JP2000044823A - 新規なロ―ダミン誘導体及びその使用 - Google Patents
新規なロ―ダミン誘導体及びその使用Info
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Abstract
分析あるいは診断目的のためのローダミン誘導体で標識
された生体分子の使用を可能とする、長波長域の改善さ
れたスペクトル特性を有する新規なローダミン誘導体を
提供する。 【解決手段】 一般式(1)または(2)の化合物。 【化1】 (1) 先行技術とは異なり、これらの化合物は、式中、A1、A2
及びA3が互いに独立して水素、シアノ、ハロゲンまたは
スルホン酸を表し、B1はハロゲン、シアノまたは水素を
表し、B2は水素、アミド、ハロゲンまたは1〜20のC原子
を有するアルキル基を表すことを特徴とする。本発明は
また、活性化ローダミン誘導体、対応するように結合さ
れた生体分子、及びそれらの診断系における使用に関す
る。
Description
が約520〜720 nmの範囲である、新規な五環式ローダミ
ン誘導体、これらの誘導体で標識された生物分子、及び
それらの診断系における使用に関する。
の形態のマーカー(標識物質)として使用することができ
る多数のローダミン誘導体が知られている。そのような
化合物は例えば、テトラメチルカルボキシローダミンま
たはカルボキシ-ローダミン101(RHODOS)のNHSエステル
をアミノ基を含むタンパク質と反応させることにより得
られ、これらは診断系において使用される。ハプテン-
蛍光物質複合体の例はEP-A-285179号に記載されている
が、記載された化合物は600 nm未満の波長に吸収極大を
有する。
吸収極大を有する長波長ローダミン様誘導体を開示して
いる。しかしこの発明の時点においては、記載された化
合物の対応するホスホルアミダイトへの変換は知られて
いなかった。またEP 0 567 622号は、600 nmより長波長
側に吸収極大を有する長波長ローダミン誘導体の製造を
開示している。しかし、対応する核酸複合体の合成、及
び核酸分析において確立されてきたもののような蛍光共
鳴エネルギー転移系(fluorescence energy transfer sy
stem, Bio Techniques Vol. 22, No. 1, p. 130-138,19
97)の成分としての記載された化合物の使用はこれまで
記載されていなかった。
やすさにより、蛍光染料のフルオレセインが広く使用さ
れており、多様な用途に使用されている。いわゆるFRET
系において、フルオレセインは通常は蛍光共鳴エネルギ
ー供与体として作用し、分析試験方法に応じて種々の蛍
光共鳴エネルギー受容体を使用することができる可能性
がある。しかし核酸分析におけるFRET系の使用はこれま
ではCy5 (PCR MethodsAppl, 4, 357-362, 1995)及びロ
ーダミン誘導体TAMRA及びROX(Anal. Biochem.,252, 78-
88, 1997)のようなシアニン誘導体の使用に限定されて
いた。
は、特に他の染料と共に蛍光共鳴電子伝達対を形成して
分析あるいは診断目的のためのローダミン誘導体で標識
された生体分子の使用を可能とする、長波長域の改善さ
れたスペクトル特性を有する新規なローダミン誘導体を
提供することである。
(1)または(2)の化合物であり、これまでに知られ
ていた技術とは異なり、該化合物は、A1、A2及びA3が互
いに独立してハロゲン、シアノ、水素、カルボン酸、リ
ン酸またはスルホン酸を示し、B1がハロゲン、シアノま
たは水素を示し、B2が水素、アミド、ハロゲン及び1〜2
0のC原子を有するアルキル基からなる群から選択される
ことを特徴とする。
a及びCb並びにCc及びCdは単結合または二重結合によっ
て結合され得、X1〜X16は互いに独立してハロゲン、ス
ルホン酸、水素または1〜20のC原子を有するアルキル基
を表し、該アルキル基は1または数個のハロゲンまたは
スルホン酸基で置換されていてもよい。R1及びR2は、同
一であるか異なり、水素、1〜20のC原子を有するアルキ
ル基、ポリオキシヒドロカルビル単位、フェニル、また
はアルキル鎖が1〜3の炭素原子を有するフェニルアルキ
ルを表し、該アルキル及び/またはフェニル基は1また
は数個のヒドロキシ、ハロゲン、スルホン酸、アミノ、
カルボキシ、またはアルコキシが1〜4の炭素原子を有し
得るアルコキシカルボニル基により置換されていてもよ
い。R1は少なくとも1つの活性化可能な基を含む。R2及
びX4は任意に0〜2のC原子からなる架橋により結合され
ていてもよい。]
も1つの基がハロゲン、特にフッ素または塩素であると
き有利であることが判明した。好ましくは、基A1、A2、
A3及びB1の全てがハロゲン、特にフッ素または塩素であ
る。全ての基A1、A2、A3及びB1がいずれもフッ素のみあ
るいは塩素のみである場合、そのような化合物の製造は
比較的単純である。B2が水素原子と同一である化合物も
好ましい。しかし、B2はあるいはフッ素または塩素を示
してもよく、全ての基A1、A2、A3、B1及びB2がいずれも
フッ素のみあるいは塩素のみである場合、そのような化
合物の合成は特に単純である。
は、好ましくは水素である。基X5、X6、X8、X9、X11、X
12、X13及びX16は好ましくはメチル基である。基X1、X
2、X3、X4、X7及びX10の全てが水素を示し、基X5、X6、
X8、X9、X11及びX12の全てがメチル基を表す化合物が特
に好ましい。基R1及びR2は同一であっても異なってもよ
いが、少なくともR1は、活性化可能な基、例えばアミ
ノ、ヒドロキシル、カルボキシル等を含む。R1は好まし
くはただ1つの活性化可能な基を含む。特に好ましい態
様においては、R1はヒドロキシエチル基またはカルボキ
シプロピル基である。R2がR1とは異なる場合は、R2は好
ましくは水素または1〜20のC原子を有するアルキルであ
る。その場合、特に好ましくは水素またはエチル基であ
る。
(約500 nm以上の範囲における吸収極大、及び約520〜72
0 nmの間の範囲における発光極大)により、染料、特に
蛍光染料として非常に適する分子を提供する。この点に
おいて、これらの分子のスペクトル特性は、A1、A2、A3
及びB1に関してハロゲン基の種類、数及び位置を変更す
ることによって変えることができる。このようにして、
約520 nm〜720 nmの間の範囲でほとんどどのような吸収
及び発光極大の蛍光染料でも製造することができる。従
って、本発明のローダミン誘導体の蛍光染料としての使
用も本発明の主題である。
調製するために、例えば標識生体分子またはその他の分
析用試薬に適した活性化誘導体を合成することができ
る。活性化誘導体は、基R1及びR2上の活性化可能な基の
うちの少なくとも1つを使用することによって調製さ
れ、当業者に知られている公知の標準的なプロトコルに
よって活性化を行うことができる。通常、活性化はR1及
びR2の少なくとも1つのヒドロキシル基、アミノまたは
カルボキシル基によって得られる。後の用途に応じて種
々の反応性基を導入することができる。ホスホルアミダ
イト及びHホスホネートは例えばヒドロキシル基から誘
導することができる。従って、ローダミンホスホルアミ
ダイトまたはH-ホスホネートは通常、これまでに知られ
ているプロトコルによって製造される(Methods in Mol.
Biol. Vol 20, "Protocols for Oligonucleotides and
Analogs, Synthesis and Properties", S.Agrawal pub
lisher Humana Press Totowa, NJ)。また、N-ヒドロキ
シスクシンイミド(NHS)エステル及びマレインイミドア
ルキルアミドは通常、カルボキシル基から誘導される。
NHSエステルは、好ましくはEP 0 543 333号に記載され
た方法によって製造され、該方法においては遊離カルボ
ン酸をDCCまたはMEIのような縮合剤の存在下でNHSと反
応させる。ローダミンイソチオシアネートは、好ましく
はアミノ基をチオホスゲンと反応させて製造する(Advan
ced Organic Chemistry, McGraw Hill, 2nd edition,
p. 383, 1997)。
の活性化誘導体に関する。活性化誘導体の反応性基は、
好ましくはホスホルアミダイト、N-ヒドロキシスクシン
イミド(NHS)エステル、マレインイミドアルキルアミ
ド、H-ホスホネートまたはイソチオシアネートである。
物またはそれらの活性化誘導体を結合することによって
得られる複合体に関する。従って、そのような複合体は
少なくとも2つの成分からなり、その1成分が本発明のロ
ーダミン誘導体である。複合体は前記活性化誘導体から
出発して標準的なプロトコルによって製造される。各場
合についての適した結合方法は当業者に知られている。
複合体の第2の成分が測定される結合パートナーに結合
できれば直ちに本発明の複合体を分析的な目的のために
使用することができ、適当な吸収波長の光による励起の
後、形成された複合体は形成された複合体の発光蛍光に
よって検出される。
分析あるいは医療用もしくは生体物質の分析に適してい
る。従って本発明の主題は特に、生体分子と相互作用す
ることができる複合体である。これらは通常、それ自体
追加の成分として1または数個の生体分子を含む複合体
である。複合体に含まれるこれらの生体分子は、例え
ば、DNA、RNA、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオ
チド誘導体のような一本鎖あるいは二本鎖核酸であり
得、また例えばPNAのような修飾核酸類似体であり得る
が、個々のヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、ヌクレ
オチド類似体またはヌクレオシドトリホスフェートでも
あり得る。そのような分子は、好ましくは、NHSエステ
ルまたはホスホルアミダイトによって5'位置で標識さ
れ、あるいはそれとは異なり、好ましくはCPGのような
染料置換キャリアー物質によって3'位置で標識される。
核酸塩基のようなその他の部位での標識化も、好ましく
はNHSエステルによって行う。
はアミノ酸を標識する場合、イソチオシアネートにより
結合を行うことが好ましい。その他の複合体成分の例と
しては、ビタミン、ステロイドホルモン、脂質分子及び
ハプテンがある。さらに、膜画分または全細胞のような
より複雑な生物学的構造を同様に標識することもでき
る。
ゴヌクレオチドは、本発明の複合体の特別な態様であ
る。このように標識されたオリゴヌクレオチドは、これ
までに知られた方法において使用して核酸を検出し分析
することができ、例えばin situハイブリダイゼーショ
ン(Meyne及びMyzis, Methods Mol. Biol. 33, 63-74, 1
994)に使用することができ、あるいはまた種々の配列決
定方法(Sheealyら、Anal.Chem. 67, 247-251, 1995)に
おいてプライマーとして使用することができる。
明のローダミン染料で標識された核酸ポリメラーゼの基
質、例えばリボヌクレオシドトリホスフェート、デオキ
シリボヌクレオシドトリホスフェート等を種々の酵素反
応によって核酸に導入することができる。これはDNAに
ついては、例えばニックトランスレーション(Rigbyら、
J. Mol. Biol. 113, p. 237, 1977)あるいはランダムプ
ライムラベリング(Feinberg及びVogelstein, Anal. Bio
chem. 137, p. 266, 1984)の方法を使用してDNAポリメ
ラーゼにより行うことができる。RNAの場合、これは転
写として、例えばT3、T7またはSP6 RNAポリメラーゼに
よって行うことができる。核酸標識化のための別の方法
としては、ターミナルトランスフェラーゼによるいわゆ
る「3'テーリング反応」によるものがある。
核酸を標識するための本発明の複合体の使用、及び核酸
の検出及び分析のための本発明により標識されたハイブ
リダイゼーションプローブの使用もまた本発明の主題で
ある。分析試験のためには、本発明のローダミン誘導体
は最初に、光源として例えばレーザー、レーザーダイオ
ードまたはLEDを使用して適当な波長の光で励起す
る。被検体に応じて、当業者に知られた測定方法により
蛍光を検出する。例としては、in situ法のための蛍光
顕微鏡観察、適当なフォトダイオードによる発光の検出
がある。
の染料の直接の励起の代わりに、励起はいわゆる蛍光共
鳴エネルギー転移によっても行うことができる。この方
法においては、フルオレセインのような第2の蛍光染料
を適当な波長の光で励起する。その後2つの染料が距離
的に近接していることにより本発明のローダミン誘導体
へのいわゆる非放射、すなわち放射なしのエネルギー転
移が起こる(Van der Meerら、Resonance Energy Transf
er, VCH, 1994)。特定の波長でこの分子から発せられる
光の検出は、被検体を定量するために好ましく使用する
ことができる。従って本発明はまた、本発明のローダミ
ン誘導体または対応する複合体の蛍光共鳴エネルギー転
移系の成分としての使用に関する。
しくは共鳴エネルギー受容体の役目を果たし、この場合
以下の構造式を有する化合物が特に適していることが判
明した。
A270及びJF9)、好ましい共鳴エネルギー供与体はフルオ
レセインまたはフルオレセイン複合体である。従って本
発明はまた、本発明のローダミン誘導体または対応する
複合体を、フルオレセインあるいは対応する複合体とと
もに蛍光共鳴エネルギー転移系における蛍光共鳴エネル
ギー受容体として使用することにも関する。蛍光共鳴エ
ネルギー転移(FRET)の原理を使用して検出することがで
きる蛍光染料で標識されたオリゴヌクレオチドのような
ハイブリダイゼーションプローブは核酸の定量的検出に
適している。例えば、オリゴヌクレオチドの場合、5'末
端をFRET系の染料成分で標識し、3'末端をFRET系の他の
染料成分で標識することができる。別の態様においては
オリゴヌクレオチドは内部標識してもよい。
したそのようなオリゴヌクレオチドを核酸増幅の間に使
用して、蛍光共鳴エネルギー供与体の発光を測定するこ
とにより形成された生成物を検出する。オリゴヌクレオ
チドが標的に結合しない場合は、放射のないエネルギー
転移から生じる供与体の蛍光は測定できない。これに対
し、オリゴヌクレオチドが標的DNAに結合すると、使用
するDNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により2
種の染料成分は空間的に互いに分離され、FRET供与体の
蛍光を測定することが可能となる(米国特許第5,210,015
号)。
て標的核酸にハイブリダイズすることができる2種の異
なるハイブリダイゼーションプローブに異なる染料を配
置する。これらは例えば標的核酸の同じ鎖にハイブリダ
イズする2種のオリゴヌクレオチドプローブとすること
ができ、この場合1つの染料を第1のプローブの3'末端ヌ
クレオチドに配置し、他方の染料を第2のプローブの5'
末端ヌクレオチドに配置してこの2つの間の距離を少数
のヌクレオチドしか存在しないようにする。この数はO
及び30の間とすることができる。JA270またはJF9のよう
な本発明のローダミン誘導体と組合せてフルオレセイン
を使用する場合、O〜15、特に1〜5ヌクレオチドの距
離、多くの場合は1ヌクレオチドの距離が有利であると
いうことが判明した。染料成分の間のヌクレオチド距離
が確保されれば、染料の1つを末端ではなく内部に結合
したプローブを使用することも可能である。二本鎖標的
核酸の場合、2つの染料成分の間の0〜30ヌクレオチドの
一定のヌクレオチド距離が確保されれば、標的の異なる
鎖に結合するプローブを使用することもできる。
レオチドとJA270またはJF9のような本発明のローダミン
誘導体とからなる本発明の複合体の核酸を分析するため
の使用であって、この場合、第2のオリゴヌクレオチド
及びもう1つの蛍光染料、好ましくはフルオレセインか
らなる別の複合体を使用し、好ましくは第2のオリゴヌ
クレオチドに結合した染料を励起した後に蛍光共鳴エネ
ルギー転移が起こり得るようにしたものである。対応す
るように標識されたオリゴヌクレオチドの組合せは、以
下においてFRET対と称する。
連鎖反応の間あるいはその後に増幅産物を検出するため
に特に有利であることが判った。従って、本発明はさら
に、核酸増幅反応の反応生成物を検出するためのFRET対
の成分としての本発明の複合体の使用に関する。特定の
態様においては、2つの増幅プライマーのうちの1つを同
時に、使用される2つの染料のうちの1つで標識すること
ができ、従ってFRETの2つの成分のうちの1つとなる。
使用により、PCR反応のいわゆるリアルタイムモニタリ
ングが可能となり、これにおいては増幅産物の生成に関
するデータを、行った反応サイクルの数に関連させて測
定することができる。これは通常、増幅プライマーの必
要なアニーリングの間の反応及び温度の条件の結果とし
てFRET対のオリゴヌクレオチドも標的核酸にハイブリダ
イズし、適当に励起されたとき対応する測定可能な蛍光
シグナルが発せられるという事実によって得られる。従
って、得られるデータは、定量測定するべき当初に使用
された標的核酸の量を与える。従ってそのような態様
は、生体試料のRNA濃度を定量する定量的RT-PCR実験に
特に重要である。従って本発明はまた、核酸増幅反応の
反応生成物を検出するためのFRET対の成分としての本発
明の複合体の使用に関し、この場合反応生成物は各サイ
クルにおいて検出する。本発明のさらに別の主題は、増
幅するべき核酸の定量測定を実施するためのFRET対の成
分としての本発明の複合体の使用である。
応の終了の後に検出し、この場合、検出すべき標的核酸
に対するFRET対のハイブリダイゼーションの後、今度は
温度を融解曲線分析の一部として連続的に増加させる。
同時に、発光蛍光を温度に関連付けて測定する。このよ
うにして、一定のミスマッチのためにFRET対に対してよ
り低いストリンジェンシーでハイブリダイズする配列を
検出する。このようにして測定される融解温度は、点突
然変異またはその他の多形性を検出するのに役立つ。従
って本発明はまた、特に多形性あるいは点突然変異を同
定する場合の融解曲線を決定するためのFRET対の成分と
しての本発明の複合体の使用に関する。
(2,3,4,5-テトラクロロフェニル)-11-エチル-2,2,4,8,1
0,11-ヘキサメチル-10,11-ジヒドロ-2H-13-オキサ-11-
アザ-1-アゾニア-ペンタセンパークロレート 第1段階:2,2,4-トリメチル-7-メトキシ-1,2-ジヒドロキ
ノリン 分子量: 203.05 g/mol 273 g(2.2 mol)のm-アニシジン、次いで221 g(2.2 mol)
のメシチルオキシドを25 mlの氷酢酸に15〜20℃で滴下
した。その後溶液を室温で約18時間攪拌した。次いで50
0 mlの臭化水素酸を20〜30℃で滴下した。室温で1時間
攪拌した後、沈殿物を濾過した。湿潤状態のままの沈殿
物を約1 lのアセトンに懸濁し、濾過し、乾燥した。200
gの2,2,4-トリメチル-7-メトキシ-1,2-ジヒドロ-キノ
リンハイドロブロミドを1 lの水及び500 mlのクロロホ
ルムの混合液中に再懸濁した。懸濁液を10%の水酸化ナ
トリウム溶液で中和した。そして有機相を水で洗浄し、
硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーター
で蒸発乾固した。短時間の後に緑色の油状物が固化し
た。固体をヘキサンから再結晶させた。67℃〜69℃の融
点を有する無色結晶が39%の収率で得られた。
トリメチル-7-メトキシ-1,2-ジヒドロキノリン 分子量: 247 g/mol 51 g(0.4 mol)のN,N-ジイソプロピルエチルアミン、72.
5 g (0.57 mol)の2-ブロモエタノール及びスパチュラ先
端分のヨウ化カリウムを、5O g(0.24 mol)の2,2,4-トリ
メチル-7-メトキシ-1,2-ジヒドロキノリンに加えた。溶
液を110〜120℃で24時間攪拌した。その後有機相を希水
酸化ナトリウム溶液及び水で洗浄し、硫酸ナトリウムで
乾燥した。その後溶媒を蒸留により完全に除去した。明
緑色油状物を生成物として得た。
トキシ-1,2-ジヒドロキノリン-1-イル)-エチル)エステ
ル 分子量:289 g/mol 18 g(O.l7 mol)の無水酢酸を10 g(0.04 mol)のN-(2-ヒ
ドロキシエチル)-2,2,4-トリメチル-7-メトキシ-1,2-ジ
ヒドロキノリンに加えた。10滴の濃硫酸をこれに加え、
100〜110℃に1時間加熱した。反応混合物を氷上に注
ぎ、クロロホルムで抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナ
トリウムで乾燥させて蒸留した。形成された明黄色油状
物は140℃/10-3 mbarの沸点を有していた。
トキシ-1,2-ジヒドロキノリン 分子量: 231.2g/mol 103 g(0.8 mol)のN,N-ジイソプロピルエチルアミン及び
231 g(1.5 mol)のジエチルスルフェートを、100 g(O.49
mol)の2,2,4-トリメチル-7-メトキシ-1,2-ジヒドロキ
ノリンに加えた。溶液を24時間還流させた。100 mlの10
%水酸化ナトリウム水溶液及び200 mlのクロロホルムを
反応混合物に加え、その後室温に冷却した。その後、有
機相を水で数回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。
溶媒を蒸留により完全に除去した。残留物を分画として
蒸留した。94〜96℃/0.01 Torrの沸点を有する明黄色油
状物が単離された。
リメチル-1,2-ジヒドロキノリンハイドロブロミド 分子量: 298.1 g/ml 60 g(0.25 mol)のN-エチル-2,2,4-トリメチル-7-メトキ
シ-1,2-ジヒドロキノリンを150 mlの氷酢酸に溶解し、1
50 mlの臭化水素酸を加えた。溶液を24時間還流させ
た。冷却した溶液を、氷/メタノール浴で攪拌した。そ
の後、沈殿物を濾過し、アセトンで数回洗浄した。85%
の収率で無色結晶が形成された。
リメチル-1,2-ジヒドロキノリン 分子量: 217.2 g/mol 200 gのN-エチル-7-ヒドロキシ-2,2,4-トリメチル-1,2-
ジヒドロキノリンヒドロブロミドを1 lの水及び500 ml
のクロロホルムの混合液中に懸濁した。pH値が約5にな
るまで20%酢酸ナトリウム溶液をこの懸濁液に加えた。
有機相を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロー
タリーエバポレーターで蒸発乾固した。このようにして
明褐色油状物が得られた。放出された塩基は非常に速く
分解されるので、別の工程のために必要な量の塩基のみ
をハイドロブロミドから遊離させた。
クロロベンゾイル)-1,2-ジヒドロ-1-エチル-7-ヒドロキ
シ-2,2,4-トリメチルキノリン 分子量: 503.2 g/mol 24 g(0.11 mol)のN-エチル-7-ヒドロキシ-2,2,4-トリメ
チル-1,2-ジヒドロキノリン及び31.6 g(0.11 mol)のテ
トラクロロフタル酸無水物を200 mlの1,2-ジクロロエタ
ンに溶解し、3時間還流させた。冷却した後に溶液を濾
過し、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固した。残留
物を約500 mlのクロロホルム中に懸濁し、沸騰するまで
加熱した。固体(=生成物)を濾過した。収量を増やすた
めに、母液をロータリーエバポレーターで蒸発乾固し、
カラムクロマトグラフィーによって精製した。このため
には、約3 gの粗生成物について約100 gのシリカゲル(I
CNシリカ32-63, 60A)を分離物質として使用した。クロ
ロホルム+5%エタノール混合液を溶出液として使用し
た。濾過した固体を約1 lのジエチルエーテルに溶解し
た。濾過した後、溶媒を蒸留により除去し、残留物を乾
燥させて黄色固体を形成した。
4,5-テトラクロロフェニル)-11-エチル-2,2,4,10,11-ヘ
キサメチル-10,11-ジヒドロ-2H-13-オキサ-11-アザ-1-
アゾニア-ペンタセンパークロレート(JA270) 分子量: 756.5 g/mol 8.7 g(0.017 mol)の6-(2-カルボキシ-3,4,5,6-テトラク
ロロ-ベンゾイル)-1,2-ジヒドロ-1-エチル-7-ヒドロキ
シ-2,2,4-トリメチル-キノリン及び5 g(0.017 mol)の酢
酸-(2-(2,2,4-トリメチル-7-ヒドロキシ-1,2-ジヒドロ
キノール-1-イル)-エチル)エステルを、全ての成分が溶
解するまで500 mlのジクロロメタン中で還流させた。そ
の後、攪拌しながら20 gの五酸化リンを注意深く加え、
加熱して1時間沸騰させた。その後、溶媒を減圧下に除
去し、100 mlの70%硫酸を残留物に加えた。徐々に赤に
着色した溶液を120℃で40分間攪拌した。反応混合液を
冷却した後、500 mlの氷冷したエタノールにゆっくりと
注ぎ、濾過した。50 mlの60%過塩素酸及び5 lの水を濾
過した溶液に滴下した。沈殿した染料を濾過し、デシケ
ーター中で五酸化リンで乾燥させた(収量; 5.6 g)。約2
gの粗生成物を60 mlのアセトン及び50 mlの2N塩酸の混
合液に溶解し、20時間還流させた。冷却した後、過塩素
酸及び水を加えることによって染料を沈殿させ、乾燥さ
せた。その後染料をカラムクロマトグラフィー(Alox N/
エタノール)によって精製した。その後、染料画分を濾
過し、濃縮して再度沈殿させた。その後約1 gの染料をo
-ジクロロベンゼンに溶解し、5時間還流させた。その
後、溶媒を水中でなお減圧下において除去した。残留物
を約50 mlの水でさらに3回蒸留した。その後、残留物を
エタノール中に取り、濾過した。過塩素酸及び水を加え
ることによって染料を再度沈殿させた。エタノール中で
の吸収極大は、615 nmの波長にあることが判明した。こ
のように合成された化合物は、下記構造式を有する。
ファニルオキシ)-エチル)-6-(2,3,4,5-テトラクロロフ
ェニル)-11-エチル-2,2,4,8,10,11-ヘキサメチル-10,11
-ジヒドロ-2H-13-オキサ-11-アザ-1-アゾニア-ペンタセ
ンパークロレート 985 mg(1.5 mmol)の実施例1で製造したローダミン誘導
体(2-ヒドロキシエチル)-6-(2,3,4,5-テトラクロロフェ
ニル)-11-エチル-2,2,4,8,10,11-ヘキサメチル-10,11-
ジヒドロ-2H-13-オキシ-11-アザ-1-アゾニア-ペンタセ
ンパークロレート、及び257 mg(1.5 mmol)のジイソプロ
ピルアミノテトラゾリドをアルゴン下50 mlの乾燥した
塩化メチレン中に溶解した。450 mg(1.5 mmol)のビス
(N,N-ジイソプロピル-アミノ)-シアノエチル-ホスフィ
ンを添加した後、室温で1時間攪拌した。溶媒を蒸留に
よって除去し、残留物を150 mlの酢酸エチル中に取っ
た。各回50mlの5%炭酸水素ナトリウム溶液で混合物を二
回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過
し、その後溶媒をロータリーエバポレーターで減圧下に
除去した。残留物をジオキサン中に取り、ヘキサンで沈
殿させた。沈殿物を濾過し、アセトニトリル中に溶解
し、溶液を0.45μmのフィルター(Millipore SLHV025NS)
を通して濾過した。濾液を減圧下に蒸発乾固した。残留
物を30 mlのジオキサンから凍結乾燥させた。暗青色粉
末が1 gの収量で得られた。
造1-(2-(2-シアノ-エトキシ)ジイソプロピルアミノ-ホス
ファニルオキシ)-エチル)-6-(2,3,4,5-テトラクロロフ
ェニル)-11-エチル-2,2,4,8,10,11-ヘキサメチル-10,11
-ジヒドロ-2H-13-オキサ-11-アザ-1-アゾニア-ペンタセ
ンパークロレート p-tert-ブチル-フェノキシアセチル保護されたホスホル
アミダイト(PerSeptive Biosystems、カタログ番号GEN
O84290-084292)を使用して製造業者による標準的な条件
下にABI 394合成器中でオリゴヌクレオチドを調製し
た。同じ装置を使用して、前記合成オリゴヌクレオチド
の5'末端の最後の塩基の代わりにアセトニトリル中の本
発明のホスホルアミダイト、1-(2-(2-シアノ-エトキシ)
ジイソプロピルアミノ-ホスファニルオキシ)エチル-6-
(2,3,4,5-テトラクロロフェニル)-11-エチル-2,2,4,8,1
0,11-ヘキサメチル-10,11-ジヒドロ-2H-13-オキサ-11-
アザ-1-アゾニア-ペンタセンパークロレートの0.1 mmol
溶液を使用して染料を結合した。標準的な条件下での酸
化及び室温での25%アンモニアによるオリゴヌクレオチ
ドの2時間の切断の後、オリゴヌクレオチドを得、これ
をその後HPLC(POROS OligoR3カラム、PerSeptive, In
c., Framingham, MA, 4.6 x 50 mm)によって精製した。
標識したオリゴヌクレオチドは以下のようにして4 ml/
分の流速で溶出した。
ト、100 mmol/l; pH 6.9 溶出液B:トリエチルアンモニウムアセテート、100 mmol
/l; pH 6.9/アセトニトリル(1:1) 勾配溶出: - 2分100%A - 10分100%の溶出液Aから100%の溶出液B - 約20〜25% B(非標識オリゴの溶出)及び約55〜65%(標
識オリゴの溶出)において約2〜3分間勾配を停止するこ
とにより、平均的に溶出した。溶出プロフィルは、260
nmで光学的に検出した。
ェニル)-11-エチル-2,2,4,8,10,11-ヘキサメチル-10,11
-ジヒドロ-2H-13-オキサ-11-アザ-1-アゾニア-ペンタセ
ン-O-スクシンイミドエステルパークロレート テトラクロロ-カルボキシフェニル前駆体はEP-0543 333
号に記載された合成工程と同様に合成した。脱カルボキ
シル化は実施例1に記載したようにo-ジクロロベンゼン
中で5時間還流沸騰させることにより行った。活性エス
テルは、ジシクロヘキシルカルボジイミド及びN-ヒドロ
キシ-スクシンイミドの存在下でEP 0543333号の一般的
な合成方法と同様に製造した。
3,4,5-テトラクロロフェニル)-11-エチル-2,2,4,8,10,1
1-ヘキサメチル-10,11-ジヒドロ-2H-13-オキサ-11-アザ
-1-アゾニア-ペンタセン-O-スクシンイミドエステルパ
ークロレートによるオリゴヌクレオチドの標識化 最初に、標識化反応のために、末端アミノ基で5'末端を
置換したオリゴヌクレオチドを製造した。5'末端アミノ
官能基は、オリゴヌクレオチドをアミノリンカーホスホ
ルアミダイト、すなわち「Aminolink 2」 (Applied Bio
systems, Foster City, CA)または「5'-Amino-Modifier
C6-TFA」(GLEN RESEARCH, Sterling, VA、カタログ番
号10-1916-02)と反応させることにより通常の方法によ
り導入した。エタノール沈殿により沈殿させたアミノ修
飾オリゴヌクレオチド(約10〜15 A260単位、約50〜8O n
molに相当)を200μlのホウ酸ナトリウムバッファー、0.
1 mol/l、pH 8.5に溶解した。200μlの1.6 mmolの NHS
エステル1-(3-カルボキシプロピル)-6-(2,3,4,5-テトラ
クロロフェニル)-11-エチル-2,2,4,8,10,11-ヘキサメチ
ル-10,11-ジヒドロ-2H-13-オキサ-11-アザ-1-アゾニア-
ペンタセン-O-スクシンイミドエステルパークロレート
のDMF溶液を加えた後、混合物を遮光して室温で15時間
静置させた。その後混合物を「SpeedVac」(50℃に加熱)
中で蒸発させた。残留物を1 mlの再蒸留水に溶解し、
「POROS OligoR3」カラム(PerSeptive, Inc., Framingh
am, MA)、4.6 x 50 mmに適用し、以下のようにして4 ml
/分の流速で溶出した。
ト、100 mmol/l; pH 6.9 溶出液B:トリエチルアンモニウムアセテート、100 mmol
/l; pH 6.9/アセトニトリル(1:1) 勾配溶出: - 2分100%溶出液A (N-ヒドロキシ-スクシンイミドの溶
出) - 10分100%溶出液Aから100%溶出液B - 約20〜25% B(非標識オリゴの溶出) - 約55〜65%(標識オリゴの溶出)において約2〜3分間勾
配を停止することにより、平均的に溶出した。 - 遊離染料は約85%において溶出する。 溶出プロフィルは、260 nmで光学的に検出した。
イトで5'末端標識したオリゴヌクレオチドを、増幅核酸
の定量的な検出のためにFRET対の一部として使用した。
このために、TNF-α遺伝子のin vitro転写したRNA(Shir
aiら、Nature 313, 803-806, 1985)を鋳型として滴定し
(109〜107コピー/混合物)、1段階RT-PCRによって増幅し
た。RT-PCR混合物は、個々のPCR段階の間のオンライン
検出のための2種の異なるように標識されたハイブリダ
イゼーションプローブを含むものとした。下流に位置す
るプローブは本発明による5'-JA270-標識したもの、上
流側プローブはフルオレセインで3'標識したものとし
た。両方のプローブはアンプリコンの配列にハイブリダ
イズし、数個の塩基のみ離間しており、ハイブリダイズ
した状態で2種の標識の間で蛍光共鳴エネルギー転移(FR
ET)が起こり得た。3種の反応混合物のそれぞれは、2.5
U Tth DNAポリメラーゼ、1 x RT-PCRバッファー(Tth DN
Aポリメラーゼキット)、4 mM Mn2+、300μM dATP、300
μM dCTP、300μM dGTP及び900μM dUTP、500 ng BSA、
1μlのin vitro転写したRNA(109、108及び107コピー)、
1μM フォワードプライマー(17量体、ヌクレオチド位置
2588-2602)、1μMリバースプライマー (17量体、ヌクレ
オチド位置2956-2973)、0.4μM TNF-α(wt)特異的3'-フ
ルオレセイン標識ハイブリダイゼーションプローブ(25
量体、ヌクレオチド位置2638-2662)及びJA270-ホスホル
アミダイト(25量体、ヌクレオチド位置2666-2690)で本
発明により5'標識された0.4 μM TNF-α(wt)特異的ハイ
ブリダイゼーションプローブを含むものとした。
ットで入れ、増幅反応の間のオンライン蛍光検出のため
に適当なLight-Cycler(Wittwerら、BioTechniques 12,
176-181, 1997)中で、以下の温度サイクルにかけた。鋳
型RNAは、55℃で10分以内で逆転写した(温度勾配20℃/
s、測定していない)。その後cDNAを30秒間95℃で変性さ
せた(温度勾配20℃/s、測定していない)。その後、cDNA
をポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)により45サイクル増幅
した。PCRの最初の段階で鋳型を1秒間99℃で変性させた
(温度勾配20℃/s、測定していない)。PCRの第2段階では
特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマ
ー、並びに2種のTNF-α(wt)特異的ハイブリダイゼーシ
ョンプローブを鋳型に15秒間50℃でハイブリダイズさ
せ、FRET効果を検出可能なものとした。結果として生じ
た蛍光を、製造業者の説明書に従って、各キャピラリー
についてアニーリング時間の終了時に測定した(温度勾
配20℃/s、一回の測定)。第3段階においては、72℃にお
いて18秒以内で重合を行った(温度勾配20℃/s、測定し
ていない)。PCR反応の45サイクルの後、キャピラリーを
40℃に45秒冷却した。
従ってLightCyclerの数量化プログラムを使用して実施
した。示した実験においては、in vitro転写したRNAの1
09〜10 7コピーを検出し量に従い滴定することが可能で
あり、31サイクルの後109コピーが初めて検出され、33
サイクルの後108コピーが初めて検出され、36サイクル
の後107コピーが初めて検出された。
ヌクレオチドを、ヒト第V因子遺伝子(Bertinaら、Natu
re 369, p. 64, 1994)のエクソン10中のヌクレオチド位
置1691におけるGからAの点突然変異の検出のためのFRET
対の一部として使用した。このために、特異的ゲノム第
V因子断片をLightCycler中でPCR増幅反応により増幅し
た(Wittwerら、BioTechniques 12, 176-181, 1997)。PC
R混合物(20μl)は、50 mM トリス、pH 8.3、3 mM MgC
l2、250 μg/ml BSA、200 μM dATP、200μM dGTP、200
μM dCTP、600 μM dUTP、0.2 μMフォワードプライマ
ー(エクソン10からのヌクレオチド位置1626-1647)、0.2
μMリバースプライマー(イントロン10からのヌクレオ
チド位置127-146)、0.1 μM 3'-フルオレセイン標識ハ
イブリダイゼーションプローブ(エクソン10からのヌク
レオチド位置1684-1701+イントロン10からの1-5)、0.5
μMの本発明のJA270で5'標識されたハイブリダイゼーシ
ョンプローブ(ヌクレオチド位置1647-1682、エクソン1
0)及び1.6 UのTaqポリメラーゼを含むものとした。さら
に1 ng第V因子野生型プラスミドDNA、1 ng異型接合体
プラスミドDNAまたは1 ng同型接合突然変異体プラスミ
ドDNAのいずれかを3種の混合物中に存在させた。突然変
異部位にハイブリダイズする3'標識プローブは、野生型
DNA配列に完全に相補的なものであった。
プローブの上流側にハイブリダイズし、両方の標識が1
つの塩基のみによって隔てられ、共鳴エネルギー転移が
起こることが可能であった。増幅反応の後に行った融解
曲線において、より短い3'標識プローブが最初に融解
し、共鳴エネルギー転移ができなくなった。変性、増幅
及びその後の融解曲線は、以下の条件下にLightCycler
中で実施した。
び融解温度に対する得られた蛍光強度の陰性の最初の誘
導体を使用して融解した点突然変異の遺伝子座にハイブ
リダイゼーションプローブが向かう温度を決定すること
ができた。第V因子野生型プラスミドDNAの場合、融解
温度は68℃であり、同型接合突然変異体第V因子プラス
ミドDNAについては60℃であり、異型接合体第V因子プ
ラスミドDNAについては60℃及び68℃であった。
オリゴヌクレオチドであるFRET対を使用した増幅産物の
検出によるmRNAの定量について実施例6で記載した実験
の結果を示す。曲線は、行ったサイクル数に対する測定
された蛍光をグラフとして示したものである。31サイク
ルの後初めて109コピーが検出でき、33サイクルの後初
めて108コピーが検出でき、36サイクルの後初めて107コ
ピーが検出できる。
オリゴヌクレオチドとした融解曲線測定による第V因子
遺伝子の突然変異分析について実施例7で記載した実験
の結果を示す。曲線は、融解温度に対する測定蛍光ある
いはそれらの陰性の最初の誘導体をグラフとして示すも
のである(WT:野生型、M:同型接合体DNA; Ht:異型接合
体DNA)。
Claims (17)
- 【請求項1】 一般式(1)または(2)の化合物であ
って、A1、A2及びA3は互いに独立して水素、シアノ、ハ
ロゲン及びスルホン酸からなる群から選択され、B1はハ
ロゲン、シアノまたは水素を示し、B2は水素、アミド、
ハロゲン及び1〜20のC原子を有するアルキル基からなる
群から選択される、該化合物。 【化1】 (1) 【化2】 (2) [式中、Ca〜CdはそれぞれC原子を表し、Ca及びCb並び
にCc及びCdは単結合または二重結合によって結合され;
X1〜X16は互いに独立してハロゲン、スルホン酸、水素
及び1〜20のC原子を有するアルキル基からなる群から選
択され、該アルキル基は1または数個のハロゲンまたは
スルホン酸基で置換されていてもよく;R1及びR2は、同
一であるか異なり、水素、1〜20のC原子を有するアルキ
ル、ポリオキシヒドロカルビル単位、フェニル、または
アルキル鎖が1〜3の炭素原子を有するフェニルアルキル
を表し、該アルキル及び/またはフェニル基は1または
数個のヒドロキシ、ハロゲン、スルホン酸、アミノ、カ
ルボキシまたはアルコキシが1〜4の炭素原子を有し得る
アルコキシカルボニル基により置換されていてもよく;
少なくともR1は活性化可能な基を含み;R2及びX4は任意
に0〜2のC原子からなる架橋により結合されていてもよ
い。] - 【請求項2】 A1、A2、A3、B1及びB2を含む群の基の全
てがフッ素または塩素を示す請求項1に記載の化合物。 - 【請求項3】 A1、A2、A3及びB1を含む群の基の全てが
フッ素または塩素を示し、B2が水素を示す請求項1に記
載の化合物。 - 【請求項4】 基X1、X2、X3、X4、X7及びX10が水素を
示し、及び/または基X5、X6、X8、X9、X11及びX12がメ
チルを表す請求項1に記載の化合物。 - 【請求項5】 請求項1〜4のいずれか1項に記載の化
合物の活性化誘導体。 - 【請求項6】 活性化基が、ホスホルアミダイト、N-ヒ
ドロキシスクシンイミド、マレインイミド、H-ホスホネ
ート及びイソチオシアネートからなる群から選択される
請求項5に記載の活性化誘導体。 - 【請求項7】 請求項1〜6のいずれか1項に記載の化
合物から得られる複合体。 - 【請求項8】 炭水化物、タンパク質、抗体、核酸、核
酸類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ハプテ
ン、ホルモン及びビタミンからなる群から選択される少
なくとも1種の分子を含む請求項7に記載の複合体。 - 【請求項9】 分子がオリゴヌクレオチドまたはヌクレ
オシドトリホスフェートである請求項8に記載の複合
体。 - 【請求項10】 請求項1〜6のいずれか1項に記載の
化合物の蛍光染料としての使用。 - 【請求項11】 請求項1〜9のいずれか1項に記載の
化合物のもう1種の染料またはもう1種の染料複合体と
合わせた蛍光共鳴エネルギー転移系としての使用。 - 【請求項12】 請求項1〜9のいずれか1項に記載の
化合物の分析または診断系における使用。 - 【請求項13】 請求項9に記載の化合物の核酸の標識
及び/または検出のための使用。 - 【請求項14】 もう1つの蛍光染料及び第2のオリゴ
ヌクレオチドからなる少なくとも1種の第2の複合体を
使用し、染料の励起の後に蛍光共鳴エネルギー転移が起
こり得る請求項13に記載の使用。 - 【請求項15】 増幅反応の生成物が核酸として検出さ
れる請求項13または14に記載の使用。 - 【請求項16】 生成物が各増幅サイクルの間または後
に検出される請求項15に記載の使用。 - 【請求項17】 融解曲線分析を行う請求項15に記載の
使用。
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