JP2000050876A - 遺伝子の特殊一本鎖核酸部位の検出用プローブ、遺伝子の特殊一本鎖核酸部位の検出方法およびその装置 - Google Patents
遺伝子の特殊一本鎖核酸部位の検出用プローブ、遺伝子の特殊一本鎖核酸部位の検出方法およびその装置Info
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- JP2000050876A JP2000050876A JP10227019A JP22701998A JP2000050876A JP 2000050876 A JP2000050876 A JP 2000050876A JP 10227019 A JP10227019 A JP 10227019A JP 22701998 A JP22701998 A JP 22701998A JP 2000050876 A JP2000050876 A JP 2000050876A
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- C07F17/02—Metallocenes of metals of Groups 8, 9 or 10 of the Periodic System
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- Organic Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 遺伝子のヘアピン構造、バルジなどの特殊一
本鎖核酸部位の検出に使用できる検出用プローブを提供
する。 【解決手段】 遺伝子の特殊一本鎖核酸部位と特異的に
結合し、電気化学的応答を発生する検出用プローブが、
フェロセンとナフタレンジイミドとを含む環状リガンド
からなる。フェロセンとナフタレンジイミドとの間の電
荷移動に基づく電流を、特殊一本鎖核酸部位と環状リガ
ンドとの結合によって抑制する。本発明の環状リガンド
は、特殊一本鎖核酸部位と特異的に結合し、二本鎖部位
とは結合しない。
本鎖核酸部位の検出に使用できる検出用プローブを提供
する。 【解決手段】 遺伝子の特殊一本鎖核酸部位と特異的に
結合し、電気化学的応答を発生する検出用プローブが、
フェロセンとナフタレンジイミドとを含む環状リガンド
からなる。フェロセンとナフタレンジイミドとの間の電
荷移動に基づく電流を、特殊一本鎖核酸部位と環状リガ
ンドとの結合によって抑制する。本発明の環状リガンド
は、特殊一本鎖核酸部位と特異的に結合し、二本鎖部位
とは結合しない。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の特殊一本
鎖核酸部位の検出用プローブ、およびこれを利用した検
出方法、検出装置に関するものである。
鎖核酸部位の検出用プローブ、およびこれを利用した検
出方法、検出装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】センサーおよびセンシング技術は、産業
界のあらゆる分野で利用されている。特にバイオテクノ
ロジーの分野においては、酵素反応を利用した高感度セ
ンシングシステムが確立されている。今日、遺伝子治
療、遺伝子診断など、遺伝子をセンシングすることの重
要性がますます増大している。現在、遺伝子のセンシン
グとして、ＤＮＡプローブ法がある。
界のあらゆる分野で利用されている。特にバイオテクノ
ロジーの分野においては、酵素反応を利用した高感度セ
ンシングシステムが確立されている。今日、遺伝子治
療、遺伝子診断など、遺伝子をセンシングすることの重
要性がますます増大している。現在、遺伝子のセンシン
グとして、ＤＮＡプローブ法がある。
【０００３】遺伝子上の特殊一本鎖核酸部位とは、ガン
化したＤＮＡのミスマッチ構造やウイルスのＲＮＡのヘ
アピン構造、バルジなどのように、ＤＮＡまたはＲＮＡ
の高次構造の一部に存在しており、一本鎖核酸の塩基が
スタックしていない部位のこである。
化したＤＮＡのミスマッチ構造やウイルスのＲＮＡのヘ
アピン構造、バルジなどのように、ＤＮＡまたはＲＮＡ
の高次構造の一部に存在しており、一本鎖核酸の塩基が
スタックしていない部位のこである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ＤＮＡプローブ法は、
ほとんどが手作業に頼っている。このため、ＤＮＡプロ
ーブ型センサーとは異なり、遺伝子の特殊一本鎖核酸部
位を迅速に検出するための遺伝子センサーが要望されて
いる。しかし、これに関する報告例、特許は知られてい
ない。
ほとんどが手作業に頼っている。このため、ＤＮＡプロ
ーブ型センサーとは異なり、遺伝子の特殊一本鎖核酸部
位を迅速に検出するための遺伝子センサーが要望されて
いる。しかし、これに関する報告例、特許は知られてい
ない。
【０００５】本発明の課題は、遺伝子の特殊一本鎖核酸
部位の検出に使用できる検出用プローブを提供すること
であり、またこのプローブを利用した検出方法、検出装
置を提供することである。
部位の検出に使用できる検出用プローブを提供すること
であり、またこのプローブを利用した検出方法、検出装
置を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、遺伝子の特殊
一本鎖核酸部位と特異的に結合し、電気化学的応答を発
生する検出用プローブであって、フェロセンとナフタレ
ンジイミドとを含む環状リガンドからなる検出用プロー
ブに係るものである。
一本鎖核酸部位と特異的に結合し、電気化学的応答を発
生する検出用プローブであって、フェロセンとナフタレ
ンジイミドとを含む環状リガンドからなる検出用プロー
ブに係るものである。
【０００７】また、本発明は、遺伝子の特殊一本鎖核酸
部位を検出する方法であって、測定対象である遺伝子
を、前記プローブに結合させ、この結合に伴う電気化学
的応答を検出することを特徴とする方法に係るものであ
る。
部位を検出する方法であって、測定対象である遺伝子
を、前記プローブに結合させ、この結合に伴う電気化学
的応答を検出することを特徴とする方法に係るものであ
る。
【０００８】本発明者は、遺伝子上の特殊一本鎖核酸部
位をターゲットとし、この部位が存在した場合にのみ電
気化学的応答を発生する環状リガンドを開発することに
成功した。これによって、ＤＮＡまたはＲＮＡの特殊一
本鎖核酸部位を迅速かつ高感度でセンシングするシステ
ムを確立できる。また、従来は、ターゲット遺伝子に応
じてＤＮＡプローブを作製していたが、本発明の検出用
プローブは、特殊一本鎖核酸部位を有するすべての遺伝
子に対して適用できる。
位をターゲットとし、この部位が存在した場合にのみ電
気化学的応答を発生する環状リガンドを開発することに
成功した。これによって、ＤＮＡまたはＲＮＡの特殊一
本鎖核酸部位を迅速かつ高感度でセンシングするシステ
ムを確立できる。また、従来は、ターゲット遺伝子に応
じてＤＮＡプローブを作製していたが、本発明の検出用
プローブは、特殊一本鎖核酸部位を有するすべての遺伝
子に対して適用できる。
【０００９】遺伝子上の特殊一本鎖核酸部位とは、ガン
化したＤＮＡに頻繁に見られるミスマッチ構造や、ウイ
ルスのＲＮＡヘアピン構造、バルジ構造などの高次構造
の一部である。これらの特殊核酸構造は、基本的には一
本鎖核酸構造を有しているが、通常は二本鎖核酸と混在
しているため、通常の一本鎖核酸と比べるとひずんでお
り、仮に連続した一本鎖（バルジやヘアピン構造の場
合）であっても、それ同士は、通常の一本鎖核酸に存在
するスタッキング様式とまったく異なっている。例え
ば、脆弱Ｘ症候群は、反復したヘアピン構造がその発病
に深く係わっている。ＨＩＶウイルスにおいても、ＴＡ
Ｒ−ＲＮＡやＲＥＥ−ＲＮＡに存在するミスマッチ、ヘ
アピン、バルジ構造が保存されており、これらの構造が
ＨＩＶの機能発現に必須である。
化したＤＮＡに頻繁に見られるミスマッチ構造や、ウイ
ルスのＲＮＡヘアピン構造、バルジ構造などの高次構造
の一部である。これらの特殊核酸構造は、基本的には一
本鎖核酸構造を有しているが、通常は二本鎖核酸と混在
しているため、通常の一本鎖核酸と比べるとひずんでお
り、仮に連続した一本鎖（バルジやヘアピン構造の場
合）であっても、それ同士は、通常の一本鎖核酸に存在
するスタッキング様式とまったく異なっている。例え
ば、脆弱Ｘ症候群は、反復したヘアピン構造がその発病
に深く係わっている。ＨＩＶウイルスにおいても、ＴＡ
Ｒ−ＲＮＡやＲＥＥ−ＲＮＡに存在するミスマッチ、ヘ
アピン、バルジ構造が保存されており、これらの構造が
ＨＩＶの機能発現に必須である。
【００１０】本発明では、フェロセンとナフタレンジイ
ミドとを縮合させ、環状の環状リガンドを得る。代表的
な製造例を図１に示す。この代表的な環状リガンドの名
称は、サイクリックナフタレンジイミドフェロセン（以
下、ＣＮＤＩＦｃと呼ぶ）である。本発明の環状リガン
ドは、フェロセンの両端にアミド基が結合しており、こ
のアミド基とナフタレンジイミドとは、連結基を介して
連結されている構造を有する。
ミドとを縮合させ、環状の環状リガンドを得る。代表的
な製造例を図１に示す。この代表的な環状リガンドの名
称は、サイクリックナフタレンジイミドフェロセン（以
下、ＣＮＤＩＦｃと呼ぶ）である。本発明の環状リガン
ドは、フェロセンの両端にアミド基が結合しており、こ
のアミド基とナフタレンジイミドとは、連結基を介して
連結されている構造を有する。
【００１１】この連結基は、アミノ基を含むアルキル基
が好ましく、特に以下のものが好ましい。１，４−ビス
（３−アミノプロピル）ピペラジン、１．１’−ビス
（３−アミノプロピル）メチルアミン、１．１’−ビス
（２−アミノエチル）アミン、１，１’−ビス（３−ア
ミノプロピル）アミン、スペルミン、スペルミジンなど
が好ましく、特に以下のものが好ましい。１，４−ビス
（３−アミノプロピル）ピペラジン、１．１’−ビス
（３−アミノプロピル）メチルアミン、１．１’−ビス
（２−アミノエチル）アミン、１，１’−ビス（３−ア
ミノプロピル）アミン、スペルミン、スペルミジンなど
【００１２】本発明の環状リガンドを製造する際には、
ナフタレンジイミドの両端に、前記のアルキル置換基を
設け、アルキル置換基の端部にアミノ基を設けてジアミ
ノ体を得、このジアミノ体をフェロセンジカルボン酸と
反応させる。
ナフタレンジイミドの両端に、前記のアルキル置換基を
設け、アルキル置換基の端部にアミノ基を設けてジアミ
ノ体を得、このジアミノ体をフェロセンジカルボン酸と
反応させる。
【００１３】以下、更に具体的に本発明を説明する。本
発明の検出装置は、容器中に前記環状リガンドを含有す
る溶液を収容する容器と、遺伝子によって修飾されてい
る作用極と、作用極に対する対極とを備えており、作用
極と対極とが溶液中に浸漬されているものである。本装
置は、好ましくは、更に参照極を備えている。
発明の検出装置は、容器中に前記環状リガンドを含有す
る溶液を収容する容器と、遺伝子によって修飾されてい
る作用極と、作用極に対する対極とを備えており、作用
極と対極とが溶液中に浸漬されているものである。本装
置は、好ましくは、更に参照極を備えている。
【００１４】作用極、対極、参照極は、例えば金、グラ
ッシーカーボン、炭素によって形成できる。測定対象で
ある遺伝子は、公知の方法によって作用極に対して固定
化できる。例えば、作用極が金である場合には、遺伝子
にチオール基を導入し、金とイオウとの金−イオウ配位
結合を介して遺伝子を作用極に結合させ得る。遺伝子を
金作用極に結合させる方法は、例えば、Ｂ．Ａ．Connol
ly, Nucleic acids Res.13, 4484, 1985年に記載されて
いる。また、グラッシーカーボンからなる作用極を過マ
ンガン酸カリウムで酸化することによって、作用極の表
面にカルボン酸を導入し、核酸のアミノ基とカルボン酸
とを結合させることで、作用極に遺伝子を固定化でき
る。この方法は、Kelly M. Mollan and Susan R. Mikke
lsen, Analitical Chemistry 65, 2317-2323(1993)に記
載されている。
ッシーカーボン、炭素によって形成できる。測定対象で
ある遺伝子は、公知の方法によって作用極に対して固定
化できる。例えば、作用極が金である場合には、遺伝子
にチオール基を導入し、金とイオウとの金−イオウ配位
結合を介して遺伝子を作用極に結合させ得る。遺伝子を
金作用極に結合させる方法は、例えば、Ｂ．Ａ．Connol
ly, Nucleic acids Res.13, 4484, 1985年に記載されて
いる。また、グラッシーカーボンからなる作用極を過マ
ンガン酸カリウムで酸化することによって、作用極の表
面にカルボン酸を導入し、核酸のアミノ基とカルボン酸
とを結合させることで、作用極に遺伝子を固定化でき
る。この方法は、Kelly M. Mollan and Susan R. Mikke
lsen, Analitical Chemistry 65, 2317-2323(1993)に記
載されている。
【００１５】測定すべき遺伝子を、そのまま、またはポ
リメラーゼ連鎖反応法によって増幅した後に、メルカプ
トエタノールと１−エチル−３−（３’−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣＩ）とによってチ
オール基を導入し、次いで金電極に化学吸着により固定
化する。この金電極を作用極とする。作用極、対極、参
照極を有するセルの中で、環状リガンドの存在下に、電
気化学的測定を行う。フェロセンの酸化還元に由来する
電流値より、遺伝子上の特殊一本鎖核酸部位の有無およ
び／または存在量を決定する。電流値を検出する手段
（装置）としては、サイクリックボルタモグラム、デフ
ァレンシャルパルスボルタモグラム、ポテンシォスタッ
トが挙げられる。
リメラーゼ連鎖反応法によって増幅した後に、メルカプ
トエタノールと１−エチル−３−（３’−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣＩ）とによってチ
オール基を導入し、次いで金電極に化学吸着により固定
化する。この金電極を作用極とする。作用極、対極、参
照極を有するセルの中で、環状リガンドの存在下に、電
気化学的測定を行う。フェロセンの酸化還元に由来する
電流値より、遺伝子上の特殊一本鎖核酸部位の有無およ
び／または存在量を決定する。電流値を検出する手段
（装置）としては、サイクリックボルタモグラム、デフ
ァレンシャルパルスボルタモグラム、ポテンシォスタッ
トが挙げられる。
【００１６】溶液中には、本発明の環状リガンドの他、
燐酸緩衝液やその他の塩類を添加できる。なお、溶液の
条件を以下のように制御することで、本発明の環状リガ
ンドが、特殊一本鎖核酸部位に対して特異的に結合し、
二本鎖核酸部位にはほとんど結合しなくなる。即ち、環
状リガンドの含有量は、1 −５０μＭ（マイクロモル）
が好ましい。塩類としては、カリウム、ナトリウムなど
のアルカリ金属類の塩が好ましい。リン酸緩衝液の含有
量は１０−１００ｍＭが好ましく、塩類の含有量は１０
−５０ｍＭが好ましい。
燐酸緩衝液やその他の塩類を添加できる。なお、溶液の
条件を以下のように制御することで、本発明の環状リガ
ンドが、特殊一本鎖核酸部位に対して特異的に結合し、
二本鎖核酸部位にはほとんど結合しなくなる。即ち、環
状リガンドの含有量は、1 −５０μＭ（マイクロモル）
が好ましい。塩類としては、カリウム、ナトリウムなど
のアルカリ金属類の塩が好ましい。リン酸緩衝液の含有
量は１０−１００ｍＭが好ましく、塩類の含有量は１０
−５０ｍＭが好ましい。
【００１７】以下、具体的な実験結果について述べる。
図１のスキームに従って環状リガンドを合成した。
図１のスキームに従って環状リガンドを合成した。
【００１８】（アミン体の合成）１，４，５，８−ナフ
タレンテトラカルボン酸二無水物２ｇ（７．４５ｍｍｏ
ｌ）と１，４−（３−アミノプロピル）ピペラジン４０
ｍｌ（１９０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン３０ｍｌ
中で８時間還流した。室温まで冷却した後、そのままヘ
キサンに沈殿させ、結晶を濾過により回収した。この結
晶を、最小量のクロロホルムに溶解させ、エーテル中で
再沈殿させた。沈殿物を除去し、エーテルを減圧除去し
た。得られた結晶をクロロホルムに再度溶解させ、ヘキ
サン中で沈殿させ、結晶を回収した。結晶の収量が３３
０ｍｇ、収率５２％であった。結晶の特性は以下のとお
りである。
タレンテトラカルボン酸二無水物２ｇ（７．４５ｍｍｏ
ｌ）と１，４−（３−アミノプロピル）ピペラジン４０
ｍｌ（１９０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン３０ｍｌ
中で８時間還流した。室温まで冷却した後、そのままヘ
キサンに沈殿させ、結晶を濾過により回収した。この結
晶を、最小量のクロロホルムに溶解させ、エーテル中で
再沈殿させた。沈殿物を除去し、エーテルを減圧除去し
た。得られた結晶をクロロホルムに再度溶解させ、ヘキ
サン中で沈殿させ、結晶を回収した。結晶の収量が３３
０ｍｇ、収率５２％であった。結晶の特性は以下のとお
りである。
【００１９】赤褐色固体 融点 ３００℃1 Ｈ−ＮＭＲ ケミカルシフト（ＣＤＣｌ3 、ｐｐｍ） １．５８、１．９５、２．２７−２．５２、２．７１、
４．２８、８．７５ ＩＲ Ｃ＝Ｏ １６５０ｃｍ- 1
４．２８、８．７５ ＩＲ Ｃ＝Ｏ １６５０ｃｍ- 1
【００２０】（１，１’−フェロセンジカルボン酸の活
性エステルの合成）１，１’−フェロセンジカルボン酸
０．１４ｇ（０．５ｍｍｏｌ）を１５ｍｌのＤＭＦに溶
かした。この溶液に、ＰＯＢ試薬０．６６ｇ（１．５ｍ
ｍｏｌ）とトリエチルアミン０．２１ｍｌ（１．５ｍｍ
ｏｌ）とを溶かした５ｍｌのＤＭＦ溶液を滴下した。こ
の溶液を室温で１時間３０分攪拌し、１，１’−フェロ
センジカルボン酸の活性エステルを含むこの溶液を、ア
ミン体との反応に使用した。
性エステルの合成）１，１’−フェロセンジカルボン酸
０．１４ｇ（０．５ｍｍｏｌ）を１５ｍｌのＤＭＦに溶
かした。この溶液に、ＰＯＢ試薬０．６６ｇ（１．５ｍ
ｍｏｌ）とトリエチルアミン０．２１ｍｌ（１．５ｍｍ
ｏｌ）とを溶かした５ｍｌのＤＭＦ溶液を滴下した。こ
の溶液を室温で１時間３０分攪拌し、１，１’−フェロ
センジカルボン酸の活性エステルを含むこの溶液を、ア
ミン体との反応に使用した。
【００２１】（環状リガンドの製造）アミン体０．３５
ｇ（０．５ｍｍｏｌ）をクロロホルム３００ｍｌに溶か
した。この溶液を攪拌しながら、１，１’−フェロセン
ジカルボン酸の活性エステル溶液を滴下した。溶液を室
温で２０時間攪拌した。反応溶液を濾過し、減圧乾固
し、メタノールに溶解させた。展開溶媒としてメタノー
ルを使用して、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで
展開し、目的物と思われる分画を得た。メタノールを減
圧留去し，クロロホルムに溶解し、飽和炭酸水素ナトリ
ウム水溶液で洗浄した。減圧乾固後の結晶を回収した。
収量は４６ｍｇであり、収率は１０％であった。この結
晶の特性を以下に示す。
ｇ（０．５ｍｍｏｌ）をクロロホルム３００ｍｌに溶か
した。この溶液を攪拌しながら、１，１’−フェロセン
ジカルボン酸の活性エステル溶液を滴下した。溶液を室
温で２０時間攪拌した。反応溶液を濾過し、減圧乾固
し、メタノールに溶解させた。展開溶媒としてメタノー
ルを使用して、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで
展開し、目的物と思われる分画を得た。メタノールを減
圧留去し，クロロホルムに溶解し、飽和炭酸水素ナトリ
ウム水溶液で洗浄した。減圧乾固後の結晶を回収した。
収量は４６ｍｇであり、収率は１０％であった。この結
晶の特性を以下に示す。
【００２２】黄色結晶 融点 ３００℃1 Ｈ−ＮＭＲ ケミカルシフト（ＣＤＣｌ3 、ｐｐｍ） １．５６、１．８３、１．９９、２．２６、２．４５、
３．２７、４．２８、４．４０、４．４３、６．８５、
８．７７ ＩＲ Ｃ＝Ｏ １７９１、１６６１ｃｍ- 1 元素分析 Ｈ（％） Ｃ（％） Ｎ（％） 計算値 ５７．２３ ５．８１ １１．６１ 実測値 ５７．２３ ５．９２ １０．９５ ＦＡＢマス Ｍ＋１（８７１．５）
３．２７、４．２８、４．４０、４．４３、６．８５、
８．７７ ＩＲ Ｃ＝Ｏ １７９１、１６６１ｃｍ- 1 元素分析 Ｈ（％） Ｃ（％） Ｎ（％） 計算値 ５７．２３ ５．８１ １１．６１ 実測値 ５７．２３ ５．９２ １０．９５ ＦＡＢマス Ｍ＋１（８７１．５）
【００２３】（測定例）特殊構造核酸の検出例として、
ＧＣＧＡＡＡＡＡＣＧＣよりなるヘアピン構造の具体的
な検出結果を、図２に示す。ヘアピン型ＤＮＡ（５’−
ＨＳ−ＧＣＧＡＡＡＡＡＣＧＣ−３’）を修飾した金電
極を、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ｍ
ＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＣＮＤＩＦｃを含む溶液に浸
漬し、Ａｇ／ＡｇＣｌ標準電極とＰｔ対極とを用いて、
サイクリックボルタモグラムを測定した。この結果を図
２のグラフｂに示す。これによって５７２ｍＶで１．２
μＡの応答電流を得た。即ち、２０ｐｍｏｌのヘアピン
によって１．２μＡの応答電流を得ることができた。ま
た、本系において、数ｆｍｏｌ（フェムトモル）までの
ヘアピン型ＤＮＡの検出が可能であった。また、ナフタ
レンジイミドに対応する−４５７ｍＶでの電気的応答が
得られた。
ＧＣＧＡＡＡＡＡＣＧＣよりなるヘアピン構造の具体的
な検出結果を、図２に示す。ヘアピン型ＤＮＡ（５’−
ＨＳ−ＧＣＧＡＡＡＡＡＣＧＣ−３’）を修飾した金電
極を、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ｍ
ＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＣＮＤＩＦｃを含む溶液に浸
漬し、Ａｇ／ＡｇＣｌ標準電極とＰｔ対極とを用いて、
サイクリックボルタモグラムを測定した。この結果を図
２のグラフｂに示す。これによって５７２ｍＶで１．２
μＡの応答電流を得た。即ち、２０ｐｍｏｌのヘアピン
によって１．２μＡの応答電流を得ることができた。ま
た、本系において、数ｆｍｏｌ（フェムトモル）までの
ヘアピン型ＤＮＡの検出が可能であった。また、ナフタ
レンジイミドに対応する−４５７ｍＶでの電気的応答が
得られた。
【００２４】また、上記の実験を、未修飾の金電極を使
用して行った。この場合には、グラフａの結果が得られ
た。５７２ｍＶでの電気的応答は観測されなかった。Ｃ
ＮＤＩＦｃは、水溶液中では、分子中のフェロセンとナ
フタレンジイミドとが電荷移動錯体を形成しているため
であると考えられる。また、ナフタレンジイミドに対応
する電気的応答は、−３１２ｍＶにシフトし、その電流
値はグラフｂの半分以下になった。これは、ＣＮＤＩＦ
ｃが、溶液中ではフェロセンからナフタレンジイミドに
電荷が移動した電荷移動錯体を形成していることを示
す。
用して行った。この場合には、グラフａの結果が得られ
た。５７２ｍＶでの電気的応答は観測されなかった。Ｃ
ＮＤＩＦｃは、水溶液中では、分子中のフェロセンとナ
フタレンジイミドとが電荷移動錯体を形成しているため
であると考えられる。また、ナフタレンジイミドに対応
する電気的応答は、−３１２ｍＶにシフトし、その電流
値はグラフｂの半分以下になった。これは、ＣＮＤＩＦ
ｃが、溶液中ではフェロセンからナフタレンジイミドに
電荷が移動した電荷移動錯体を形成していることを示
す。
【００２５】これに対してグラフｂでは、５７２ｍＶで
の電気的応答が生じた。これは、ＣＮＤＩＦｃと一本鎖
核酸部位との相互作用によって、一本鎖核酸部位の核酸
の塩基がＣＮＤＩＦｃの中に挟み込まれ、分子内での電
荷移動が抑制され、このため５７２ｍＶの電位でフェロ
センに対応する電流が観測されたためである。
の電気的応答が生じた。これは、ＣＮＤＩＦｃと一本鎖
核酸部位との相互作用によって、一本鎖核酸部位の核酸
の塩基がＣＮＤＩＦｃの中に挟み込まれ、分子内での電
荷移動が抑制され、このため５７２ｍＶの電位でフェロ
センに対応する電流が観測されたためである。
【００２６】また、上記の実験において、ヘアピン型Ｄ
ＮＡと相補的なオリゴヌクレオチド（５’−ＧＣＧＴＴ
ＴＴＴＣＧＣ−３’）をハイブリダイゼーションさせ、
ヘアピン領域を消失させると、５７２ｍＶでは電流値を
示さなくなった（グラフｃ）。この結果は、一本鎖核酸
領域に二本鎖核酸が共存している場合も、一本鎖核酸領
域の測定が可能なことを示している。また、この結果よ
り、ＣＮＤＩＦｃが確かに一本鎖核酸領域に特異的に結
合しており、電極上で電気的応答を示していることが分
かる。
ＮＡと相補的なオリゴヌクレオチド（５’−ＧＣＧＴＴ
ＴＴＴＣＧＣ−３’）をハイブリダイゼーションさせ、
ヘアピン領域を消失させると、５７２ｍＶでは電流値を
示さなくなった（グラフｃ）。この結果は、一本鎖核酸
領域に二本鎖核酸が共存している場合も、一本鎖核酸領
域の測定が可能なことを示している。また、この結果よ
り、ＣＮＤＩＦｃが確かに一本鎖核酸領域に特異的に結
合しており、電極上で電気的応答を示していることが分
かる。
【００２７】
【発明の効果】以上述べたように、ナフタレンジイミド
とフェロセンとを含む環状リガンドを、遺伝子修飾電極
に混在させ、その電気化学的挙動を、サイクリックボル
タモグラムやディファレンシャルパルスボルタモグラム
を測定することによって、得られた電流値から、電極を
修飾した遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の特殊一本鎖核
酸部位の有無、および／または存在量を評価できる。特
に、本発明の検出用プローブは、特殊一本鎖核酸部位に
結合したときのみに、フェロセンとナフタレンジイミド
との間の電荷移動の抑制に基づく電気化学的応答が発生
するので、感度が高い。
とフェロセンとを含む環状リガンドを、遺伝子修飾電極
に混在させ、その電気化学的挙動を、サイクリックボル
タモグラムやディファレンシャルパルスボルタモグラム
を測定することによって、得られた電流値から、電極を
修飾した遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の特殊一本鎖核
酸部位の有無、および／または存在量を評価できる。特
に、本発明の検出用プローブは、特殊一本鎖核酸部位に
結合したときのみに、フェロセンとナフタレンジイミド
との間の電荷移動の抑制に基づく電気化学的応答が発生
するので、感度が高い。
【図１】本発明の検出用プローブの代表例（ＣＮＤＩＦ
ｃ）の合成スキームを示す。
ｃ）の合成スキームを示す。
【図２】本発明の検出装置における検出例を示すグラフ
である。
である。
ａ 遺伝子で修飾されていない金電極を作用極としたと
きの、ＣＮＤＩＦｃのサイクリックボルタモグラム ｂ ヘアピン構造のＤＮＡで修飾された金電極を作用極
としたときの、ＣＮＤＩＦｃのサイクリックボルタモグ
ラム ｃ 前記のヘアピン構造のＤＮＡと相補的なオリゴヌク
レオチドをハイブリダイゼーションさせた後のＣＮＤＩ
Ｆｃのサイクリックボルタモグラム
きの、ＣＮＤＩＦｃのサイクリックボルタモグラム ｂ ヘアピン構造のＤＮＡで修飾された金電極を作用極
としたときの、ＣＮＤＩＦｃのサイクリックボルタモグ
ラム ｃ 前記のヘアピン構造のＤＮＡと相補的なオリゴヌク
レオチドをハイブリダイゼーションさせた後のＣＮＤＩ
Ｆｃのサイクリックボルタモグラム
【手続補正書】
【提出日】平成１１年６月１４日（１９９９．６．１
４）
４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、遺伝子の特殊
一本鎖核酸部位と特異的に結合し、電気化学的応答を発
生する検出用プローブであって、この検出用プローブが
環状リガンドからなり、環状リガンドが、一つの１，
１’−フェロセンジカルボン酸と、一つの１，４，５，
８−ナフタレンテトラカルボン酸と、１，４−ビス（３
−アミノプロピル）ピペラジン、１．１’−ビス（３−
アミノプロピル）メチルアミン、１．１’−ビス（２−
アミノエチル）アミン、１，１’−ビス（３−アミノプ
ロピル）アミン、スペルミンおよびスペルミジンからな
る群より選ばれた一対の連結用化合物との縮合生成物か
らなり、各連結用化合物の一方の末端の各アミノ基が、
フェロセンに結合するカルボニル基と共にアミド結合を
構成しており、各連結用化合物の他方の末端の各アミノ
基が、ナフタレンに結合する二つのカルボニル基と共に
イミド結合を構成していることを特徴とする。
一本鎖核酸部位と特異的に結合し、電気化学的応答を発
生する検出用プローブであって、この検出用プローブが
環状リガンドからなり、環状リガンドが、一つの１，
１’−フェロセンジカルボン酸と、一つの１，４，５，
８−ナフタレンテトラカルボン酸と、１，４−ビス（３
−アミノプロピル）ピペラジン、１．１’−ビス（３−
アミノプロピル）メチルアミン、１．１’−ビス（２−
アミノエチル）アミン、１，１’−ビス（３−アミノプ
ロピル）アミン、スペルミンおよびスペルミジンからな
る群より選ばれた一対の連結用化合物との縮合生成物か
らなり、各連結用化合物の一方の末端の各アミノ基が、
フェロセンに結合するカルボニル基と共にアミド結合を
構成しており、各連結用化合物の他方の末端の各アミノ
基が、ナフタレンに結合する二つのカルボニル基と共に
イミド結合を構成していることを特徴とする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】本発明では、一つの１，１’−フェロセン
ジカルボン酸と、一つの１，４，５，８−ナフタレンテ
トラカルボン酸とを、二つの連結用化合物と縮合させ、
環状の環状リガンドを得る。代表的な製造例を図１に示
す。この代表的な環状リガンドの名称は、サイクリック
ナフタレンジイミドフェロセン（以下、ＣＮＤＩＦｃと
呼ぶ）である。
ジカルボン酸と、一つの１，４，５，８−ナフタレンテ
トラカルボン酸とを、二つの連結用化合物と縮合させ、
環状の環状リガンドを得る。代表的な製造例を図１に示
す。この代表的な環状リガンドの名称は、サイクリック
ナフタレンジイミドフェロセン（以下、ＣＮＤＩＦｃと
呼ぶ）である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１１】連結用化合物は、１，４−ビス（３−アミ
ノプロピル）ピペラジン、１．１’−ビス（３−アミノ
プロピル）メチルアミン、１．１’−ビス（２−アミノ
エチル）アミン、１，１’−ビス（３−アミノプロピ
ル）アミン、スペルミン、スペルミジンからなる群より
選ばれる。
ノプロピル）ピペラジン、１．１’−ビス（３−アミノ
プロピル）メチルアミン、１．１’−ビス（２−アミノ
エチル）アミン、１，１’−ビス（３−アミノプロピ
ル）アミン、スペルミン、スペルミジンからなる群より
選ばれる。
Claims (3)
- 【請求項１】 遺伝子の特殊一本鎖核酸部位と特異的に
結合し、電気化学的応答を発生する検出用プローブであ
って、フェロセンとナフタレンジイミドとを含む環状リ
ガンドからなる検出用プローブ。 - 【請求項２】 遺伝子の特殊一本鎖核酸部位を検出する
方法であって、測定対象である遺伝子を、請求項１記載
の検出用プローブに結合させ、この結合に伴う電気化学
的応答を検出することを特徴とする、遺伝子の特殊一本
鎖核酸部位の検出方法。 - 【請求項３】 遺伝子の特殊一本鎖核酸部位を検出する
装置であって、前記遺伝子によって修飾されている作用
極、前記作用極に対する対極、作用極と対極とが浸漬さ
れている溶液およびこの溶液が収容されている容器を備
えており、前記溶液中に請求項１記載の検出用プローブ
が溶解されていることを特徴とする、遺伝子の特殊一本
鎖核酸部位の検出装置。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10227019A JP2967197B1 (ja) | 1998-08-11 | 1998-08-11 | 遺伝子の特殊一本鎖核酸部位の検出用プローブ、遺伝子の特殊一本鎖核酸部位の検出方法およびその装置 |
| US09/313,992 US6294670B1 (en) | 1998-08-11 | 1999-05-19 | Probe for detecting a highly ordered structural site of a single stranded nucleic acid of a gene, and a method and a device for detecting the same |
| US09/902,633 US6951936B2 (en) | 1998-08-11 | 2001-07-12 | Probe for detecting a highly ordered structural site of a single stranded nucleic acid of a gene, and a method and a device for detecting the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10227019A JP2967197B1 (ja) | 1998-08-11 | 1998-08-11 | 遺伝子の特殊一本鎖核酸部位の検出用プローブ、遺伝子の特殊一本鎖核酸部位の検出方法およびその装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2967197B1 JP2967197B1 (ja) | 1999-10-25 |
| JP2000050876A true JP2000050876A (ja) | 2000-02-22 |
Family
ID=16854247
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10227019A Expired - Lifetime JP2967197B1 (ja) | 1998-08-11 | 1998-08-11 | 遺伝子の特殊一本鎖核酸部位の検出用プローブ、遺伝子の特殊一本鎖核酸部位の検出方法およびその装置 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6294670B1 (ja) |
| JP (1) | JP2967197B1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001038571A1 (fr) * | 1999-11-26 | 2001-05-31 | Japan Science And Technology Corporation | Molecule reconnaissant les mesappariements |
| JP2007248396A (ja) * | 2006-03-17 | 2007-09-27 | Toshiba Corp | 核酸検出用デバイスおよび核酸検出装置 |
| JP2007263880A (ja) * | 2006-03-29 | 2007-10-11 | Toshiba Corp | 核酸検出用デバイス |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6399305B1 (en) * | 1999-06-07 | 2002-06-04 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Protection of partial complementary nucleic acid fragment using a electroconductive chip and intercalator |
| US6506567B2 (en) * | 2000-01-31 | 2003-01-14 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Water-soluble flourescent intercalator compound |
| AU2001242274A1 (en) * | 2000-03-01 | 2001-09-12 | November Aktiengesellschaft Gesellschaft Fur Molekulare Medizin | Quantifying target molecules contained in a liquid |
| JP2002181816A (ja) * | 2000-12-08 | 2002-06-26 | Univ Waseda | 二本鎖核酸の検出試薬と二本鎖核酸検出方法 |
| JP2003144152A (ja) * | 2001-11-09 | 2003-05-20 | Fuji Photo Film Co Ltd | ターゲット核酸断片の検出方法及びターゲット核酸断片の検出キット |
| GB0205455D0 (en) | 2002-03-07 | 2002-04-24 | Molecular Sensing Plc | Nucleic acid probes, their synthesis and use |
| WO2004012805A2 (en) | 2002-08-05 | 2004-02-12 | Miravant Medical Technologies | Light delivery catheter |
| EP1719777A4 (en) * | 2004-02-24 | 2009-07-29 | Japan Science & Tech Agency | LIGAND WITH ELECTROCHEMICAL ACTIVITY FOR THE SPECIFIC DETECTION OF DOUBLE STRANDED NUCLEIC ACID MOLECULE SEQUENCE |
| KR100773543B1 (ko) | 2005-12-05 | 2007-11-07 | 삼성전자주식회사 | 전기화학적 생분자 검출 센서, 그의 제조 방법 및 그를이용한 생분자 검출 방법 |
| JP4167697B2 (ja) * | 2006-04-13 | 2008-10-15 | 株式会社東芝 | 核酸検出用デバイス |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3233851B2 (ja) | 1996-04-24 | 2001-12-04 | 繁織 竹中 | 遺伝子の電気化学的検出法およびその装置 |
-
1998
- 1998-08-11 JP JP10227019A patent/JP2967197B1/ja not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-05-19 US US09/313,992 patent/US6294670B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-07-12 US US09/902,633 patent/US6951936B2/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001038571A1 (fr) * | 1999-11-26 | 2001-05-31 | Japan Science And Technology Corporation | Molecule reconnaissant les mesappariements |
| JP2007248396A (ja) * | 2006-03-17 | 2007-09-27 | Toshiba Corp | 核酸検出用デバイスおよび核酸検出装置 |
| JP2007263880A (ja) * | 2006-03-29 | 2007-10-11 | Toshiba Corp | 核酸検出用デバイス |
| US7851206B2 (en) | 2006-03-29 | 2010-12-14 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Nucleic acid detection device |
| JP4664846B2 (ja) * | 2006-03-29 | 2011-04-06 | 株式会社東芝 | 核酸検出用デバイス |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20020068294A1 (en) | 2002-06-06 |
| US6294670B1 (en) | 2001-09-25 |
| JP2967197B1 (ja) | 1999-10-25 |
| US6951936B2 (en) | 2005-10-04 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
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