金色、疎水性；赤色、負に帯電。ＧＰＩの分子
は球およびスティックの表示で示されており、黄金色の
帯を有し、そして原子は型により着色されている（炭素
および塩素：緑色；酸素：赤色；窒素：青色）。この図
面はプログラムRibbons (Carson 、M. (1991) 、Ribbon
s 2.0 、J. Appl. Cryst. 24: 958-961 ）を使用して作
られた。
い新規な結合部位の残基を示す。新規な結合部位は双方
のサブユニットからの残基から成る。１つのサブユニッ
トからの二次構造の要素は青色に着色されており、関係
する対称の関係するサブユニットからのものは紫色に着
色されている。新規な結合部位を形成する残基の側鎖は
クラスにより着色されている：青色、正に帯電；緑色、
極性；黄金色、疎水性；赤色、負に帯電。ＧＰＩの分子
は球およびスティックの表示で示されており、黄金色の
帯を有し、そして原子は型により着色されている（炭素
および塩素：緑色；酸素：赤色；窒素：青色）。この図
面はプログラムRibbons (Carson 、M. (1991) 、Ribbon
s 2.0 、J. Appl. Cryst. 24: 958-961 ）を使用して作
られた。
【００１３】
【発明の要約】１つの態様において、本発明は、グリコ
ーゲンホスホリラーゼインヒビターのある部分がグリコ
ーゲンホスホリラーゼの下記の残基の一部分または全部
分とファン・デル・ワールスまたは水素結合接触する、
グリコーゲンホスホリラーゼインヒビターのための新規
な結合部位に関する：
ーゲンホスホリラーゼインヒビターのある部分がグリコ
ーゲンホスホリラーゼの下記の残基の一部分または全部
分とファン・デル・ワールスまたは水素結合接触する、
グリコーゲンホスホリラーゼインヒビターのための新規
な結合部位に関する：
【００１４】 親の二次構造 残基の番号 １３−２３ ヘリックスα１ ２４−３７ ターン ３８−３９、４３、４６−４７ ヘリックスα２ ４８−６６、６９−７０、７３−７４、７６−７８ ７９−８０ 鎖β１ ８１−８６ ８７−８８ 鎖β２ ８９−９２ ９３ ヘリックスα３ ９４−１０２ １０３ ヘリックスα４ １０４−１１５ １１６−１１７ ヘリックスα５ １１８−１２４ １２５−１２８ 鎖β３ １２９−１３１ １３２−１３３ ヘリックスα６ １３４−１５０ １５１−１５２ 鎖β４ １５３−１６０ １６１ 鎖β４ｂ １６２−１６３ １６４−１６６ 鎖β５ １６７−１７１ １７２−１７３ 鎖β６ １７４−１７８ １７９−１９０ 鎖β７ １９１−１９２ １９４、１９７ 鎖β８ １９８−２０９ ２１０−２１１ 鎖β９ ２１２−２１６ 鎖β１０ ２１９−２２６、２２８−２３２ ２３３−２３６ 鎖β１１ ２３７−２３９、２４１、２４３−２４７ ２４８−２６０ ヘリックスα７ ２６１−２７６ 鎖β１１ｂ ２７７−２８１ リバーズターン ２８２−２８９ ヘリックスα８ ２９０−３０４。
【００１５】グリコーゲンホスホリラーゼインヒビター
のための好ましい新規な結合部位は、前記のインヒビタ
ーの１つの部分がグリコーゲンホスホリラーゼの下記の
残基の一部分または全部分と、１つまたは双方のサブユ
ニットにおいてファン・デル・ワールスまたは水素結合
接触している結合部位である：
のための好ましい新規な結合部位は、前記のインヒビタ
ーの１つの部分がグリコーゲンホスホリラーゼの下記の
残基の一部分または全部分と、１つまたは双方のサブユ
ニットにおいてファン・デル・ワールスまたは水素結合
接触している結合部位である：
【００１６】 親の二次構造 残基の番号 １３−２３ ヘリックスα１ ２４−３７ 回転 ３８−３９、４３、４６−４７ ヘリックスα２ ４８−６６、６９−７０、７３−７４、７６−７８ ７９−８０ 鎖β２ ９１−９２ ９３ ヘリックスα３ ９４−１０２ １０３ ヘリックスα４ １０４−１１５ １１６−１１７ ヘリックスα５ １１８−１２４ １２５−１２８ 鎖β３ １２９−１３０ 鎖β４ １５９−１６０ １６１ 鎖β４ｂ １６２−１６３ １６４−１６６ 鎖β５ １６７−１６８ 鎖β６ １７８ １７９−１９０ 鎖β７ １９１−１９２ １９４、１９７ 鎖β９ １９８−２００ 鎖β１０ ２２０−２２６ ２２８−２３２ ２３３−２３６ 鎖β１１ ２３７−２３９、２４１、２４３−２４７ ２４８−２６０ ヘリックスα７ ２６１−２７６ 鎖β１１ｂ ２７７−２８０。
【００１７】グリコーゲンホスホリラーゼインヒビター
のための、いっそう好ましい新規な結合部位は、前記イ
ンヒビターのある部分がグリコーゲンホスホリラーゼの
下記の残基の一部分または全部分と、１つまたは双方の
サブユニットにおいてファン・デル・ワールスまたは水
素結合接触している結合部位である：
のための、いっそう好ましい新規な結合部位は、前記イ
ンヒビターのある部分がグリコーゲンホスホリラーゼの
下記の残基の一部分または全部分と、１つまたは双方の
サブユニットにおいてファン・デル・ワールスまたは水
素結合接触している結合部位である：
【００１８】残基の番号 ３３−３９ ４９−６６ ９４ ９８ １０２ １２５−１２６ １６０ １６２ １８２−１９２ １９７ ２２４−２２６ ２２８−２３１ ２３８−２３９ ２４１ ２４５ ２４７。
【００１９】グリコーゲンホスホリラーゼインヒビター
のための、最も好ましい新規な結合部位は、前記インヒ
ビターのある部分がグリコーゲンホスホリラーゼの下記
の残基の一部分または全部分と、１つまたは双方のサブ
ユニットにおいてファン・デル・ワールスまたは水素結
合接触している結合部位である：
のための、最も好ましい新規な結合部位は、前記インヒ
ビターのある部分がグリコーゲンホスホリラーゼの下記
の残基の一部分または全部分と、１つまたは双方のサブ
ユニットにおいてファン・デル・ワールスまたは水素結
合接触している結合部位である：
【００２０】残基の番号 ３７−３９ ５３ ５７ ６０ ６３−６４ １８４−１９２ ２２６ ２２９。
【００２１】他の態様において、本発明は、グリコーゲ
ンホスホリラーゼと、結合部位において結合するグリコ
ーゲンホスホリラーゼインヒビターとの複合体に関す
る。なお他の態様において、本発明は、グリコーゲンホ
スホリラーゼと、結合部位において結合するグリコーゲ
ンホスホリラーゼインヒビターとの複合体の結晶に関す
る。
ンホスホリラーゼと、結合部位において結合するグリコ
ーゲンホスホリラーゼインヒビターとの複合体に関す
る。なお他の態様において、本発明は、グリコーゲンホ
スホリラーゼと、結合部位において結合するグリコーゲ
ンホスホリラーゼインヒビターとの複合体の結晶に関す
る。
【００２２】さらになお他の態様において、本発明は、
この部位に結合することができるグリコーゲンホスホリ
ラーゼインヒビターが本発明の詳細な説明に記載する式
Ｉ、式ＩＩおよび式ＩＩＩを有する、グリコーゲンホス
ホリラーゼとグリコーゲンホスホリラーゼインヒビター
との複合体の結晶に関する。他の態様において、本発明
は、グリコーゲンホスホリラーゼがヒトの肝臓のグリコ
ーゲンホスホリラーゼであり、そして結晶が下記の物理
学的測定値を有する、グリコーゲンホスホリラーゼとグ
リコーゲンホスホリラーゼインヒビターとの複合体の結
晶に関する：
この部位に結合することができるグリコーゲンホスホリ
ラーゼインヒビターが本発明の詳細な説明に記載する式
Ｉ、式ＩＩおよび式ＩＩＩを有する、グリコーゲンホス
ホリラーゼとグリコーゲンホスホリラーゼインヒビター
との複合体の結晶に関する。他の態様において、本発明
は、グリコーゲンホスホリラーゼがヒトの肝臓のグリコ
ーゲンホスホリラーゼであり、そして結晶が下記の物理
学的測定値を有する、グリコーゲンホスホリラーゼとグ
リコーゲンホスホリラーゼインヒビターとの複合体の結
晶に関する：
【００２３】 スペースグループ(Space group） Ｐ３1 ユニットセル(Unit cell）： ａ＝ｂ＝１２４．６３オングストローム ｃ＝１２４．０６オングストローム α＝β＝９０．００度 δ＝１２０．００度 前記値は下記の次元の変動性を有する単位格子において
測定された： ａ １２３．４− １２４．６３Å（１％） ｂ １２２．２２− １２４．０６Å（１．５％）。
測定された： ａ １２３．４− １２４．６３Å（１％） ｂ １２２．２２− １２４．０６Å（１．５％）。
【００２４】他の態様において、本発明は、グリコーゲ
ンホスホリラーゼと、結合部位において結合するグリコ
ーゲンホスホリラーゼインヒビターとの複合体の形成を
検出する方法に関する。さらに他の態様において、本発
明は、結合部位からの結合したリガンドの変位に頼る、
グリコーゲンホスホリラーゼと、結合部位において結合
するグリコーゲンホスホリラーゼインヒビターとの複合
体の形成を検出する方法に関する。さらになお他の態様
において、本発明は、結合部位からの結合したリガンド
の変位に頼る、グリコーゲンホスホリラーゼと、結合部
位において結合するグリコーゲンホスホリラーゼインヒ
ビターとの複合体の形成に基づく、ヒトの肝臓のグリコ
ーゲンホスホリラーゼの阻害を測定する方法に関する。
ンホスホリラーゼと、結合部位において結合するグリコ
ーゲンホスホリラーゼインヒビターとの複合体の形成を
検出する方法に関する。さらに他の態様において、本発
明は、結合部位からの結合したリガンドの変位に頼る、
グリコーゲンホスホリラーゼと、結合部位において結合
するグリコーゲンホスホリラーゼインヒビターとの複合
体の形成を検出する方法に関する。さらになお他の態様
において、本発明は、結合部位からの結合したリガンド
の変位に頼る、グリコーゲンホスホリラーゼと、結合部
位において結合するグリコーゲンホスホリラーゼインヒ
ビターとの複合体の形成に基づく、ヒトの肝臓のグリコ
ーゲンホスホリラーゼの阻害を測定する方法に関する。
【００２５】本発明の他の態様は、下記の工程ａ〜ｃ： ａ） グリコーゲンホスホリラーゼに新規な結合部位に
おいて結合する化合物の複合体を形成し； ｂ） 工程（ａ）における複合体の構造的特徴、特に前
記化合物のための結合部位の構造的特徴を測定し；そし
て ｃ） 工程（ｂ）において測定された構造的特徴、特に
工程（ａ）の前記化合物のための結合部位の構造的特
徴、または前記構造的特徴をベースとするモデルを使用
して、新規な結合部位に結合することができるヒトの肝
臓のグリコーゲンホスホリラーゼインヒビターを設計す
る； を含んで成る、ヒトの肝臓のグリコーゲンホスホリラー
ゼのインヒビターを設計する方法に関する。
おいて結合する化合物の複合体を形成し； ｂ） 工程（ａ）における複合体の構造的特徴、特に前
記化合物のための結合部位の構造的特徴を測定し；そし
て ｃ） 工程（ｂ）において測定された構造的特徴、特に
工程（ａ）の前記化合物のための結合部位の構造的特
徴、または前記構造的特徴をベースとするモデルを使用
して、新規な結合部位に結合することができるヒトの肝
臓のグリコーゲンホスホリラーゼインヒビターを設計す
る； を含んで成る、ヒトの肝臓のグリコーゲンホスホリラー
ゼのインヒビターを設計する方法に関する。
【００２６】本発明の他の態様は、工程： ａ） グリコーゲンホスホリラーゼに新規な結合部位に
おいて結合する化合物の複合体を形成し； ｂ） 工程（ａ）における複合体の構造的特徴、特に前
記化合物のための結合部位の構造的特徴を測定し； ｃ） 工程（ｂ）において測定された構造的特徴、特に
工程（ａ）の前記化合物のための結合部位の構造的特
徴、または前記構造的特徴をベースとするモデルを使用
して、新規な結合部位に結合することができるヒトの肝
臓のグリコーゲンホスホリラーゼインヒビターを設計
し；そして ｄ） 治療を必要とする患者に工程ｃ）の化合物を投与
する； を含んでなる、高血糖症、高インスリン血症、高脂血
症、インスリン抵抗性または組織虚血のための指標を有
する哺乳動物を治療する方法である。
おいて結合する化合物の複合体を形成し； ｂ） 工程（ａ）における複合体の構造的特徴、特に前
記化合物のための結合部位の構造的特徴を測定し； ｃ） 工程（ｂ）において測定された構造的特徴、特に
工程（ａ）の前記化合物のための結合部位の構造的特
徴、または前記構造的特徴をベースとするモデルを使用
して、新規な結合部位に結合することができるヒトの肝
臓のグリコーゲンホスホリラーゼインヒビターを設計
し；そして ｄ） 治療を必要とする患者に工程ｃ）の化合物を投与
する； を含んでなる、高血糖症、高インスリン血症、高脂血
症、インスリン抵抗性または組織虚血のための指標を有
する哺乳動物を治療する方法である。
【００２７】
【発明の実施の形態】本発明は、グリコーゲンホスホリ
ラーゼインヒビターのためのグリコーゲンホスホリラー
ゼ上の新規な結合部位に関する。グリコーゲンホスホリ
ラーゼインヒビターは、グリコーゲンホスホリラーゼと
一緒に存在したとき、グリコーゲンホスホリラーゼの活
性を遅延または減少する任意の基質である。新規な結合
部位は、一連のクラスのグリコーゲンホスホリラーゼイ
ンヒビターと複合体化したグリコーゲンホスホリラーゼ
（ＧＰ）の三次元構造を決定することによって、明らか
にされた。新規な結合部位は予期せざるものであり、従
来知られていない。
ラーゼインヒビターのためのグリコーゲンホスホリラー
ゼ上の新規な結合部位に関する。グリコーゲンホスホリ
ラーゼインヒビターは、グリコーゲンホスホリラーゼと
一緒に存在したとき、グリコーゲンホスホリラーゼの活
性を遅延または減少する任意の基質である。新規な結合
部位は、一連のクラスのグリコーゲンホスホリラーゼイ
ンヒビターと複合体化したグリコーゲンホスホリラーゼ
（ＧＰ）の三次元構造を決定することによって、明らか
にされた。新規な結合部位は予期せざるものであり、従
来知られていない。
【００２８】新規な結合部位において結合したインヒビ
ターで阻害された酵素の構造は、この部位におけるＧＰ
Ｉの結合が酵素を阻害し、また、この部位に結合できる
他のＧＰＩの設計を可能とする方法を説明することがで
きる。この構造、同様な複合体の構造、またはこの部位
の他の知識を使用しないと、新規な結合部位は当業者に
よるグリコーゲンホスホリラーゼインヒビターの設計の
目標またはそのための基礎として選択されないであろ
う。この新規な結合部位を形成する二次構造の要素は、
酵母、ウサギの筋肉およびヒトの肝臓からのホスホリラ
ーゼの既知の結晶構造において保存される。新規な結合
部位は、ホスホリラーゼのすべての既知の哺乳動物種に
おいて存在する。
ターで阻害された酵素の構造は、この部位におけるＧＰ
Ｉの結合が酵素を阻害し、また、この部位に結合できる
他のＧＰＩの設計を可能とする方法を説明することがで
きる。この構造、同様な複合体の構造、またはこの部位
の他の知識を使用しないと、新規な結合部位は当業者に
よるグリコーゲンホスホリラーゼインヒビターの設計の
目標またはそのための基礎として選択されないであろ
う。この新規な結合部位を形成する二次構造の要素は、
酵母、ウサギの筋肉およびヒトの肝臓からのホスホリラ
ーゼの既知の結晶構造において保存される。新規な結合
部位は、ホスホリラーゼのすべての既知の哺乳動物種に
おいて存在する。
【００２９】複合体の結晶化および複合体の構造の決定
は、グリコーゲンホスホリラーゼインヒビターのための
結合部位を決定するアミノ酸およびアミノ酸の位置の決
定を可能とする。理解されるように、グリコーゲンホス
ホリラーゼとグリコーゲンホスホリラーゼインヒビター
との間の好適な水素結合の相互作用は直接的に起こる
か、あるいは水分子を通して起こることができる。複合
体を決定する工程は次の通りである。理解されるよう
に、これは本発明の例示であり、そして新規な結合部位
における他のグリコーゲンホスホリラーゼインヒビター
の結合、および／または他のグルコース類似体を使用す
ることができる。
は、グリコーゲンホスホリラーゼインヒビターのための
結合部位を決定するアミノ酸およびアミノ酸の位置の決
定を可能とする。理解されるように、グリコーゲンホス
ホリラーゼとグリコーゲンホスホリラーゼインヒビター
との間の好適な水素結合の相互作用は直接的に起こる
か、あるいは水分子を通して起こることができる。複合
体を決定する工程は次の通りである。理解されるよう
に、これは本発明の例示であり、そして新規な結合部位
における他のグリコーゲンホスホリラーゼインヒビター
の結合、および／または他のグルコース類似体を使用す
ることができる。
【００３０】発現および発酵 ＨＬＧＰ、およびＨＬＧＰのｃＤＮＡを、プラスミドpK
K233-2 (Pharmacia Biotech. inc. 、ニュージャージイ
州ピスカタウェイ）から大腸菌（E.coli) XL-1Blue株
（Stratagene Cloning System 、カリフォルニア州ラジ
ョラ）中で発現させた。この株をＬＢ培地（１０ｇのト
リプトン、５ｇの酵母エキス、５ｇのＮａＣｌ、および
１ｍｌのＮａＯＨ／ｌ）＋１００ｇ／ｍｌのアンピシリ
ン、１００ｍｇ／ｌのピリドキシンおよび６００ｍｇ／
ｌのＭｎＣｌ2 の中に接種し、３７℃においてＯＤ550
＝１．０の細胞密度に増殖させた。この時点において、
細胞を１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラ
クトシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。３時間の誘導後、細
胞を遠心により収集し、精製のために必要となるまで、
細胞ペレットを−７０℃において凍結させた。
K233-2 (Pharmacia Biotech. inc. 、ニュージャージイ
州ピスカタウェイ）から大腸菌（E.coli) XL-1Blue株
（Stratagene Cloning System 、カリフォルニア州ラジ
ョラ）中で発現させた。この株をＬＢ培地（１０ｇのト
リプトン、５ｇの酵母エキス、５ｇのＮａＣｌ、および
１ｍｌのＮａＯＨ／ｌ）＋１００ｇ／ｍｌのアンピシリ
ン、１００ｍｇ／ｌのピリドキシンおよび６００ｍｇ／
ｌのＭｎＣｌ2 の中に接種し、３７℃においてＯＤ550
＝１．０の細胞密度に増殖させた。この時点において、
細胞を１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラ
クトシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。３時間の誘導後、細
胞を遠心により収集し、精製のために必要となるまで、
細胞ペレットを−７０℃において凍結させた。
【００３１】ＨＢＧＰのｃＤＮＡを、いくつかの方法、
例えば、Crerar、et al.、(J. Biol. Chem. 270: 13748
-13756）により記載されている方法により下記のように
して、発現させることができる：ＨＢＧＰのｃＤＮＡを
プラスミドpTACTAC から大腸菌（E.coli) 25A6中で発現
させることができる。この株をＬＢ培地（１０ｇのトリ
プトン、５ｇの酵母エキス、５ｇのＮａＣｌ、および１
ｍｌのＮａＯＨ／ｌ）＋５０ｇ／ｍｌのアンピシリンの
中に接種し、一夜成長させ、次いで新鮮なＬＢ培地＋５
０ｇ／ｍｌのアンピシリンの中に懸濁させ、２５０μＭ
のイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｉ
ＰＴＧ）、０．５ｍＭのピリドキシンおよび３ｍＭのＭ
ｎＣｌ2 を含有する４０×体積のＬＢ／ａｍｐ培地の中
に接種し、２２℃において４８〜５０時間成長させた。
次いで細胞を遠心により収集し、精製のために必要とな
るまで、細胞ペレットを−７０℃において凍結させた。
例えば、Crerar、et al.、(J. Biol. Chem. 270: 13748
-13756）により記載されている方法により下記のように
して、発現させることができる：ＨＢＧＰのｃＤＮＡを
プラスミドpTACTAC から大腸菌（E.coli) 25A6中で発現
させることができる。この株をＬＢ培地（１０ｇのトリ
プトン、５ｇの酵母エキス、５ｇのＮａＣｌ、および１
ｍｌのＮａＯＨ／ｌ）＋５０ｇ／ｍｌのアンピシリンの
中に接種し、一夜成長させ、次いで新鮮なＬＢ培地＋５
０ｇ／ｍｌのアンピシリンの中に懸濁させ、２５０μＭ
のイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｉ
ＰＴＧ）、０．５ｍＭのピリドキシンおよび３ｍＭのＭ
ｎＣｌ2 を含有する４０×体積のＬＢ／ａｍｐ培地の中
に接種し、２２℃において４８〜５０時間成長させた。
次いで細胞を遠心により収集し、精製のために必要とな
るまで、細胞ペレットを−７０℃において凍結させた。
【００３２】ＨＬＧＰのｃＤＮＡを、また、プラスミド
pBlueBacIII(Invitrogen Corp.、カリフォルニア州サン
ディエゴ）（これはBacloGold Linear Viral DNA［Phar
macia 、カリフォルニア州サンディエゴ］とともにＳｆ
９細胞の中に共トランスフェクトされている）から発現
させる。数ラウンドのプラーク精製後、ＨＬＧＰをコー
ドするＤＮＡを含有するウイルスを単離し、増幅した。
ウェスタンブロットおよび酵素活性アッセイにより、発
現は確証された。Sf900II 培地（ＧＩＢｃｏ−ＢＲＬ）
中で無血清条件下にＳｆ９中で０．５の多重感染におい
て２２時間２×１０6 細胞／ｍｌの細胞密度で、ＨＬＧ
Ｐの最適化された発現を実施した。２７℃において７２
時間成長させた後、細胞を遠心し、精製のために必要と
なるまで、細胞ペレットを−７０℃において凍結させ
た。
pBlueBacIII(Invitrogen Corp.、カリフォルニア州サン
ディエゴ）（これはBacloGold Linear Viral DNA［Phar
macia 、カリフォルニア州サンディエゴ］とともにＳｆ
９細胞の中に共トランスフェクトされている）から発現
させる。数ラウンドのプラーク精製後、ＨＬＧＰをコー
ドするＤＮＡを含有するウイルスを単離し、増幅した。
ウェスタンブロットおよび酵素活性アッセイにより、発
現は確証された。Sf900II 培地（ＧＩＢｃｏ−ＢＲＬ）
中で無血清条件下にＳｆ９中で０．５の多重感染におい
て２２時間２×１０6 細胞／ｍｌの細胞密度で、ＨＬＧ
Ｐの最適化された発現を実施した。２７℃において７２
時間成長させた後、細胞を遠心し、精製のために必要と
なるまで、細胞ペレットを−７０℃において凍結させ
た。
【００３３】大腸菌（E.coli) またはＳｆ９細胞中で発
現されたグリコーゲンホスホリラーゼの精製 前述のペレット中の大腸菌（E.coli）細胞を、２５ｍＭ
のβ−グリセロホスフェート（ｐＨ７．０）および０．
２ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＭｇＣｌ2 及び下記のプロテ
アーゼインヒビターの中に再懸濁させ： ０．７μｇ／ｍｌ ペスタチンＡ ０．５μｇ／ｍｌ ロイペプチン ０．２ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオライド（Ｐ ＭＳＦ）、および ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、
現されたグリコーゲンホスホリラーゼの精製 前述のペレット中の大腸菌（E.coli）細胞を、２５ｍＭ
のβ−グリセロホスフェート（ｐＨ７．０）および０．
２ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＭｇＣｌ2 及び下記のプロテ
アーゼインヒビターの中に再懸濁させ： ０．７μｇ／ｍｌ ペスタチンＡ ０．５μｇ／ｍｌ ロイペプチン ０．２ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオライド（Ｐ ＭＳＦ）、および ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、
【００３４】２００μｇ／ｍｌのリゾチームおよび３μ
ｇ／ｍｌのＤＮアーゼで前処理して溶解し、次いでブラ
ンソン（Branson ）４５０型超音波細胞崩壊装置（Bran
sonSonic Power Co. 、コネチカット州ダンブリー）を
使用して２５０ｍｌのバッチを５×１．５分間氷上で超
音波処理した。次いで大腸菌（E.coli）細胞のライゼイ
トを、３５，０００×ｇにおける１時間の遠心および引
き続く０．４５ミクロンのフィルターを通す濾過によ
り、清澄化する。下記の工程（下に詳述する）の間にお
いて下記の順序で酵素活性（ＧＰａ活性活性の節に記載
するように、下記）をモニターすることによって、ライ
ゼイトの可溶性画分中のＧＰ（全体のタンパク質の１％
より少ないと推定される）を精製する：金属アフィニテ
ィークロマトグラフィー、５’−ＡＭＰセファローズク
ロマトグラフィー、色素−リガンドクロマトグラフィー
およびアニオン交換クロマトグラフィー。
ｇ／ｍｌのＤＮアーゼで前処理して溶解し、次いでブラ
ンソン（Branson ）４５０型超音波細胞崩壊装置（Bran
sonSonic Power Co. 、コネチカット州ダンブリー）を
使用して２５０ｍｌのバッチを５×１．５分間氷上で超
音波処理した。次いで大腸菌（E.coli）細胞のライゼイ
トを、３５，０００×ｇにおける１時間の遠心および引
き続く０．４５ミクロンのフィルターを通す濾過によ
り、清澄化する。下記の工程（下に詳述する）の間にお
いて下記の順序で酵素活性（ＧＰａ活性活性の節に記載
するように、下記）をモニターすることによって、ライ
ゼイトの可溶性画分中のＧＰ（全体のタンパク質の１％
より少ないと推定される）を精製する：金属アフィニテ
ィークロマトグラフィー、５’−ＡＭＰセファローズク
ロマトグラフィー、色素−リガンドクロマトグラフィー
およびアニオン交換クロマトグラフィー。
【００３５】前述のペレット中のＳｆ９細胞を緩衝液体
積に再懸濁させる：３：１の細胞質量比、２５ｍＭのβ
−グリセロホスフェート（ｐＨ７．０）および０．２ｍ
ＭのＤＴＴ、１ｍＭのＭｇＣｌ2 、＋下記のプロテアー
ゼインヒビターから成る緩衝液中： ０．７μｇ／ｍｌ ペスタチンＡ ０．５μｇ／ｍｌ ロイペプチン ０．２ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオライド（Ｐ ＭＳＦ）、および ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、
積に再懸濁させる：３：１の細胞質量比、２５ｍＭのβ
−グリセロホスフェート（ｐＨ７．０）および０．２ｍ
ＭのＤＴＴ、１ｍＭのＭｇＣｌ2 、＋下記のプロテアー
ゼインヒビターから成る緩衝液中： ０．７μｇ／ｍｌ ペスタチンＡ ０．５μｇ／ｍｌ ロイペプチン ０．２ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオライド（Ｐ ＭＳＦ）、および ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、
【００３６】３μｇ／ｍｌののＤＮアーゼで前処理して
溶解し、次いでブランソン４５０型超音波細胞崩壊装置
（Branson Sonic Power Co. 、コネチカット州ダンブリ
ー）を使用してバッチ中で３×１分間氷上で超音波処理
した。次いでＳｆ９細胞のライゼイトを、３５，０００
×ｇにおける１時間の遠心および引き続く０．４５ミク
ロンのフィルターを通す濾過により、清澄化する。金属
クロマトグラフィーの間において酵素活性（ＧＰａ活性
活性の節に記載するように）をモニターすることによっ
て、ライゼイトの可溶性画分中のＧＰ（全体のタンパク
質の１．５％より少ないと推定される）を精製する。
溶解し、次いでブランソン４５０型超音波細胞崩壊装置
（Branson Sonic Power Co. 、コネチカット州ダンブリ
ー）を使用してバッチ中で３×１分間氷上で超音波処理
した。次いでＳｆ９細胞のライゼイトを、３５，０００
×ｇにおける１時間の遠心および引き続く０．４５ミク
ロンのフィルターを通す濾過により、清澄化する。金属
クロマトグラフィーの間において酵素活性（ＧＰａ活性
活性の節に記載するように）をモニターすることによっ
て、ライゼイトの可溶性画分中のＧＰ（全体のタンパク
質の１．５％より少ないと推定される）を精製する。
【００３７】金属アフィニティークロマトグラフィー この工程はLuong et al. (Luong et al.、Journal of C
hromatography (1992)584、77-84 ）の方法をベースす
る。５００ｍｌの細胞ライゼイトの濾過した可溶性画分
（ｐａｘ１６０〜２５０ｇのもとの細胞ペレットから調
製した）を、１３０ｍｌのカラムのＩＭＡＣキレート化
−セファローズ（Pharmacia LKB Biotechnology 、ニュ
ージャージイ州ピスカタウェイ）（これは５０ｍＭのＣ
ｕＣｌ2および２５ｍＭのβ−グリセロホスフェート、
２５０ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのイミダゾール、ｐ
Ｈ７［平衡緩衝液］を供給されている）。Ａ280 が基線
に戻るまで、カラムを平衡緩衝液で洗浄する。
hromatography (1992)584、77-84 ）の方法をベースす
る。５００ｍｌの細胞ライゼイトの濾過した可溶性画分
（ｐａｘ１６０〜２５０ｇのもとの細胞ペレットから調
製した）を、１３０ｍｌのカラムのＩＭＡＣキレート化
−セファローズ（Pharmacia LKB Biotechnology 、ニュ
ージャージイ州ピスカタウェイ）（これは５０ｍＭのＣ
ｕＣｌ2および２５ｍＭのβ−グリセロホスフェート、
２５０ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのイミダゾール、ｐ
Ｈ７［平衡緩衝液］を供給されている）。Ａ280 が基線
に戻るまで、カラムを平衡緩衝液で洗浄する。
【００３８】次いで試料をカラムから０〜４００ｎＭの
イミダゾールの勾配で溶離する。ＧＰ活性を含有する画
分をプールし（ほぼ６００ｍｌ）、エチレンジアミン四
酢酸（EDTA）、ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、
フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、
ロイペプチンおよびペスタチンＡを、それぞれ、０．３
ｍＭ、０．２ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５μｇ／ｍｌおよ
び０．７μｇ／ｍｌの濃度に添加する。プールしたＧＰ
を２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、３ｍＭ
のＤＴＴ緩衝液（緩衝液Ａ）と平衡化したセファデック
スＧ−２５カラム（Sigma Chemical Co.、ミゾリー州セ
ントルイス）上で脱塩して、イミダゾールを除去し、氷
上で貯蔵する。
イミダゾールの勾配で溶離する。ＧＰ活性を含有する画
分をプールし（ほぼ６００ｍｌ）、エチレンジアミン四
酢酸（EDTA）、ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、
フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、
ロイペプチンおよびペスタチンＡを、それぞれ、０．３
ｍＭ、０．２ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５μｇ／ｍｌおよ
び０．７μｇ／ｍｌの濃度に添加する。プールしたＧＰ
を２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、３ｍＭ
のＤＴＴ緩衝液（緩衝液Ａ）と平衡化したセファデック
スＧ−２５カラム（Sigma Chemical Co.、ミゾリー州セ
ントルイス）上で脱塩して、イミダゾールを除去し、氷
上で貯蔵する。
【００３９】５’−ＡＭＰセファローズクロマトグラフ
ィー 次に、金属アフィニティー工程からの脱塩しプールした
試料（ほぼ６００ｍｌ）を、緩衝液Ａ（上を参照）と平
衡化した７０ｍｌの５’−ＡＭＰセファローズ（Pharma
cia LKB Biotechnology 、ニュージャージイ州ピスカタ
ウェイ）と混合する。この混合物を２２℃においておだ
やかに１時間撹拌し、次いでカラムの中に詰め、Ａ280
が基線に戻るまで、緩衝液Ａで洗浄する。
ィー 次に、金属アフィニティー工程からの脱塩しプールした
試料（ほぼ６００ｍｌ）を、緩衝液Ａ（上を参照）と平
衡化した７０ｍｌの５’−ＡＭＰセファローズ（Pharma
cia LKB Biotechnology 、ニュージャージイ州ピスカタ
ウェイ）と混合する。この混合物を２２℃においておだ
やかに１時間撹拌し、次いでカラムの中に詰め、Ａ280
が基線に戻るまで、緩衝液Ａで洗浄する。
【００４０】ＧＰおよび他のタンパク質をカラムから２
５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２ｍＭのＤＴＴおよび
１０ｍＭのアデノシン５’−モノホスフェート（ＡＭ
Ｐ）、ｐＨ７．３（緩衝液Ｂ）で溶離する。酵素活性を
測定し（後述する）、ドデシル硫酸ナトリウムのポリア
クリルアミドゲルの電気泳動（SDS-PAGE）によりＭｒほ
ぼ９７ｋｄのＧＰタンパク質のバンドを可視化し、次い
で銀染色（２Ｄ−銀染色ＩＩ「Daiichi Kit 」、Daiich
i Pure Chemicals Co., LTD.、東京）により、ＧＰを含
有する画分を同定し、次いでプールする。プールしたＧ
Ｐを２５ｍＭのβ−グリセロホスフェート、０．２ｍＭ
のＤＴＴ、０．３ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａＣ
ｌ、ｐＨ７．０の緩衝液（緩衝液Ｃ）の中に透析し、使
用するまで氷上で貯蔵する。
５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２ｍＭのＤＴＴおよび
１０ｍＭのアデノシン５’−モノホスフェート（ＡＭ
Ｐ）、ｐＨ７．３（緩衝液Ｂ）で溶離する。酵素活性を
測定し（後述する）、ドデシル硫酸ナトリウムのポリア
クリルアミドゲルの電気泳動（SDS-PAGE）によりＭｒほ
ぼ９７ｋｄのＧＰタンパク質のバンドを可視化し、次い
で銀染色（２Ｄ−銀染色ＩＩ「Daiichi Kit 」、Daiich
i Pure Chemicals Co., LTD.、東京）により、ＧＰを含
有する画分を同定し、次いでプールする。プールしたＧ
Ｐを２５ｍＭのβ−グリセロホスフェート、０．２ｍＭ
のＤＴＴ、０．３ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａＣ
ｌ、ｐＨ７．０の緩衝液（緩衝液Ｃ）の中に透析し、使
用するまで氷上で貯蔵する。
【００４１】色素−リガンドアフィニティークロマトグ
ラフィー ５−ＡＭＰセファローズクロマトグラフィーからのＨＬ
ＧＰを含有する画分をプールし、２５ｍＭのβ−グリセ
ロホスフェート、０．２ＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＤ
ＴＴ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０（ＤＬ−緩衝
液）に対して透析した。プールをＤＬ−緩衝液と平衡化
したマトレックス・グリーン（Matrex Green）A アガロ
ースカラム（Amicon）に負荷する。結合したタンパク質
をＤＬ−緩衝液中の２０ｍＭの５’−ＡＭＰで溶離し、
ＨＬＧＰを含有する画分をプールし、アミコン（Amico
n）撹拌セル単位中で緩衝液Ａに対して透析濃縮して、
同時に濃縮し、ＡＭＰを除去した。
ラフィー ５−ＡＭＰセファローズクロマトグラフィーからのＨＬ
ＧＰを含有する画分をプールし、２５ｍＭのβ−グリセ
ロホスフェート、０．２ＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＤ
ＴＴ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０（ＤＬ−緩衝
液）に対して透析した。プールをＤＬ−緩衝液と平衡化
したマトレックス・グリーン（Matrex Green）A アガロ
ースカラム（Amicon）に負荷する。結合したタンパク質
をＤＬ−緩衝液中の２０ｍＭの５’−ＡＭＰで溶離し、
ＨＬＧＰを含有する画分をプールし、アミコン（Amico
n）撹拌セル単位中で緩衝液Ａに対して透析濃縮して、
同時に濃縮し、ＡＭＰを除去した。
【００４２】ＨＬＧＰａへのＨＬＧＰｂの変換 大腸菌（E.coli）またはＳｆ９細胞の発現からのＨＬＧ
Ｐの部分的精製ぢた調製物を、アニオン交換クロマトグ
ラフィーの前に、リン酸化された形態（後述する）に完
全に変換する。
Ｐの部分的精製ぢた調製物を、アニオン交換クロマトグ
ラフィーの前に、リン酸化された形態（後述する）に完
全に変換する。
【００４３】アニオン交換クロマトグラフィー 後述するように、固定化ホスホリラーゼキナーゼとの反
応によりＧＰｂのＧＰａへの活性化後、プールしたＧＰ
ａ画分を０．５ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、
１．０ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド
（ＰＭＳＦ）、１．０μｇ／ｍｌのロイペプチンおよび
１．０μｇ／ｍｌのペプスタチンＡを含有する２５ｍＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に対して透析する。次
いで画分をResource QまたはMono Qアニオン交換クロマ
トグラフィーのカラム（PharmaciaBiotech inc.ニュー
ジャージイ州ピスカタウェイ）上に負荷する。Ａ280 が
基線に戻るまで、カラムを平衡緩衝液で洗浄する。
応によりＧＰｂのＧＰａへの活性化後、プールしたＧＰ
ａ画分を０．５ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、
１．０ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド
（ＰＭＳＦ）、１．０μｇ／ｍｌのロイペプチンおよび
１．０μｇ／ｍｌのペプスタチンＡを含有する２５ｍＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に対して透析する。次
いで画分をResource QまたはMono Qアニオン交換クロマ
トグラフィーのカラム（PharmaciaBiotech inc.ニュー
ジャージイ州ピスカタウェイ）上に負荷する。Ａ280 が
基線に戻るまで、カラムを平衡緩衝液で洗浄する。
【００４４】次いで試料をカラムから０〜０．２５Ｍの
ＮａＣｌの直線の勾配で溶離して、結合したＧＰおよび
他の結合したタンパク質を除去する。溶出液をＡ280 に
おけるピークタンパク質吸収についてモニターすること
によって検出して、ＧＰを含有する画分は０．１〜０．
２ＭのＮａＣｌの範囲の間で溶出する。次いで、ドデシ
ル硫酸ナトリウムのポリアクリルアミドゲルの電気泳動
（SDS-PAGE）によりＭｒほぼ９７ｋｄのＧＰタンパク質
のバンドを可視化し、次いで銀染色（２Ｄ−銀染色ＩＩ
「Daiichi Kit 」、Daiichi Pure Chemicals Co., LT
D.、東京）によりＧＰを含有する画分を同定し、次いで
プールする。プールしたＧＰを２５ｍＭのＮ，Ｎ−ビス
−（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホ
ン酸（ＢＥＳ）、１．０ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＥ
ＤＴＡ、５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．８の緩衝液の中に
透析し、使用するまで氷上で貯蔵する。
ＮａＣｌの直線の勾配で溶離して、結合したＧＰおよび
他の結合したタンパク質を除去する。溶出液をＡ280 に
おけるピークタンパク質吸収についてモニターすること
によって検出して、ＧＰを含有する画分は０．１〜０．
２ＭのＮａＣｌの範囲の間で溶出する。次いで、ドデシ
ル硫酸ナトリウムのポリアクリルアミドゲルの電気泳動
（SDS-PAGE）によりＭｒほぼ９７ｋｄのＧＰタンパク質
のバンドを可視化し、次いで銀染色（２Ｄ−銀染色ＩＩ
「Daiichi Kit 」、Daiichi Pure Chemicals Co., LT
D.、東京）によりＧＰを含有する画分を同定し、次いで
プールする。プールしたＧＰを２５ｍＭのＮ，Ｎ−ビス
−（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホ
ン酸（ＢＥＳ）、１．０ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＥ
ＤＴＡ、５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．８の緩衝液の中に
透析し、使用するまで氷上で貯蔵する。
【００４５】ＧＰ酵素活性の測定 ＧＰの活性化 ：ＧＰａへのＧＰｂの変換 ＧＰ酵素活性の測定の前に、酵素を大腸菌（E.coli) XL
-1Blue株（StratageneCloning System 、カリフォルニ
ア州ラジョラ）中で発現された不活性の形態から、下記
のようにして、ホスホリラーゼキナーゼを使用するＧＰ
のリン酸化により、活性の形態（ＧＰａと表示する）変
換する。Ｓｆ９細胞中の発現された不活性の酵素（ＧＰ
ｂと表示する）の画分を、また、下記の手順により活性
の形態（ＧＰａと表示する）変換する。
-1Blue株（StratageneCloning System 、カリフォルニ
ア州ラジョラ）中で発現された不活性の形態から、下記
のようにして、ホスホリラーゼキナーゼを使用するＧＰ
のリン酸化により、活性の形態（ＧＰａと表示する）変
換する。Ｓｆ９細胞中の発現された不活性の酵素（ＧＰ
ｂと表示する）の画分を、また、下記の手順により活性
の形態（ＧＰａと表示する）変換する。
【００４６】固定化ホスホリラーゼキナーゼとのＧＰの
反応 ホスホリラーゼキナーゼ（Sigma Chemical Co.、ミゾリ
ー州セントルイス）を、Affi-Gel(R) 10 (BioRad Cor
p.、ニューヨーク州メルビレ）上に製造業者の使用説明
書に従い固定化する。簡単に述べると、ホスホリラーゼ
キナーゼ酵素（１０ｍｇ）を洗浄したAffi-Gel(R) ビー
ズ（１ｍｌ）と２．５ｍｌの１００ｍＭのHEPES および
８０ｍＭのＣａＣｌ2 、ｐＨ７．４中で４℃において４
時間インキュベートする。次いでAffi-Gel(R) ビーズを
１回同一緩衝液で洗浄した後、５０ｍＭのHEPES および
１Ｍのグリシンメチルエステル、ｐＨ８．０で室温にお
いて１時間ブロックする。
反応 ホスホリラーゼキナーゼ（Sigma Chemical Co.、ミゾリ
ー州セントルイス）を、Affi-Gel(R) 10 (BioRad Cor
p.、ニューヨーク州メルビレ）上に製造業者の使用説明
書に従い固定化する。簡単に述べると、ホスホリラーゼ
キナーゼ酵素（１０ｍｇ）を洗浄したAffi-Gel(R) ビー
ズ（１ｍｌ）と２．５ｍｌの１００ｍＭのHEPES および
８０ｍＭのＣａＣｌ2 、ｐＨ７．４中で４℃において４
時間インキュベートする。次いでAffi-Gel(R) ビーズを
１回同一緩衝液で洗浄した後、５０ｍＭのHEPES および
１Ｍのグリシンメチルエステル、ｐＨ８．０で室温にお
いて１時間ブロックする。
【００４７】ブロッキング緩衝液を除去し、５０ｍＭの
HEPES （ｐＨ７．４）、１ｍＭのβ−メルカプトエタノ
ールおよび０．２％のＮａＮ3 と貯蔵のために置換す
る。使用する前に、Affi-Gel(R) 固定化ホスホリラーゼ
キナーゼのビーズを、キナーゼ反応の実行に使用し、２
５ｍＭのβ−グリセロホスフェート、０．３ｍＭのＤＴ
Ｔ、および０．３ｍＭのEDTA、ｐＨ７．８（キナーゼア
ッセイ緩衝液）から成る、緩衝液中で洗浄して平衡化す
る。
HEPES （ｐＨ７．４）、１ｍＭのβ−メルカプトエタノ
ールおよび０．２％のＮａＮ3 と貯蔵のために置換す
る。使用する前に、Affi-Gel(R) 固定化ホスホリラーゼ
キナーゼのビーズを、キナーゼ反応の実行に使用し、２
５ｍＭのβ−グリセロホスフェート、０．３ｍＭのＤＴ
Ｔ、および０．３ｍＭのEDTA、ｐＨ７．８（キナーゼア
ッセイ緩衝液）から成る、緩衝液中で洗浄して平衡化す
る。
【００４８】前述のクロマトグラフィー手順から得られ
た不活性ＧＰｂをキナーゼアッセイ緩衝液で１：１０に
希釈し、次いでAffi-Gel(R) ビーズ上に固定化された、
前述のホスホリラーゼキナーゼ酵素と混合する。ＮａＡ
ＴＰを７ｍＭに添加し、そしてＭｇＣｌ2 を２２ｍＭに
添加する。生ずる混合物を２５℃において３０〜６０分
間おだやかに混合する。試料をビーズから取出し、３．
３ｍＭのＡＭＰの存在および非存在においてＧＰ酵素活
性を測定することによって、ＧＰａへの変換によるＧＰ
ｂの活性化百分率を推定する。次いで、ＧＰ酵素活性
（ＡＭＰ独立性）のための合計のＧＰ酵素活性の百分率
を、下記のようにして計算する。 合計のＨＬＧＰａの％＝（ＨＬＧＰ活性−ＡＭＰ）／
（ＨＬＧＰ活性＋ＡＭＰ）×１００
た不活性ＧＰｂをキナーゼアッセイ緩衝液で１：１０に
希釈し、次いでAffi-Gel(R) ビーズ上に固定化された、
前述のホスホリラーゼキナーゼ酵素と混合する。ＮａＡ
ＴＰを７ｍＭに添加し、そしてＭｇＣｌ2 を２２ｍＭに
添加する。生ずる混合物を２５℃において３０〜６０分
間おだやかに混合する。試料をビーズから取出し、３．
３ｍＭのＡＭＰの存在および非存在においてＧＰ酵素活
性を測定することによって、ＧＰａへの変換によるＧＰ
ｂの活性化百分率を推定する。次いで、ＧＰ酵素活性
（ＡＭＰ独立性）のための合計のＧＰ酵素活性の百分率
を、下記のようにして計算する。 合計のＨＬＧＰａの％＝（ＨＬＧＰ活性−ＡＭＰ）／
（ＨＬＧＰ活性＋ＡＭＰ）×１００
【００４９】また、ＧＰａへのＧＰｂの変換後に電気泳
動の移動度のシフトに基づく等電点電気泳動により、Ｇ
ＰａへのＧＰｂの変換をモニターすることができる。フ
ァーマシア（Pharmacia) PfastGel System (Pharmacia
Biotech inc.、ニュージャージイ州ピスカタウェイ）を
利用し、プレキャストゲル（ｐｌ範囲４〜６．５）およ
び製造業者が推奨する方法を使用して、等電点電気泳動
（ＩＥＦ）により、ＧＰ試料を分析する。次いで分割し
たＧＰａおよびＧＰｂのバンドをゲル上で銀染色（２Ｄ
−銀染色ＩＩ「Daiichi Kit 」、Daiichi Pure Chemica
ls Co., LTD.、東京）により可視化する。実験試料とし
て同一ゲル上で平行に実施した、大腸菌（E.coli）由来
ＧＰａおよびＧＰｂ標準と比較することによって、ＧＰ
ａおよびＧＰｂの同定を実施する。イオン交換前に、活
性化された酵素のプールを透析した。
動の移動度のシフトに基づく等電点電気泳動により、Ｇ
ＰａへのＧＰｂの変換をモニターすることができる。フ
ァーマシア（Pharmacia) PfastGel System (Pharmacia
Biotech inc.、ニュージャージイ州ピスカタウェイ）を
利用し、プレキャストゲル（ｐｌ範囲４〜６．５）およ
び製造業者が推奨する方法を使用して、等電点電気泳動
（ＩＥＦ）により、ＧＰ試料を分析する。次いで分割し
たＧＰａおよびＧＰｂのバンドをゲル上で銀染色（２Ｄ
−銀染色ＩＩ「Daiichi Kit 」、Daiichi Pure Chemica
ls Co., LTD.、東京）により可視化する。実験試料とし
て同一ゲル上で平行に実施した、大腸菌（E.coli）由来
ＧＰａおよびＧＰｂ標準と比較することによって、ＧＰ
ａおよびＧＰｂの同定を実施する。イオン交換前に、活
性化された酵素のプールを透析した。
【００５０】ＧＰａアッセイ ２つの方法の１つによりグリコーゲンホスホリラーゼの
活性化された形態（ＧＰａ）の活性に対する本発明の化
合物の作用を評価することによって、本発明の化合物の
本明細書に記載する疾患／症状の治療／予防の活性を間
接的に測定することができる；グリコーゲンからのグル
コース−１−ホスフェートの産生をモニターするか、あ
るいは逆反応を追跡し、無機ホスフェートの解放により
グルコース−１−ホスフェートのグリコーゲンの合成を
測定することによって、グリコーゲンホスホリラーゼの
活性を前方方向において測定する。
活性化された形態（ＧＰａ）の活性に対する本発明の化
合物の作用を評価することによって、本発明の化合物の
本明細書に記載する疾患／症状の治療／予防の活性を間
接的に測定することができる；グリコーゲンからのグル
コース−１−ホスフェートの産生をモニターするか、あ
るいは逆反応を追跡し、無機ホスフェートの解放により
グルコース−１−ホスフェートのグリコーゲンの合成を
測定することによって、グリコーゲンホスホリラーゼの
活性を前方方向において測定する。
【００５１】すべての反応を三重反復実験において９６
ウェルのマイクロタイタープレート中で実施し、そして
Titertech Microplate Stacker (ICN Biomedical Co.、
アラバマ州ハンツビレ）に接続された、MCC/340MKII El
isa Reader(Lab Systems、フィンランド国）中で下に特
定する波長で、反応生成物の形成のための吸収変化を測
定する。
ウェルのマイクロタイタープレート中で実施し、そして
Titertech Microplate Stacker (ICN Biomedical Co.、
アラバマ州ハンツビレ）に接続された、MCC/340MKII El
isa Reader(Lab Systems、フィンランド国）中で下に特
定する波長で、反応生成物の形成のための吸収変化を測
定する。
【００５２】前方方向にＧＰａ酵素活性を測定するため
に、下記のように変更したPesce 、et al.［Pesce 、M.
A. 、Bodourian 、S. H. 、Harris、R. C. およびNich
olson 、J. F.(1977) Clinical Chemistry 23 、1711-1
717 ］の多酵素結合の一般的方法により、グリコーゲン
からのグルコース−１−ホスフェートの産生をモニター
する：１〜１００μｇのＧＰａ、１０単位のホスホグル
コムターゼおよび１５単位のグルコース−６−ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼ（Boehringer MannheimBiochemic
als、インジアナ州インヂアナポリス）を緩衝液Ｄ（ｐ
Ｈ７．２、５０ｍＭのHEPES 、１００ｍＭのＫＣｌ、
２．５ｍＭのエチレングリコ四酢酸（EGTA）、２．５ｍ
ＭのＭｇＣｌ2 、３．５ｍＭのＫＨ2 ＰＯ4 および０．
５ｍＭのジチオスレイトール）中で１ｍｌに希釈する。
に、下記のように変更したPesce 、et al.［Pesce 、M.
A. 、Bodourian 、S. H. 、Harris、R. C. およびNich
olson 、J. F.(1977) Clinical Chemistry 23 、1711-1
717 ］の多酵素結合の一般的方法により、グリコーゲン
からのグルコース−１−ホスフェートの産生をモニター
する：１〜１００μｇのＧＰａ、１０単位のホスホグル
コムターゼおよび１５単位のグルコース−６−ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼ（Boehringer MannheimBiochemic
als、インジアナ州インヂアナポリス）を緩衝液Ｄ（ｐ
Ｈ７．２、５０ｍＭのHEPES 、１００ｍＭのＫＣｌ、
２．５ｍＭのエチレングリコ四酢酸（EGTA）、２．５ｍ
ＭのＭｇＣｌ2 、３．５ｍＭのＫＨ2 ＰＯ4 および０．
５ｍＭのジチオスレイトール）中で１ｍｌに希釈する。
【００５３】０．４７ｍｇ／ｍｌのグリコーゲン、９．
４ｍＭのグルコース、０．６３ｍＭのニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドホスフェートの酸化された形態
（ＮＡＤＰ+ ）を含有する８０μｌの緩衝液Ｄに、２０
μｌの前記貯蔵液を添加する。試験すべき化合物を１４
％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の５μｌの溶
液として添加した後、酵素を添加する。インヒビターの
非存在におけるＧＰａ酵素活性の基底割合を５μｌの１
４％DMSOの添加により測定し、そしてＧＰａ酵素活性の
完全に阻害された割合を２０μｌの５０ｍＭの陽性の対
照の被験物質のカフェインの添加により測定する。室温
において酸化されたＮＡＤＰ+ の還元されたNADPH への
変換を３４０ｎｍにおいて測定することによって、この
反応を追跡する。
４ｍＭのグルコース、０．６３ｍＭのニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドホスフェートの酸化された形態
（ＮＡＤＰ+ ）を含有する８０μｌの緩衝液Ｄに、２０
μｌの前記貯蔵液を添加する。試験すべき化合物を１４
％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の５μｌの溶
液として添加した後、酵素を添加する。インヒビターの
非存在におけるＧＰａ酵素活性の基底割合を５μｌの１
４％DMSOの添加により測定し、そしてＧＰａ酵素活性の
完全に阻害された割合を２０μｌの５０ｍＭの陽性の対
照の被験物質のカフェインの添加により測定する。室温
において酸化されたＮＡＤＰ+ の還元されたNADPH への
変換を３４０ｎｍにおいて測定することによって、この
反応を追跡する。
【００５４】ＧＰａ酵素活性を逆方向に測定するため
に、下記のように変更したEngers、etal.、［Engers、
H. D. 、Shechosky 、S.およびMadsen、N. B. (1970) C
an. J.Biochem. 48、746-754 ］に記載されている一般
的方法により、グルコース−１−ホスフェートのグリコ
ーゲン＋無機ホスフェートへの変換を測定する：１〜１
００μｇのＧＰａを緩衝液Ｅ（ｐＨ７．２、５０ｍＭの
HEPES 、１００ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのEGTA、２．
５ｍＭのＭｇＣｌ2 および０．５ｍＭのジチオスレイト
ール）中で１ｍｌに希釈する。２０μｌのこの貯蔵液を
８０μｌの緩衝液Ｅおよび１．２５ｍｇ／ｍｌのグリコ
ーゲン、９．４ｍＭのグルコース、および０．６３ｍＭ
のグルコース−１−ホスフェートに添加する。
に、下記のように変更したEngers、etal.、［Engers、
H. D. 、Shechosky 、S.およびMadsen、N. B. (1970) C
an. J.Biochem. 48、746-754 ］に記載されている一般
的方法により、グルコース−１−ホスフェートのグリコ
ーゲン＋無機ホスフェートへの変換を測定する：１〜１
００μｇのＧＰａを緩衝液Ｅ（ｐＨ７．２、５０ｍＭの
HEPES 、１００ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのEGTA、２．
５ｍＭのＭｇＣｌ2 および０．５ｍＭのジチオスレイト
ール）中で１ｍｌに希釈する。２０μｌのこの貯蔵液を
８０μｌの緩衝液Ｅおよび１．２５ｍｇ／ｍｌのグリコ
ーゲン、９．４ｍＭのグルコース、および０．６３ｍＭ
のグルコース−１−ホスフェートに添加する。
【００５５】試験すべき化合物を１４％のジメチルスル
ホキシド（DMSO）中の５μｌの溶液として添加した後、
酵素を添加する。添加したインヒビターの非存在におけ
るＧＰａ酵素活性の基底割合を５μｌの１４％DMSOの添
加により測定する。ＧＰａ酵素活性の完全に阻害された
割合を２０μｌの５０ｍＭの陽性の対照のカフェインの
添加により測定する。
ホキシド（DMSO）中の５μｌの溶液として添加した後、
酵素を添加する。添加したインヒビターの非存在におけ
るＧＰａ酵素活性の基底割合を５μｌの１４％DMSOの添
加により測定する。ＧＰａ酵素活性の完全に阻害された
割合を２０μｌの５０ｍＭの陽性の対照のカフェインの
添加により測定する。
【００５６】この混合物を室温において１時間インキュ
ベートし、そしてグルコース−１−ホスフェートから解
放された無機ホスフェートを下記のように変更したLanz
etta、et al.［Lanzetta、P. A. 、Alvarez 、L. J. 、
Reinach 、P. S. およびCandia、O. A. (1979) Anal. B
iochem. 100 、95-97 ］の一般的方法により測定する：
１ＮヒトのＨＣｌ中の１５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌのモ
リブデン酸アンモニウム、０．３８ｍｇ／ｍｌのマラカ
イトグリーンを１００μｌの酵素混合物に添加する。室
温において２０分のインキュベーション後、吸収を６２
０ｎｍにおいて測定する。ある範囲の濃度の被験化合物
を使用して実施した前述のアッセイは、その被験化合物
によるＧＰａ酵素活性のin vitro阻害についてのＩＣ50
値（５０％の阻害に要求される被験化合物の濃度）の測
定を可能とする。
ベートし、そしてグルコース−１−ホスフェートから解
放された無機ホスフェートを下記のように変更したLanz
etta、et al.［Lanzetta、P. A. 、Alvarez 、L. J. 、
Reinach 、P. S. およびCandia、O. A. (1979) Anal. B
iochem. 100 、95-97 ］の一般的方法により測定する：
１ＮヒトのＨＣｌ中の１５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌのモ
リブデン酸アンモニウム、０．３８ｍｇ／ｍｌのマラカ
イトグリーンを１００μｌの酵素混合物に添加する。室
温において２０分のインキュベーション後、吸収を６２
０ｎｍにおいて測定する。ある範囲の濃度の被験化合物
を使用して実施した前述のアッセイは、その被験化合物
によるＧＰａ酵素活性のin vitro阻害についてのＩＣ50
値（５０％の阻害に要求される被験化合物の濃度）の測
定を可能とする。
【００５７】実施例１ 結晶化 前述したように製造した、組換えヒト肝臓グリコーゲン
ホスホリラーゼのタンパク質を、２０ｍＭのＮａＢＥＳ
＋１．０ｍＭのＥＤＴＡ＋０．５ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ
６．８。溜溶液＝０．１ＭのＮａＭＥＳ＋２５％のＭＰ
Ｄ（ｖ／ｖ）において３０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
ホスホリラーゼのタンパク質を、２０ｍＭのＮａＢＥＳ
＋１．０ｍＭのＥＤＴＡ＋０．５ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ
６．８。溜溶液＝０．１ＭのＮａＭＥＳ＋２５％のＭＰ
Ｄ（ｖ／ｖ）において３０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
【００５８】グリコーゲンホスホリラーゼインヒビタ
ー、（Ｓ）−１−｛２−［（５−クロロ−１Ｈ−インド
ール−２−カルボニル）−アミノ］−３−フェニル−プ
ロピオニル｝−アゼチジン−３−カルボン酸を、タンパ
ク質：Ｎ−アセチル−βＤ−グルコピラノシルアミン
（ＧｌｃＮＡｃ）複合体に６：１のモル比で添加した。
２μｌの複合体＋２μｌ溜溶液を使用して、吊下がる滴
（蒸気拡散法）を構成した。結晶を１７℃において成長
させた。Ｎ−アセチル−Ｂ−Ｄ−グルコピラノシルアミ
ンを製造し、ジョージ・フリート（Georg Fleet ）博士
（Oxford University 、英国）から購入した。使用する
成分に依存して、結晶の品質を変更しないで、GlcNAcを
省略することができる。
ー、（Ｓ）−１−｛２−［（５−クロロ−１Ｈ−インド
ール−２−カルボニル）−アミノ］−３−フェニル−プ
ロピオニル｝−アゼチジン−３−カルボン酸を、タンパ
ク質：Ｎ−アセチル−βＤ−グルコピラノシルアミン
（ＧｌｃＮＡｃ）複合体に６：１のモル比で添加した。
２μｌの複合体＋２μｌ溜溶液を使用して、吊下がる滴
（蒸気拡散法）を構成した。結晶を１７℃において成長
させた。Ｎ−アセチル−Ｂ−Ｄ−グルコピラノシルアミ
ンを製造し、ジョージ・フリート（Georg Fleet ）博士
（Oxford University 、英国）から購入した。使用する
成分に依存して、結晶の品質を変更しないで、GlcNAcを
省略することができる。
【００５９】結晶 空間群：Ｐ３1 。単位格子：ａ＝ｂ＝１２４．６３オン
グストローム、ｃ＝１２４．０６オングストローム、α
＝β＝９０．０度、γ＝１２０．０度。結晶の対称単位
はヒト肝臓ホスホリラーゼの機能的二量体を含有する。
各サブユニットは１分子の前述のグリコーゲンホスホリ
ラーゼインヒビターと結合し、そしてさらに結晶中の１
分子の１−ＧｌｃＮＡｃと結合する。理解されるよう
に、新規な結合部位または他のグルコース類似体に結合
する他のグリコーゲンホスホリラーゼインヒビターを使
用する場合、前記グリコーゲンホスホリラーゼインヒビ
ターおよび／または前記グルコース類似体は結晶の中に
存在するであろう。
グストローム、ｃ＝１２４．０６オングストローム、α
＝β＝９０．０度、γ＝１２０．０度。結晶の対称単位
はヒト肝臓ホスホリラーゼの機能的二量体を含有する。
各サブユニットは１分子の前述のグリコーゲンホスホリ
ラーゼインヒビターと結合し、そしてさらに結晶中の１
分子の１−ＧｌｃＮＡｃと結合する。理解されるよう
に、新規な結合部位または他のグルコース類似体に結合
する他のグリコーゲンホスホリラーゼインヒビターを使
用する場合、前記グリコーゲンホスホリラーゼインヒビ
ターおよび／または前記グルコース類似体は結晶の中に
存在するであろう。
【００６０】データの測定 結晶をナイロンループで吊下がる滴から結晶化溶液（２
５ｍＭのGlcNAcおよび１ｍＭの（Ｓ）−１−｛２−
［（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−カルボニル）
−アミノ］−３−フェニル−プロピオニル｝−アゼチジ
ン−３−カルボン酸ナトリウムを添加した、平衡化溜溶
液から成る）に短時間で移し、次いでデータの測定のた
めに１０８Ｋの液体窒素ガスの流れの中に直接入れた。
１００ｍＡおよび５０ｋＶで作動する回転アノードに取
付けられたSupperフォカシング・ミラーを装備したMaRR
esearch Detectorを使用して、データを測定した。
５ｍＭのGlcNAcおよび１ｍＭの（Ｓ）−１−｛２−
［（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−カルボニル）
−アミノ］−３−フェニル−プロピオニル｝−アゼチジ
ン−３−カルボン酸ナトリウムを添加した、平衡化溜溶
液から成る）に短時間で移し、次いでデータの測定のた
めに１０８Ｋの液体窒素ガスの流れの中に直接入れた。
１００ｍＡおよび５０ｋＶで作動する回転アノードに取
付けられたSupperフォカシング・ミラーを装備したMaRR
esearch Detectorを使用して、データを測定した。
【００６１】２００フレームの０．７５度の振動を測定
した。XDISPLAYF 、Denzo およびScalepack (Z. Otwino
ski およびW. Minor、Processing of X-ray Diffractin
Data Collected in Oscillation Mode 、Methods in E
nzymology 、Vol. 276: Macromolecular Crystallograp
hy、Part. A 、p.307-326 、1977、C. W. Carter、Jrお
よびR. M. Sweet 編、Academic Press）を使用して、デ
ータを処理した。
した。XDISPLAYF 、Denzo およびScalepack (Z. Otwino
ski およびW. Minor、Processing of X-ray Diffractin
Data Collected in Oscillation Mode 、Methods in E
nzymology 、Vol. 276: Macromolecular Crystallograp
hy、Part. A 、p.307-326 、1977、C. W. Carter、Jrお
よびR. M. Sweet 編、Academic Press）を使用して、デ
ータを処理した。
【００６２】構造の解明 ヒト肝臓ホスホリラーゼの既知の配位化合物、ＡＭＰと
の複合体を使用して、X-PLOR［PUT IN REFERNCE ］にお
いて実行されるように、分子の置換方法により、構造を
解明した。ＡＭＰを省略し、ポリアラニン鎖を検索分子
として使用した。パターソン・コリレイション（Patter
son Correlation ）洗練参照を使用して、１０〜４Åの
分解能からのデータを使用して計算した旋光溶液の結果
をさらに最適化した。分子を４つの剛性のボディに真空
乾燥した：各サブユニットのＮ−およびＣ−ドメインの
各々について１つ。
の複合体を使用して、X-PLOR［PUT IN REFERNCE ］にお
いて実行されるように、分子の置換方法により、構造を
解明した。ＡＭＰを省略し、ポリアラニン鎖を検索分子
として使用した。パターソン・コリレイション（Patter
son Correlation ）洗練参照を使用して、１０〜４Åの
分解能からのデータを使用して計算した旋光溶液の結果
をさらに最適化した。分子を４つの剛性のボディに真空
乾燥した：各サブユニットのＮ−およびＣ−ドメインの
各々について１つ。
【００６３】パターソン・コリレイション洗練からの第
２の最高の解明は、４７％の遊離のＲファクターを有す
る解明を生じた。双方の空間群Ｐ３1 およびＰ３2 にお
けるこの解明を使用して計算した並進機能は、解読可能
な地図を生じた。ポウウェル（Powell）最小化後、遊離
のＲファクターは空間群Ｐ３1 において４１．３％に低
下した。グラフのプログラムＯｃを使用してモデルを再
構築し、そして最大確度のターゲットを使用して、X-PL
ORにおいて洗練させた。
２の最高の解明は、４７％の遊離のＲファクターを有す
る解明を生じた。双方の空間群Ｐ３1 およびＰ３2 にお
けるこの解明を使用して計算した並進機能は、解読可能
な地図を生じた。ポウウェル（Powell）最小化後、遊離
のＲファクターは空間群Ｐ３1 において４１．３％に低
下した。グラフのプログラムＯｃを使用してモデルを再
構築し、そして最大確度のターゲットを使用して、X-PL
ORにおいて洗練させた。
【００６４】この部位にin vivo において結合すること
ができる、ある種の化合物は、下記の構造式（Ｉ）：
ができる、ある種の化合物は、下記の構造式（Ｉ）：
【化４】 式Ｉ
【００６５】〔式中、破線（−−−）は、任意の結合で
あり；破線（−−−）が結合であるとき、Ａは−Ｃ
（Ｈ）＝、−Ｃ（（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル）＝または−
Ｃ（ハロ）＝であるか、あるいは破線（−−−）が結合
でないとき、Ａはメチレンまたは−ＣＨ（（Ｃ1 −
Ｃ4 ）アルキル）−であり；Ｒ1 、Ｒ10またはＲ11の各
々は独立してＨ、ハロ、４−，６−もしくは７−ニト
ロ、シアノ、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）
アルコキシ、フルオロメチル、ジフルオロメチル、また
はトリフルオロメチルであり；Ｒ2 は、Ｈであり；Ｒ3
は、Ｈまたは（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルであり；
あり；破線（−−−）が結合であるとき、Ａは−Ｃ
（Ｈ）＝、−Ｃ（（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル）＝または−
Ｃ（ハロ）＝であるか、あるいは破線（−−−）が結合
でないとき、Ａはメチレンまたは−ＣＨ（（Ｃ1 −
Ｃ4 ）アルキル）−であり；Ｒ1 、Ｒ10またはＲ11の各
々は独立してＨ、ハロ、４−，６−もしくは７−ニト
ロ、シアノ、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）
アルコキシ、フルオロメチル、ジフルオロメチル、また
はトリフルオロメチルであり；Ｒ2 は、Ｈであり；Ｒ3
は、Ｈまたは（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルであり；
【００６６】Ｒ4 は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、
ヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ3 ）ア
ルコキシ（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルキル、フェニル（Ｃ1 −Ｃ
4 ）アルキル、フェニルヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アル
キル、フェニル（Ｃ1 −Ｃ4）アルコキシ（Ｃ1 −
Ｃ4 ）アルキル、チエン−２−もしくは−３−イル（Ｃ
1−Ｃ4 ）アルキル、またはフル−２−もしくは−３−
イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルであり、ここでＲ4 環は、
Ｈ、ハロ、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4）ア
ルコキシ、トリフルオロメチル、ヒドロキシ、アミノま
たはシアノにより炭素上で独立して１、２または３置換
されており；あるいは
ヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ3 ）ア
ルコキシ（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルキル、フェニル（Ｃ1 −Ｃ
4 ）アルキル、フェニルヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アル
キル、フェニル（Ｃ1 −Ｃ4）アルコキシ（Ｃ1 −
Ｃ4 ）アルキル、チエン−２−もしくは−３−イル（Ｃ
1−Ｃ4 ）アルキル、またはフル−２−もしくは−３−
イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルであり、ここでＲ4 環は、
Ｈ、ハロ、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4）ア
ルコキシ、トリフルオロメチル、ヒドロキシ、アミノま
たはシアノにより炭素上で独立して１、２または３置換
されており；あるいは
【００６７】Ｒ4 は、ピリド−２−，−３−もしくは−
４−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、チアゾル−２−，−
４−もしくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、イミ
ダゾル−１−，−２−，−４−もしくは−５−イル（Ｃ
1 −Ｃ4 ）アルキル、ピロル−２−もしくは−３−イル
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、オキサゾル−２−，−４−も
しくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、ピラゾル−
３−，−４−もしくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキ
ル、イソキサゾル−３−，−４−もしくは−５−イル
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、イソチアゾル−３−，−４−
もしくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、ピリダジ
ン−３−もしくは−４−イル（Ｃ1 −Ｃ4）アルキル、
ピリミジン−２−，−４−，−５−もしくは−６−イル
（Ｃ1 −Ｃ 4 ）アルキル、ピラジン−２−もしくは−３
−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、または１，３，５−ト
リアジン−２−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルであり、こ
こで前記先行するＲ4 複素環は、必要に応じて、ハロ、
トリフルオロメチル、（Ｃ1−Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1
−Ｃ4 ）アルコキシ、アミノまたはヒドロキシにより独
立して１または２置換されており、そして前記１または
２置換基は炭素に結合しており；
４−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、チアゾル−２−，−
４−もしくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、イミ
ダゾル−１−，−２−，−４−もしくは−５−イル（Ｃ
1 −Ｃ4 ）アルキル、ピロル−２−もしくは−３−イル
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、オキサゾル−２−，−４−も
しくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、ピラゾル−
３−，−４−もしくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキ
ル、イソキサゾル−３−，−４−もしくは−５−イル
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、イソチアゾル−３−，−４−
もしくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、ピリダジ
ン−３−もしくは−４−イル（Ｃ1 −Ｃ4）アルキル、
ピリミジン−２−，−４−，−５−もしくは−６−イル
（Ｃ1 −Ｃ 4 ）アルキル、ピラジン−２−もしくは−３
−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、または１，３，５−ト
リアジン−２−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルであり、こ
こで前記先行するＲ4 複素環は、必要に応じて、ハロ、
トリフルオロメチル、（Ｃ1−Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1
−Ｃ4 ）アルコキシ、アミノまたはヒドロキシにより独
立して１または２置換されており、そして前記１または
２置換基は炭素に結合しており；
【００６８】Ｒ5 は、ヒドロキシ、フルオロ、（Ｃ1 −
Ｃ5 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルコキシ、（Ｃ1 −
Ｃ6 ）アルカノイル、アミノ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキ
シ、モノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ4 ）ア
ルキルアミノ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ、カルボキシ
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルコキシ
カルボニル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ、ベンジルオキシ
カルボニル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ、またはカルボニ
ルオキシであり、ここで前記カルボニルオキシはフェニ
ル、チアゾリル、イミダゾリル、１Ｈ−インドリル、フ
リル、ピロリル、オキサゾリル、ピラゾリル、イソキサ
ゾル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、
ピラジニルまたは１，３，５−トリアジニルと炭素−炭
素結合しており、そして前記先行するＲ5 環は、必要に
応じて、ハロ、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −
Ｃ4 ）アルコキシ、ヒドロキシ、アミノまたはトリフル
オロメチルにより１置換されており、そして前記１置換
基は炭素に結合されており；
Ｃ5 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルコキシ、（Ｃ1 −
Ｃ6 ）アルカノイル、アミノ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキ
シ、モノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ4 ）ア
ルキルアミノ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ、カルボキシ
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルコキシ
カルボニル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ、ベンジルオキシ
カルボニル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ、またはカルボニ
ルオキシであり、ここで前記カルボニルオキシはフェニ
ル、チアゾリル、イミダゾリル、１Ｈ−インドリル、フ
リル、ピロリル、オキサゾリル、ピラゾリル、イソキサ
ゾル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、
ピラジニルまたは１，３，５−トリアジニルと炭素−炭
素結合しており、そして前記先行するＲ5 環は、必要に
応じて、ハロ、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −
Ｃ4 ）アルコキシ、ヒドロキシ、アミノまたはトリフル
オロメチルにより１置換されており、そして前記１置換
基は炭素に結合されており；
【００６９】Ｒ7 は、Ｈ、フルオロまたは（Ｃ1 −
Ｃ5 ）アルキルであり；あるいはＲ5 およびＲ7 は、一
緒になってオキソであることができ；Ｒ6 は、カルボキ
シまたは（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルコキシカルボニルであり；
ここでＲ8 は、（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルキル、ヒドロキシま
たは（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルコキシであり、そして
Ｃ5 ）アルキルであり；あるいはＲ5 およびＲ7 は、一
緒になってオキソであることができ；Ｒ6 は、カルボキ
シまたは（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルコキシカルボニルであり；
ここでＲ8 は、（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルキル、ヒドロキシま
たは（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルコキシであり、そして
【００７０】Ｒ9 は、Ｈ、（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルキル、ヒ
ドロキシ、（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルコキシ、メチレン−ペル
フルオロ化（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルキル、フェニル、ピリジ
ル、チエニル、フリル、ピロリル、ピロリジニル、オキ
サゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピ
ラゾリニル、ピラゾリジニル、イソキサゾリル、イソチ
アゾリル、ピラニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピ
リダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペラジニル
または１，３，５−トリアジニルであり、ここで前記先
行するＲ9 環は炭素−窒素結合しているか、あるいは
ドロキシ、（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルコキシ、メチレン−ペル
フルオロ化（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルキル、フェニル、ピリジ
ル、チエニル、フリル、ピロリル、ピロリジニル、オキ
サゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピ
ラゾリニル、ピラゾリジニル、イソキサゾリル、イソチ
アゾリル、ピラニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピ
リダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペラジニル
または１，３，５−トリアジニルであり、ここで前記先
行するＲ9 環は炭素−窒素結合しているか、あるいは
【００７１】Ｒ9 は、１、２または３置換された（Ｃ1
−Ｃ5 ）アルキルであり、ここで前記置換基は独立し
て、Ｈ、ヒドロキシ、アミノ、モノ−Ｎ−もしくはジ−
Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルアミノであるか；ある
いはＲ9 は、１または２置換（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルで
あり、ここで前記置換基は独立してフェニル、ピリジ
ル、フリル、ピロリル、ピロリジニル、オキサゾリル、
チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピラゾリニ
ル、ピラゾリジニル、イソキサゾリル、イソチアゾリ
ル、ピラニル、ピリジニル、ピペリジニル、モルホリニ
ル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペラ
ジニルまたは１，３，５−トリアジニルであり、
−Ｃ5 ）アルキルであり、ここで前記置換基は独立し
て、Ｈ、ヒドロキシ、アミノ、モノ−Ｎ−もしくはジ−
Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルアミノであるか；ある
いはＲ9 は、１または２置換（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルで
あり、ここで前記置換基は独立してフェニル、ピリジ
ル、フリル、ピロリル、ピロリジニル、オキサゾリル、
チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピラゾリニ
ル、ピラゾリジニル、イソキサゾリル、イソチアゾリ
ル、ピラニル、ピリジニル、ピペリジニル、モルホリニ
ル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペラ
ジニルまたは１，３，５−トリアジニルであり、
【００７２】ここで非芳香族窒素含有Ｒ9 環は、必要に
応じて、（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルキル、ベンジル、ベンゾイ
ルまたは（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシカルボニルにより窒
素上において１置換されており、そしてＲ9 は、必要に
応じてハロ、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）
アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、またはモノ−Ｎ−も
しくはジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルアミノによ
り炭素上において１置換されており、ただし第四級化窒
素は含有されておらず、そして窒素−酸素、窒素−窒素
または窒素−ハロの結合は存在せず；
応じて、（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルキル、ベンジル、ベンゾイ
ルまたは（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシカルボニルにより窒
素上において１置換されており、そしてＲ9 は、必要に
応じてハロ、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）
アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、またはモノ−Ｎ−も
しくはジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルアミノによ
り炭素上において１置換されており、ただし第四級化窒
素は含有されておらず、そして窒素−酸素、窒素−窒素
または窒素−ハロの結合は存在せず；
【００７３】Ｒ12は、ピペラジン−１−イル、４−（Ｃ
1 −Ｃ4 ）アルキルピペラジン−１−イル、４−ホルミ
ルピペラジン−１−イル、モルホリノ、チオモルホリ
ノ、１−オキソチオモルホリノ、１，１−ジオキソ−チ
オモルホリノ、チアゾリジン−３−イル、１−オキソチ
アゾリジン−３−イル、１，１−ジオキソ−チアゾリジ
ン−３−イル、２−（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシカルボニ
ルピロリジン−１−イル、オキサゾリジン−３−イルま
たは２（Ｒ）−ヒドロキシメチルピロリジン−１−イル
であるか；あるいは
1 −Ｃ4 ）アルキルピペラジン−１−イル、４−ホルミ
ルピペラジン−１−イル、モルホリノ、チオモルホリ
ノ、１−オキソチオモルホリノ、１，１−ジオキソ−チ
オモルホリノ、チアゾリジン−３−イル、１−オキソチ
アゾリジン−３−イル、１，１−ジオキソ−チアゾリジ
ン−３−イル、２−（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシカルボニ
ルピロリジン−１−イル、オキサゾリジン−３−イルま
たは２（Ｒ）−ヒドロキシメチルピロリジン−１−イル
であるか；あるいは
【００７４】Ｒ12は、３−および／または４−１または
２置換オキサゼチジン−２−イル、２−，４−および／
または５−１または２置換オキサゾリジン−３−イル、
２−，４−および／または５−１または２置換チアゾリ
ジン−３−イル、２−，４−および／または５−１また
は２置換１−オキソチアゾリジン−３−イル、２−，４
−および／または５−１または２置換１，１−ジオキソ
−チアゾリジン−３−イル、３−および／または４−１
または２置換ピロリジン−１−イル、３−，４−および
／または５−１，２または３置換ピペリジン−１−イ
ル、３−，４−および／または５−１，２または３置換
ピペラジン−１−イル、３−置換アゼチジン−１−イ
ル、４−および／または５−１または２置換１，２−オ
キサジナン−２−イル、３−および／または４−１また
は２置換ピラゾリジン−１−イル、４−および／または
５−１または２置換イソキサゾリジン−２−イル、ある
いは４−および／または５−１または２置換イソチアゾ
リジン−２−イルであり、ここで前記Ｒ12の置換基は独
立して、Ｈ、ハロ、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル、ヒドロキ
シ、アミノ、モノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −
Ｃ5 ）アルキルアミノ、ホルミル、オキソ、ヒドロキシ
イミノ、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルコキシ、カルボキシ、カル
バモイル、モノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ
4 ）アルキルカルバモイル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ
イミノ、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシメトキシ、（Ｃ1 −
Ｃ6 ）アルコキシカルボニル、カルボキシ（Ｃ1 −
Ｃ5 ）アルキルもしくはヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ5 ）アル
キルであり；
２置換オキサゼチジン−２−イル、２−，４−および／
または５−１または２置換オキサゾリジン−３−イル、
２−，４−および／または５−１または２置換チアゾリ
ジン−３−イル、２−，４−および／または５−１また
は２置換１−オキソチアゾリジン−３−イル、２−，４
−および／または５−１または２置換１，１−ジオキソ
−チアゾリジン−３−イル、３−および／または４−１
または２置換ピロリジン−１−イル、３−，４−および
／または５−１，２または３置換ピペリジン−１−イ
ル、３−，４−および／または５−１，２または３置換
ピペラジン−１−イル、３−置換アゼチジン−１−イ
ル、４−および／または５−１または２置換１，２−オ
キサジナン−２−イル、３−および／または４−１また
は２置換ピラゾリジン−１−イル、４−および／または
５−１または２置換イソキサゾリジン−２−イル、ある
いは４−および／または５−１または２置換イソチアゾ
リジン−２−イルであり、ここで前記Ｒ12の置換基は独
立して、Ｈ、ハロ、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル、ヒドロキ
シ、アミノ、モノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −
Ｃ5 ）アルキルアミノ、ホルミル、オキソ、ヒドロキシ
イミノ、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルコキシ、カルボキシ、カル
バモイル、モノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ
4 ）アルキルカルバモイル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ
イミノ、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシメトキシ、（Ｃ1 −
Ｃ6 ）アルコキシカルボニル、カルボキシ（Ｃ1 −
Ｃ5 ）アルキルもしくはヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ5 ）アル
キルであり；
【００７５】ただしＲ4 がＨ、メチル、エチルまたはｎ
−プロピルである場合、Ｒ5 はＯＨであり；ただしＲ5
およびＲ7 がＨであるとき、Ｒ4 はＨ、メチル、エチ
ル、ｎ−プロピル、ヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルキル
または（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルコキシ（Ｃ 1 −Ｃ3 ）アルキ
ルではなく、そしてＲ6 はＣ（Ｏ）ＮＲ8 Ｒ9 、Ｃ
（Ｏ）Ｒ12または（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシカルボニル
である〕を有し、そして薬学上許容される塩又はプロド
ラッグであってもよい。式Ｉの化合物は公開された国際
出願第ＷＯ９６／３９３８５号（その完全な開示は引用
することによって本明細書の一部とされる）に開示され
ている。
−プロピルである場合、Ｒ5 はＯＨであり；ただしＲ5
およびＲ7 がＨであるとき、Ｒ4 はＨ、メチル、エチ
ル、ｎ−プロピル、ヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルキル
または（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルコキシ（Ｃ 1 −Ｃ3 ）アルキ
ルではなく、そしてＲ6 はＣ（Ｏ）ＮＲ8 Ｒ9 、Ｃ
（Ｏ）Ｒ12または（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシカルボニル
である〕を有し、そして薬学上許容される塩又はプロド
ラッグであってもよい。式Ｉの化合物は公開された国際
出願第ＷＯ９６／３９３８５号（その完全な開示は引用
することによって本明細書の一部とされる）に開示され
ている。
【００７６】この部位にin vivo において結合すること
ができる他の化合物は下記の構造式ＩＩ：
ができる他の化合物は下記の構造式ＩＩ：
【化５】 式ＩＩ
【００７７】〔式中、破線（−−−）は任意の結合であ
り；破線（−−−）が結合であるとき、Ａは−Ｃ（Ｈ）
＝、Ｃ（（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、−Ｃ（ハロ）＝また
は−Ｎ＝であり、あるいは破線（−−−）が結合でない
とき、Ａはメチレンまたは−ＣＨ（（Ｃ1 −Ｃ4 ）アル
キル）−であり；Ｒ1 、Ｒ10またはＲ11の各々は、独立
して、Ｈ、ハロ、４−，６−もしくは７−ニトロ、（Ｃ
1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ、フル
オロメチル、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメ
チルであり；Ｒ2 は、Ｈであり；Ｒ3 は、Ｈまたは（Ｃ
1 −Ｃ5 ）アルキルであり；
り；破線（−−−）が結合であるとき、Ａは−Ｃ（Ｈ）
＝、Ｃ（（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、−Ｃ（ハロ）＝また
は−Ｎ＝であり、あるいは破線（−−−）が結合でない
とき、Ａはメチレンまたは−ＣＨ（（Ｃ1 −Ｃ4 ）アル
キル）−であり；Ｒ1 、Ｒ10またはＲ11の各々は、独立
して、Ｈ、ハロ、４−，６−もしくは７−ニトロ、（Ｃ
1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ、フル
オロメチル、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメ
チルであり；Ｒ2 は、Ｈであり；Ｒ3 は、Ｈまたは（Ｃ
1 −Ｃ5 ）アルキルであり；
【００７８】Ｒ4 は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、
ヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ3 ）ア
ルコキシ（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルキル、フェニル（Ｃ1 −Ｃ
4 ）アルキル、フェニルヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アル
キル、（フェニル）（（Ｃ1−Ｃ4 ）アルコキシ）（Ｃ
1 −Ｃ4 ）アルキル、チエン−２−もしくは−３−イル
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、またはフル−２−もしくは−
３−イル（Ｃ1 −Ｃ4）アルキルであり、ここでＲ4 環
はＨ、ハロ、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4 ）
アルコキシ、トリフルオロメチル、ヒドロキシ、アミ
ノ、シアノまたは４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾル
−２−イルにより炭素上で独立して１、２または３置換
されており；あるいは
ヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ3 ）ア
ルコキシ（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルキル、フェニル（Ｃ1 −Ｃ
4 ）アルキル、フェニルヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アル
キル、（フェニル）（（Ｃ1−Ｃ4 ）アルコキシ）（Ｃ
1 −Ｃ4 ）アルキル、チエン−２−もしくは−３−イル
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、またはフル−２−もしくは−
３−イル（Ｃ1 −Ｃ4）アルキルであり、ここでＲ4 環
はＨ、ハロ、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1−Ｃ4 ）
アルコキシ、トリフルオロメチル、ヒドロキシ、アミ
ノ、シアノまたは４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾル
−２−イルにより炭素上で独立して１、２または３置換
されており；あるいは
【００７９】Ｒ4 は、ピリド−２−，−３−もしくは−
４−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、チアゾル−２−，−
４−もしくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、イミ
ダゾル−１−，−２−，−４−もしくは−５−イル（Ｃ
1 −Ｃ4 ）アルキル、ピロル−２−もしくは−３−イル
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、オキサゾル−２−，−４−も
しくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、ピラゾル−
３−，−４−もしくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキ
ル、イソキサゾル−３−，−４−もしくは−５−イル
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、イソチアゾル−３−，−４−
もしくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、ピリダジ
ン−３−もしくは−４−イル（Ｃ1 −Ｃ4）アルキル、
ピリミジン−２−，−４−，−５−もしくは−６−イル
（Ｃ1 −Ｃ 4 ）アルキル、ピラジン−２−もしくは−３
−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、１，３，５−トリアジ
ン−２−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、またはインドル
−２−（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルであり、ここで前記先行
するＲ4 複素環は、必要に応じて、ハロ、トリフルオロ
メチル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アル
コキシ、アミノ、ヒドロキシまたはシアノにより独立し
て１または２置換されており、そして前記置換基は炭素
に結合されており；あるいは
４−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、チアゾル−２−，−
４−もしくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、イミ
ダゾル−１−，−２−，−４−もしくは−５−イル（Ｃ
1 −Ｃ4 ）アルキル、ピロル−２−もしくは−３−イル
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、オキサゾル−２−，−４−も
しくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、ピラゾル−
３−，−４−もしくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキ
ル、イソキサゾル−３−，−４−もしくは−５−イル
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、イソチアゾル−３−，−４−
もしくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、ピリダジ
ン−３−もしくは−４−イル（Ｃ1 −Ｃ4）アルキル、
ピリミジン−２−，−４−，−５−もしくは−６−イル
（Ｃ1 −Ｃ 4 ）アルキル、ピラジン−２−もしくは−３
−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、１，３，５−トリアジ
ン−２−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、またはインドル
−２−（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルであり、ここで前記先行
するＲ4 複素環は、必要に応じて、ハロ、トリフルオロ
メチル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アル
コキシ、アミノ、ヒドロキシまたはシアノにより独立し
て１または２置換されており、そして前記置換基は炭素
に結合されており；あるいは
【００８０】Ｒ4 は、Ｒ15−カルボニルオキシメチルで
あり、ここで前記Ｒ15はフェニル、チアゾリル、イミダ
ゾリル、1 Ｈ−インドリル、フリル、ピロリル、オキサ
ゾリル、ピラゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリ
ル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニ
ル、または１，３，５−トリアジニルであり、ここで前
記先行するＲ15環は、必要に応じて、ハロ、アミノ、ヒ
ドロキシ、（Ｃ1 −Ｃ4）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）ア
ルコキシまたはトリフルオロメチルにより独立して１ま
たは２置換されており、そして前記１または２置換基は
炭素に結合しており；
あり、ここで前記Ｒ15はフェニル、チアゾリル、イミダ
ゾリル、1 Ｈ−インドリル、フリル、ピロリル、オキサ
ゾリル、ピラゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリ
ル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニ
ル、または１，３，５−トリアジニルであり、ここで前
記先行するＲ15環は、必要に応じて、ハロ、アミノ、ヒ
ドロキシ、（Ｃ1 −Ｃ4）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）ア
ルコキシまたはトリフルオロメチルにより独立して１ま
たは２置換されており、そして前記１または２置換基は
炭素に結合しており；
【００８１】Ｒ5 は、Ｈ、メチル、エチル、ｎ−プロピ
ル、ヒドロキシメチルまたはヒドロキシエチルであり；
Ｒ6 は、カルボキシ、（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルコキシカルボ
ニル、ベンジルオキシカルボニル、Ｃ（Ｏ）ＮＲ8 Ｒ9
またはＣ（Ｏ）Ｒ12であり；ここでＲ8 は、Ｈ、（Ｃ1
−Ｃ6 ）アルキル、シクロ（Ｃ3 −Ｃ6 ）アルキル、シ
クロ（Ｃ3 −Ｃ6 ）アルキル（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル、
ヒドロキシまたは（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルコキシであり；そ
して
ル、ヒドロキシメチルまたはヒドロキシエチルであり；
Ｒ6 は、カルボキシ、（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルコキシカルボ
ニル、ベンジルオキシカルボニル、Ｃ（Ｏ）ＮＲ8 Ｒ9
またはＣ（Ｏ）Ｒ12であり；ここでＲ8 は、Ｈ、（Ｃ1
−Ｃ6 ）アルキル、シクロ（Ｃ3 −Ｃ6 ）アルキル、シ
クロ（Ｃ3 −Ｃ6 ）アルキル（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル、
ヒドロキシまたは（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルコキシであり；そ
して
【００８２】Ｒ9 は、Ｈ、シクロ（Ｃ3 −Ｃ8 ）アルキ
ル、シクロ（Ｃ3 −Ｃ8 ）アルキル（Ｃ1 −Ｃ5 ）アル
キル、シクロ（Ｃ4 −Ｃ7 ）アルケニル、シクロ（Ｃ3
−Ｃ 7 ）アルキル（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルコキシ、シクロ
（Ｃ3 −Ｃ7 ）アルキルオキシ、ヒドロキシ、メチレン
−ペルフルオロ化（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルキル、フェニル、
または複素環であり、ここで前記複素環はピリジル、フ
リル、ピロリル、ピロリジニル、オキサゾリル、チアゾ
リル、インダゾリル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラ
ゾリジニル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、ピラニ
ル、ピリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピリダ
ジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペラジニル、
１，３，５−トリアジニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾ
キサゾリル、ベンズイミダゾリル、チオクロマニルまた
はテトラヒドロベンゾチアゾリルであり、ここで前記複
素環は炭素−窒素結合しており；あるいは
ル、シクロ（Ｃ3 −Ｃ8 ）アルキル（Ｃ1 −Ｃ5 ）アル
キル、シクロ（Ｃ4 −Ｃ7 ）アルケニル、シクロ（Ｃ3
−Ｃ 7 ）アルキル（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルコキシ、シクロ
（Ｃ3 −Ｃ7 ）アルキルオキシ、ヒドロキシ、メチレン
−ペルフルオロ化（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルキル、フェニル、
または複素環であり、ここで前記複素環はピリジル、フ
リル、ピロリル、ピロリジニル、オキサゾリル、チアゾ
リル、インダゾリル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラ
ゾリジニル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、ピラニ
ル、ピリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピリダ
ジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペラジニル、
１，３，５−トリアジニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾ
キサゾリル、ベンズイミダゾリル、チオクロマニルまた
はテトラヒドロベンゾチアゾリルであり、ここで前記複
素環は炭素−窒素結合しており；あるいは
【００８３】Ｒ9 は、（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルキルまたは
（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルコキシであり、ここで前記（Ｃ1 −
Ｃ6 ）アルキルまたは（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルコキシは必要
に応じてシクロ（Ｃ4 −Ｃ7 ）アルケン−１−イル、フ
ェニル、チエニル、ピリジル、フリル、ピロリル、ピロ
リジニル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、
ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イソキサ
ゾリル、イソチアゾリル、ピラニル、ピペリジニル、モ
ルホリニル、チオモルホリニル、１−オキソチオモルホ
リニル、１，１−ジオキソチオモルホリニル、ピリダジ
ニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペラジニル、１，
３，５−トリアジニルまたはインドリルにより１置換さ
れており、そして前記（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルキルまたは
（Ｃ1 −Ｃ8）アルコキシは、必要に応じて且つ独立し
て、ハロ、ヒドロキシ、（Ｃ1 −Ｃ5）アルコキシ、ア
ミノ、モノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ5 ）
アルキルアミノ、シアノ、カルボキシ、または（Ｃ1 −
Ｃ4 ）アルコキシカルボニルにより１または２置換され
ており；そして
（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルコキシであり、ここで前記（Ｃ1 −
Ｃ6 ）アルキルまたは（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルコキシは必要
に応じてシクロ（Ｃ4 −Ｃ7 ）アルケン−１−イル、フ
ェニル、チエニル、ピリジル、フリル、ピロリル、ピロ
リジニル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、
ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イソキサ
ゾリル、イソチアゾリル、ピラニル、ピペリジニル、モ
ルホリニル、チオモルホリニル、１−オキソチオモルホ
リニル、１，１−ジオキソチオモルホリニル、ピリダジ
ニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペラジニル、１，
３，５−トリアジニルまたはインドリルにより１置換さ
れており、そして前記（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルキルまたは
（Ｃ1 −Ｃ8）アルコキシは、必要に応じて且つ独立し
て、ハロ、ヒドロキシ、（Ｃ1 −Ｃ5）アルコキシ、ア
ミノ、モノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ5 ）
アルキルアミノ、シアノ、カルボキシ、または（Ｃ1 −
Ｃ4 ）アルコキシカルボニルにより１または２置換され
ており；そして
【００８４】ここでＲ9 環は、必要に応じて独立して、
ハロ、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコ
キシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキ
ル、アミノ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、モノ−Ｎ−もしく
はジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルアミノ（Ｃ1 −
Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ（Ｃ1 −Ｃ
4 ）アルキル、アミノ、モノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ
−（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルアミノ、シアノ、カルボキ
シ、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルカルボニル、カルバモイ
ル、ホルミルまたはトリフルオロメチルにより炭素上に
おいて１または２置換されており、そして前記Ｒ9 環
は、必要に応じて且つ独立して、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキ
ルまたはハロにより１または２置換されており；ただし
いずれのＲ9 複素環上においても第四級化窒素は存在せ
ず；
ハロ、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコ
キシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキ
ル、アミノ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、モノ−Ｎ−もしく
はジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルアミノ（Ｃ1 −
Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ（Ｃ1 −Ｃ
4 ）アルキル、アミノ、モノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ
−（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルアミノ、シアノ、カルボキ
シ、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルカルボニル、カルバモイ
ル、ホルミルまたはトリフルオロメチルにより炭素上に
おいて１または２置換されており、そして前記Ｒ9 環
は、必要に応じて且つ独立して、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキ
ルまたはハロにより１または２置換されており；ただし
いずれのＲ9 複素環上においても第四級化窒素は存在せ
ず；
【００８５】Ｒ12は、モルホリノ、チオモルホリノ、１
−オキソチオモルホリノ、１，１−ジオキソチオモルホ
リノ、チアゾリジン−３−イル、１−オキソチアゾリジ
ン−３−イル、１，１−ジオキソチアゾリジン−３−イ
ル、ピロリジン−１−イル、ピペリジン−１−イル、ピ
ペラジン−１−イル、ピペラジン−４−イル、アゼチジ
ン−１−イル、１，２−オキサジナン−２−イル、ピラ
ゾリジン−１−イル、イソキサゾリジン−２−イル、イ
ソチアゾリジン−２−イル、１，２−オキサゼチジン−
２−イル、オキサゾリジン−３−イル、３，４−ジヒド
ロイソキノリン−２−イル、１，３−ジヒドロイソイン
ドル−２−イル、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−キノルー１
−イル、２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］オキサジ
ン−４−イル、２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］チ
アジン−４−イル、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−キノキサ
リンー１−イル、３，４−ジヒドロ−ベンゾ［ｃ］
［１，２］オキサジン−１−イル、１，４−ジヒドロ−
ベンゾ［ｄ］［１，４］オキサジン−３−イル、３，４
−ジヒドロ−ベンゾ［ｅ］［１，２］オキサジン−２１
−イル、３Ｈ−ベンゾ［ｄ］イソキサゾル−２−イル、
３Ｈ−ベンゾ［ｃ］イソキサゾル−１−イルまたはアゼ
パン−１−イルであり；
−オキソチオモルホリノ、１，１−ジオキソチオモルホ
リノ、チアゾリジン−３−イル、１−オキソチアゾリジ
ン−３−イル、１，１−ジオキソチアゾリジン−３−イ
ル、ピロリジン−１−イル、ピペリジン−１−イル、ピ
ペラジン−１−イル、ピペラジン−４−イル、アゼチジ
ン−１−イル、１，２−オキサジナン−２−イル、ピラ
ゾリジン−１−イル、イソキサゾリジン−２−イル、イ
ソチアゾリジン−２−イル、１，２−オキサゼチジン−
２−イル、オキサゾリジン−３−イル、３，４−ジヒド
ロイソキノリン−２−イル、１，３−ジヒドロイソイン
ドル−２−イル、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−キノルー１
−イル、２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］オキサジ
ン−４−イル、２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］チ
アジン−４−イル、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−キノキサ
リンー１−イル、３，４−ジヒドロ−ベンゾ［ｃ］
［１，２］オキサジン−１−イル、１，４−ジヒドロ−
ベンゾ［ｄ］［１，４］オキサジン−３−イル、３，４
−ジヒドロ−ベンゾ［ｅ］［１，２］オキサジン−２１
−イル、３Ｈ−ベンゾ［ｄ］イソキサゾル−２−イル、
３Ｈ−ベンゾ［ｃ］イソキサゾル−１−イルまたはアゼ
パン−１−イルであり；
【００８６】ここで前記Ｒ12環は、必要に応じて且つ独
立して、ハロ、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル、（Ｃ1 −
Ｃ5 ）アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、モノ−Ｎ−も
しくはジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルアミノ、ホ
ルミル、カルボキシ、カルバモイル、モノ−Ｎ−もしく
はジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルカルバモイル、
（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシ（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルコキシ、
（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルコキシカルボニル、ベンジルオキシ
カルボニル、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルコキシカルボニル（Ｃ
1 −Ｃ5 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシカルボ
ニルアミノ、カルボキシ（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル、カル
バモイル（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル、モノ−Ｎ−もしくは
ジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルカルバモイル（Ｃ
1 −Ｃ5 ）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキ
ル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ（Ｃ1−Ｃ4 ）アルキ
ル、アミノ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、モノ−Ｎ−もしく
はジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルアミノ（Ｃ1 −
Ｃ4 ）アルキル、オキソ、ヒドロキシイミノ、または
（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシイミノにより１、２または３
置換されており、そして２以下の置換基はオキソ、ヒド
ロキシイミノまたは（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシイミノか
ら選択され、そしてオキソ、ヒドロキシイミノまたは
（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシイミノは非芳香族炭素上に存
在し；そして
立して、ハロ、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル、（Ｃ1 −
Ｃ5 ）アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、モノ−Ｎ−も
しくはジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルアミノ、ホ
ルミル、カルボキシ、カルバモイル、モノ−Ｎ−もしく
はジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルカルバモイル、
（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシ（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルコキシ、
（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルコキシカルボニル、ベンジルオキシ
カルボニル、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルコキシカルボニル（Ｃ
1 −Ｃ5 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシカルボ
ニルアミノ、カルボキシ（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル、カル
バモイル（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル、モノ−Ｎ−もしくは
ジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルカルバモイル（Ｃ
1 −Ｃ5 ）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキ
ル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ（Ｃ1−Ｃ4 ）アルキ
ル、アミノ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、モノ−Ｎ−もしく
はジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルアミノ（Ｃ1 −
Ｃ4 ）アルキル、オキソ、ヒドロキシイミノ、または
（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシイミノにより１、２または３
置換されており、そして２以下の置換基はオキソ、ヒド
ロキシイミノまたは（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシイミノか
ら選択され、そしてオキソ、ヒドロキシイミノまたは
（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシイミノは非芳香族炭素上に存
在し；そして
【００８７】ここで前記Ｒ12環は、必要に応じて且つ独
立して、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルまたはハロにより１ま
たは２置換されており；ただしＲ6 が（Ｃ1 −Ｃ5 ）ア
ルコキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニルで
あるとき、Ｒ1 は５−ハロ、５−（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキ
ルまたは５−シアノでありかつＲ4 は（フェニル）（ヒ
ドロキシ）（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（フェニル）
（（（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ）（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキ
ル、ヒドロキシメチルまたはＡｒ（Ｃ1 −Ｃ2 ）アルキ
ルであり、ここでＡｒはチエン−２−もしくは−３−イ
ル、フル−２−もしくは−３−イルまたはフェニルであ
り、ここで前記Ａｒは必要に応じて独立してハロにより
１または２置換されており、ただしＲ4 がベンジルであ
りかつＲ5 がメチルであるとき、Ｒ12は４−ヒドロキシ
−ピペリジン−１−イルではなく、あるいはＲ4 がベン
ジルでありかつＲ5 がメチルであるとき、Ｒ6 はＣ
（Ｏ）Ｎ（ＣＨ3 ）2 ではなく；
立して、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルまたはハロにより１ま
たは２置換されており；ただしＲ6 が（Ｃ1 −Ｃ5 ）ア
ルコキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニルで
あるとき、Ｒ1 は５−ハロ、５−（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキ
ルまたは５−シアノでありかつＲ4 は（フェニル）（ヒ
ドロキシ）（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（フェニル）
（（（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ）（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキ
ル、ヒドロキシメチルまたはＡｒ（Ｃ1 −Ｃ2 ）アルキ
ルであり、ここでＡｒはチエン−２−もしくは−３−イ
ル、フル−２−もしくは−３−イルまたはフェニルであ
り、ここで前記Ａｒは必要に応じて独立してハロにより
１または２置換されており、ただしＲ4 がベンジルであ
りかつＲ5 がメチルであるとき、Ｒ12は４−ヒドロキシ
−ピペリジン−１−イルではなく、あるいはＲ4 がベン
ジルでありかつＲ5 がメチルであるとき、Ｒ6 はＣ
（Ｏ）Ｎ（ＣＨ3 ）2 ではなく；
【００８８】ただしＲ1 およびＲ10およびＲ11がＨであ
るとき、Ｒ4 はイミダゾル−４−イルメチル、２−フェ
ニルエチルまたは２−ヒドロキシ−２−フェニルエチル
ではなく；ただしＲ8 およびＲ9 の双方がｎ−ペンチル
であるとき、Ｒ1 は５−クロロ、５−ブロモ、５−シア
ノ、５（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル、５（Ｃ1 −Ｃ5 ）アル
コキシまたはトリフルオロメチルであり；ただしＲ12が
３，４−ジヒドロイソキノール−２−イルであるとき、
前記３，４−ジヒドロイソキノール−２−イルはカルボ
キシ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルで置換されておらず；
るとき、Ｒ4 はイミダゾル−４−イルメチル、２−フェ
ニルエチルまたは２−ヒドロキシ−２−フェニルエチル
ではなく；ただしＲ8 およびＲ9 の双方がｎ−ペンチル
であるとき、Ｒ1 は５−クロロ、５−ブロモ、５−シア
ノ、５（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル、５（Ｃ1 −Ｃ5 ）アル
コキシまたはトリフルオロメチルであり；ただしＲ12が
３，４−ジヒドロイソキノール−２−イルであるとき、
前記３，４−ジヒドロイソキノール−２−イルはカルボ
キシ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルで置換されておらず；
【００８９】ただしＲ8 がＨでありかつＲ9 が（Ｃ1 −
Ｃ6 ）アルキルであるとき、Ｒ9 はＮＨＲ9 の窒素原子
Ｎに結合する炭素上においてカルボキシまたは（Ｃ1 −
Ｃ4）アルコキシカルボニルにより置換されておらず；
さらにただしＲ6 がカルボキシでありかつＲ1 、Ｒ10、
Ｒ11およびＲ5 のすべてがＨであるとき、Ｒ4 はベンジ
ル、Ｈ、（フェニル）（ヒドロキシ）メチル、メチル、
エチルまたはｎ−プロピルではない〕を有し、さらに薬
学上許容される塩、又はプロドラッグであってもよい。
式ＩＩの化合物は公開された国際出願第ＷＯ９６／３９
３８４号（その完全な開示は引用することによって本明
細書の一部とされる）に開示されている。
Ｃ6 ）アルキルであるとき、Ｒ9 はＮＨＲ9 の窒素原子
Ｎに結合する炭素上においてカルボキシまたは（Ｃ1 −
Ｃ4）アルコキシカルボニルにより置換されておらず；
さらにただしＲ6 がカルボキシでありかつＲ1 、Ｒ10、
Ｒ11およびＲ5 のすべてがＨであるとき、Ｒ4 はベンジ
ル、Ｈ、（フェニル）（ヒドロキシ）メチル、メチル、
エチルまたはｎ−プロピルではない〕を有し、さらに薬
学上許容される塩、又はプロドラッグであってもよい。
式ＩＩの化合物は公開された国際出願第ＷＯ９６／３９
３８４号（その完全な開示は引用することによって本明
細書の一部とされる）に開示されている。
【００９０】この部位にin vivo において結合すること
ができる他のクラスの化合物は下記の構造式ＩＩＩ：
ができる他のクラスの化合物は下記の構造式ＩＩＩ：
【化６】 式ＩＩＩ
【００９１】〔式中、Ｒ1 は、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキ
ル；（Ｃ3 −Ｃ7 ）シクロアルキル；フェニル；または
３つまでの（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）ア
ルコキシもしくはハロゲンで置換されたフェニルであ
り；Ｒ2 は、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルであり；そしてＲ
3 は、（Ｃ3 −Ｃ7 ）シクロアルキル；フェニル；パラ
位において（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、ハロ、ヒドロキシ
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルもしくはトリフルオロメチルで
置換されたフェニル；メタ位においてフルオロで置換さ
れたフェニル；またはオルト位においてフルオロで置換
されたフェニルである〕を有し、さらに薬学上許容され
る塩、又はプロドラッグであってもよい。
ル；（Ｃ3 −Ｃ7 ）シクロアルキル；フェニル；または
３つまでの（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）ア
ルコキシもしくはハロゲンで置換されたフェニルであ
り；Ｒ2 は、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルであり；そしてＲ
3 は、（Ｃ3 −Ｃ7 ）シクロアルキル；フェニル；パラ
位において（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、ハロ、ヒドロキシ
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルもしくはトリフルオロメチルで
置換されたフェニル；メタ位においてフルオロで置換さ
れたフェニル；またはオルト位においてフルオロで置換
されたフェニルである〕を有し、さらに薬学上許容され
る塩、又はプロドラッグであってもよい。
【００９２】式ＩＩＩの化合物を下記の方法により合成
することができる。製造１ ５−アセチル−１−エチル−２−オキソ−２，３−ジヒ
ドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸（３−フェニ
ルカルバモイル−フェニル）−アミド
することができる。製造１ ５−アセチル−１−エチル−２−オキソ−２，３−ジヒ
ドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸（３−フェニ
ルカルバモイル−フェニル）−アミド
【化７】
【００９３】工程Ａ． １−エチル−５−（２−メチル
−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキソ−
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
（３−フェニルカルバモイル−フェニル）−アミド １−エチル−５−（２−メチル−［１，３］ジオキソラ
ン−２−イル）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ
−インドール−３−カルボン酸メチルエステル（３．６
ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）および３−アミノ−Ｎ−フェニ
ル−ベンズアミド（５．０ｇ、２４ｍｍｏｌ）を、活性
化４Åモレキュラーシーブを含有するソクスレー装置を
装備するフラスコ内のベンゼン（１６０ｍｌ）中で一緒
にした。この混合物を３０分間加熱還流させ、次いで冷
却し、０．１Ｎ ＨＣｌ（２×３０ｍｌ）、水およびブ
ラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空濃縮
すると、暗オレンジ色泡状物が得られ、これをフラッシ
ュクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール、２
０：１）により精製すると、わずかにオレンジ色の泡状
固体が得られた（３．７５ｇ、６６％）。
−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキソ−
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
（３−フェニルカルバモイル−フェニル）−アミド １−エチル−５−（２−メチル−［１，３］ジオキソラ
ン−２−イル）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ
−インドール−３−カルボン酸メチルエステル（３．６
ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）および３−アミノ−Ｎ−フェニ
ル−ベンズアミド（５．０ｇ、２４ｍｍｏｌ）を、活性
化４Åモレキュラーシーブを含有するソクスレー装置を
装備するフラスコ内のベンゼン（１６０ｍｌ）中で一緒
にした。この混合物を３０分間加熱還流させ、次いで冷
却し、０．１Ｎ ＨＣｌ（２×３０ｍｌ）、水およびブ
ラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空濃縮
すると、暗オレンジ色泡状物が得られ、これをフラッシ
ュクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール、２
０：１）により精製すると、わずかにオレンジ色の泡状
固体が得られた（３．７５ｇ、６６％）。
【００９４】工程Ｂ． ５−アセチル−１−エチル−２
−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−
カルボン酸（３−フェニルカルバモイル−フェニル）−
アミド ＴＨＦ（７０ｍｌ）中の１−エチル−５−（２−メチル
−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキソ−
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
（３−フェニルカルバモイル−フェニル）−アミド（製
造１、工程Ａの標題化合物、３．７５ｇ、７．８ｍｍｏ
ｌ）の溶液に、２Ｎ ＨＣｌ（２０ｍｌ）を添加した。
この混合物を室温において１時間撹拌し、次いで水（２
００ｍｌ）中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。抽出液を
水およびブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥
し、真空濃縮すると、オレンジ色泡状物が得られた。泡
状物を少量の酢酸エチル中に溶解し、ヘキサンで沈澱さ
せると、黄褐色固体が得られ、これを高真空下に乾燥し
た（融点１７３−１７５℃、２．５ｇ、７８％）。Ｃ 26
Ｈ23Ｎ3 Ｏ4 についての計算値：Ｃ７０．７４；Ｈ５．
２５；Ｎ９．５２；実測値：Ｃ７０．９１；Ｈ５．５
６；Ｎ９．２５。
−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−
カルボン酸（３−フェニルカルバモイル−フェニル）−
アミド ＴＨＦ（７０ｍｌ）中の１−エチル−５−（２−メチル
−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキソ−
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
（３−フェニルカルバモイル−フェニル）−アミド（製
造１、工程Ａの標題化合物、３．７５ｇ、７．８ｍｍｏ
ｌ）の溶液に、２Ｎ ＨＣｌ（２０ｍｌ）を添加した。
この混合物を室温において１時間撹拌し、次いで水（２
００ｍｌ）中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。抽出液を
水およびブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥
し、真空濃縮すると、オレンジ色泡状物が得られた。泡
状物を少量の酢酸エチル中に溶解し、ヘキサンで沈澱さ
せると、黄褐色固体が得られ、これを高真空下に乾燥し
た（融点１７３−１７５℃、２．５ｇ、７８％）。Ｃ 26
Ｈ23Ｎ3 Ｏ4 についての計算値：Ｃ７０．７４；Ｈ５．
２５；Ｎ９．５２；実測値：Ｃ７０．９１；Ｈ５．５
６；Ｎ９．２５。
【００９５】製造２〜１５ 適当な出発物質から製造１の方法に類似する方法におい
て、反応時間、温度、および試薬を記載するように変更
して、製造２〜１５を実施した。製造２
て、反応時間、温度、および試薬を記載するように変更
して、製造２〜１５を実施した。製造２
【００９６】
【化８】
【００９７】５−アセチル−１−エチル−２−オキソ−
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
（３−シクロヘキシルカルバモイル−フェニル）−アミ
ド 製造１におけるようにして、１−エチル−５−（２−メ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−シクロヘキ
シル−ベンズアミドから製造した。酢酸エチル中の粉砕
により精製した。融点１８０℃分解。製造３
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
（３−シクロヘキシルカルバモイル−フェニル）−アミ
ド 製造１におけるようにして、１−エチル−５−（２−メ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−シクロヘキ
シル−ベンズアミドから製造した。酢酸エチル中の粉砕
により精製した。融点１８０℃分解。製造３
【００９８】
【化９】
【００９９】５−アセチル−１−エチル−２−オキソ−
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
［３−（４−クロロ−フェニルカルバモイル）−フェニ
ル］−アミド 製造１におけるようにして、１−エチル−５−（２−メ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−（４−クロ
ロフェニル）−ベンズアミドから製造した。酢酸エチル
−ヘキサンから再結晶化させた。融点１１９−１２１
℃。製造４
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
［３−（４−クロロ−フェニルカルバモイル）−フェニ
ル］−アミド 製造１におけるようにして、１−エチル−５−（２−メ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−（４−クロ
ロフェニル）−ベンズアミドから製造した。酢酸エチル
−ヘキサンから再結晶化させた。融点１１９−１２１
℃。製造４
【０１００】
【化１０】
【０１０１】５−アセチル−１−エチル−２−オキソ−
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
（３−ｐ−トリルカルバモイル−フェニル）−アミド 製造１におけるようにして、１−エチル−５−（２−メ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−（ｐ−トリ
ル）−ベンズアミドから製造した。酢酸エチル／ヘキサ
ン中の粉砕により精製した。融点１６８℃分解。製造５
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
（３−ｐ−トリルカルバモイル−フェニル）−アミド 製造１におけるようにして、１−エチル−５−（２−メ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−（ｐ−トリ
ル）−ベンズアミドから製造した。酢酸エチル／ヘキサ
ン中の粉砕により精製した。融点１６８℃分解。製造５
【０１０２】
【化１１】
【０１０３】５−アセチル−１−エチル−２−オキソ−
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
［３−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−フェ
ニル］−アミド 製造１におけるようにして、１−エチル−５−（２−メ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−（４−フル
オロ−フェニル）−ベンズアミドから製造した。酢酸エ
チル−ヘキサン−ベンゼンから再結晶化させた。Ｃ26Ｈ
22ＦＮ3 Ｏ4 についての計算値：Ｃ６７．７９；Ｈ４．
８３；Ｎ９．１５；実測値：Ｃ６８．３４；Ｈ５．３
１；Ｎ８．８０。製造６
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
［３−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−フェ
ニル］−アミド 製造１におけるようにして、１−エチル−５−（２−メ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−（４−フル
オロ−フェニル）−ベンズアミドから製造した。酢酸エ
チル−ヘキサン−ベンゼンから再結晶化させた。Ｃ26Ｈ
22ＦＮ3 Ｏ4 についての計算値：Ｃ６７．７９；Ｈ４．
８３；Ｎ９．１５；実測値：Ｃ６８．３４；Ｈ５．３
１；Ｎ８．８０。製造６
【０１０４】
【化１２】
【０１０５】５−アセチル−１−エチル−２−オキソ−
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
［３−（４−エチル−フェニルカルバモイル）−フェニ
ル］−アミド 製造１におけるようにして、１−エチル−５−（２−メ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−（４−エチ
ル−フェニル）−ベンズアミドから製造した。クロマト
グラフィー（クロロホルム／メタノール、１０：１）に
より精製した。1 Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）δ１．
１５（ｍ、６Ｈ）、２．５（ｑ，２Ｈ）、３．８５
（ｑ，２Ｈ）、６．８５−８．３（ｍ，１１Ｈ）、１
０．０（ｓ，１Ｈ）、１１．１（ｓ，１Ｈ）。製造７
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
［３−（４−エチル−フェニルカルバモイル）−フェニ
ル］−アミド 製造１におけるようにして、１−エチル−５−（２−メ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−（４−エチ
ル−フェニル）−ベンズアミドから製造した。クロマト
グラフィー（クロロホルム／メタノール、１０：１）に
より精製した。1 Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）δ１．
１５（ｍ、６Ｈ）、２．５（ｑ，２Ｈ）、３．８５
（ｑ，２Ｈ）、６．８５−８．３（ｍ，１１Ｈ）、１
０．０（ｓ，１Ｈ）、１１．１（ｓ，１Ｈ）。製造７
【０１０６】
【化１３】
【０１０７】５−アセチル−１−エチル−２−オキソ−
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
［３−（３−フルオロ−フェニルカルバモイル）−フェ
ニル］−アミド 製造１におけるようにして、１−エチル−５−（２−メ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−（３−フル
オロ−フェニル）−ベンズアミドから製造した。1 Ｈ
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ１．２５（ｔ，３Ｈ）、２．６
（ｓ，３Ｈ）、３．８５（ｑ，２Ｈ）、４．４５（ｓ，
１Ｈ）、６．８５−８．０５（ｍ，１１Ｈ）、８．３
（ｓ，１Ｈ）、９．６５（ｓ，１Ｈ）。製造８
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
［３−（３−フルオロ−フェニルカルバモイル）−フェ
ニル］−アミド 製造１におけるようにして、１−エチル−５−（２−メ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−（３−フル
オロ−フェニル）−ベンズアミドから製造した。1 Ｈ
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ１．２５（ｔ，３Ｈ）、２．６
（ｓ，３Ｈ）、３．８５（ｑ，２Ｈ）、４．４５（ｓ，
１Ｈ）、６．８５−８．０５（ｍ，１１Ｈ）、８．３
（ｓ，１Ｈ）、９．６５（ｓ，１Ｈ）。製造８
【０１０８】
【化１４】
【０１０９】５−アセチル−１−エチル−２−オキソ−
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
［３−（４−ブロモ−フェニルカルバモイル）−フェニ
ル］−アミド 製造１におけるようにして、１−エチル−５−（２−メ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−（４−ブロ
モ−フェニル）−ベンズアミドから製造した、融点１１
７−１２０℃。製造９
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
［３−（４−ブロモ−フェニルカルバモイル）−フェニ
ル］−アミド 製造１におけるようにして、１−エチル−５−（２−メ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−（４−ブロ
モ−フェニル）−ベンズアミドから製造した、融点１１
７−１２０℃。製造９
【０１１０】
【化１５】
【０１１１】５−アセチル−１−エチル−２−オキソ−
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
［３−（４−ヨード−フェニルカルバモイル）−フェニ
ル］−アミド 製造１におけるようにして、１−エチル−５−（２−メ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−（４−ヨー
ド−フェニル）−ベンズアミドから製造した。融点２０
５−２１０℃。Ｃ26Ｈ22ＩＮ3 Ｏ4 についての計算値：
Ｃ５５．０４；Ｈ３．９１；Ｎ７．４１；実測値：Ｃ５
５．１３；Ｈ４．０４；Ｎ７．１２。製造１０
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
［３−（４−ヨード−フェニルカルバモイル）−フェニ
ル］−アミド 製造１におけるようにして、１−エチル−５−（２−メ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−（４−ヨー
ド−フェニル）−ベンズアミドから製造した。融点２０
５−２１０℃。Ｃ26Ｈ22ＩＮ3 Ｏ4 についての計算値：
Ｃ５５．０４；Ｈ３．９１；Ｎ７．４１；実測値：Ｃ５
５．１３；Ｈ４．０４；Ｎ７．１２。製造１０
【０１１２】
【化１６】
【０１１３】５−ベンゾイル−１−エチル−２−オキソ
−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン
酸（３−フェニルカルバモイル−フェニル）−アミド 製造１、Ａにおけるようにして、５−ベンゾイル−１−
エチル−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インド
ール−３−カルボン酸エチルエステル（米国特許第4,68
6,224 号）および３−アミノ−Ｎ−フェニル−ベンズア
ミドから製造した。酢酸エチル／ヘキサン中の粉砕によ
り精製した。融点１２９−１３５℃。製造１１
−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン
酸（３−フェニルカルバモイル−フェニル）−アミド 製造１、Ａにおけるようにして、５−ベンゾイル−１−
エチル−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インド
ール−３−カルボン酸エチルエステル（米国特許第4,68
6,224 号）および３−アミノ−Ｎ−フェニル−ベンズア
ミドから製造した。酢酸エチル／ヘキサン中の粉砕によ
り精製した。融点１２９−１３５℃。製造１１
【０１１４】
【化１７】
【０１１５】５−ベンゾイル−１−エチル−２−オキソ
−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン
酸［３−（４−ブロモ−フェニルカルバモイル）−フェ
ニル］−アミド 製造１、Ａにおけるようにして、５−ベンゾイル−１−
エチル−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インド
ール−３−カルボン酸エチルエステル（米国特許第4,68
6,224 号）および３−アミノ−Ｎ−（４−ブロモ−フェ
ニル）−ベンズアミドから製造した。フラッシュクロマ
トグラフィー（ヘキサン／アセトン、１：１）により精
製した。融点１３９−１４２℃。製造１２
−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン
酸［３−（４−ブロモ−フェニルカルバモイル）−フェ
ニル］−アミド 製造１、Ａにおけるようにして、５−ベンゾイル−１−
エチル−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インド
ール−３−カルボン酸エチルエステル（米国特許第4,68
6,224 号）および３−アミノ−Ｎ−（４−ブロモ−フェ
ニル）−ベンズアミドから製造した。フラッシュクロマ
トグラフィー（ヘキサン／アセトン、１：１）により精
製した。融点１３９−１４２℃。製造１２
【０１１６】
【化１８】
【０１１７】５−アセチル−１−メチル−２−オキソ−
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
（３−フェニルカルバモイル−フェニル）−アミド 製造１におけるようにして、１−メチル−５−（２−メ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−フェニル−
ベンズアミドから製造した。ヘキサン／酢酸エチル中の
粉砕により精製した。融点１７８−１７９℃。Ｃ25Ｈ21
Ｎ3 Ｏ4 についての計算値：Ｃ７０．２５；Ｈ４．９
５；Ｎ９．８３；実測値：Ｃ６９．８９；Ｈ４．７９；
Ｎ９．６９。製造１３
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
（３−フェニルカルバモイル−フェニル）−アミド 製造１におけるようにして、１−メチル−５−（２−メ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−フェニル−
ベンズアミドから製造した。ヘキサン／酢酸エチル中の
粉砕により精製した。融点１７８−１７９℃。Ｃ25Ｈ21
Ｎ3 Ｏ4 についての計算値：Ｃ７０．２５；Ｈ４．９
５；Ｎ９．８３；実測値：Ｃ６９．８９；Ｈ４．７９；
Ｎ９．６９。製造１３
【０１１８】
【化１９】
【０１１９】５−アセチル−１−メチル−２−オキソ−
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
［３−（４−ブロモ−フェニルカルバモイル−フェニ
ル］−アミド 製造１におけるようにして、１−メチル−５−（２−メ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−（４−ブロ
モ−フェニル）−ベンズアミドから製造した。フラッシ
ュクロマトグラフィー（ヘキサン／アセトン、１：１）
により精製した。融点２３４−２３６℃。Ｃ25Ｈ20Ｂｒ
Ｎ3 Ｏ4についての計算値：Ｃ５９．３０；Ｈ３．９
８；Ｎ８．３０；実測値：Ｃ５９．１２；Ｈ４．１５；
Ｎ８．０８。製造１４
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
［３−（４−ブロモ−フェニルカルバモイル−フェニ
ル］−アミド 製造１におけるようにして、１−メチル−５−（２−メ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−（４−ブロ
モ−フェニル）−ベンズアミドから製造した。フラッシ
ュクロマトグラフィー（ヘキサン／アセトン、１：１）
により精製した。融点２３４−２３６℃。Ｃ25Ｈ20Ｂｒ
Ｎ3 Ｏ4についての計算値：Ｃ５９．３０；Ｈ３．９
８；Ｎ８．３０；実測値：Ｃ５９．１２；Ｈ４．１５；
Ｎ８．０８。製造１４
【０１２０】
【化２０】
【０１２１】１−エチル−２−オキソ−５−プロピオニ
ル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸（３−フェニルカルバモイル−フェニル）−アミド 製造１におけるようにして、１−エチル−５−（２−エ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−フェニル−
ベンズアミドから製造した。フラッシュ−クロマトグラ
フィー（クロロフォルム／メタノール、２０：１）次い
で、ヘキサン／酢酸エチル中の粉砕により精製した。融
点１７９−１８０℃。Ｃ27Ｈ25Ｎ3 Ｏ4 についての計算
値：Ｃ７１．１９；Ｈ５．５３；Ｎ９．２２；実測値：
Ｃ７０．７９；Ｈ５．７３；Ｎ８．７９。製造１５
ル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸（３−フェニルカルバモイル−フェニル）−アミド 製造１におけるようにして、１−エチル−５−（２−エ
チル−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボ
ン酸メチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−フェニル−
ベンズアミドから製造した。フラッシュ−クロマトグラ
フィー（クロロフォルム／メタノール、２０：１）次い
で、ヘキサン／酢酸エチル中の粉砕により精製した。融
点１７９−１８０℃。Ｃ27Ｈ25Ｎ3 Ｏ4 についての計算
値：Ｃ７１．１９；Ｈ５．５３；Ｎ９．２２；実測値：
Ｃ７０．７９；Ｈ５．７３；Ｎ８．７９。製造１５
【０１２２】
【化２１】
【０１２３】５−シクロペンタンカルボニル−１−エチ
ル−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール
−３−カルボン酸（３−フェニルカルバモイル−フェニ
ル）−アミド 製造１におけるようにして、５−（２−シクロペンチル
−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−１−エチル−
２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３
−カルボン酸エチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−フ
ェニル−ベンズアミドから製造した。フラッシュクロマ
トグラフィー（ヘキサン／アセトン、１：１）次いで酢
酸エチル中の粉砕により精製した。融点２０８−２１３
℃。製造１６
ル−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール
−３−カルボン酸（３−フェニルカルバモイル−フェニ
ル）−アミド 製造１におけるようにして、５−（２−シクロペンチル
−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−１−エチル−
２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３
−カルボン酸エチルエステルおよび３−アミノ−Ｎ−フ
ェニル−ベンズアミドから製造した。フラッシュクロマ
トグラフィー（ヘキサン／アセトン、１：１）次いで酢
酸エチル中の粉砕により精製した。融点２０８−２１３
℃。製造１６
【０１２４】
【化２２】
【０１２５】５−アセチル−２−オキソ−１−（２，
２，２−トリフルオロ−エチル）−２，３−ジヒドロ−
１Ｈ−インドール−３−カルボン酸（３−フェニルカル
バモイル−フェニル）−アミド 水素化ナトリウム（０．１３ｇの６０％懸濁液、３．３
ｍｍｏｌ）をＨＭＰＡ（６ｍｌ）中の５−（２−メチル
−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−１−（２，
２，２−トリフルオロ−エチル）−１，３−ジヒドロ−
インドール−２−オン（０．５ｇ、１．６６ｍｍｏｌ）
の溶液に添加し、１０分後、３−（３，３−ジフェニル
−ウレイド）−Ｎ−フェニル−ベンズアミド（０．７４
ｇ、１．８ｍｍｏｌ）を添加した。
２，２−トリフルオロ−エチル）−２，３−ジヒドロ−
１Ｈ−インドール−３−カルボン酸（３−フェニルカル
バモイル−フェニル）−アミド 水素化ナトリウム（０．１３ｇの６０％懸濁液、３．３
ｍｍｏｌ）をＨＭＰＡ（６ｍｌ）中の５−（２−メチル
−［１，３］ジオキソラン−２−イル）−１−（２，
２，２−トリフルオロ−エチル）−１，３−ジヒドロ−
インドール−２−オン（０．５ｇ、１．６６ｍｍｏｌ）
の溶液に添加し、１０分後、３−（３，３−ジフェニル
−ウレイド）−Ｎ−フェニル−ベンズアミド（０．７４
ｇ、１．８ｍｍｏｌ）を添加した。
【０１２６】反応混合物を３日間撹拌し、１Ｎ ＨＣｌ
で酸性化し、水中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。一緒
にした抽出液を水およびブラインで洗浄し、硫酸マグネ
シウムで乾燥し、真空濃縮すると、暗色の泡状物が得ら
れた。酢酸エチル／ヘキサン中で粉砕すると、標題化合
物が無色固体としてが得られた（１２４ｍｇ、１５％、
融点１９７−２０３℃）。Ｃ26Ｈ20Ｆ3 Ｎ3 Ｏ4 につい
ての計算値：Ｃ６３．０３；Ｈ４．０７；Ｎ８．４８；
実測値：Ｃ６２．８３；Ｈ４．３２；Ｎ８．４７。製造１７
で酸性化し、水中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。一緒
にした抽出液を水およびブラインで洗浄し、硫酸マグネ
シウムで乾燥し、真空濃縮すると、暗色の泡状物が得ら
れた。酢酸エチル／ヘキサン中で粉砕すると、標題化合
物が無色固体としてが得られた（１２４ｍｇ、１５％、
融点１９７−２０３℃）。Ｃ26Ｈ20Ｆ3 Ｎ3 Ｏ4 につい
ての計算値：Ｃ６３．０３；Ｈ４．０７；Ｎ８．４８；
実測値：Ｃ６２．８３；Ｈ４．３２；Ｎ８．４７。製造１７
【０１２７】
【化２３】
【０１２８】１−エチル−５−（２−メチル−［１，
３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキソ−２，３−
ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸メチルエ
ステル 還流冷却器を装備する３首フラス中のメタノール（１１
０ｍｌ）に、氷浴で温度を冷却しながら、ナトリウム
（２．６８ｇ、１１２ｍｍｏｌ）を添加した。溶解後、
ジメチルカーボネート（９．４ｍｌ、１１２ｍｍｏｌ）
を添加し、次いで１−エチル−５−（２−メチル−
［１，３］ジオキソラン−２−イル）−１，３−ジヒド
ロ−インドール−２−オン（米国特許第4,686,224 号、
９．２ｇ、３７ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を７
０時間加熱還流させ、次いで冷却し、約２５ｍｌに濃縮
し、水で希釈し、酢酸でｐＨ７に酸性化し、酢酸エチル
で２回抽出した。一緒にした抽出液をブラインで洗浄
し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空濃縮すると、油状
固体が得られ、これをイソプロピルエーテル中の粉砕
し、収集し、乾燥した（７．９ｇ、７０％）。
３］ジオキソラン−２−イル）−２−オキソ−２，３−
ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸メチルエ
ステル 還流冷却器を装備する３首フラス中のメタノール（１１
０ｍｌ）に、氷浴で温度を冷却しながら、ナトリウム
（２．６８ｇ、１１２ｍｍｏｌ）を添加した。溶解後、
ジメチルカーボネート（９．４ｍｌ、１１２ｍｍｏｌ）
を添加し、次いで１−エチル−５−（２−メチル−
［１，３］ジオキソラン−２−イル）−１，３−ジヒド
ロ−インドール−２−オン（米国特許第4,686,224 号、
９．２ｇ、３７ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を７
０時間加熱還流させ、次いで冷却し、約２５ｍｌに濃縮
し、水で希釈し、酢酸でｐＨ７に酸性化し、酢酸エチル
で２回抽出した。一緒にした抽出液をブラインで洗浄
し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空濃縮すると、油状
固体が得られ、これをイソプロピルエーテル中の粉砕
し、収集し、乾燥した（７．９ｇ、７０％）。
【０１２９】製造１８〜２０ 適当な出発物質から製造１の方法に類似する方法によ
り、製造１８〜２０の化合物を製造した。製造１８ １−メチル−５−（２−メチル−［１，３］ジオキソラ
ン−２−イル）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ
−インドール−３−カルボン酸メチルエステル １−メチ
ル−５−（２−メチル−［１，３］ジオキソラン−２−
イル）−２，３−ジヒドロ−インドール−２−オン（こ
れは米国特許第4,686,224 号に記載されているように製
造した）から製造した。
り、製造１８〜２０の化合物を製造した。製造１８ １−メチル−５−（２−メチル−［１，３］ジオキソラ
ン−２−イル）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ
−インドール−３−カルボン酸メチルエステル １−メチ
ル−５−（２−メチル−［１，３］ジオキソラン−２−
イル）−２，３−ジヒドロ−インドール−２−オン（こ
れは米国特許第4,686,224 号に記載されているように製
造した）から製造した。
【０１３０】製造１９ １−エチル−５−（２−エチル−［１，３］ジオキソラ
ン−２−イル）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ
−インドール−３−カルボン酸メチルエステル １−エチル−５−（２−エチル−［１，３］ジオキソラ
ン−２−イル）−２，３−ジヒドロ−インドール−２−
オン（製造３８の標題化合物）から製造した。製造２０ （２−シクロペンチル−［１，３］ジオキソラン−２−
イル）−１−エチル−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−
１Ｈ−インドール−３−カルボン酸エチルエステル （２−シクロペンチル−［１，３］ジオキソラン−２−
イル）−１−エチル−２，３−ジヒドロ−インドール−
２−オン（製造４０の標題化合物）から製造した。製造２１
ン−２−イル）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ
−インドール−３−カルボン酸メチルエステル １−エチル−５−（２−エチル−［１，３］ジオキソラ
ン−２−イル）−２，３−ジヒドロ−インドール−２−
オン（製造３８の標題化合物）から製造した。製造２０ （２−シクロペンチル−［１，３］ジオキソラン−２−
イル）−１−エチル−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−
１Ｈ−インドール−３−カルボン酸エチルエステル （２−シクロペンチル−［１，３］ジオキソラン−２−
イル）−１−エチル−２，３−ジヒドロ−インドール−
２−オン（製造４０の標題化合物）から製造した。製造２１
【０１３１】
【化２４】
【０１３２】３−ニトロ−Ｎ−フェニル−ベンズアミド ジクロロメタン（１００ｍｌ）中のアニリン（１７ｇ、
１８０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２７ｍｌ、
１９０ｍｍｏｌ）の冷却した（０℃）に、ジクロロメタ
ン（６０ｍｌ）中の塩化３−ニトロベンゾイル（３０
ｇ，１６０ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。この混合物を
０℃において１５分間撹拌し、次いで室温において一夜
撹拌した。次いでそれを飽和重炭酸ナトリウム溶液（１
Ｌ）中に注ぎ、１５分間激しく撹拌した。沈澱を収集
し、水で洗浄し、乾燥した（４０ｇ、１００％）。製造２２
１８０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２７ｍｌ、
１９０ｍｍｏｌ）の冷却した（０℃）に、ジクロロメタ
ン（６０ｍｌ）中の塩化３−ニトロベンゾイル（３０
ｇ，１６０ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。この混合物を
０℃において１５分間撹拌し、次いで室温において一夜
撹拌した。次いでそれを飽和重炭酸ナトリウム溶液（１
Ｌ）中に注ぎ、１５分間激しく撹拌した。沈澱を収集
し、水で洗浄し、乾燥した（４０ｇ、１００％）。製造２２
【０１３３】
【化２５】
【０１３４】３−アミノ−Ｎ−フェニル−ベンズアミド １０％炭素担持パラジウム（２．０ｇ）をエタノール
（２２５ｍｌ）中の３−ニトロ−Ｎ−フェニル−ベンズ
アミド（２０ｇ、８３ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、この
混合物を４５ｐｓｉにおいて２時間水素化した。この混
合物を珪藻土を通して濾過し、濃縮すると、無色固体が
得られた（融点１１８−１２０℃、１６ｇ、９０％）。
（２２５ｍｌ）中の３−ニトロ−Ｎ−フェニル−ベンズ
アミド（２０ｇ、８３ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、この
混合物を４５ｐｓｉにおいて２時間水素化した。この混
合物を珪藻土を通して濾過し、濃縮すると、無色固体が
得られた（融点１１８−１２０℃、１６ｇ、９０％）。
【０１３５】製造２３〜３１ 適当な商業的に入手可能出発物質から、順次に実施され
た製造２１および２２の方法に類似する方法により、製
造２３〜３１を行った。製造２３ ３−アミノ−Ｎ−シクロヘキシル−ベンズアミド。製造２４ ３−アミノ−Ｎ−（４−クロロ−フェニル）−ベンズア
ミド。製造２５ ３−アミノ−Ｎ−（ｐ−トリル）−ベンズアミド。製造２６ ３−アミノ−Ｎ−（４−フルオロ−フェニル）−ベンズ
アミド。
た製造２１および２２の方法に類似する方法により、製
造２３〜３１を行った。製造２３ ３−アミノ−Ｎ−シクロヘキシル−ベンズアミド。製造２４ ３−アミノ−Ｎ−（４−クロロ−フェニル）−ベンズア
ミド。製造２５ ３−アミノ−Ｎ−（ｐ−トリル）−ベンズアミド。製造２６ ３−アミノ−Ｎ−（４−フルオロ−フェニル）−ベンズ
アミド。
【０１３６】製造２７ ３−アミノ−Ｎ−（４−エチル−フェニル）−ベンズア
ミド。製造２８ ３−アミノ−Ｎ−（３−フルオロ−フェニル）−ベンズ
アミド。製造２９ ３−アミノ−Ｎ−（４−ブロモ−フェニル）−ベンズア
ミド。製造３０ ３−アミノ−Ｎ−（４−ヨード−フェニル）−ベンズア
ミド。製造３１ ３−アミノ−Ｎ−（３−メチル−フェニル）−ベンズア
ミド。製造３２
ミド。製造２８ ３−アミノ−Ｎ−（３−フルオロ−フェニル）−ベンズ
アミド。製造２９ ３−アミノ−Ｎ−（４−ブロモ−フェニル）−ベンズア
ミド。製造３０ ３−アミノ−Ｎ−（４−ヨード−フェニル）−ベンズア
ミド。製造３１ ３−アミノ−Ｎ−（３−メチル−フェニル）−ベンズア
ミド。製造３２
【０１３７】
【化２６】
【０１３８】（２，２，２−トリフルオロ−エチル）−
１Ｈ−インドール−２，３−ジオン 水素化ナトリウム（８．６５ｇの６０％油懸濁液、０．
２２ｍｏｌ）をヘキサンで洗浄し、ヘキサメチルホスホ
ルアミド（２００ｍｌ）の中に懸濁させた。イサチン
（２９．４ｇ、０．２０ｍｏｌ）を注意して添加した。
気体の発生がおさまった後、ヨウ化２，２，２−トリフ
ルオロエチル（４６．２ｇ、０．２２ｍｏｌ）を添加
し、この混合物をを５５℃で４時間加熱した。この溶液
を冷却し、水（１Ｌ）で希釈し、沈澱を収集した。濾液
を６Ｎ ＨＣｌで酸性化し、新しい沈澱が形成し、収集
した。一緒にした固体を９５％エタノールから再結晶化
させた。収量２２．５ｇ（４９％）、融点１６１−１６
３℃。製造３３
１Ｈ−インドール−２，３−ジオン 水素化ナトリウム（８．６５ｇの６０％油懸濁液、０．
２２ｍｏｌ）をヘキサンで洗浄し、ヘキサメチルホスホ
ルアミド（２００ｍｌ）の中に懸濁させた。イサチン
（２９．４ｇ、０．２０ｍｏｌ）を注意して添加した。
気体の発生がおさまった後、ヨウ化２，２，２−トリフ
ルオロエチル（４６．２ｇ、０．２２ｍｏｌ）を添加
し、この混合物をを５５℃で４時間加熱した。この溶液
を冷却し、水（１Ｌ）で希釈し、沈澱を収集した。濾液
を６Ｎ ＨＣｌで酸性化し、新しい沈澱が形成し、収集
した。一緒にした固体を９５％エタノールから再結晶化
させた。収量２２．５ｇ（４９％）、融点１６１−１６
３℃。製造３３
【０１３９】
【化２７】
【０１４０】（２，２，２−トリフルオロ−エチル）−
１，３−ジヒドロ−インドル−２−オン 酢酸（１００ｍｌ）および７０％過塩素酸（６．４ｍ
ｌ、８０ｍｍｏｌ）中の１−（２，２，２−トリフルオ
ロ−エチル）−１Ｈ−インドール−２，３−ジオン
（９．２ｇ、４０ｍｍｏｌ）と１０％炭素担持パラジウ
ム（２．４ｇ）との混合物を、パール（Ｐａｒｒ）装置
中で２２時間水素化した。この混合物を珪藻土を通して
濾過し、水（１．５Ｌ）で希釈し、沈澱を収集し、乾燥
した。融点１５５−１６２℃。収量７．５ｇ（８７
％）。製造３４
１，３−ジヒドロ−インドル−２−オン 酢酸（１００ｍｌ）および７０％過塩素酸（６．４ｍ
ｌ、８０ｍｍｏｌ）中の１−（２，２，２−トリフルオ
ロ−エチル）−１Ｈ−インドール−２，３−ジオン
（９．２ｇ、４０ｍｍｏｌ）と１０％炭素担持パラジウ
ム（２．４ｇ）との混合物を、パール（Ｐａｒｒ）装置
中で２２時間水素化した。この混合物を珪藻土を通して
濾過し、水（１．５Ｌ）で希釈し、沈澱を収集し、乾燥
した。融点１５５−１６２℃。収量７．５ｇ（８７
％）。製造３４
【０１４１】
【化２８】
【０１４２】５−アセチル−（２，２，２−トリフルオ
ロ−エチル）−１，３−ジヒドロ−インドル−２−オン 二硫化炭素（４０ｍｌ）中の１−（２，２，２−トリフ
ルオロ−エチル）−１，３−ジヒドロ−インドル−２−
オン（２．０ｇ、９．３ｍｍｏｌ）および塩化アセチル
（０．８６ｍｌ、１２ｍｍｏｌ）の溶液に、三塩化アル
ミニウム（７．４ｇ、５６ｍｍｏｌ）を少しずつ添加し
た。この混合物を３時間加熱還流させ、次いで冷却し
た。固体を濾過し、水で洗浄し、乾燥し、アセトン／ヘ
キサンから再結晶化させると、薄ピンク色の固体が得ら
れた。融点１７０−１７１℃。収量１．２３ｇ（５１
％）。製造３５
ロ−エチル）−１，３−ジヒドロ−インドル−２−オン 二硫化炭素（４０ｍｌ）中の１−（２，２，２−トリフ
ルオロ−エチル）−１，３−ジヒドロ−インドル−２−
オン（２．０ｇ、９．３ｍｍｏｌ）および塩化アセチル
（０．８６ｍｌ、１２ｍｍｏｌ）の溶液に、三塩化アル
ミニウム（７．４ｇ、５６ｍｍｏｌ）を少しずつ添加し
た。この混合物を３時間加熱還流させ、次いで冷却し
た。固体を濾過し、水で洗浄し、乾燥し、アセトン／ヘ
キサンから再結晶化させると、薄ピンク色の固体が得ら
れた。融点１７０−１７１℃。収量１．２３ｇ（５１
％）。製造３５
【０１４３】
【化２９】
【０１４４】（２−メチル−［１，３］ジオキソラン−
２−イル）−１−（２，２，２−トリフルオロ−エチ
ル）−１，３−ジヒドロ−インドル−２−オン ベンゼン（２５ｍｌ）中の５−アセチル−（２，２，２
−トリフルオロ−エチル）−１，３−ジヒドロ−インド
ル−２−オン（１．０４ｇ、４．０ｍｍｏｌ）、エチレ
ングリコール（１．３７ｍｌ、２４ｍｍｏｌ）およびｐ
−トルエンスルホン酸（１０ｍｇ）の溶液を、ディーン
−スタークトラップを装備したフラスコ中で４時間加熱
還流させ、飽和重炭酸ナトリウム溶液、水およびブライ
ンで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空濃縮する
と、油状物が得られ、これは静置したとき固化した
（１．１９ｇ、９８％、融点８７−８９℃）。製造３６
２−イル）−１−（２，２，２−トリフルオロ−エチ
ル）−１，３−ジヒドロ−インドル−２−オン ベンゼン（２５ｍｌ）中の５−アセチル−（２，２，２
−トリフルオロ−エチル）−１，３−ジヒドロ−インド
ル−２−オン（１．０４ｇ、４．０ｍｍｏｌ）、エチレ
ングリコール（１．３７ｍｌ、２４ｍｍｏｌ）およびｐ
−トルエンスルホン酸（１０ｍｇ）の溶液を、ディーン
−スタークトラップを装備したフラスコ中で４時間加熱
還流させ、飽和重炭酸ナトリウム溶液、水およびブライ
ンで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空濃縮する
と、油状物が得られ、これは静置したとき固化した
（１．１９ｇ、９８％、融点８７−８９℃）。製造３６
【０１４５】
【化３０】
【０１４６】（３，３−ジフェニル−ウレイド）−Ｎ−
フェニル−ベンズアミド エタノール（１０ｍｌ）中の３−アミノ−Ｎ−フェニル
−ベンズアミド（２．０ｇ、９．４ｍｍｏｌ）、塩化ジ
フェニルカルバモイル（２．２ｇ、９．４ｍｍｏｌ）お
よびトリエチルアミン（２．６ｍｌ、１９ｍｍｏｌ）の
混合物を４．５時間加熱還流させた。この混合物を冷却
し、濃縮し、水を添加し、このスラリーを１Ｎ ＨＣｌ
で酸性化し、固体を集め、水で洗浄し、乾燥し、アセト
ン／ヘキサンから再結晶化させると、無色の固体が得ら
れた（１．６３ｇ、４２％）。製造３７ １−エチル−５−プロピオニル−２，３−ジヒドロ−イ
ンドル−２−オン 製造３４に記載する方法に類似する方法により、容易に
入手可能な出発物質（Ｎ−エチルオキシインドールおよ
び塩化プロピオニル）から製造した。
フェニル−ベンズアミド エタノール（１０ｍｌ）中の３−アミノ−Ｎ−フェニル
−ベンズアミド（２．０ｇ、９．４ｍｍｏｌ）、塩化ジ
フェニルカルバモイル（２．２ｇ、９．４ｍｍｏｌ）お
よびトリエチルアミン（２．６ｍｌ、１９ｍｍｏｌ）の
混合物を４．５時間加熱還流させた。この混合物を冷却
し、濃縮し、水を添加し、このスラリーを１Ｎ ＨＣｌ
で酸性化し、固体を集め、水で洗浄し、乾燥し、アセト
ン／ヘキサンから再結晶化させると、無色の固体が得ら
れた（１．６３ｇ、４２％）。製造３７ １−エチル−５−プロピオニル−２，３−ジヒドロ−イ
ンドル−２−オン 製造３４に記載する方法に類似する方法により、容易に
入手可能な出発物質（Ｎ−エチルオキシインドールおよ
び塩化プロピオニル）から製造した。
【０１４７】製造３８ １−エチル−５−（２−エチル−［１，３］ジオキソラ
ン−２−イル）−２，３−ジヒドロ−インドル−２−オ
ン 製造１９に記載する方法に類似する方法により、製造３
５の標題化合物から製造した。
製造３９ （５−シクロペンタンカルボニル−１−エチル−２，３
−ジヒドロ−インドル−２−オン 製造３４に記載する方法に類似する方法により、容易に
入手可能な出発物質（Ｎ−エチルオキシインドールおよ
び塩化シクロペンタンカルボニル）から製造した。製造４０ （２−シクロペンチル−［１，３］ジオキソラン−２−
イル）−１−エチル−２，３−ジヒドロ−インドル−２
−オン 製造３５に記載する方法に類似する方法により、製造３
９の標題化合物から製造した。
ン−２−イル）−２，３−ジヒドロ−インドル−２−オ
ン 製造１９に記載する方法に類似する方法により、製造３
５の標題化合物から製造した。
製造３９ （５−シクロペンタンカルボニル−１−エチル−２，３
−ジヒドロ−インドル−２−オン 製造３４に記載する方法に類似する方法により、容易に
入手可能な出発物質（Ｎ−エチルオキシインドールおよ
び塩化シクロペンタンカルボニル）から製造した。製造４０ （２−シクロペンチル−［１，３］ジオキソラン−２−
イル）−１−エチル−２，３−ジヒドロ−インドル−２
−オン 製造３５に記載する方法に類似する方法により、製造３
９の標題化合物から製造した。
【０１４８】一般的実験手順 ＮＭＲスペクトルをBruker AM-300 分光光度計により約
２２℃において記録した。化学シフトをテトラメチルシ
ランからのダウンフィールドでｐｐｍで表す。サーモス
プレー（thermospray) MS (TSPMS）は、アンモニアのイ
オン化を使用してFisons Trio-1000分光光度計により得
られた。化学的イオン化質量スペクトル（PBMS）は、He
wlett-Packard 5989計装（アンモニアのイオン化）で得
られた。シリカゲルのクロマトグラフィーは、３０μ
Ｍ、６０Åの孔大きさのシリカまたは同等物を使用して
ガラスのカラム中で低い窒素圧下に実施した。カラムを
湿式充填し、特定した溶媒または溶媒混合物の適当な組
成物または極性溶媒が増加する勾配で、カラムから目標
物質が溶離されるまで、溶離した。
２２℃において記録した。化学シフトをテトラメチルシ
ランからのダウンフィールドでｐｐｍで表す。サーモス
プレー（thermospray) MS (TSPMS）は、アンモニアのイ
オン化を使用してFisons Trio-1000分光光度計により得
られた。化学的イオン化質量スペクトル（PBMS）は、He
wlett-Packard 5989計装（アンモニアのイオン化）で得
られた。シリカゲルのクロマトグラフィーは、３０μ
Ｍ、６０Åの孔大きさのシリカまたは同等物を使用して
ガラスのカラム中で低い窒素圧下に実施した。カラムを
湿式充填し、特定した溶媒または溶媒混合物の適当な組
成物または極性溶媒が増加する勾配で、カラムから目標
物質が溶離されるまで、溶離した。
【０１４９】製造４１ アゼチジン−３−カルボン酸メチルエステル塩酸塩 メタノール（１０ｍｌ）中のアゼチジン−３−カルボン
酸（１．２６ｇ）およびクロロトリメチルシラン（７．
１ｍｌ）の混合物を５時間加熱還流させ、濃縮すると、
固体が得られた（１．８８ｇ、１００％）。1 Ｈ ＮＭ
Ｒ（３００ｍＨｚ、Ｄ2 Ｏ）δ４．３１（ｍ、４Ｈ）、
３．８１（ｍ、１Ｈ）、３．７８（ｓ、３Ｈ）。
酸（１．２６ｇ）およびクロロトリメチルシラン（７．
１ｍｌ）の混合物を５時間加熱還流させ、濃縮すると、
固体が得られた（１．８８ｇ、１００％）。1 Ｈ ＮＭ
Ｒ（３００ｍＨｚ、Ｄ2 Ｏ）δ４．３１（ｍ、４Ｈ）、
３．８１（ｍ、１Ｈ）、３．７８（ｓ、３Ｈ）。
【０１５０】製造４２ （Ｓ）−１−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミ
ン−３−フェニル−プロピオニル）−アゼチジン−３−
カルボン酸メチルエステル １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカル
ボジイミド塩酸塩（２．２６ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）
を、ジクロロメタン（２５ｍｌ）中のアゼチジン−３−
カルボン酸メチルエステル塩酸塩（１．７９ｇ、１１．
８ｍｍｏｌ）、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−フェ
ニルアラニン（３．１３ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）、トリ
エチルアミン（１．２０ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）および
１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（２．７２
ｇ、１７．７ｍｍｏｌ）の混合物に０℃において添加
し、この混合物を数時間かけて２０℃加温し、室温にお
いて７２時間撹拌した。
ン−３−フェニル−プロピオニル）−アゼチジン−３−
カルボン酸メチルエステル １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカル
ボジイミド塩酸塩（２．２６ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）
を、ジクロロメタン（２５ｍｌ）中のアゼチジン−３−
カルボン酸メチルエステル塩酸塩（１．７９ｇ、１１．
８ｍｍｏｌ）、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−フェ
ニルアラニン（３．１３ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）、トリ
エチルアミン（１．２０ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）および
１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（２．７２
ｇ、１７．７ｍｍｏｌ）の混合物に０℃において添加
し、この混合物を数時間かけて２０℃加温し、室温にお
いて７２時間撹拌した。
【０１５１】この混合物を酢酸エチルで希釈し、生ずる
混合物を１ＮａＯＨで３回洗浄し、１Ｎ ＨＣｌで３回
洗浄し、水性ＮａＨＣＯ3 で１回洗浄し、乾燥し、濃縮
すると、２．８ｇの標題化合物が得られた。1 Ｈ ＮＭ
Ｒ（３００ｍＨｚ、ＣＤＣｌ 3 ）δ７．３５−７．２
（ｍ，５Ｈ）、５．３０（ｍ，１Ｈ）、４．３５−３．
９５（ｍ，４Ｈ）、３．７１（ｓ，３Ｈ）、３．３−
３．１５（ｍ，１Ｈ）、３．１−２．８（ｍ，３Ｈ）、
１．４９（ｓ，４．５Ｈ）。ＰＢＭＳ３６３（ＭＨ+
）。
混合物を１ＮａＯＨで３回洗浄し、１Ｎ ＨＣｌで３回
洗浄し、水性ＮａＨＣＯ3 で１回洗浄し、乾燥し、濃縮
すると、２．８ｇの標題化合物が得られた。1 Ｈ ＮＭ
Ｒ（３００ｍＨｚ、ＣＤＣｌ 3 ）δ７．３５−７．２
（ｍ，５Ｈ）、５．３０（ｍ，１Ｈ）、４．３５−３．
９５（ｍ，４Ｈ）、３．７１（ｓ，３Ｈ）、３．３−
３．１５（ｍ，１Ｈ）、３．１−２．８（ｍ，３Ｈ）、
１．４９（ｓ，４．５Ｈ）。ＰＢＭＳ３６３（ＭＨ+
）。
【０１５２】製造４３ （Ｓ）−１−（２−アミノ−３−フェニル−プロピオニ
ル）−アゼチジン−３−カルボン酸メチルエステル塩酸
塩 （Ｓ）−１−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミ
ノ−３−フェニル−プロピオニル）−アゼチジン−３−
カルボン酸メチルエステル（２．７４ｇ、７．６ｍｍｏ
ｌ）を、４ＭのＨＣｌ−ジオキサン（２８ｍｌ）中に０
℃において溶解した。生ずる混合物を２５℃において１
時間撹拌し、濃縮し、残留物をエーテル下に粉砕し、濾
過した。無色の固体を収集し、乾燥した（２．１７ｇ、
９６％）。
ル）−アゼチジン−３−カルボン酸メチルエステル塩酸
塩 （Ｓ）−１−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミ
ノ−３−フェニル−プロピオニル）−アゼチジン−３−
カルボン酸メチルエステル（２．７４ｇ、７．６ｍｍｏ
ｌ）を、４ＭのＨＣｌ−ジオキサン（２８ｍｌ）中に０
℃において溶解した。生ずる混合物を２５℃において１
時間撹拌し、濃縮し、残留物をエーテル下に粉砕し、濾
過した。無色の固体を収集し、乾燥した（２．１７ｇ、
９６％）。
【０１５３】製造４４ （Ｓ）−１−｛２−［（５−クロロ−１Ｈ−インドール
−２−カルボニル）−アミノ］−３−フェニル−プロピ
オニル｝−アゼチジン−３−カルボン酸メチルエステル １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカル
ボジイミド塩酸塩（１．１５ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を、
ジクロロメタン（１８ｍｌ）中の（Ｓ）−１−（２−ア
ミノ−３−フェニル−プロピオニル）−アゼチジン−３
−カルボン酸メチルエステル塩酸塩（１．８ｇ、６．０
ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（６１０ｍｇ、６．０ｍ
ｍｏｌ）、５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−カルボ
ン酸（１．２ｇ，６．０ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール水和物（１．３９ｇ、９．０ｍｍ
ｏｌ）の混合物に０℃において添加し、この混合物を数
時間かけて２０℃加温し、室温において７２時間撹拌し
た。
−２−カルボニル）−アミノ］−３−フェニル−プロピ
オニル｝−アゼチジン−３−カルボン酸メチルエステル １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカル
ボジイミド塩酸塩（１．１５ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を、
ジクロロメタン（１８ｍｌ）中の（Ｓ）−１−（２−ア
ミノ−３−フェニル−プロピオニル）−アゼチジン−３
−カルボン酸メチルエステル塩酸塩（１．８ｇ、６．０
ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（６１０ｍｇ、６．０ｍ
ｍｏｌ）、５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−カルボ
ン酸（１．２ｇ，６．０ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール水和物（１．３９ｇ、９．０ｍｍ
ｏｌ）の混合物に０℃において添加し、この混合物を数
時間かけて２０℃加温し、室温において７２時間撹拌し
た。
【０１５４】この混合物を酢酸エチルで希釈し、生ずる
混合物を１ＮａＯＨで３回洗浄し、１Ｎ ＨＣｌで３回
洗浄し、水性ＮａＨＣＯ3 で１回洗浄し、乾燥し、濃縮
すると、２．８ｇの黄色泡状物が得られ、これをシリカ
ゲルのクロマトグラフィーにより精製し、ヘキサン中の
酢酸エチルの勾配で、次いで酢酸エチルで溶離すると、
無色泡状物が得られた（２．２４ｇ、８６％）。1 Ｈ
ＮＭＲ（３００ｍＨｚ、ＣＤＣｌ2 ）δ９．２８（ｄ，
１Ｈ、Ｊ＝９．２Ｈｚ）、７．５９（ｍ，１Ｈ）、７．
３２−７．１９（ｍ，１０Ｈ）、６．８３（ｍ，１
Ｈ）、４．７６（ｍ，１Ｈ）、４．３−４．０５（ｍ，
３Ｈ）、３．７１（ｓ，１．５Ｈ）、３．６９（ｓ，
１．５Ｈ）、３．３３（ｍ，１Ｈ）、３．３−３．０
（ｍ，３Ｈ）。ＴＳＰＭＳ４４０（ＭＨ＋、１００
％）。
混合物を１ＮａＯＨで３回洗浄し、１Ｎ ＨＣｌで３回
洗浄し、水性ＮａＨＣＯ3 で１回洗浄し、乾燥し、濃縮
すると、２．８ｇの黄色泡状物が得られ、これをシリカ
ゲルのクロマトグラフィーにより精製し、ヘキサン中の
酢酸エチルの勾配で、次いで酢酸エチルで溶離すると、
無色泡状物が得られた（２．２４ｇ、８６％）。1 Ｈ
ＮＭＲ（３００ｍＨｚ、ＣＤＣｌ2 ）δ９．２８（ｄ，
１Ｈ、Ｊ＝９．２Ｈｚ）、７．５９（ｍ，１Ｈ）、７．
３２−７．１９（ｍ，１０Ｈ）、６．８３（ｍ，１
Ｈ）、４．７６（ｍ，１Ｈ）、４．３−４．０５（ｍ，
３Ｈ）、３．７１（ｓ，１．５Ｈ）、３．６９（ｓ，
１．５Ｈ）、３．３３（ｍ，１Ｈ）、３．３−３．０
（ｍ，３Ｈ）。ＴＳＰＭＳ４４０（ＭＨ＋、１００
％）。
【０１５５】製造４５ （Ｓ）−１−｛２−［（５−クロロ−１Ｈ−インドール
−２−カルボニル）−アミノ］−３−フェニル−プロピ
オニル｝−アゼチジン−３−カルボン酸ナトリウム塩 メタノール（１ｍｌ）中の１−｛２−［（５−クロロ−
１Ｈ−インドール−２−カルボニル）−アミノ］−３−
フェニル−プロピオニル｝−アゼチジン−３−カルボン
酸メチルエステル（１５０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）の
溶液を、２３℃において１．０Ｎ水性ＮａＯＨ（０．３
４ｍｌ）で処理した。
−２−カルボニル）−アミノ］−３−フェニル−プロピ
オニル｝−アゼチジン−３−カルボン酸ナトリウム塩 メタノール（１ｍｌ）中の１−｛２−［（５−クロロ−
１Ｈ−インドール−２−カルボニル）−アミノ］−３−
フェニル−プロピオニル｝−アゼチジン−３−カルボン
酸メチルエステル（１５０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）の
溶液を、２３℃において１．０Ｎ水性ＮａＯＨ（０．３
４ｍｌ）で処理した。
【０１５６】３０分後、この混合物を真空濃縮し、残留
物をエーテルで粉砕し、乾燥した（１４１ｍｇ、９３
％）。1 Ｈ ＮＭＲ（３００ｍＨｚ、Ｄ2 Ｏ）δ７．６
１（ｍ，１Ｈ）、７．４１−７．２２（ｍ，９Ｈ）、
６．９８（ｍ，１Ｈ）、４．６５−４．５２（ｍ，１
Ｈ）、４．４−４．２（ｍ，１Ｈ）、３．８６（ｍ，
０．５Ｈ）、３．６４（ｓ，０．５Ｈ）、３．３５−
３．２（ｍ，１Ｈ）、３．２−３．０（ｍ，３Ｈ）。Ｔ
ＳＰＭＳ４２６（ＭＨ＋，１００％）。ＨＰＬＣ（１：
１ＭｅＣＮ−ｐＨ２．１，０．１Ｍ ＫＨ2 ＰＯ4 −Ｈ
3 ＰＯ4 、１．０ｍｌ／分、４．６×２５０ｍｍ Rain
in MicrosorbTMC-18、２１４ｎＭ）４．４３分（９６
％）。Ｃ22Ｈ19ＣｌＮ3 Ｏ4 Ｎａ＋３．５Ｈ2 Ｏについ
ての計算値：Ｃ５１．７２；Ｈ５．１２；Ｎ８．２２；
実測値：Ｃ５１．４９；Ｈ５．０２；Ｎ８．０１。
物をエーテルで粉砕し、乾燥した（１４１ｍｇ、９３
％）。1 Ｈ ＮＭＲ（３００ｍＨｚ、Ｄ2 Ｏ）δ７．６
１（ｍ，１Ｈ）、７．４１−７．２２（ｍ，９Ｈ）、
６．９８（ｍ，１Ｈ）、４．６５−４．５２（ｍ，１
Ｈ）、４．４−４．２（ｍ，１Ｈ）、３．８６（ｍ，
０．５Ｈ）、３．６４（ｓ，０．５Ｈ）、３．３５−
３．２（ｍ，１Ｈ）、３．２−３．０（ｍ，３Ｈ）。Ｔ
ＳＰＭＳ４２６（ＭＨ＋，１００％）。ＨＰＬＣ（１：
１ＭｅＣＮ−ｐＨ２．１，０．１Ｍ ＫＨ2 ＰＯ4 −Ｈ
3 ＰＯ4 、１．０ｍｌ／分、４．６×２５０ｍｍ Rain
in MicrosorbTMC-18、２１４ｎＭ）４．４３分（９６
％）。Ｃ22Ｈ19ＣｌＮ3 Ｏ4 Ｎａ＋３．５Ｈ2 Ｏについ
ての計算値：Ｃ５１．７２；Ｈ５．１２；Ｎ８．２２；
実測値：Ｃ５１．４９；Ｈ５．０２；Ｎ８．０１。
【０１５７】製造４６ （Ｓ）−１−｛２−［（５−クロロ−１Ｈ−インドール
−２−カルボニル）−アミノ］−３−フェニル−プロピ
オニル｝−アゼチジン−３−カルボン酸 前述の対応するナトリウム塩を酢酸エチルと水性２Ｎ
ＨＣｌとの間で分配した。水性層を分離し、酢酸エチル
で溶離した。酢酸エチル層を一緒にし、硫酸マグネシウ
ムで乾燥し、濃縮すると、遊離酸が定量的収率で得られ
た。1 Ｈ ＮＭＲ（３００ｍＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6 、部
分的）δ１１．７８（ｓ，０．５Ｈ）、１１．７６
（ｓ，０．５Ｈ）、８．９（ｍ，１Ｈ）、７．７２
（ｍ，１Ｈ）、７．４５−７．１５（ｍ，８Ｈ）、４．
６５（ｍ，１Ｈ）、４．４５（ｔ，０．５Ｈ）、４．３
７（ｍ，０．５Ｈ）、４．１５（ｍ，０．５Ｈ）、４．
１−３．８（ｍ，２．５Ｈ）、３．１−２．９８（ｍ，
２Ｈ）。
−２−カルボニル）−アミノ］−３−フェニル−プロピ
オニル｝−アゼチジン−３−カルボン酸 前述の対応するナトリウム塩を酢酸エチルと水性２Ｎ
ＨＣｌとの間で分配した。水性層を分離し、酢酸エチル
で溶離した。酢酸エチル層を一緒にし、硫酸マグネシウ
ムで乾燥し、濃縮すると、遊離酸が定量的収率で得られ
た。1 Ｈ ＮＭＲ（３００ｍＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6 、部
分的）δ１１．７８（ｓ，０．５Ｈ）、１１．７６
（ｓ，０．５Ｈ）、８．９（ｍ，１Ｈ）、７．７２
（ｍ，１Ｈ）、７．４５−７．１５（ｍ，８Ｈ）、４．
６５（ｍ，１Ｈ）、４．４５（ｔ，０．５Ｈ）、４．３
７（ｍ，０．５Ｈ）、４．１５（ｍ，０．５Ｈ）、４．
１−３．８（ｍ，２．５Ｈ）、３．１−２．９８（ｍ，
２Ｈ）。
【０１５８】本発明の化合物は、低血糖剤として臨床的
使用に容易に採用される。本発明の化合物の低血糖活性
は、雄のｏｂ／ｏｂマウスにおいて、被験化合物を含ま
ないベヒクルに関してグルコースレベルを減少する被験
化合物の量により測定することができる。この試験は、
また、このような被験化合物のためのこのようなマウス
において、血漿グルコース濃度のin vivo 減少につい
て、近似最小有効投与量（ＭＥＤ）値の決定を可能とす
る。血液中のグルコースの濃度は糖尿病疾患の発生に密
接に関係するので、本発明の化合物は、低血糖作用によ
って、糖尿病疾患を予防し、阻止しおよび／または退行
させる。
使用に容易に採用される。本発明の化合物の低血糖活性
は、雄のｏｂ／ｏｂマウスにおいて、被験化合物を含ま
ないベヒクルに関してグルコースレベルを減少する被験
化合物の量により測定することができる。この試験は、
また、このような被験化合物のためのこのようなマウス
において、血漿グルコース濃度のin vivo 減少につい
て、近似最小有効投与量（ＭＥＤ）値の決定を可能とす
る。血液中のグルコースの濃度は糖尿病疾患の発生に密
接に関係するので、本発明の化合物は、低血糖作用によ
って、糖尿病疾患を予防し、阻止しおよび／または退行
させる。
【０１５９】５〜８週齢の雄のC57BL/6J-ob/obマウス(J
acson Laboratory、メイン州バールハーバー、から入手
した）を、標準的動物管理プラクティス下に５匹／ケー
ジで収容する。１週の順化期間後、動物を秤量し、２５
μｌの血液を処置前に後方眼窩洞（retro-orbital sinu
s ）から収集する。血液試料を０．０２５％のナトリウ
ムヘパリンを含有する生理食塩水で直ちに１：５に希釈
し、代謝物分析のために氷上に保持する。各群が血漿グ
ルコース濃度について同様な意味を有するように、動物
を処置群に割り当てる。
acson Laboratory、メイン州バールハーバー、から入手
した）を、標準的動物管理プラクティス下に５匹／ケー
ジで収容する。１週の順化期間後、動物を秤量し、２５
μｌの血液を処置前に後方眼窩洞（retro-orbital sinu
s ）から収集する。血液試料を０．０２５％のナトリウ
ムヘパリンを含有する生理食塩水で直ちに１：５に希釈
し、代謝物分析のために氷上に保持する。各群が血漿グ
ルコース濃度について同様な意味を有するように、動物
を処置群に割り当てる。
【０１６０】群の割り当て後、動物に下記のいずれかの
成分から成るベヒクルで毎日４日間経口投与する：
（１）ｐＨ調節をしない水中の０．２５％ｗ／ｖのメチ
ルセルロース；または（２）ｐＨ調節をしない０．１％
の生理食塩水中の０．１％のPluronic(R) ブロックコポ
リマーの界面活性剤（BASF Corporation、ニュージャー
ジイ州パルシパニイ）。第５日に、動物を再び秤量し、
次いで被験化合物またはベヒクル単独を経口投与する。
すべての薬剤を下記のいずれかの成分から成るベヒクル
中で投与する：（１）ｐＨ調節をしない水中の０．２５
％ｗ／ｖのメチルセルロース；または（２）ｐＨ調節を
しない０．１％の生理食塩水中の１０％のDMSO／０．１
％のPluronic(R) 。
成分から成るベヒクルで毎日４日間経口投与する：
（１）ｐＨ調節をしない水中の０．２５％ｗ／ｖのメチ
ルセルロース；または（２）ｐＨ調節をしない０．１％
の生理食塩水中の０．１％のPluronic(R) ブロックコポ
リマーの界面活性剤（BASF Corporation、ニュージャー
ジイ州パルシパニイ）。第５日に、動物を再び秤量し、
次いで被験化合物またはベヒクル単独を経口投与する。
すべての薬剤を下記のいずれかの成分から成るベヒクル
中で投与する：（１）ｐＨ調節をしない水中の０．２５
％ｗ／ｖのメチルセルロース；または（２）ｐＨ調節を
しない０．１％の生理食塩水中の１０％のDMSO／０．１
％のPluronic(R) 。
【０１６１】次いで、血液代謝物レベルを測定するため
に、３時間後、動物を後方眼窩洞から採血する。新しく
収集した試料を室温において１０，０００×ｇで２分間
遠心する。Abbott VPTTM (Abbott Laboratories 、Diag
nostics Division、テキサス州アービング）およびVP S
uper System (R) Autoanalyzer(Abbott Laboratories、
テキサス州アービング）またはAbbott Spectrum CCX TM
(Abbott Laboratories 、テキサス州アービング）によ
り、A-GentTM Glucose-UV Test試薬系（AbbottLaborato
ries 、テキサス州アービング）（RichterichおよびDau
walder の方法の変法、Schweizerische Medizinische W
ochenschrift 、101 、860 (1971)) （ヘキソキナーゼ
法）および１００ｍｇ／ｄｌの標準を使用して、上清
を、例えば、グルコースについて分析する。次いで、血
漿グルコースを下記の方程式により計算する： 血漿グルコース（ｍｇ／ｄｌ）＝試料の値×８．１４
に、３時間後、動物を後方眼窩洞から採血する。新しく
収集した試料を室温において１０，０００×ｇで２分間
遠心する。Abbott VPTTM (Abbott Laboratories 、Diag
nostics Division、テキサス州アービング）およびVP S
uper System (R) Autoanalyzer(Abbott Laboratories、
テキサス州アービング）またはAbbott Spectrum CCX TM
(Abbott Laboratories 、テキサス州アービング）によ
り、A-GentTM Glucose-UV Test試薬系（AbbottLaborato
ries 、テキサス州アービング）（RichterichおよびDau
walder の方法の変法、Schweizerische Medizinische W
ochenschrift 、101 、860 (1971)) （ヘキソキナーゼ
法）および１００ｍｇ／ｄｌの標準を使用して、上清
を、例えば、グルコースについて分析する。次いで、血
漿グルコースを下記の方程式により計算する： 血漿グルコース（ｍｇ／ｄｌ）＝試料の値×８．１４
【０１６２】ここで８．１４は血漿ヘマトクリットにつ
いて調整のための希釈係数である（ヘマトクリットは４
４％であると仮定する）。ベヒクルを投与した動物は実
質的に非変化の高血糖のグルコースレベル（例えば、２
５０ｍｇ／ｄｌより大きいか、あるいはそれに等しい）
を維持し、適当な投与量において低血糖活性を有する化
合物で処置された動物は有意に低下したグルコースレベ
ルを有する。第５日に被験化合物とベヒクル処置群との
間の平均血漿グルコース濃度の統計学的分析（不対ｔ−
テスト）により、被験化合物の低血糖活性を決定する。
ある範囲の投与量の被験化合物を使用して実施した上記
アッセイは、血漿グルコース濃度のｉｎ ｖｉｖｏ減少
についての近似最小有効投与量（ＭＥＤ）の決定を可能
とする。
いて調整のための希釈係数である（ヘマトクリットは４
４％であると仮定する）。ベヒクルを投与した動物は実
質的に非変化の高血糖のグルコースレベル（例えば、２
５０ｍｇ／ｄｌより大きいか、あるいはそれに等しい）
を維持し、適当な投与量において低血糖活性を有する化
合物で処置された動物は有意に低下したグルコースレベ
ルを有する。第５日に被験化合物とベヒクル処置群との
間の平均血漿グルコース濃度の統計学的分析（不対ｔ−
テスト）により、被験化合物の低血糖活性を決定する。
ある範囲の投与量の被験化合物を使用して実施した上記
アッセイは、血漿グルコース濃度のｉｎ ｖｉｖｏ減少
についての近似最小有効投与量（ＭＥＤ）の決定を可能
とする。
【０１６３】本発明の化合物は、高インスリン血症逆転
剤、トリグリセリド低下剤および低コレステロール血症
剤として臨床的使用に容易に採用される。このような活
性は、雄のｏｂ／ｏｂマウスにおいて、被験化合物を含
まない対照ベヒクルに関して、インスリン、トリグリセ
リドおよびコレステロールを減少する被験化合物の量に
より、容易に測定することができる。血液中のコレステ
ロールの濃度は心臓血管、脳血管または末梢血管の疾患
の発生に密接に関係するので、本発明の化合物はそれら
の低コレステロール血作用によりアテローム性動脈硬化
症を予防し、阻止し、および／または退行させる。
剤、トリグリセリド低下剤および低コレステロール血症
剤として臨床的使用に容易に採用される。このような活
性は、雄のｏｂ／ｏｂマウスにおいて、被験化合物を含
まない対照ベヒクルに関して、インスリン、トリグリセ
リドおよびコレステロールを減少する被験化合物の量に
より、容易に測定することができる。血液中のコレステ
ロールの濃度は心臓血管、脳血管または末梢血管の疾患
の発生に密接に関係するので、本発明の化合物はそれら
の低コレステロール血作用によりアテローム性動脈硬化
症を予防し、阻止し、および／または退行させる。
【０１６４】血液中のインスリンの濃度は脈管構造の細
胞の成長の促進および腎臓ナトリウムの保持の増加（他
の作用、例えば、グルコース利用の促進に加えて）に関
係づけられ、これらの機能は高血圧症の既知の原因であ
るので、本発明の化合物はそれらの低インスリン血作用
により高血圧症を予防し、阻止し、および／または退行
させる。血液中のトリグリセリドおよび／または遊離脂
肪酸の濃度は血液脂質の全体のレベルに寄与するので、
本発明の化合物はそれらのトリグリセリド低下および／
または遊離脂肪酸低下活性により高脂血症を予防し、阻
止し、および／または退行させる。遊離脂肪酸は血液脂
質の全体のレベルに寄与し、そして種々の生理学的およ
び病理学的状態におけるインスリン感受性に独立に消極
的に相関されてきた。
胞の成長の促進および腎臓ナトリウムの保持の増加（他
の作用、例えば、グルコース利用の促進に加えて）に関
係づけられ、これらの機能は高血圧症の既知の原因であ
るので、本発明の化合物はそれらの低インスリン血作用
により高血圧症を予防し、阻止し、および／または退行
させる。血液中のトリグリセリドおよび／または遊離脂
肪酸の濃度は血液脂質の全体のレベルに寄与するので、
本発明の化合物はそれらのトリグリセリド低下および／
または遊離脂肪酸低下活性により高脂血症を予防し、阻
止し、および／または退行させる。遊離脂肪酸は血液脂
質の全体のレベルに寄与し、そして種々の生理学的およ
び病理学的状態におけるインスリン感受性に独立に消極
的に相関されてきた。
【０１６５】５〜８週齢の雄のC57BL/6J-ob/obマウス(J
acson Laboratory、メイン州バールハーバー、から入手
した）を、標準的動物管理プラクティス下に５匹／ケー
ジで収容し、標準的齧歯類の食事を任意に与える。１週
の順化期間後、動物を秤量し、２５μｌの血液を処置前
に後方眼窩洞から収集する。血液試料を０．０２５％の
ナトリウムヘパリンを含有する生理食塩水で直ちに１：
５に希釈し、血漿グルコース分析のために氷上に保持す
る。各群が血漿グルコース濃度について同様な意味を有
するように、動物を処置群に割り当てる。
acson Laboratory、メイン州バールハーバー、から入手
した）を、標準的動物管理プラクティス下に５匹／ケー
ジで収容し、標準的齧歯類の食事を任意に与える。１週
の順化期間後、動物を秤量し、２５μｌの血液を処置前
に後方眼窩洞から収集する。血液試料を０．０２５％の
ナトリウムヘパリンを含有する生理食塩水で直ちに１：
５に希釈し、血漿グルコース分析のために氷上に保持す
る。各群が血漿グルコース濃度について同様な意味を有
するように、動物を処置群に割り当てる。
【０１６６】試験すべき化合物を下記のいずれかの中の
約０．０２％〜２．０％の溶液（重量／体積（ｗ／
ｖ））：（１）ｐＨ調節をしない０．１％の生理食塩水
中の１０％のDMSO／０．１％のPluronic(R) P105ブロッ
クコポリマーの界面活性剤（BASFCorporation、ニュー
ジャージイ州パルシパニイ）；または（２）ｐＨ調節を
しない水中の０．２５％ｗ／ｖのメチルセルロース。１
回の毎日の投与（ｓ．ｉ．ｄ．）または２回の毎日の投
与（ｂ．１．ｄ．）を１日〜例えば５日間維持する。
約０．０２％〜２．０％の溶液（重量／体積（ｗ／
ｖ））：（１）ｐＨ調節をしない０．１％の生理食塩水
中の１０％のDMSO／０．１％のPluronic(R) P105ブロッ
クコポリマーの界面活性剤（BASFCorporation、ニュー
ジャージイ州パルシパニイ）；または（２）ｐＨ調節を
しない水中の０．２５％ｗ／ｖのメチルセルロース。１
回の毎日の投与（ｓ．ｉ．ｄ．）または２回の毎日の投
与（ｂ．１．ｄ．）を１日〜例えば５日間維持する。
【０１６７】対照マウスにｐＨ調節をしない０．１％の
生理食塩水中の１０％のDMSO／０．１％のPluronic(R)
P105またはｐＨ調節をしない水中の０．２５％ｗ／ｖの
メチルセルロースのみを与える。最後の投与後３時間
に、動物を断頭により殺し、３．６ｍｇの１：１重量／
重量のフッ化ナトリウム：シュウ酸カリウムの混合物を
含有する０．５ｍｌの血清セパレーター管の中に、胴の
血液を収集する。新しく収集した試料を１０，０００×
ｇ、室温において２分間遠心し、血清上清を移し、ｐＨ
調節をしない０．１％の生理食塩水中の１ＴＩＵ／ｍｌ
のアプロチニン溶液で１：１体積／体積に希釈する。
生理食塩水中の１０％のDMSO／０．１％のPluronic(R)
P105またはｐＨ調節をしない水中の０．２５％ｗ／ｖの
メチルセルロースのみを与える。最後の投与後３時間
に、動物を断頭により殺し、３．６ｍｇの１：１重量／
重量のフッ化ナトリウム：シュウ酸カリウムの混合物を
含有する０．５ｍｌの血清セパレーター管の中に、胴の
血液を収集する。新しく収集した試料を１０，０００×
ｇ、室温において２分間遠心し、血清上清を移し、ｐＨ
調節をしない０．１％の生理食塩水中の１ＴＩＵ／ｍｌ
のアプロチニン溶液で１：１体積／体積に希釈する。
【０１６８】次いで希釈した試料を、分析するまで、−
８０℃において貯蔵する。融解し、希釈した試料をイン
スリン、トリグリセリド、遊離脂肪酸およびコレステロ
ールのレベルについて分析する。Equate(R) RIA INSULI
N キット（二重抗体方法；製造業者により規格された）
（Binax 、メイン州サウスポートランド、から購入し
た）を使用して、血清インスリン濃度を測定する。相互
アッセイの変動係数≦１０％。Abbott VP TMおよびVP S
uper System (R) Autoanalyzer (Abbott Laboratories
、テキサス州アービング）またはAbbott Spectrum CCX
TM（Abbott Laboratories 、テキサス州アービング）
により、A-GentTMトリグリセリド試験試薬系（Abbott L
aboratories 、Diagnostics Division、テキサス州アー
ビング）（リパーゼ結合酵素法；Sampson 、et al.、Cl
inical Chemistry 21 、1983 (1975)の方法の変法））
を使用して、血清トリグリセリドを測定する。
８０℃において貯蔵する。融解し、希釈した試料をイン
スリン、トリグリセリド、遊離脂肪酸およびコレステロ
ールのレベルについて分析する。Equate(R) RIA INSULI
N キット（二重抗体方法；製造業者により規格された）
（Binax 、メイン州サウスポートランド、から購入し
た）を使用して、血清インスリン濃度を測定する。相互
アッセイの変動係数≦１０％。Abbott VP TMおよびVP S
uper System (R) Autoanalyzer (Abbott Laboratories
、テキサス州アービング）またはAbbott Spectrum CCX
TM（Abbott Laboratories 、テキサス州アービング）
により、A-GentTMトリグリセリド試験試薬系（Abbott L
aboratories 、Diagnostics Division、テキサス州アー
ビング）（リパーゼ結合酵素法；Sampson 、et al.、Cl
inical Chemistry 21 、1983 (1975)の方法の変法））
を使用して、血清トリグリセリドを測定する。
【０１６９】Abbott VP TMおよびVP Super System (R)
Autoanalyzer(Abbott Laboratories、テキサス州アービ
ング）またはAbbott Spectrum CCX TM(Abbott Laborato
ries、テキサス州アービング）により、A-GentTMコレス
テロール試験試薬系（AbbottLaboratories 、Diagnosti
cs Division、テキサス州アービング）（コレステロー
ルエステラーゼ結合酵素法；Allan 、et al.、Clinical
Chemistry 20 、470(1974)の方法の変法））および１
００および３００ｍｇ／ｄｌの標準を使用して、血清の
総コレステロールレベルを測定する。Abbott VP TMおよ
びVP Super System (R) Autoanalyzer(Abbott Laborato
ries、テキサス州アービング）またはAbbott Spectrum
CCX TM(Abbott Laboratories、テキサス州アービング）
とともに使用するために適合したキット（Amano Intern
ational Enzyme Co., Inc.から）を使用して、血清の遊
離脂肪酸濃度を測定する。
Autoanalyzer(Abbott Laboratories、テキサス州アービ
ング）またはAbbott Spectrum CCX TM(Abbott Laborato
ries、テキサス州アービング）により、A-GentTMコレス
テロール試験試薬系（AbbottLaboratories 、Diagnosti
cs Division、テキサス州アービング）（コレステロー
ルエステラーゼ結合酵素法；Allan 、et al.、Clinical
Chemistry 20 、470(1974)の方法の変法））および１
００および３００ｍｇ／ｄｌの標準を使用して、血清の
総コレステロールレベルを測定する。Abbott VP TMおよ
びVP Super System (R) Autoanalyzer(Abbott Laborato
ries、テキサス州アービング）またはAbbott Spectrum
CCX TM(Abbott Laboratories、テキサス州アービング）
とともに使用するために適合したキット（Amano Intern
ational Enzyme Co., Inc.から）を使用して、血清の遊
離脂肪酸濃度を測定する。
【０１７０】次いで、血清のインスリン、トリグリセリ
ド、遊離脂肪酸および総コレステロールのレベルを下記
の方程式により計算する： 血清インスリン（μＵ／ｍｌ）＝試料の値×２ 血清トリグリセリド（ｍｇ／ｄｌ）＝試料の値×２ 血清総コレステロール（ｍｇ／ｄｌ）＝試料の値×２ 血清遊離脂肪酸（μＥｑ／ｌ）＝試料の値×２ ここで２は希釈係数である。
ド、遊離脂肪酸および総コレステロールのレベルを下記
の方程式により計算する： 血清インスリン（μＵ／ｍｌ）＝試料の値×２ 血清トリグリセリド（ｍｇ／ｄｌ）＝試料の値×２ 血清総コレステロール（ｍｇ／ｄｌ）＝試料の値×２ 血清遊離脂肪酸（μＥｑ／ｌ）＝試料の値×２ ここで２は希釈係数である。
【０１７１】ベヒクルを投与した動物は、実質的に非変
化の、増加した血清インスリン（例えば、２７５μＵ／
ｍｌ）、血清トリグリセリド（例えば、２３５ｍｇ／ｄ
ｌ）、血清遊離脂肪酸（１５００μＥｑ／ｍｌ）および
血清総コレステロール（例えば、１９０ｍｇ／ｄｌ）の
レベルを維持するが、本発明の化合物を投与した動物
は、一般に、減少した血清インスリン、トリグリセリ
ド、遊離脂肪酸および総コレステロールのレベルを表示
する。被験化合物の群とベヒクル処置の対照群との間の
平均の血清インスリン、トリグリセリド、または総コレ
ステロールの濃度の統計学的分析（不対ｔ−テスト）に
より、被験化合物の血清インスリン、トリグリセリド、
遊離脂肪酸および総コレステロールを低下する活性を測
定する。
化の、増加した血清インスリン（例えば、２７５μＵ／
ｍｌ）、血清トリグリセリド（例えば、２３５ｍｇ／ｄ
ｌ）、血清遊離脂肪酸（１５００μＥｑ／ｍｌ）および
血清総コレステロール（例えば、１９０ｍｇ／ｄｌ）の
レベルを維持するが、本発明の化合物を投与した動物
は、一般に、減少した血清インスリン、トリグリセリ
ド、遊離脂肪酸および総コレステロールのレベルを表示
する。被験化合物の群とベヒクル処置の対照群との間の
平均の血清インスリン、トリグリセリド、または総コレ
ステロールの濃度の統計学的分析（不対ｔ−テスト）に
より、被験化合物の血清インスリン、トリグリセリド、
遊離脂肪酸および総コレステロールを低下する活性を測
定する。
【０１７２】Butwell 、et al.、Am. J. Physiol. 264
、H1884-H1889 、1993およびAllard、et al.、Am. J.
Physiol. 、1994、267 、H66-H74 に記載されている手
法により、虚血（例えば、心臓組織に対する損傷）から
の保護を提供する活性を本発明の化合物についてin vit
roで証明することができる。本質的に上記文献に記載す
るように、等体積の単離されたラット心臓調製物を使用
して実験を実施する。対照ラットの年齢が合致する、正
常の雄のＳＤラット、大動脈バンディング手術により肥
大を有するように処置された雄のＳＤラット、急性糖尿
病の雄のＢＢ／Ｗラット、または非糖尿病のＢＢ／Ｗラ
ットをヘパリン（１０００Ｕ、ｉ．ｐ．）で前処理し、
次いでペントバルビタール（６５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．
ｐ．）で前処理する。
、H1884-H1889 、1993およびAllard、et al.、Am. J.
Physiol. 、1994、267 、H66-H74 に記載されている手
法により、虚血（例えば、心臓組織に対する損傷）から
の保護を提供する活性を本発明の化合物についてin vit
roで証明することができる。本質的に上記文献に記載す
るように、等体積の単離されたラット心臓調製物を使用
して実験を実施する。対照ラットの年齢が合致する、正
常の雄のＳＤラット、大動脈バンディング手術により肥
大を有するように処置された雄のＳＤラット、急性糖尿
病の雄のＢＢ／Ｗラット、または非糖尿病のＢＢ／Ｗラ
ットをヘパリン（１０００Ｕ、ｉ．ｐ．）で前処理し、
次いでペントバルビタール（６５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．
ｐ．）で前処理する。
【０１７３】足の反射の非存在により決定して、深い麻
酔が達成された後、心臓を急速に切除し、氷冷生理食塩
水の中に入れる。２分以内に大動脈を通して、心臓を逆
行的に灌流する。圧力トランスデューサーに高圧管を接
続して、左心室の中にラテックスバルーンを使用して、
心拍数および収縮圧を測定する。（ｍＭ）ＮａＣｌ１１
８、ＫＣｌ ４．７、ＣａＣｌ2 １．２、ＭｇＣｌ2
１．２、ＮａＨＣＯ3 ２５およびグルコース １１
から成る灌流溶液を使用して、心臓を灌流する。灌流液
のためにおよび加熱温度を３７℃に維持するために灌流
管の回りの水ジャケットのために加熱浴を使用して、灌
流装置を厳密に温度制御する。心臓に直ぐ近接させて、
小児の中空繊維の酸素供給器（Ｃａｐｉａｘ、会社テル
モ、東京）により、灌流溶液に酸素を供給する。
酔が達成された後、心臓を急速に切除し、氷冷生理食塩
水の中に入れる。２分以内に大動脈を通して、心臓を逆
行的に灌流する。圧力トランスデューサーに高圧管を接
続して、左心室の中にラテックスバルーンを使用して、
心拍数および収縮圧を測定する。（ｍＭ）ＮａＣｌ１１
８、ＫＣｌ ４．７、ＣａＣｌ2 １．２、ＭｇＣｌ2
１．２、ＮａＨＣＯ3 ２５およびグルコース １１
から成る灌流溶液を使用して、心臓を灌流する。灌流液
のためにおよび加熱温度を３７℃に維持するために灌流
管の回りの水ジャケットのために加熱浴を使用して、灌
流装置を厳密に温度制御する。心臓に直ぐ近接させて、
小児の中空繊維の酸素供給器（Ｃａｐｉａｘ、会社テル
モ、東京）により、灌流溶液に酸素を供給する。
【０１７４】被験化合物を含む灌流溶液および含まない
灌流溶液に、心臓を約１０分またはそれ以上の間暴露
し、次いで被験化合物の非存在において２０分の全体的
虚血および６０分の再灌流を行う。虚血後ある期間にお
いて、対照および被験化合物で処置した心臓の心拍を比
較する。虚血後ある期間において、対照および被験化合
物で処置した心臓の左心室を比較する。実験の終わりに
おいて、心臓をまた灌流し、後述するように、染色し
て、梗塞区域／危険（ＩＡ／ＡＡＲ％）における区域の
比を決定する。
灌流溶液に、心臓を約１０分またはそれ以上の間暴露
し、次いで被験化合物の非存在において２０分の全体的
虚血および６０分の再灌流を行う。虚血後ある期間にお
いて、対照および被験化合物で処置した心臓の心拍を比
較する。虚血後ある期間において、対照および被験化合
物で処置した心臓の左心室を比較する。実験の終わりに
おいて、心臓をまた灌流し、後述するように、染色し
て、梗塞区域／危険（ＩＡ／ＡＡＲ％）における区域の
比を決定する。
【０１７５】そうでなければ虚血の障害から生ずる心臓
組織の損傷を防止する本発明の化合物の治療効果を、ま
た、Liu 、et al.、Circulation 、Vol.84、No. 1 (Jul
y 1991）に記載されている手順に従い、本明細書におい
て詳細に記載するように、証明することができる。in v
ivo アッセイは、生理食塩水ベヒクルを与える対照群に
関して被験化合物の心臓保護を試験する。短期間の心筋
虚血、その後の冠状動脈の再灌流は、引き続く重度の心
筋虚血から心臓を保護することが認められる（Murry 、
et al.、Criculation 、74: 1124-1136 、1986）。
組織の損傷を防止する本発明の化合物の治療効果を、ま
た、Liu 、et al.、Circulation 、Vol.84、No. 1 (Jul
y 1991）に記載されている手順に従い、本明細書におい
て詳細に記載するように、証明することができる。in v
ivo アッセイは、生理食塩水ベヒクルを与える対照群に
関して被験化合物の心臓保護を試験する。短期間の心筋
虚血、その後の冠状動脈の再灌流は、引き続く重度の心
筋虚血から心臓を保護することが認められる（Murry 、
et al.、Criculation 、74: 1124-1136 、1986）。
【０１７６】心臓保護は、心筋梗塞の減少により示さ
れ、心筋虚血の前コンディショニングのin situ モデル
として研究された、無傷の麻酔したウサギにおいて、静
脈内に投与されたアデノシンレセプターアゴニストを使
用して、薬理学的に誘導することができる（Liu 、et a
l.、Circulation 、84: 350-356 、1991）。in vivo ア
ッセイは、無傷の麻酔したウサギに非経口投与したと
き、化合物が薬理学的に心臓保護、すなわち、心筋梗塞
の大きさの減少、を誘導することができるかどうかを試
験する。in situ で研究された無傷の麻酔したウサギに
おいて心臓保護を薬理学的に誘導することが示されたＡ
１アデノシンアゴニスト、Ｎ6 −１−（フェニル−２Ｒ
−イソプロピル）アデノシン（ＰＩＡ）を使用する虚血
前コンディショニングと、本発明の化合物の作用を比較
することができる（Liu 、et al.、Circulation 、84:
350-356 、1991）。正確な方法を後述する。
れ、心筋虚血の前コンディショニングのin situ モデル
として研究された、無傷の麻酔したウサギにおいて、静
脈内に投与されたアデノシンレセプターアゴニストを使
用して、薬理学的に誘導することができる（Liu 、et a
l.、Circulation 、84: 350-356 、1991）。in vivo ア
ッセイは、無傷の麻酔したウサギに非経口投与したと
き、化合物が薬理学的に心臓保護、すなわち、心筋梗塞
の大きさの減少、を誘導することができるかどうかを試
験する。in situ で研究された無傷の麻酔したウサギに
おいて心臓保護を薬理学的に誘導することが示されたＡ
１アデノシンアゴニスト、Ｎ6 −１−（フェニル−２Ｒ
−イソプロピル）アデノシン（ＰＩＡ）を使用する虚血
前コンディショニングと、本発明の化合物の作用を比較
することができる（Liu 、et al.、Circulation 、84:
350-356 、1991）。正確な方法を後述する。
【０１７７】外科手術：ニュージーランド白ウサギ（３
〜４ｋｇ）をペントバルビタール（３０ｍｇ／ｋｇ、
ｉ．ｖ．）で麻酔した。気管切開を腹側中線頸部切開に
より実施し、そして正圧ベンチレーターを使用して１０
０％の酸素でウサギを通気する。カテーテルを化合物を
投与するために左頸静脈の中に入れ、そして血圧を測定
するために左頸動脈の中に入れる。次いで心臓を左開胸
により露出させ、そして左冠状動脈の突起した枝の回り
にスネア（００絹）を配置する。スネアを緊密に引張
り、それを所定位置にクランプすることによって、虚血
を誘発する。スネアを解放すると、影響を受けた区域は
再灌流された。心筋虚血は局所チアノーゼにより証明さ
れる；再灌流は反応性充血により証明された。
〜４ｋｇ）をペントバルビタール（３０ｍｇ／ｋｇ、
ｉ．ｖ．）で麻酔した。気管切開を腹側中線頸部切開に
より実施し、そして正圧ベンチレーターを使用して１０
０％の酸素でウサギを通気する。カテーテルを化合物を
投与するために左頸静脈の中に入れ、そして血圧を測定
するために左頸動脈の中に入れる。次いで心臓を左開胸
により露出させ、そして左冠状動脈の突起した枝の回り
にスネア（００絹）を配置する。スネアを緊密に引張
り、それを所定位置にクランプすることによって、虚血
を誘発する。スネアを解放すると、影響を受けた区域は
再灌流された。心筋虚血は局所チアノーゼにより証明さ
れる；再灌流は反応性充血により証明された。
【０１７８】プロトコール： いったん動脈圧および心
拍数が少なくとも３０秒間安定となったとき、実験を開
始する。冠状動脈を２回５分間閉塞し、次いで１０分間
再灌流することによって、虚血前コンディショニングは
誘発される。被験化合物を２回、例えば、５分間注入
し、そしてそれ以上の関与の前に１０分経過させるか、
あるいはアデノシンアゴニスト、ＰＩＡ（０．２５ｍｇ
／ｋｇ）を注入することによって、薬理学的前コンディ
ショニングを誘発する。虚血前コンディショニング、薬
理学的前コンディショニングまたは非コンディショニン
グ（非コンディショニング、ベヒクル対照）後におい
て、動脈を３０分間閉塞し、次いで２時間再灌流して心
筋梗塞を誘発させる。被験化合物およびＰＩＡを生理食
塩水または他の適当なベヒクル中に溶解し、それぞれ、
１〜５ｍｌ／ｋｇで送出す。
拍数が少なくとも３０秒間安定となったとき、実験を開
始する。冠状動脈を２回５分間閉塞し、次いで１０分間
再灌流することによって、虚血前コンディショニングは
誘発される。被験化合物を２回、例えば、５分間注入
し、そしてそれ以上の関与の前に１０分経過させるか、
あるいはアデノシンアゴニスト、ＰＩＡ（０．２５ｍｇ
／ｋｇ）を注入することによって、薬理学的前コンディ
ショニングを誘発する。虚血前コンディショニング、薬
理学的前コンディショニングまたは非コンディショニン
グ（非コンディショニング、ベヒクル対照）後におい
て、動脈を３０分間閉塞し、次いで２時間再灌流して心
筋梗塞を誘発させる。被験化合物およびＰＩＡを生理食
塩水または他の適当なベヒクル中に溶解し、それぞれ、
１〜５ｍｌ／ｋｇで送出す。
【０１７９】染色： （Liu 、et al.、Circulation 、
84: 350-356 、1991） ２時間の再灌流の終わりにおいて、心臓を急速に取り出
し、ランゲンドルフ（Langendorff ）装置に吊下げ、体
温（３８℃）に加熱した通常の生理食塩水で１分間フラ
ッシュする。次いでスネアとして使用する絹の縫合糸を
緊密に結束して動脈を再閉塞し、そして蛍光粒子の０．
５％の懸濁液（直径１〜１０μｍ、DukeScientific Cor
p. 、カリフォルニア州パロアルト、から入手した）を
灌流液とともに注入して、危険にある面積（非蛍光心
室）を除外して、心筋のすべてを染色する。次いで心臓
を急速凍結し、−２０℃において一夜貯蔵する。次の日
に、心臓を２ｍｍのスライスに切り、１％の塩化トリフ
ェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）で染色する。
84: 350-356 、1991） ２時間の再灌流の終わりにおいて、心臓を急速に取り出
し、ランゲンドルフ（Langendorff ）装置に吊下げ、体
温（３８℃）に加熱した通常の生理食塩水で１分間フラ
ッシュする。次いでスネアとして使用する絹の縫合糸を
緊密に結束して動脈を再閉塞し、そして蛍光粒子の０．
５％の懸濁液（直径１〜１０μｍ、DukeScientific Cor
p. 、カリフォルニア州パロアルト、から入手した）を
灌流液とともに注入して、危険にある面積（非蛍光心
室）を除外して、心筋のすべてを染色する。次いで心臓
を急速凍結し、−２０℃において一夜貯蔵する。次の日
に、心臓を２ｍｍのスライスに切り、１％の塩化トリフ
ェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）で染色する。
【０１８０】ＴＣＣは生きている組織と反応するので、
この染色は生きている（赤色に染色される）と、死んだ
組織（非染色の梗塞した組織）との間の差違を生じさせ
る。前もって目盛定めした画像アナライザーにより、梗
塞面積（染色なし）および危険にある面積（蛍光粒子な
し）を左心室の各スライスについて計算する。心臓の間
の危険にある面積の差について虚血損傷を正規化するた
めに、データを梗塞面積／危険にある面積（ＩＡ／ＡＡ
Ｒ％）として表す。すべてのデータを平均±ＳＥＭとし
て表し、単一の因子ANOVA または不対ｔ−テストを使用
して統計学的に比較する。有意性をｐ＜０．０５と考え
る。
この染色は生きている（赤色に染色される）と、死んだ
組織（非染色の梗塞した組織）との間の差違を生じさせ
る。前もって目盛定めした画像アナライザーにより、梗
塞面積（染色なし）および危険にある面積（蛍光粒子な
し）を左心室の各スライスについて計算する。心臓の間
の危険にある面積の差について虚血損傷を正規化するた
めに、データを梗塞面積／危険にある面積（ＩＡ／ＡＡ
Ｒ％）として表す。すべてのデータを平均±ＳＥＭとし
て表し、単一の因子ANOVA または不対ｔ−テストを使用
して統計学的に比較する。有意性をｐ＜０．０５と考え
る。
【０１８１】科学文献に報告されている手法を利用し
て、非心臓組織、例えば、脳、または肝臓における虚血
性損傷の減少または予防における実用性について、本発
明の化合物を試験することができる。本発明の化合物
は、投与の好ましい経路およびベヒクルにより、虚血性
エピソードの前、虚血性エピソードの間、含める場合、
虚血性エピソード（再灌流の期間）後、または後述する
実験段階のいずれかの間、の好ましい投与時間におい
て、投与することができる。
て、非心臓組織、例えば、脳、または肝臓における虚血
性損傷の減少または予防における実用性について、本発
明の化合物を試験することができる。本発明の化合物
は、投与の好ましい経路およびベヒクルにより、虚血性
エピソードの前、虚血性エピソードの間、含める場合、
虚血性エピソード（再灌流の期間）後、または後述する
実験段階のいずれかの間、の好ましい投与時間におい
て、投与することができる。
【０１８２】脳の虚血性損傷を減少する本発明の利益
は、例えば、哺乳動物においてPark、et al. (Ann. Neu
rol. 1988 、24: 543-551 ）の方法により証明すること
ができる。簡単に述べると、Ｐａｒｋの手順において、
成体の雄のＳＤラットを最初に２％のハロタンで、次い
で０．５〜１％のハロタンを含有する亜酸化窒素−酸素
の混合物（７０％：３０％）を使用する機械的通気によ
り麻酔する。次いで気管開口を実施する。ベンチレータ
ーのストローク体積を調節して、動脈の二酸化炭素の圧
力をほぼ３５ｍｍＨｇおよび適切な動脈の酸素供給（Ｐ
ａＯ2 ＞９０ｍｍＨｇ）をａｍｉする。
は、例えば、哺乳動物においてPark、et al. (Ann. Neu
rol. 1988 、24: 543-551 ）の方法により証明すること
ができる。簡単に述べると、Ｐａｒｋの手順において、
成体の雄のＳＤラットを最初に２％のハロタンで、次い
で０．５〜１％のハロタンを含有する亜酸化窒素−酸素
の混合物（７０％：３０％）を使用する機械的通気によ
り麻酔する。次いで気管開口を実施する。ベンチレータ
ーのストローク体積を調節して、動脈の二酸化炭素の圧
力をほぼ３５ｍｍＨｇおよび適切な動脈の酸素供給（Ｐ
ａＯ2 ＞９０ｍｍＨｇ）をａｍｉする。
【０１８３】体温を直腸温度計によりモニターし、そし
て動物を、必要に応じて、外部加熱により、正常温度に
維持することができる。次に動物を手術用顕微鏡下に側
頭下頭蓋骨切除して左中央動脈（ＭＣＡ）の主幹を露出
させ、露出した動脈をミクロ双極凝固で閉塞させて、脳
皮質および脳幹神経節において大きい虚血性病変を発生
させる。３時間のＭＣＡ閉塞後、ラットを２％のハロタ
ンで深く麻酔させ、胸郭切除してヘパリン添加した生理
食塩水を左心室の中に注入する。生理食塩水で洗浄し、
次いでほぼ２００ｍｌの４０％のホルムアルデヒド、氷
酢酸および無水メタノール溶液（ＦＡＭ；１：１：８、
ｖ／ｖ／ｖ）で洗浄し、次いで動物を断頭し、頭を固定
液の中に２４時間貯蔵する。
て動物を、必要に応じて、外部加熱により、正常温度に
維持することができる。次に動物を手術用顕微鏡下に側
頭下頭蓋骨切除して左中央動脈（ＭＣＡ）の主幹を露出
させ、露出した動脈をミクロ双極凝固で閉塞させて、脳
皮質および脳幹神経節において大きい虚血性病変を発生
させる。３時間のＭＣＡ閉塞後、ラットを２％のハロタ
ンで深く麻酔させ、胸郭切除してヘパリン添加した生理
食塩水を左心室の中に注入する。生理食塩水で洗浄し、
次いでほぼ２００ｍｌの４０％のホルムアルデヒド、氷
酢酸および無水メタノール溶液（ＦＡＭ；１：１：８、
ｖ／ｖ／ｖ）で洗浄し、次いで動物を断頭し、頭を固定
液の中に２４時間貯蔵する。
【０１８４】次いで脳を取り出し、解剖し、プロセス
し、パラフィンワックスの中に埋め込み、切片に切る
（ほぼ１００切片／脳）。切片をヘマトキシリン−エオ
シンで、またはクレシルバイオレットとルクソール（Lu
xol)ファストブルーとの組合わせで染色し、光学顕微鏡
検査により画像アナライザー（例えば、Quantimer 720
）を使用して検査して虚血性損傷を同定し、定量す
る。虚血の体積および面積を絶対単位（ｍｍ3 およびｍ
ｍ2 ）でそして検査した全体の領域の百分率として表
す。プラシーボ処置対照群におけるラットからの脳切片
と比較して、処置群におけるラットからの脳切片におけ
る相対的または絶対的虚血性損傷の面積または体積の減
少に基づいて、ＭＣＡ閉塞により誘発された虚血性脳損
傷を減少する本発明の化合物の作用を記録する。
し、パラフィンワックスの中に埋め込み、切片に切る
（ほぼ１００切片／脳）。切片をヘマトキシリン−エオ
シンで、またはクレシルバイオレットとルクソール（Lu
xol)ファストブルーとの組合わせで染色し、光学顕微鏡
検査により画像アナライザー（例えば、Quantimer 720
）を使用して検査して虚血性損傷を同定し、定量す
る。虚血の体積および面積を絶対単位（ｍｍ3 およびｍ
ｍ2 ）でそして検査した全体の領域の百分率として表
す。プラシーボ処置対照群におけるラットからの脳切片
と比較して、処置群におけるラットからの脳切片におけ
る相対的または絶対的虚血性損傷の面積または体積の減
少に基づいて、ＭＣＡ閉塞により誘発された虚血性脳損
傷を減少する本発明の化合物の作用を記録する。
【０１８５】虚血性脳損傷を減少する本発明の利益を証
明するために別に利用することができる他の方法は、下
記の文献に記載されている：Nakayama、et al.、Neurol
ogy1988、38: 1667-1673; Memezawa 、et al.、Stroke
1992 、23: 552-559; Folbergrova、et al.、Proc. Nat
l. Acad. Sci. 1995 、92: 5057-5059 ；またはGotti
、et al.、Brain Res. 1990 、522: 290-307。
明するために別に利用することができる他の方法は、下
記の文献に記載されている：Nakayama、et al.、Neurol
ogy1988、38: 1667-1673; Memezawa 、et al.、Stroke
1992 、23: 552-559; Folbergrova、et al.、Proc. Nat
l. Acad. Sci. 1995 、92: 5057-5059 ；またはGotti
、et al.、Brain Res. 1990 、522: 290-307。
【０１８６】虚血性肝臓損傷を減少する本発明の利益
は、例えば、Yokoyama、et al. (Am.J. Physiol.1990
、258:G564-G570 ）の方法により、例えば、哺乳動物
において証明することができる。簡単に述べると、Yoko
yama、et al.の手順において、断食させる成体のＳＤラ
ットをナトリウムペントバルビタール（４０ｍｇ／ｋ
ｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔させ、次いで動物を気管切開し、
室内の空気で機械的に通気させる。肝臓を切除し、一定
温度（３７℃）に維持した環境チャンバーの中に入れ、
次いで門静脈を通して１５ｃｍのＨ2 Ｏの一定圧力にお
いて変性した無ヘモグロビンクレブス−ヘンセレイト
（Krebs-Henseleit ）緩衝液（ｍＭ：１１８ ＮａＣ
ｌ、４．７ ＫＣｌ、２７ ＮａＨＣＯ3 、２．５ Ｃ
ａＣｌ2 、１．２ＭｇＳＯ4 、１．２ＫＨ2 ＰＯ4 、
０．０５ ＥＤＴＡ、および１１ｍＭのグルコース、＋
３００Ｕのヘパリン）で灌流する。９５％Ｏ2 −５％Ｃ
Ｏ2 を緩衝液に通入することによって、灌流液のｐＨを
７．４に維持する。
は、例えば、Yokoyama、et al. (Am.J. Physiol.1990
、258:G564-G570 ）の方法により、例えば、哺乳動物
において証明することができる。簡単に述べると、Yoko
yama、et al.の手順において、断食させる成体のＳＤラ
ットをナトリウムペントバルビタール（４０ｍｇ／ｋ
ｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔させ、次いで動物を気管切開し、
室内の空気で機械的に通気させる。肝臓を切除し、一定
温度（３７℃）に維持した環境チャンバーの中に入れ、
次いで門静脈を通して１５ｃｍのＨ2 Ｏの一定圧力にお
いて変性した無ヘモグロビンクレブス−ヘンセレイト
（Krebs-Henseleit ）緩衝液（ｍＭ：１１８ ＮａＣ
ｌ、４．７ ＫＣｌ、２７ ＮａＨＣＯ3 、２．５ Ｃ
ａＣｌ2 、１．２ＭｇＳＯ4 、１．２ＫＨ2 ＰＯ4 、
０．０５ ＥＤＴＡ、および１１ｍＭのグルコース、＋
３００Ｕのヘパリン）で灌流する。９５％Ｏ2 −５％Ｃ
Ｏ2 を緩衝液に通入することによって、灌流液のｐＨを
７．４に維持する。
【０１８７】各肝臓を２０ｍｌ／分の流速で１回通過の
方法で３０分の洗浄および平衡期間（虚血前の期間）の
間灌流し、次いで全体的虚血を２時間実施し、次いで虚
血前の期間と同一の条件下に再灌流を２時間実施する。
虚血前の期間、閉塞性虚血性期間の直後、および２時間
の再灌流期間の３０毎に、灌流液のアリコート（２０ｍ
ｌ）を収集する。灌流液の試料を肝細胞の酵素、例え
ば、アスパラギン酸塩アミノ−トランスフェラーゼ（Ａ
ＳＴ）、アラニンアミノ−トランスフェラーゼ（ＡＬ
Ｔ）、および乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の出現
についてアッセイし、これらの酵素は手順の間に虚血性
肝臓組織の損傷の程度を反映させるために取る。
方法で３０分の洗浄および平衡期間（虚血前の期間）の
間灌流し、次いで全体的虚血を２時間実施し、次いで虚
血前の期間と同一の条件下に再灌流を２時間実施する。
虚血前の期間、閉塞性虚血性期間の直後、および２時間
の再灌流期間の３０毎に、灌流液のアリコート（２０ｍ
ｌ）を収集する。灌流液の試料を肝細胞の酵素、例え
ば、アスパラギン酸塩アミノ−トランスフェラーゼ（Ａ
ＳＴ）、アラニンアミノ−トランスフェラーゼ（ＡＬ
Ｔ）、および乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の出現
についてアッセイし、これらの酵素は手順の間に虚血性
肝臓組織の損傷の程度を反映させるために取る。
【０１８８】灌流液中のＡＳＴ、ＡＬＴ、およびＬＤＨ
の活性は、いくつかの方法、例えば、自動コダック・エ
クタケム５００（Kodak Ektachem）アナライザーを使用
する反射法（Nakano、et al.、Hepatology 1995 、22:5
39-545に報告されている）により測定することができ
る。プラシーボ処置対照群におけるラットからの灌流し
た肝臓に比較して、処置群におけるラットからの灌流し
た肝臓において、閉塞期間の直後および／または虚血性
後の再灌流期間の間における、肝細胞の酵素の解放の減
少に基づいて、閉塞により誘発される虚血性肝臓損傷を
減少する本発明の効果は認められる。
の活性は、いくつかの方法、例えば、自動コダック・エ
クタケム５００（Kodak Ektachem）アナライザーを使用
する反射法（Nakano、et al.、Hepatology 1995 、22:5
39-545に報告されている）により測定することができ
る。プラシーボ処置対照群におけるラットからの灌流し
た肝臓に比較して、処置群におけるラットからの灌流し
た肝臓において、閉塞期間の直後および／または虚血性
後の再灌流期間の間における、肝細胞の酵素の解放の減
少に基づいて、閉塞により誘発される虚血性肝臓損傷を
減少する本発明の効果は認められる。
【０１８９】虚血性肝臓損傷を減少する本発明の利益を
証明するために別に利用することができる他の方法およ
びパラメーターは、Nakano、et al.、Hepatology 1995
、22: 539-545 に記載されているものを包含する。本
発明は本明細書に記載する特定の態様に限定されず、本
発明の精神および範囲から逸脱しないで種々の変化およ
び変更が可能であることを理解すべきである。
証明するために別に利用することができる他の方法およ
びパラメーターは、Nakano、et al.、Hepatology 1995
、22: 539-545 に記載されているものを包含する。本
発明は本明細書に記載する特定の態様に限定されず、本
発明の精神および範囲から逸脱しないで種々の変化およ
び変更が可能であることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒト肝臓グリコーゲンホスホリラーゼ
の完全なポリペプチドの三次構造を示す図である。
の完全なポリペプチドの三次構造を示す図である。
【図２】図２は、ＧＰＩと複合体化した結合部位の残基
を示す図である。
を示す図である。
フロントページの続き (72)発明者 デニス ジェイ フーバー アメリカ合衆国，コネチカット 06340, イースタン ポイント ロード，ファイザ ー セントラル リサーチ (72)発明者 マーク アミラティ アメリカ合衆国，コネチカット 06340, イースタン ポイント ロード，ファイザ ー セントラル リサーチ
Claims (17)
- 【請求項１】 グリコーゲンホスホリラーゼインヒビタ
ーのある部分がグリコーゲンホスホリラーゼ酵素の下記
の残基の一部分または全部分とファン・デル・ワールス
または水素結合接触する、グリコーゲンホスホリラーゼ
インヒビターのためのグリコーゲンホスホリラーゼ酵素
中の結合部位： 親の二次構造 残基の番号 １３−２３ ヘリックスα１ ２４−３７ ターン ３８−３９、４３、４６−４７ ヘリックスα２ ４８−６６、６９−７０、７３−７４、７６−７８ ７９−８０ 鎖β１ ８１−８６ ８７−８８ 鎖β２ ８９−９２ ９３ ヘリックスα３ ９４−１０２ １０３ ヘリックスα４ １０４−１１５ １１６−１１７ ヘリックスα５ １１８−１２４ １２５−１２８ 鎖β３ １２９−１３１ １３２−１３３ ヘリックスα６ １３４−１５０ １５１−１５２ 鎖β４ １５３−１６０ １６１ 鎖β４ｂ １６２−１６３ １６４−１６６ 鎖β５ １６７−１７１ １７２−１７３ 鎖β６ １７４−１７８ １７９−１９０ 鎖β７ １９１−１９２ １９４、１９７ 鎖β８ １９８−２０９ ２１０−２１１ 鎖β９ ２１２−２１６ 鎖β１０ ２１９−２２６、２２８−２３２ ２３３−２３６ 鎖β１１ ２３７−２３９、２４１、２４３−２４７ ２４８−２６０ ヘリックスα７ ２６１−２７６ 鎖β１１ｂ ２７７−２８１ リバーズターン ２８２−２８９ ヘリックスα８ ２９０−３０４。 - 【請求項２】 前記インヒビターのある部分がグリコー
ゲンホスホリラーゼの下記の残基の一部分または全部分
と、１つまたは双方のサブユニットにおいてファン・デ
ル・ワールスまたは水素結合接触する、請求項１に記載
の結合部位： 親の二次構造 残基の番号 １３−２３ ヘリックスα１ ２４−３７ 回転 ３８−３９、４３、４６−４７ ヘリックスα２ ４８−６６、６９−７０、７３−７４、７６−７８ ７９−８０ 鎖β２ ９１−９２ ９３ ヘリックスα３ ９４−１０２ １０３ ヘリックスα４ １０４−１１５ １１６−１１７ ヘリックスα５ １１８−１２４ １２５−１２８ 鎖β３ １２９−１３０ 鎖β４ １５９−１６０ １６１ 鎖β４ｂ １６２−１６３ １６４−１６６ 鎖β５ １６７−１６８ 鎖β６ １７８ １７９−１９０ 鎖β７ １９１−１９２ １９４、１９７ 鎖β９ １９８−２００ 鎖β１０ ２２０−２２６ ２２８−２３２ ２３３−２３６ 鎖β１１ ２３７−２３９、２４１、２４３−２４７ ２４８−２６０ ヘリックスα７ ２６１−２７６ 鎖β１１ｂ ２７７−２８０。 - 【請求項３】 前記インヒビターのある部分がグリコー
ゲンホスホリラーゼの下記の残基の一部分または全部分
と、１つまたは双方のサブユニットにおいてファン・デ
ル・ワールスまたは水素結合接触する、請求項２に記載
のグリコーゲンホスホリラーゼインヒビターのための結
合部位：残基の番号 ３３−３９ ４９−６６ ９４ ９８ １０２ １２５−１２６ １６０ １６２ １８２−１９２ １９７ ２２４−２２６ ２２８−２３１ ２３８−２３９ ２４１ ２４５ ２４７。 - 【請求項４】 前記インヒビターのある部分がグリコー
ゲンホスホリラーゼの下記の残基の一部分または全部分
と、１つまたは双方のサブユニットにおいてファン・デ
ル・ワールスまたは水素結合接触する、請求項３に記載
のグリコーゲンホスホリラーゼインヒビターのための結
合部位：残基の番号 ３７−３９ ５３ ５７ ６０ ６３−６４ １８４−１９２ ２２６ ２２９。 - 【請求項５】 グリコーゲンホスホリラーゼインヒビタ
ーのある部分がグリコーゲンホスホリラーゼの下記の残
基の一部分または全部分と、１つまたは双方のサブユニ
ットにおいてファン・デル・ワールスまたは水素結合接
触している、グリコーゲンホスホリラーゼとグリコーゲ
ンホスホリラーゼインヒビターとの複合体：残基の番号 ３７−３９ ５３ ５７ ６０ ６３−６４ １８４−１９２ ２２６ ２２９。 - 【請求項６】 請求項５に記載の複合体の結晶。
- 【請求項７】 グリコーゲンホスホリラーゼインヒビタ
ーが下記の式Ｉ： 【化１】 式Ｉ 〔式中、 破線（−−−）は、任意の結合であり；破線（−−−）
が結合であるとき、Ａは−Ｃ（Ｈ）＝、−Ｃ（（Ｃ1 −
Ｃ4 ）アルキル）＝または−Ｃ（ハロ）＝であり、ある
いは破線（−−−）が結合でないとき、Ａはメチレンま
たは−ＣＨ（（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル）−であり；
Ｒ1 、Ｒ10またはＲ11の各々は、独立して、Ｈ、ハロ、
４−、６−もしくは７−ニトロ、シアノ、（Ｃ1 −
Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ、フルオロ
メチル、ジフルオロメチルまたはトリフルオロメチルで
あり；Ｒ2 は、Ｈであり；Ｒ3 は、Ｈまたは（Ｃ1 −Ｃ
5 ）アルキルであり；Ｒ4 は、メチル、エチル、ｎ−プ
ロピル、ヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルキル、（Ｃ1 −
Ｃ3 ）アルコキシ（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルキル、フェニル
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、フェニルヒドロキシ（Ｃ1 −
Ｃ4 ）アルキル、フェニル（Ｃ1 −Ｃ4）アルコキシ
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、チエン−２−もしくは−３−
イル（Ｃ1−Ｃ4 ）アルキル、またはフル−２−もしく
は−３−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルであり、ここでＲ
4 環はＨ、ハロ、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ
4 ）アルコキシ、トリフルオロメチル、ヒドロキシ、ア
ミノまたはシアノにより炭素上で独立して１、２または
３置換されており；あるいはＲ4 は、ピリド−２−，−
３−もしくは−４−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、チア
ゾル−２−，−４−もしくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）
アルキル、イミダゾル−１−，−２−，−４−もしくは
−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、ピロル−２−もし
くは−３−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、オキサゾル−
２−，−４−もしくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキ
ル、ピラゾル−３−，−４−もしくは−５−イル（Ｃ1
−Ｃ4 ）アルキル、イソキサゾル−３−，−４−もしく
は−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、イソチアゾル−
３−，−４−もしくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキ
ル、ピリダジン−３−もしくは−４−イル（Ｃ1 −
Ｃ4）アルキル、ピリミジン−２−，−４−，−５−も
しくは−６−イル（Ｃ1 −Ｃ 4 ）アルキル、ピラジン−
２−もしくは−３−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、また
は１，３，５−トリアジン−２−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）ア
ルキルであり、ここで前記先行するＲ4 複素環は必要に
応じてハロ、トリフルオロメチル、（Ｃ1 −Ｃ 4 ）アル
キル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ、アミノまたはヒドロ
キシにより独立して１または２置換されており、そして
前記１または２置換基は炭素に結合しており；Ｒ5 は、
ヒドロキシ、フルオロ、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル、（Ｃ
1 −Ｃ5 ）アルコキシ、（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルカノイル、
アミノ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ、モノ−Ｎ−もしくは
ジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルアミノ（Ｃ1 −Ｃ
4 ）アルコキシ、カルボキシ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキ
シ、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルコキシカルボニル（Ｃ1 −
Ｃ4 ）アルコキシ、ベンジルオキシカルボニル（Ｃ1 −
Ｃ4 ）アルコキシ、またはカルボニルオキシであり、こ
こで前記カルボニルオキシはフェニル、チアゾリル、イ
ミダゾリル、１Ｈ−インドリル、フリル、ピロリル、オ
キサゾリル、ピラゾリル、イソキサゾル、イソチアゾリ
ル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニルまたは
１，３，５−トリアジニルと炭素−炭素結合しており、
そして前記先行するＲ5 環は必要に応じてハロ、（Ｃ1
−Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ、ヒドロ
キシ、アミノまたはトリフルオロメチルにより１置換さ
れており、そして前記１置換基は炭素に結合されてお
り；Ｒ7 は、Ｈ、フリルまたは（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル
であるか；あるいはＲ5 とＲ7 は、一緒になってオキソ
であることができ；Ｒ6 は、カルボキシもしくは（Ｃ1
−Ｃ8 ）アルコキシカルボニル、Ｃ（Ｏ）ＮＲ8 Ｒ9 、
またはＣ（Ｏ）Ｒ12であり；ここでＲ8 は、Ｈ、（Ｃ1
−Ｃ3 ）アルキル、ヒドロキシまたは（Ｃ1 −Ｃ3 ）ア
ルコキシであり；そしてＲ9 は、Ｈ、（Ｃ1 −Ｃ8 ）ア
ルキル、ヒドロキシ、（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルコキシ、メチ
レン−ペルフルオロ化（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルキル、フェニ
ル、ピリジル、チエニル、フリル、ピロリル、ピロリジ
ニル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラ
ゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イソキサゾリ
ル、イソチアゾリル、ピラニル、ピペリジニル、モルホ
リニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピ
ペラジニルまたは１，３，５−トリアジニルであり、こ
こで前記先行するＲ9 環は炭素−窒素結合しているか、
あるいはＲ9 は、１、２または３置換された（Ｃ1 −Ｃ
5 ）アルキルであり、ここで前記置換基は独立してＨ、
ヒドロキシ、アミノ、モノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ−
（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルアミノであるか、あるいはＲ9
は、１または２置換（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルであり、こ
こで前記置換基は独立してフェニル、ピリジル、フリ
ル、ピロリル、ピロリジニル、オキサゾリル、チアゾリ
ル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾ
リジニル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、ピラニ
ル、ピリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピリダ
ジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペラジニルまた
は１，３，５−トリアジニルであり、 ここで非芳香族窒素含有Ｒ9 環は、必要に応じて、（Ｃ
1 −Ｃ6 ）アルキル、ベンジル、ベンゾイルまたは（Ｃ
1 −Ｃ6 ）アルコキシカルボニルにより窒素上において
１置換されており、そしてＲ9 は必要に応じてハロ、
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ、
ヒドロキシ、アミノ、またはモノ−Ｎ−もしくはジ−
Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルアミノにより炭素上に
おいて１置換されており、ただし第四級化窒素は含有さ
れず、そして窒素−酸素、窒素−窒素または窒素−ハロ
の結合は存在せず；Ｒ12は、ピペラジン−１−イル、４
−（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルピペラジン−１−イル、４−
ホルミルピペラジン−１−イル、モルホリノ、チオモル
ホリノ、１−オキソチオモルホリノ、１，１−ジオキソ
−チオモルホリノ、チアゾリジン−３−イル、１−オキ
ソチアゾリジン−３−イル、１，１−ジオキソ−チアゾ
リジン−３−イル、２−（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシカル
ボニルピロリジン−１−イル、オキサゾリジン−３−イ
ルまたは２（Ｒ）−ヒドロキシメチルピロリジン−１−
イルであるか；あるいはＲ12は、３−および／または４
−１または２置換オキサゼチジン−２−イル、２−，４
−および／または５−１または２置換オキサゾリジン−
３−イル、２−，４−および／または５−１または２置
換チアゾリジン−３−イル、２−，４−および／または
５−１または２置換１−オキソチアゾリジン−３−イ
ル、２−，４−および／または５−１または２置換１，
１−ジオキソチアゾリジン−３−イル、３−および／ま
たは４−１または２置換ピロリジン−１−イル、３−，
４−および／または５−１，２または３置換ピペリジン
−１−イル、３−，４−および／または５−１，２また
は３置換ピペラジン−１−イル、３−置換アゼチジン−
１−イル、４−および／または５−１または２置換１，
２−オキサジナン−２−イル、３−および／または４−
１または２置換ピラゾリジン−１−イル、４−および／
または５−１または２置換イソキサゾリジン−２−イ
ル、あるいは４−および／または５−１または２置換イ
ソチアゾリジン−２−イルであり、ここで前記Ｒ12の置
換基は独立してＨ、ハロ、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル、ヒ
ドロキシ、アミノ、モノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ−
（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルアミノ、ホルミル、オキソ、ヒ
ドロキシイミノ、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルコキシ、カルボキ
シ、カルバモイル、モノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ−
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルカルバモイル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）
アルコキシイミノ、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシメトキ
シ、（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシカルボニル、カルボキシ
（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル、またはヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ
5 ）アルキルであり；ただしＲ4 がＨ、メチル、エチル
またはｎ−プロピルである場合、Ｒ5 はＯＨであり；た
だしＲ5 およびＲ7 がＨであるとき、Ｒ4 はＨ、メチ
ル、エチル、ｎ−プロピル、ヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ3 ）
アルキルまたは（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルコキシ（Ｃ 1 −
Ｃ3 ）アルキルではなく、そしてＲ6 はＣ（Ｏ）ＮＲ8
Ｒ9 、Ｃ（Ｏ）Ｒ12または（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシカ
ルボニルである〕を有する、請求項６に記載の結晶ある
いはその薬学上許容される塩またはプロドラッグ。 - 【請求項８】 グリコーゲンホスホリラーゼインヒビタ
ーが下記の式ＩＩ： 【化２】 式ＩＩ 〔式中、 破線（−−−）は任意の結合であり；破線（−−−）が
結合であるとき、Ａは−Ｃ（Ｈ）＝、−Ｃ（（Ｃ1 −Ｃ
4 ）アルキル）＝、−Ｃ（ハロ）＝または−Ｎ＝である
か、あるいは破線（−−−）が結合でないとき、Ａはメ
チレンまたは−ＣＨ（（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル）−であ
り；Ｒ1 、Ｒ10またはＲ11の各々は、独立して、Ｈ、ハ
ロ、４−、６−もしくは７−ニトロ、（Ｃ1 −Ｃ4 ）ア
ルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ、フルオロメチル、
ジフルオロメチルまたはトリフルオロメチルであり；Ｒ
2 は、Ｈであり；Ｒ3 は、Ｈまたは（Ｃ1 −Ｃ5 ）アル
キルであり；Ｒ4 は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、
ヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ3 ）ア
ルコキシ（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルキル、フェニル（Ｃ1 −Ｃ
4 ）アルキル、フェニルヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アル
キル、（フェニル）（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ）（Ｃ1
−Ｃ4 ）アルキル、チエン−２−もしくは−３−イル
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、またはフル−２−もしくは−
３−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルであり、ここでＲ4 環
はＨ、ハロ、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）
アルコキシ、トリフルオロメチル、ヒドロキシ、アミ
ノ、シアノまたは４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾル
−２−イルにより炭素上で独立して１、２または３置換
されており；あるいはＲ4 は、ピリド−２−，−３−も
しくは−４−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、チアゾル−
２−，−４−もしくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキ
ル、イミダゾル−２−，−４−もしくは−５−イル（Ｃ
1 −Ｃ4 ）アルキル、ピロル−２−もしくは−３−イル
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、オキサゾル−２−，−４−も
しくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、ピラゾル−
３−，−４−もしくは−５−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキ
ル、イソキサゾル−３−，−４−もしくは−５−イル
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、イソチアゾル−３−，−４−
もしくは−５−イル（Ｃ1−Ｃ4 ）アルキル、ピリダジ
ン−３−もしくは−４−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、
ピリミジン−２−，−４−，−５−もしくは−６−イル
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、ピラジン−２−もしくは−３
−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、１，３，５−トリアジ
ン−２−イル（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、またはインドル
−２−（Ｃ1−Ｃ4 ）アルキルであり、ここで前記先行
するＲ4 複素環は、必要に応じて、ハロ、トリフルオロ
メチル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アル
コキシ、アミノ、ヒドロキシまたはシアノにより独立し
て１または２置換されており、そして前記置換基は炭素
に結合しており；あるいはＲ4 は、Ｒ15−カルボニルオ
キシメチルであり、ここで前記Ｒ15はフェニル、チアゾ
リル、イミダゾリル、1 Ｈ−インドリル、フリル、ピロ
リル、オキサゾリル、ピラゾリル、イソキサゾリル、イ
ソチアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニ
ル、ピラジニルまたは１，３，５−トリアジニルであ
り、ここで前記先行するＲ15環は必要に応じてハロ、ア
ミノ、ヒドロキシ、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −
Ｃ4 ）アルコキシまたはトリフルオロメチルにより独立
して１または２置換されており、そして前記１または２
置換基は炭素に結合しており；Ｒ5 は、Ｈ、メチル、エ
チル、ｎ−プロピル、ヒドロキシメチルまたはヒドロキ
シエチルであり；Ｒ6 は、カルボキシ、（Ｃ1 −Ｃ8 ）
アルコキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニル
であり；ここでＲ8 は、（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルキル、シク
ロ（Ｃ3 −Ｃ6 ）アルキル、シクロ（Ｃ3 −Ｃ6 ）アル
キル（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル、ヒドロキシまたは（Ｃ1
−Ｃ8）アルコキシであり；そしてＲ9 は、シクロ（Ｃ
3 −Ｃ8 ）アルキル、シクロ（Ｃ3 −Ｃ8 ）アルキル
（Ｃ 1 −Ｃ5 ）アルキル、シクロ（Ｃ4 −Ｃ7 ）アルケ
ニル、シクロ（Ｃ3 −Ｃ7 ）アルキル（Ｃ1 −Ｃ5 ）ア
ルコキシ、シクロ（Ｃ3 −Ｃ7 ）アルキルオキシ、ヒド
ロキシ、メチレン−過フッ素化（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルキ
ル、フェニルまたは複素環であり、ここで前記複素環は
ピリジル、フリル、ピロリル、ピロリジニル、オキサゾ
リル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピラゾ
リニル、ピラゾリジニル、イソキサゾリル、イソチアゾ
リル、ピラニル、ピリジニル、ピペリジニル、モルホリ
ニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペ
ラジニル、１，３，５−トリアジニル、ベンゾチアゾリ
ル、ベンゾキサゾリル、ベンズイミダゾリル、チオクロ
マニルまたはテトラヒドロベンゾチアゾリルであり、こ
こで前記複素環は炭素−窒素結合しており、あるいはＲ
9 は、（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルキルまたは（Ｃ1 −Ｃ8 ）ア
ルコキシであり、ここで前記（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルキルま
たは（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルコキシは、必要に応じて、シク
ロ（Ｃ4 −Ｃ7 ）アルケン−１−イル、フェニル、チエ
ニル、ピリジル、フリル、ピロリル、ピロリジニル、オ
キサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、
ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イソキサゾリル、イソ
チアゾリル、ピラニル、ピペリジニル、モルホリニル、
チオモルホリニル、１−オキソチオモルホリニル、１，
１−ジオキソチオモルホリニル、ピリダジニル、ピリミ
ジニル、ピラジニル、ピペラジニル、１，３，５−トリ
アジニルまたはインドリルにより１置換されており、そ
して前記（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルキルまたは（Ｃ1 −Ｃ8 ）
アルコキシは必要に応じてさらに独立してハロ、ヒドロ
キシ、（Ｃ1 −Ｃ 5 ）アルコキシ、アミノ、モノ−Ｎ−
もしくはジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルアミノ、
シアノ、カルボキシまたは（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシカ
ルボニルにより１または２置換されており；そしてここ
でＲ9 環は、必要に応じて且つ独立して、ハロ、（Ｃ1
−Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ、ヒドロ
キシ、ヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、アミノ（Ｃ
1 −Ｃ4 ）アルキル、モノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ−
（Ｃ1 −Ｃ 4 ）アルキルアミノ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキ
ル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシ（Ｃ1−Ｃ4 ）アルキ
ル、アミノ、モノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1 −
Ｃ4 ）アルキルアミノ、シアノ、カルボキシ、（Ｃ1 −
Ｃ5 ）アルコキシカルボニル、カルバモイル、ホルミ
ル、またはトリフルオロメチルにより炭素上において１
または２置換されており、そして前記Ｒ9 環は必要に応
じてさらに独立して（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルまたはハロ
により１または２置換されており；ただしいずれのＲ9
複素環上においても第四級化窒素は存在せず；Ｒ12はモ
ルホリノ、チオモルホリノ、１−オキソチオモルホリ
ノ、１，１−ジオキソチオモルホリノ、チアゾリジン−
３−イル、１−オキソチアゾリジン−３−イル、１，１
−ジオキソチアゾリジン−３−イル、ピロリジン−１−
イル、ピペリジン−１−イル、ピペラジン−１−イル、
ピペラジン−４−イル、アゼチジン−１−イル、１，２
−オキサジナン−２−イル、ピラゾリジン−１−イル、
イソキサゾリジン−２−イル、イソチアゾリジン−２−
イル、１，２−オキサゼチジン−２−イル、オキサゾリ
ジン−３−イル、３，４−ジヒドロイソキノリン−２−
イル、１，３−ジヒドロイソインドル−２−イル、３，
４−ジヒドロ−２Ｈ−キノルー１−イル、２，３−ジヒ
ドロ−ベンゾ［１，４］オキサジン−４−イル、２，３
−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］チアジン−４−イル、
３，４−ジヒドロ−２Ｈ−キノキサリンー１−イル、
３，４−ジヒドロ−ベンゾ［ｃ］［１，２］オキサジン
−１−イル、１，４−ジヒドロ−ベンゾ［ｄ］［１，
２］オキサジン−３−イル、３，４−ジヒドロ−ベンゾ
［ｅ］［１，２］オキサジン−２−イル、３Ｈ−ベンゾ
［ｄ］イソキサゾル−２−イル、３Ｈ−ベンゾ［ｃ］イ
ソキサゾル−１−イル、またはアゼパン−１−イルであ
り、 ここで前記Ｒ12環は、必要に応じて且つ独立して、ハ
ロ、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルコキ
シ、ヒドロキシ、アミノ、モノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，
Ｎ−（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルアミノ、ホルミル、カルボ
キシ、カルバモイル、モノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ−
（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルカルバモイル、（Ｃ1 −Ｃ6 ）
アルコキシ（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルコキシ、（Ｃ1 −Ｃ5 ）
アルコキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、
（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルコキシカルボニル（Ｃ1 −Ｃ5 ）ア
ルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシカルボニルアミノ、
カルボキシ（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル、カルバモイル（Ｃ
1 −Ｃ5 ）アルキル、モノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ−
（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルカルバモイル（Ｃ1 −Ｃ5 ）ア
ルキル、ヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル、（Ｃ1 −
Ｃ4 ）アルコキシ（Ｃ1−Ｃ4 ）アルキル、アミノ（Ｃ
1 −Ｃ4 ）アルキル、モノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ−
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルアミノ（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキ
ル、オキソ、ヒドロキシイミノ、または（Ｃ1 −Ｃ6 ）
アルコキシイミノにより１、２または３置換されてお
り、そして２以下の置換基はオキソ、ヒドロキシイミノ
または（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシイミノから選択され、
そしてオキソ、ヒドロキシイミノまたは（Ｃ1 −Ｃ6 ）
アルコキシイミノは非芳香族炭素上に存在し；そしてこ
こで前記Ｒ12環は、必要に応じて且つ独立して、（Ｃ1
−Ｃ5 ）アルキルまたはハロにより１または２置換され
ており；ただしＲ6 が（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルコキシカルボ
ニルまたはベンジルオキシカルボニルであるとき、Ｒ1
は５−ハロ、５−（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルまたは５−シ
アノであり且つＲ4 は（フェニル）（ヒドロキシ）（Ｃ
1 −Ｃ4 ）アルキル、（フェニル）（（（Ｃ1 −Ｃ4 ）
アルコキシ）（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、ヒドロキシメチ
ルまたはＡｒ（Ｃ1 −Ｃ2 ）アルキルであり、ここでＡ
ｒはチエン−２−もしくは−３−イル、フル−２−もし
くは−３−イルまたはフェニルであり、ここで前記Ａｒ
は必要に応じて独立してハロにより１または２置換され
ており、ただしＲ4 がベンジルでありかつＲ5 がメチル
であるとき、Ｒ12は４−ヒドロキシ−ピペリジン−１−
イルではなく、あるいはＲ4 がベンジルでありかつＲ5
がメチルであるとき、Ｒ6 はＣ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ3 ）2 で
はなく；ただしＲ1 およびＲ10およびＲ11がＨであると
き、Ｒ4 はイミダゾル−４−イルメチル、２−フェニル
エチルまたは２−ヒドロキシ−２−フェニルエチルでは
なく；ただしＲ8 およびＲ9 の双方がｎ−ペンチルであ
るとき、Ｒ1 は５−クロロ、５−ブロモ、５−シアノ、
５（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル、５（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルコキ
シまたはトリフルオロメチルであり；ただしＲ12が３，
４−ジヒドロイソキノール−２−イルであるとき、前記
３，４−ジヒドロイソキノール−２−イルはカルボキシ
（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキルで置換されていず；ただしＲ8
がＨでありかつＲ9 が（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルキルであると
き、Ｒ9 はＮＨＲ9 の窒素原子Ｎに結合する炭素上にお
いてカルボキシまたは（Ｃ1 −Ｃ4）アルコキシカルボ
ニルにより置換されておらず；そしてただしＲ6 がカル
ボキシでありかつＲ1 、Ｒ10、Ｒ11およびＲ5 のすべて
がＨであるとき、Ｒ4 はベンジル、Ｈ、（フェニル）
（ヒドロキシ）メチル、メチル、エチルまたはｎ−プロ
ピルではない〕を有する、請求項６に記載の結晶または
その薬学上許容される塩またはプロドラッグ。 - 【請求項９】 グリコーゲンホスホリラーゼインヒビタ
ーが下記の式ＩＩＩ： 【化３】 式ＩＩＩ 〔式中、 Ｒ1 は、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル；（Ｃ3 −Ｃ7 ）シク
ロアルキル；フェニル；または３つまでの（Ｃ1 −
Ｃ4 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルコキシもしくはハ
ロゲンにより置換されたフェニルであり；Ｒ2 は、（Ｃ
1 −Ｃ4 ）アルキルであり；そしてＲ3 は、（Ｃ3 −Ｃ
7 ）シクロアルキル；フェニル；パラ位において（Ｃ1
−Ｃ4 ）アルキル、ハロ、ヒドロキシ（Ｃ1 −Ｃ4 ）ア
ルキルもしくはトリフルオロメチルにより置換されたフ
ェニル；メタ位においてフルオロにより置換されたフェ
ニル；またはオルト位においてフルオロで置換されたフ
ェニルである〕を有する、請求項６に記載の結晶または
そのプロドラッグまたは前記化合物または前記プロドラ
ッグの薬学上許容される塩。 - 【請求項１０】 前記グリコーゲンホスホリラーゼがヒ
トの肝臓のグリコーゲンホスホリラーゼであり、そして
下記の物理学的測定値： スペースグループ Ｐ３1 ユニットセル： ａ＝ｂ＝１２４．６３オングストローム ｃ＝１２４．０６オングストローム α＝β＝９０．００度 δ＝１２０．００度 前記値は下記の次元の変動性を有するユニットセルにお
いて測定された： ａ １２３．４− １２４．６３Å（１％） ｂ １２２．２２− １２４．０６Å（１．５％）； を有する、請求項７に記載の結晶。 - 【請求項１１】 前記グリコーゲンホスホリラーゼがヒ
トの肝臓のグリコーゲンホスホリラーゼであり、そして
下記の物理学的測定値： スペースグループ Ｐ３1 ユニットセル： ａ＝ｂ＝１２４．６３オングストローム ｃ＝１２４．０６オングストローム α＝β＝９０．００度 δ＝１２０．００度 前記値は下記の次元の変動性を有するユニットセルにお
いて測定された： ａ １２３．４− １２４．６３Å（１％） ｂ １２２．２２− １２４．０６Å（１．５％）； を有する、請求項８に記載の結晶。 - 【請求項１２】 前記グリコーゲンホスホリラーゼがヒ
トの肝臓のグリコーゲンホスホリラーゼであり、そして
下記の物理学的測定値： スペースグループ Ｐ３1 ユニットセル： ａ＝ｂ＝１２４．６３オングストローム ｃ＝１２４．０６オングストローム α＝β＝９０．００度 δ＝１２０．００度 前記値は下記の次元の変動性を有するユニットセルにお
いて測定された： ａ １２３．４− １２４．６３Å（１％） ｂ １２２．２２− １２４．０６Å（１．５％）； を有する、請求項９に記載の結晶。 - 【請求項１３】 請求項５に記載の複合体の形成を検出
する方法。 - 【請求項１４】 結合したリガンドの結合部位からの除
去に頼る、請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 請求項５に記載の複合体の形成に基づ
く、ヒトの肝臓のグリコーゲンホスホリラーゼの阻害を
測定する方法。 - 【請求項１６】 ヒトの肝臓のグリコーゲンホスホリラ
ーゼのインヒビターを設計する方法であって； ａ） グリコーゲンホスホリラーゼに結合する化合物の
複合体を形成し； ｂ） 工程（ａ）における複合体の構造的特徴、特に前
記化合物のための結合部位の構造的特徴を測定し；そし
て ｃ） 工程（ｂ）において測定された構造的特徴、特に
工程（ａ）の前記化合物のための結合部位の構造的特
徴、または前記構造的特徴をベースとするモデルを使用
して、請求項２に記載の結合部位に結合することができ
るヒトの肝臓のグリコーゲンホスホリラーゼインヒビタ
ーを設計する；工程を含んで成る方法。 - 【請求項１７】 高血糖症、高インスリン血症、高脂血
症、インスリン抵抗性または組織虚血のための指標を有
する哺乳動物を治療する方法であって、 ａ） グリコーゲンホスホリラーゼに結合する化合物の
複合体を形成し； ｂ） 工程（ａ）における複合体の構造的特徴、特に前
記化合物のための結合部位の構造的特徴を測定し； ｃ） 工程（ｂ）において測定された構造的特徴、特に
工程（ａ）の前記化合物のための結合部位の構造的特
徴、または前記構造的特徴をベースとするモデルを使用
して、請求項２に記載の結合部位に結合することができ
るヒトの肝臓のグリコーゲンホスホリラーゼインヒビタ
ーを設計し；そして ｄ） 治療を必要とする患者に工程ｃ）の化合物を投与
する；工程を含んで成る方法。
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