JP2000002708A - エンドトキシン特異的アッセイ - Google Patents
エンドトキシン特異的アッセイInfo
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 サンプル中のエンドトキシンをより特異的に
検出する手段を提供すること。 【解決手段】 試験サンプル中のエンドトキシンを検出
するのに適する変形細胞分解産物中のグルカン感受性経
路を阻害する方法であって、該変形細胞分解産物を、該
変形細胞分解産物中の該グルカン感受性酵素的経路を阻
害するのに有効な量のβ−１，４−グルカンと接触させ
る段階を含んでなり、該β−１，４−グルカンの全ての
グリコシド結合が、β−１，４−グリコシド結合である
方法。
検出する手段を提供すること。 【解決手段】 試験サンプル中のエンドトキシンを検出
するのに適する変形細胞分解産物中のグルカン感受性経
路を阻害する方法であって、該変形細胞分解産物を、該
変形細胞分解産物中の該グルカン感受性酵素的経路を阻
害するのに有効な量のβ−１，４−グルカンと接触させ
る段階を含んでなり、該β−１，４−グルカンの全ての
グリコシド結合が、β−１，４−グリコシド結合である
方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、変形細胞分解産物
を用いるエンドトキシン検出の分野に関する。より特定
すると、本発明は、リムルス(Limulus) 変形細胞分解産
物を用いるエンドトキシンの検出に関する。
を用いるエンドトキシン検出の分野に関する。より特定
すると、本発明は、リムルス(Limulus) 変形細胞分解産
物を用いるエンドトキシンの検出に関する。
【０００２】
【従来の技術】カブトガニ血液リンパは、エンドトキシ
ン（リポ多糖類) に応答して血液リンパの凝固を引き起
こすエンドトキシン媒介セリンプロテアーゼ経路を含有
している (Iwanaga ら, Curr. Opin. Immunol. 5, 74-8
2, 1993)。リムルス細胞分解産物（ＬＡＬ）は、ヒト及
び動物用医薬品、生体物質、及び医療装置を含む種々の
試験サンプル中のエンドトキシンを検出するアッセイに
広く用いられている。医薬品及び研究生成物は、しばし
ば、細菌性エンドトキシンからの汚染物質について試験
される。これら汚染物質が体内に注射されると、発熱及
び場合によっては死を含む重篤な副作用を引き起し得
る。
ン（リポ多糖類) に応答して血液リンパの凝固を引き起
こすエンドトキシン媒介セリンプロテアーゼ経路を含有
している (Iwanaga ら, Curr. Opin. Immunol. 5, 74-8
2, 1993)。リムルス細胞分解産物（ＬＡＬ）は、ヒト及
び動物用医薬品、生体物質、及び医療装置を含む種々の
試験サンプル中のエンドトキシンを検出するアッセイに
広く用いられている。医薬品及び研究生成物は、しばし
ば、細菌性エンドトキシンからの汚染物質について試験
される。これら汚染物質が体内に注射されると、発熱及
び場合によっては死を含む重篤な副作用を引き起し得
る。
【０００３】ＬＡＬアッセイでは、リムルス変形細胞の
抽出物には、ＬＡＬに高い鋭敏性及び／又は安定性を与
える成分が混ざっており、それらがＬＡＬ試薬を形成し
ている。試験サンプルは、このＬＡＬ試薬と混合され、
ＬＡＬ試薬と混合された一連の既知のエンドトキシンス
タンダードと比較される。サンプル及びスタンダードの
結果を比較して、サンプル中のエンドトキシンの濃度を
決定する。エンドトキシンについてのＬＡＬアッセイ
は、完全に特異的という訳ではない。別のグルカン感受
性酵素的経路を通ってＬＡＬと反応するβ−１，３−グ
ルカン類にも応答する（Iwanaga ら, 1993を参照のこ
と) 。これらβ−グルカン類は、種々の分子量とそのグ
ルコースサブユニット間に主としてβ−１，３−グリコ
シド結合を有するグルコースのポリマーである。充分な
量のβ−グルカンが試験サンプル中に存在すると、偽陽
性結果が得られる。偽陽性は、高価な医療装置又は大量
の製品を不必要に廃棄するという事態を製造業者にもた
らす。ＬＡＬ試験における陽性結果がエンドトキシンに
起因するのか又はβ−グルカン汚染物質に起因するのか
を見極めるのは困難なことが多い。かくして、β−グル
カン汚染物質に起因する偽陽性結果の発生を少なくする
か又は無くするエンドトキシン特異的アッセイについて
の必要性が、依然として当該技術分野に存在している。
抽出物には、ＬＡＬに高い鋭敏性及び／又は安定性を与
える成分が混ざっており、それらがＬＡＬ試薬を形成し
ている。試験サンプルは、このＬＡＬ試薬と混合され、
ＬＡＬ試薬と混合された一連の既知のエンドトキシンス
タンダードと比較される。サンプル及びスタンダードの
結果を比較して、サンプル中のエンドトキシンの濃度を
決定する。エンドトキシンについてのＬＡＬアッセイ
は、完全に特異的という訳ではない。別のグルカン感受
性酵素的経路を通ってＬＡＬと反応するβ−１，３−グ
ルカン類にも応答する（Iwanaga ら, 1993を参照のこ
と) 。これらβ−グルカン類は、種々の分子量とそのグ
ルコースサブユニット間に主としてβ−１，３−グリコ
シド結合を有するグルコースのポリマーである。充分な
量のβ−グルカンが試験サンプル中に存在すると、偽陽
性結果が得られる。偽陽性は、高価な医療装置又は大量
の製品を不必要に廃棄するという事態を製造業者にもた
らす。ＬＡＬ試験における陽性結果がエンドトキシンに
起因するのか又はβ−グルカン汚染物質に起因するのか
を見極めるのは困難なことが多い。かくして、β−グル
カン汚染物質に起因する偽陽性結果の発生を少なくする
か又は無くするエンドトキシン特異的アッセイについて
の必要性が、依然として当該技術分野に存在している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、サン
プル中のエンドトキシンをより特異的に検出する手段を
提供することである。本発明のこの目的及び他の目的
は、以下に記載する１又はそれを越える態様により達成
される。
プル中のエンドトキシンをより特異的に検出する手段を
提供することである。本発明のこの目的及び他の目的
は、以下に記載する１又はそれを越える態様により達成
される。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明の１つの態様は、
試験サンプル中のエンドトキシンを検出するのに適する
変形細胞分解産物中のグルカン感受性経路を阻害する方
法を提供する。変形細胞分解産物を、その変形細胞分解
産物中のグルカン感受性酵素的経路を阻害するのに有効
な量のβ−１，４−グルカンと接触させる。このβ−
１，４−グルカン中の全てのグリコシド結合は、β−
１，４−グリコシド結合である。本発明のもう１つの態
様は、試験サンプル中のエンドトキシンを検出するため
の試薬を提供する。この試薬は、変形細胞分解産物とβ
−１，４−グルカンを含んでなる。このβ−１，４−グ
ルカン中の全てのグリコシド結合は、β−１，４−グリ
コシド結合である。本発明のいま１つの態様は、試験サ
ンプル中のエンドトキシンを検出するためのキットを提
供する。このキットは、変形細胞分解産物、β−１，４
−グルカン、及びそのキットをエンドトキシンの検出に
用いるための使用説明書を含んでなる。このβ−１，４
−グルカン中の全てのグリコシド結合は、β−１，４−
グリコシド結合である。
試験サンプル中のエンドトキシンを検出するのに適する
変形細胞分解産物中のグルカン感受性経路を阻害する方
法を提供する。変形細胞分解産物を、その変形細胞分解
産物中のグルカン感受性酵素的経路を阻害するのに有効
な量のβ−１，４−グルカンと接触させる。このβ−
１，４−グルカン中の全てのグリコシド結合は、β−
１，４−グリコシド結合である。本発明のもう１つの態
様は、試験サンプル中のエンドトキシンを検出するため
の試薬を提供する。この試薬は、変形細胞分解産物とβ
−１，４−グルカンを含んでなる。このβ−１，４−グ
ルカン中の全てのグリコシド結合は、β−１，４−グリ
コシド結合である。本発明のいま１つの態様は、試験サ
ンプル中のエンドトキシンを検出するためのキットを提
供する。このキットは、変形細胞分解産物、β−１，４
−グルカン、及びそのキットをエンドトキシンの検出に
用いるための使用説明書を含んでなる。このβ−１，４
−グルカン中の全てのグリコシド結合は、β−１，４−
グリコシド結合である。
【０００６】かくして、本発明は、グルカン汚染物質の
存在に起因する偽陽性結果を出しがちなＬＡＬアッセイ
の傾向を少なくして、ＬＡＬアッセイをエンドトキシン
検出についてより特異的にするための試薬及び方法を当
該技術分野に提供する。本発明は、なかんずく、試験サ
ンプルが痕跡量のβ−グルカンを含有するときに偽陽性
結果を回避できるエンドトキシン特異的アッセイを提供
する。
存在に起因する偽陽性結果を出しがちなＬＡＬアッセイ
の傾向を少なくして、ＬＡＬアッセイをエンドトキシン
検出についてより特異的にするための試薬及び方法を当
該技術分野に提供する。本発明は、なかんずく、試験サ
ンプルが痕跡量のβ−グルカンを含有するときに偽陽性
結果を回避できるエンドトキシン特異的アッセイを提供
する。
【０００７】
【好ましい態様の詳細な説明】本発明者らは、全てのグ
リコシド結合がβ−１，４−グリコシド結合であるβ−
グルカン類を用いると、カブトガニ変形細胞分解産物中
のグルカン感受性経路を阻害し、エンドトキシンについ
てのＬＡＬ試薬及びＬＡＬアッセイを特異的にすること
ができることを発見した。変形細胞分解産物を調製する
方法は当該技術分野で周知である。例えば、Levin と B
ang, Bull. Johns Hopkins Hosp. 115, 265-74, 1968；
Young ら, J. Clin. Invest., 51, 1790-97, 1972 を参
照のこと。変形細胞分解産物は、Limuluspolyphemus、T
achypleus tridentatus、Tachypleus gigas、及び Carc
inoscorpius rotundicauda のようなあらゆる種のカブ
トガニから単離される変形細胞から調製することができ
る。変形細胞分解産物は、調製されたばかりのものであ
っても、一般に知られているように、凍結乾燥されてか
ら使用前に解凍されたものであってもよい。本発明の方
法は、細胞分解産物の供給源に限定されるものではな
い。変形細胞分解産物は、例えば、速度論的発色法、エ
ンドポイント発色法、ゲル−クロット法、濁度法、又は
酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）法における使用に適す
る試薬の形態であることができる。そのような試薬は、
例えば、米国特許第４，３２２，２１７号、４，５１
０，２４１号、及び５，３１０，６５７号に開示されて
いる。この細胞分解産物のエンドトキシン感受性範囲
は、好ましくは０．００５〜５０ＥＵ／ｍｌの範囲であ
る。
リコシド結合がβ−１，４−グリコシド結合であるβ−
グルカン類を用いると、カブトガニ変形細胞分解産物中
のグルカン感受性経路を阻害し、エンドトキシンについ
てのＬＡＬ試薬及びＬＡＬアッセイを特異的にすること
ができることを発見した。変形細胞分解産物を調製する
方法は当該技術分野で周知である。例えば、Levin と B
ang, Bull. Johns Hopkins Hosp. 115, 265-74, 1968；
Young ら, J. Clin. Invest., 51, 1790-97, 1972 を参
照のこと。変形細胞分解産物は、Limuluspolyphemus、T
achypleus tridentatus、Tachypleus gigas、及び Carc
inoscorpius rotundicauda のようなあらゆる種のカブ
トガニから単離される変形細胞から調製することができ
る。変形細胞分解産物は、調製されたばかりのものであ
っても、一般に知られているように、凍結乾燥されてか
ら使用前に解凍されたものであってもよい。本発明の方
法は、細胞分解産物の供給源に限定されるものではな
い。変形細胞分解産物は、例えば、速度論的発色法、エ
ンドポイント発色法、ゲル−クロット法、濁度法、又は
酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）法における使用に適す
る試薬の形態であることができる。そのような試薬は、
例えば、米国特許第４，３２２，２１７号、４，５１
０，２４１号、及び５，３１０，６５７号に開示されて
いる。この細胞分解産物のエンドトキシン感受性範囲
は、好ましくは０．００５〜５０ＥＵ／ｍｌの範囲であ
る。
【０００８】全てのグリコシド結合がβ−１，４−グリ
コシド結合であるどのようなβ−１，４−グルカンも、
本発明の方法に用いることができる。ダイマー（セロビ
オース）が好ましいが、少なくとも３、４、５、６、
７、８、９若しくは１０又はより多くのグルコースモノ
マー単位を含むポリマーでも、阻害剤として使用でき
る。場合により、β−１，４−グルカンは、アルキル、
カルボキシメチル、メチル又はヒドロキシメチル基のよ
うな１又はそれを越える化学部分を含むことができる。
その化学部分がグルコースモノマー又はポリマーである
場合は、β−１，３−又はβ−１，６−グリコシド結合
によってそのβ−１，４−グルカンに結合していること
はない。その化学部分がグルコースポリマーである場合
は、それはβ−１，３−グリコシド結合を含まない。そ
のような化学部分にカップリングしているか又はしてい
ない２又はそれを越える異なるβ−１，４−グルカンの
混合物も、グルカンに対する変形細胞分解産物の応答を
阻害するために、本発明に従って用いることができる。
コシド結合であるどのようなβ−１，４−グルカンも、
本発明の方法に用いることができる。ダイマー（セロビ
オース）が好ましいが、少なくとも３、４、５、６、
７、８、９若しくは１０又はより多くのグルコースモノ
マー単位を含むポリマーでも、阻害剤として使用でき
る。場合により、β−１，４−グルカンは、アルキル、
カルボキシメチル、メチル又はヒドロキシメチル基のよ
うな１又はそれを越える化学部分を含むことができる。
その化学部分がグルコースモノマー又はポリマーである
場合は、β−１，３−又はβ−１，６−グリコシド結合
によってそのβ−１，４−グルカンに結合していること
はない。その化学部分がグルコースポリマーである場合
は、それはβ−１，３−グリコシド結合を含まない。そ
のような化学部分にカップリングしているか又はしてい
ない２又はそれを越える異なるβ−１，４−グルカンの
混合物も、グルカンに対する変形細胞分解産物の応答を
阻害するために、本発明に従って用いることができる。
【０００９】グルカン感受性酵素的経路を阻害するため
のアッセイにおける具体的なβ−１，４−グルカンの最
適濃度は、使用される変形細胞分解産物製剤で変動し得
る。具体的な供給源の変形細胞分解産物中のグルカン感
受性酵素的経路を阻害するのに有効である特定のβ−
１，４−グルカンの量は、例えば、日常試験により決定
することができる。以下の実施例４に記載するように、
種々の濃度のβ−１，４−グルカンを、ザイモサンＡの
ようなβ−グルカンを含有する物質が加えられた変形細
胞分解産物アッセイに添加することができる。好ましく
は、本発明による阻害性添加剤として使用されるβ−
１，４−グルカンは、セロビオースである。セロビオー
スの有効量は、１００ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、
一般には１００ｎｇ／ｍｌ〜７０ｍｇ／ｍｌ、最も高頻
度には１５〜５０ｍｇ／ｍｌ、１５〜４０ｍｇ／ｍｌ、
１５〜３５ｍｇ／ｍｌ、又は１５〜２５ｍｇ／ｍｌであ
る（図３を参照のこと）。０．０５、０．１、０．１
５、０．１７５、１、１．５、２、２．５、５、７．
５、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２１、２
２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３
０、３５、４０、４５、５０、６０又は７０ｍｇ／ｍｌ
のような濃度のセロビオースを変形細胞分解産物アッセ
イで使用することができる。
のアッセイにおける具体的なβ−１，４−グルカンの最
適濃度は、使用される変形細胞分解産物製剤で変動し得
る。具体的な供給源の変形細胞分解産物中のグルカン感
受性酵素的経路を阻害するのに有効である特定のβ−
１，４−グルカンの量は、例えば、日常試験により決定
することができる。以下の実施例４に記載するように、
種々の濃度のβ−１，４−グルカンを、ザイモサンＡの
ようなβ−グルカンを含有する物質が加えられた変形細
胞分解産物アッセイに添加することができる。好ましく
は、本発明による阻害性添加剤として使用されるβ−
１，４−グルカンは、セロビオースである。セロビオー
スの有効量は、１００ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、
一般には１００ｎｇ／ｍｌ〜７０ｍｇ／ｍｌ、最も高頻
度には１５〜５０ｍｇ／ｍｌ、１５〜４０ｍｇ／ｍｌ、
１５〜３５ｍｇ／ｍｌ、又は１５〜２５ｍｇ／ｍｌであ
る（図３を参照のこと）。０．０５、０．１、０．１
５、０．１７５、１、１．５、２、２．５、５、７．
５、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２１、２
２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３
０、３５、４０、４５、５０、６０又は７０ｍｇ／ｍｌ
のような濃度のセロビオースを変形細胞分解産物アッセ
イで使用することができる。
【００１０】本発明によれば、変形細胞分解産物は、β
−１，４−グルカンと接触させられる。その最終反応混
合物は、変形細胞分解産物、β−１，４−グルカン、及
び試験サンプルを含む。しかしながら、これら変形細胞
分解産物、β−１，４−グルカン、及び試験サンプル
は、どのような順序で添加されてもよい。例えば、試験
サンプルを変形細胞分解産物とβ−１，４−グルカンの
混合物に添加してもよい。また、試験サンプルを、変形
細胞分解産物がβ−１，４−グルカンと接触させられる
前に、その変形細胞分解産物に添加してもよい。変形細
胞分解産物及びβ−１，４−グルカンを凍結乾燥してか
ら接触段階前に解凍してもよい。また、変形細胞分解産
物をβ−１，４−グルカンと接触させる段階の前に、β
−１，４−グルカンと試験サンプルを予備混合してもよ
い。β−１，４−グルカン、変形細胞分解産物、及び試
験サンプルを添加する全ての可能な順序が、本発明の範
囲内のものである。
−１，４−グルカンと接触させられる。その最終反応混
合物は、変形細胞分解産物、β−１，４−グルカン、及
び試験サンプルを含む。しかしながら、これら変形細胞
分解産物、β−１，４−グルカン、及び試験サンプル
は、どのような順序で添加されてもよい。例えば、試験
サンプルを変形細胞分解産物とβ−１，４−グルカンの
混合物に添加してもよい。また、試験サンプルを、変形
細胞分解産物がβ−１，４−グルカンと接触させられる
前に、その変形細胞分解産物に添加してもよい。変形細
胞分解産物及びβ−１，４−グルカンを凍結乾燥してか
ら接触段階前に解凍してもよい。また、変形細胞分解産
物をβ−１，４−グルカンと接触させる段階の前に、β
−１，４−グルカンと試験サンプルを予備混合してもよ
い。β−１，４−グルカン、変形細胞分解産物、及び試
験サンプルを添加する全ての可能な順序が、本発明の範
囲内のものである。
【００１１】試験サンプルは、水、医療装置、医薬品、
及び組織培養液や血液や血清のような生物学的試験サン
プルを包含する、起こり得るエンドトキシン汚染を測定
するのに有用な如何なるサンプルであってもよい。β−
１，４−グルカンの存在下での変形細胞分解産物の試験
サンプルに対する応答は、当該技術分野で周知なやり方
で検出され得る。例えば、濁度法、ゲル−クロット形成
アッセイ、速度論的発色法、エンドポイント発色法、及
び酵素結合免疫吸着法は全て、本発明の方法で使用する
のに適している。そのようなアッセイの実行は、日常的
なものである。例えば、Moritaら, BACTERIAL ENDOTOXI
NS: STRUCTURE, BIOMEDICAL SIGNIFICANCE, AND DETECT
ION WITH THE LIMULUS AMEBOCYTE LYSATE TEST, pp. 53
-64, 1985 ；Kambayashiら, J. Biochem. Biophys. Met
h. 22, 93-100, 1991 ；Matuuraと Tsuchiya, 米国特
許第５，１７９，００６号；及び Cooper ら, PDA J. P
harm. Sci. Technol. 51, 2-6, 1997 を参照のこと。用
いられる具体的なタイプのアッセイに適するあらゆる方
法を用いて陽性結果及び陰性結果を検出することがで
き、それらには、変形細胞分解産物アッセイの結果を読
み取って計算するように特別にデザインされた自動読取
装置及びソフトウェアーが包含される（例えば、Bio Wh
ittaker 社の Kinetic-QCL読取装置及び WinKQCLソフト
ウェアー）。
及び組織培養液や血液や血清のような生物学的試験サン
プルを包含する、起こり得るエンドトキシン汚染を測定
するのに有用な如何なるサンプルであってもよい。β−
１，４−グルカンの存在下での変形細胞分解産物の試験
サンプルに対する応答は、当該技術分野で周知なやり方
で検出され得る。例えば、濁度法、ゲル−クロット形成
アッセイ、速度論的発色法、エンドポイント発色法、及
び酵素結合免疫吸着法は全て、本発明の方法で使用する
のに適している。そのようなアッセイの実行は、日常的
なものである。例えば、Moritaら, BACTERIAL ENDOTOXI
NS: STRUCTURE, BIOMEDICAL SIGNIFICANCE, AND DETECT
ION WITH THE LIMULUS AMEBOCYTE LYSATE TEST, pp. 53
-64, 1985 ；Kambayashiら, J. Biochem. Biophys. Met
h. 22, 93-100, 1991 ；Matuuraと Tsuchiya, 米国特
許第５，１７９，００６号；及び Cooper ら, PDA J. P
harm. Sci. Technol. 51, 2-6, 1997 を参照のこと。用
いられる具体的なタイプのアッセイに適するあらゆる方
法を用いて陽性結果及び陰性結果を検出することがで
き、それらには、変形細胞分解産物アッセイの結果を読
み取って計算するように特別にデザインされた自動読取
装置及びソフトウェアーが包含される（例えば、Bio Wh
ittaker 社の Kinetic-QCL読取装置及び WinKQCLソフト
ウェアー）。
【００１２】本発明は、試験サンプル中のエンドトキシ
ンを特異的に検出するのに用いることができる試薬も提
供する。その試薬は、変形細胞分解産物、好ましくはカ
ブトガニ変形細胞分解産物、最も好ましくはリムルス変
形細胞分解産物、及びβ−１，４−グルカンを含んでな
る。そのβ−１，４−グルカンは、好ましくはセロビオ
ースであるが、上に記載したように、付加的な化学部分
にカップリングしているか又はしていない２又はそれを
越えるグルコースモノマーを含むどのようなポリマーで
あってもよい。この試薬は、保存及び輸送の便宜から、
凍結乾燥された形態で提供されることができる。場合に
より、この試薬は、ＬＡＬアッセイに高い鋭敏性又は安
定性を与える追加の成分を含んでいてもよい（米国特許
第４，３２２，２１７号；４，５１０，２４１号；５，
３１０，６５７号を参照のこと）。
ンを特異的に検出するのに用いることができる試薬も提
供する。その試薬は、変形細胞分解産物、好ましくはカ
ブトガニ変形細胞分解産物、最も好ましくはリムルス変
形細胞分解産物、及びβ−１，４−グルカンを含んでな
る。そのβ−１，４−グルカンは、好ましくはセロビオ
ースであるが、上に記載したように、付加的な化学部分
にカップリングしているか又はしていない２又はそれを
越えるグルコースモノマーを含むどのようなポリマーで
あってもよい。この試薬は、保存及び輸送の便宜から、
凍結乾燥された形態で提供されることができる。場合に
より、この試薬は、ＬＡＬアッセイに高い鋭敏性又は安
定性を与える追加の成分を含んでいてもよい（米国特許
第４，３２２，２１７号；４，５１０，２４１号；５，
３１０，６５７号を参照のこと）。
【００１３】本発明は、試験サンプル中のエンドトキシ
ンの特異的検出のためのキットも提供する。そのキット
は、変形細胞分解産物、好ましくはカブトガニ変形細胞
分解産物、最も好ましくはリムルス変形細胞分解産物、
及びβ−１，４−グルカンを含んでなる。その変形細胞
分解産物は、β−１，４−グルカンと一緒に又は別々に
凍結乾燥されていてもよい。好ましくは、β−１，４−
グルカンはセロビオースであるが、上に記載したよう
に、付加的な化学部分にカップリングしているか又はし
ていないβ−１，４−グリコシド結合により連結された
他のグルコースポリマーも使用することができる。その
キットを使用してエンドトキシンを特異的に検出するた
めの使用説明書も含められる。場合により、変形細胞分
解産物とβ−１，４−グルカンを含んでなる上記の本発
明の試薬をキットで提供してもよい。以下は、例示のた
めだけに示すのであって、上に一般的に説明した発明の
範囲を限定することを意図したものではない。
ンの特異的検出のためのキットも提供する。そのキット
は、変形細胞分解産物、好ましくはカブトガニ変形細胞
分解産物、最も好ましくはリムルス変形細胞分解産物、
及びβ−１，４−グルカンを含んでなる。その変形細胞
分解産物は、β−１，４−グルカンと一緒に又は別々に
凍結乾燥されていてもよい。好ましくは、β−１，４−
グルカンはセロビオースであるが、上に記載したよう
に、付加的な化学部分にカップリングしているか又はし
ていないβ−１，４−グリコシド結合により連結された
他のグルコースポリマーも使用することができる。その
キットを使用してエンドトキシンを特異的に検出するた
めの使用説明書も含められる。場合により、変形細胞分
解産物とβ−１，４−グルカンを含んでなる上記の本発
明の試薬をキットで提供してもよい。以下は、例示のた
めだけに示すのであって、上に一般的に説明した発明の
範囲を限定することを意図したものではない。
【００１４】
【実施例】実施例１ この実施例は、以下の実施例で使用する材料及び方法を
説明するものである。 エンドトキシン溶液：精製大腸菌エンドトキシン、つま
り参照スタンダードエンドトキシン（ＲＳＥ）ロットＥ
Ｃ−６を、Center for Biologics Evaluationand Resea
rch Center,ＦＤＡ(Rockville, MD) から得た。１０，
０００エンドトキシン単位を含有する１つのバイアル瓶
を５．０ｍｌのＬＡＬ試薬水（ＬＡＬ−ＲＷ）で解凍し
て、３０分間渦を巻かせた。このストックを逐次希釈し
てスタンダードとサンプルの両方を調製した。ＦＤＡ菌
株シアトル１９４６（カタログ番号２５９２２）から誘
導された天然大腸菌をアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションから得た。試験前にトリプチカーゼ大豆
ブロス中で培養して２〜８℃で保存した。 リムルス変形細胞分解産物反応性物質（ＬＡＬ−Ｒ
Ｍ）：Baxter Health Care社(Deerfield, IL) から得た
CF-Capillary Flow Dialyzer, Model CF23 をＬＡＬ−
ＲＷで濯ぐことによって、ＬＡＬ−ＲＭサンプルを調製
した。濯ぎ液を凍結乾燥してからＬＡＬ−ＲＷで解凍し
た。ＬＡＬ−ＲＭサンプルは、＜−１０℃で保存した。
説明するものである。 エンドトキシン溶液：精製大腸菌エンドトキシン、つま
り参照スタンダードエンドトキシン（ＲＳＥ）ロットＥ
Ｃ−６を、Center for Biologics Evaluationand Resea
rch Center,ＦＤＡ(Rockville, MD) から得た。１０，
０００エンドトキシン単位を含有する１つのバイアル瓶
を５．０ｍｌのＬＡＬ試薬水（ＬＡＬ−ＲＷ）で解凍し
て、３０分間渦を巻かせた。このストックを逐次希釈し
てスタンダードとサンプルの両方を調製した。ＦＤＡ菌
株シアトル１９４６（カタログ番号２５９２２）から誘
導された天然大腸菌をアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションから得た。試験前にトリプチカーゼ大豆
ブロス中で培養して２〜８℃で保存した。 リムルス変形細胞分解産物反応性物質（ＬＡＬ−Ｒ
Ｍ）：Baxter Health Care社(Deerfield, IL) から得た
CF-Capillary Flow Dialyzer, Model CF23 をＬＡＬ−
ＲＷで濯ぐことによって、ＬＡＬ−ＲＭサンプルを調製
した。濯ぎ液を凍結乾燥してからＬＡＬ−ＲＷで解凍し
た。ＬＡＬ−ＲＭサンプルは、＜−１０℃で保存した。
【００１５】ザイモサンＡ：サッカロミセス・セレビシ
エからのザイモサンＡ（カタログ番号Ｚ−４２５０）を
Sigma Chemical 社(St. Louis, MO) から得た。ザイモ
サンＡは、β−１，３−グリコシド結合を含有するグル
カン、並びに諸タンパク質及び脂質を含んでなる。５．
０ｍｇのサンプルを５ｍｌの９０％ギ酸（カタログ番号
Ａ−１１９−５００，Fisher Chemical 社 (Fair Lawn,
NJ)）と混合した。この溶液をザイモサンＡが完全に溶
解するまで５６℃に加熱した（約３時間）。水酸化ナト
リウム及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの
添加により、この調製物の中和を行った。このストック
中のザイモサンＡの最終濃度は３１７μｇ／ｍｌでｐＨ
は６．５であった。この溶液を使用するまで２〜８℃で
保存した。 セロビオース：β−Ｄ（＋）−セロビオースを Aldrich
Chemical 社（カタログ番号Ｃ１，７７０−５）又は S
igma Chemical 社（カタログ番号Ｃ−７２５２）のいず
れかから得た。セロビオースをＬＡＬ−ＲＷ中に溶解さ
せてから、Sartorius （カタログ番号Ｄ２０）からの U
ltrasartフィルターで超濾過してエンドトキシンを除去
することによって、セロビオースストック溶液を調製し
た。超濾過したセロビオースを試験して、＜０．００５
のＬＡＬ反応性単位を含有することが分かった。このセ
ロビオース調製物を２〜８℃で保存した。
エからのザイモサンＡ（カタログ番号Ｚ−４２５０）を
Sigma Chemical 社(St. Louis, MO) から得た。ザイモ
サンＡは、β−１，３−グリコシド結合を含有するグル
カン、並びに諸タンパク質及び脂質を含んでなる。５．
０ｍｇのサンプルを５ｍｌの９０％ギ酸（カタログ番号
Ａ−１１９−５００，Fisher Chemical 社 (Fair Lawn,
NJ)）と混合した。この溶液をザイモサンＡが完全に溶
解するまで５６℃に加熱した（約３時間）。水酸化ナト
リウム及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの
添加により、この調製物の中和を行った。このストック
中のザイモサンＡの最終濃度は３１７μｇ／ｍｌでｐＨ
は６．５であった。この溶液を使用するまで２〜８℃で
保存した。 セロビオース：β−Ｄ（＋）−セロビオースを Aldrich
Chemical 社（カタログ番号Ｃ１，７７０−５）又は S
igma Chemical 社（カタログ番号Ｃ−７２５２）のいず
れかから得た。セロビオースをＬＡＬ−ＲＷ中に溶解さ
せてから、Sartorius （カタログ番号Ｄ２０）からの U
ltrasartフィルターで超濾過してエンドトキシンを除去
することによって、セロビオースストック溶液を調製し
た。超濾過したセロビオースを試験して、＜０．００５
のＬＡＬ反応性単位を含有することが分かった。このセ
ロビオース調製物を２〜８℃で保存した。
【００１６】実施例２ この実施例は、後の試験で使用するＬＡＬ−ＲＭの最適
量を見出すためのＬＡＬ−ＲＭの滴定を示すものであ
る。上記のＬＡＬ−ＲＭ調製物をＬＡＬ−ＲＷで希釈し
て、Bio Whittaker 社により Kinetic-QCLとして販売さ
れている凍結乾燥リムルス変形細胞分解産物（ＬＡＬ）
試薬（ＫＱＣＬ Bio Whittaker Kinetic-QCL試薬＃Ｋ５
０−６４３）を用いて試験した。この試薬は、米国特許
第５，３１０，６５７号に記載された通りに調製された
ものである。この調製物は、０．００５〜５０ＥＵ／ｍ
ｌの範囲のエンドトキシンに対して直線的応答を示し
た。ＫＱＣＬ試薬は、２．６ｍｌのＬＡＬ−ＲＷ又はセ
ロビオースが溶解した２．６ｍｌのＬＡＬ−ＲＷのいず
れかで解凍させた。この実施例及び後の実施例に記載し
た試験は、エンドトキシン汚染を最小にした条件下で行
われた。一連のエンドトキシンスタンダードは、２００
０ＥＵ／ｍｌのＥＣ−６ストックを用いて調製された。
０．００５、０．０５、０．５０、５．０及び５０ＥＵ
／ｍｌのスタンダード濃度を全ての試験に含めた。
量を見出すためのＬＡＬ−ＲＭの滴定を示すものであ
る。上記のＬＡＬ−ＲＭ調製物をＬＡＬ−ＲＷで希釈し
て、Bio Whittaker 社により Kinetic-QCLとして販売さ
れている凍結乾燥リムルス変形細胞分解産物（ＬＡＬ）
試薬（ＫＱＣＬ Bio Whittaker Kinetic-QCL試薬＃Ｋ５
０−６４３）を用いて試験した。この試薬は、米国特許
第５，３１０，６５７号に記載された通りに調製された
ものである。この調製物は、０．００５〜５０ＥＵ／ｍ
ｌの範囲のエンドトキシンに対して直線的応答を示し
た。ＫＱＣＬ試薬は、２．６ｍｌのＬＡＬ−ＲＷ又はセ
ロビオースが溶解した２．６ｍｌのＬＡＬ−ＲＷのいず
れかで解凍させた。この実施例及び後の実施例に記載し
た試験は、エンドトキシン汚染を最小にした条件下で行
われた。一連のエンドトキシンスタンダードは、２００
０ＥＵ／ｍｌのＥＣ−６ストックを用いて調製された。
０．００５、０．０５、０．５０、５．０及び５０ＥＵ
／ｍｌのスタンダード濃度を全ての試験に含めた。
【００１７】スタンダード又はサンプル（１００μｌ）
を９６ウェルマイクロプレートに添加した。そのマイク
ロプレートを、エンドトキシン試験を行うためにデザイ
ンされたインキュベーティングマイクロプレート読取装
置（Kinetic-QCL 読取装置＃２５−１４１Ｂ, Bio Whit
taker 社）中に入れた。そのプレートを10分間予備イン
キュベートした後、１００μｌのＫＱＣＬをセロビオー
スと一緒に又はセロビオースなしに、そのマイクロプレ
ートの適切なウェルに添加した。そのマイクロプレート
を３０秒間震盪した。エンドトキシン試験を行うために
特別にデザインされたソフトウェアー（WinKQCL ＃２５
−３００, Bio Whittaker 社）を用いて試験の実行とデ
ータ解析を行った。サンプル結果を“ＬＡＬ反応性単
位”として示した。これは、ＥＣ−６スタンダード曲線
に対して測定されたＬＡＬ活性である。結果を図１に示
す。典型的な鐘状曲線が認められた。ＫＱＣＬ試薬の最
大活性は、ＬＡＬ−ＲＭの１：４０００希釈液で見られ
た。より高濃度のＬＡＬ−ＲＭでは、より低い値が得ら
れ、これは、過剰のβ−グルカンがＬＡＬアッセイ中に
存在するときの“飽和効果”を象徴するものである。
を９６ウェルマイクロプレートに添加した。そのマイク
ロプレートを、エンドトキシン試験を行うためにデザイ
ンされたインキュベーティングマイクロプレート読取装
置（Kinetic-QCL 読取装置＃２５−１４１Ｂ, Bio Whit
taker 社）中に入れた。そのプレートを10分間予備イン
キュベートした後、１００μｌのＫＱＣＬをセロビオー
スと一緒に又はセロビオースなしに、そのマイクロプレ
ートの適切なウェルに添加した。そのマイクロプレート
を３０秒間震盪した。エンドトキシン試験を行うために
特別にデザインされたソフトウェアー（WinKQCL ＃２５
−３００, Bio Whittaker 社）を用いて試験の実行とデ
ータ解析を行った。サンプル結果を“ＬＡＬ反応性単
位”として示した。これは、ＥＣ−６スタンダード曲線
に対して測定されたＬＡＬ活性である。結果を図１に示
す。典型的な鐘状曲線が認められた。ＫＱＣＬ試薬の最
大活性は、ＬＡＬ−ＲＭの１：４０００希釈液で見られ
た。より高濃度のＬＡＬ−ＲＭでは、より低い値が得ら
れ、これは、過剰のβ−グルカンがＬＡＬアッセイ中に
存在するときの“飽和効果”を象徴するものである。
【００１８】実施例３ この実施例は、後の試験で使用するザイモサンＡの最適
量を見出すための、ＬＡＬアッセイのザイモサンＡに対
する用量−応答を示すものである。上記のザイモサンＡ
調製物（３１７μｇ／ｍｌ）をＬＡＬ−ＲＷで希釈し
て、上の実施例２に記載した、Bio Whittaker ＫＱＣＬ
試薬＃Ｋ５０−６４３を用いて試験した。結果を図２に
示す。典型的な鐘状応答曲線が認められた。最大活性は
１５９ｎｇ／ｍｌのザイモサンＡで見られた。より高濃
度のザイモサンＡでは、より低い値が得られ、これは、
過剰のβ−グルカンがＬＡＬアッセイ中に存在するとき
の“飽和効果”を象徴するものである。
量を見出すための、ＬＡＬアッセイのザイモサンＡに対
する用量−応答を示すものである。上記のザイモサンＡ
調製物（３１７μｇ／ｍｌ）をＬＡＬ−ＲＷで希釈し
て、上の実施例２に記載した、Bio Whittaker ＫＱＣＬ
試薬＃Ｋ５０−６４３を用いて試験した。結果を図２に
示す。典型的な鐘状応答曲線が認められた。最大活性は
１５９ｎｇ／ｍｌのザイモサンＡで見られた。より高濃
度のザイモサンＡでは、より低い値が得られ、これは、
過剰のβ−グルカンがＬＡＬアッセイ中に存在するとき
の“飽和効果”を象徴するものである。
【００１９】実施例４ この実施例は、後の試験で使用するセロビオースの最適
量を見出すための比較試験を示すものである。ＬＡＬ−
ＲＭ及びザイモサンＡの調製物を、ＬＡＬ−ＲＷで解凍
したＫＱＣＬ試薬及び種々の濃度のセロビオースで解凍
したＫＱＣＬ試薬で試験した（図３を参照のこと）。各
々の調製物を、上の実施例２（図１）及び実施例３（図
２）で決定されたＫＱＣＬアッセイにおける最大反応性
を与える希釈度又は濃度で試験した。ＫＱＣＬ試薬にセ
ロビオースを添加すると、ＬＡＬ−ＲＭ及びザイモサン
Ａの両方の調製物中に存在するグルカンへの応答が阻害
された。試験したセロビオースの最小濃度（０．１５６
ｍｇ／ｍｌ）は、グルカン阻害物質としての効果を殆ど
有さなかった。完全な阻害は、約２５ｍｇ／ｍｌもの低
濃度のセロビオースで認められた。ＬＡＬ−ＲＷで解凍
したＫＱＣＬ試薬又はセロビオースで解凍したＫＱＣＬ
試薬でのＥＣ−６エンドトキシンの試験は、両方の試薬
のエンドトキシンに対する特異性を証明するものであっ
た。これら結果は、最適量のセロビオースの添加によ
り、エンドトキシンの調製物が、グルカンからの干渉を
受けることなく、速度論的発色ＬＡＬアッセイで分析さ
れ得ることを示すものである。
量を見出すための比較試験を示すものである。ＬＡＬ−
ＲＭ及びザイモサンＡの調製物を、ＬＡＬ−ＲＷで解凍
したＫＱＣＬ試薬及び種々の濃度のセロビオースで解凍
したＫＱＣＬ試薬で試験した（図３を参照のこと）。各
々の調製物を、上の実施例２（図１）及び実施例３（図
２）で決定されたＫＱＣＬアッセイにおける最大反応性
を与える希釈度又は濃度で試験した。ＫＱＣＬ試薬にセ
ロビオースを添加すると、ＬＡＬ−ＲＭ及びザイモサン
Ａの両方の調製物中に存在するグルカンへの応答が阻害
された。試験したセロビオースの最小濃度（０．１５６
ｍｇ／ｍｌ）は、グルカン阻害物質としての効果を殆ど
有さなかった。完全な阻害は、約２５ｍｇ／ｍｌもの低
濃度のセロビオースで認められた。ＬＡＬ−ＲＷで解凍
したＫＱＣＬ試薬又はセロビオースで解凍したＫＱＣＬ
試薬でのＥＣ−６エンドトキシンの試験は、両方の試薬
のエンドトキシンに対する特異性を証明するものであっ
た。これら結果は、最適量のセロビオースの添加によ
り、エンドトキシンの調製物が、グルカンからの干渉を
受けることなく、速度論的発色ＬＡＬアッセイで分析さ
れ得ることを示すものである。
【００２０】実施例５ この実施例は、前に調製した凍結乾燥ＬＡＬ試薬にグル
カン汚染物質を添加したときに、セロビオースが、ＬＡ
Ｌアッセイのグルカン汚染物質に対する応答を阻害する
ことを示すものである。ＫＱＣＬ試薬と３５ｍｇ／ｍｌ
のセロビオースで解凍したＫＱＣＬ試薬の間で比較を行
った。両方の調製物を用いて、ＬＡＬ−ＲＷ、精製ＥＣ
−６エンドトキシン、天然大腸菌、ＬＡＬ−ＲＭ、及び
ザイモサンＡのサンプルを試験した。結果を表１に示
す。
カン汚染物質を添加したときに、セロビオースが、ＬＡ
Ｌアッセイのグルカン汚染物質に対する応答を阻害する
ことを示すものである。ＫＱＣＬ試薬と３５ｍｇ／ｍｌ
のセロビオースで解凍したＫＱＣＬ試薬の間で比較を行
った。両方の調製物を用いて、ＬＡＬ−ＲＷ、精製ＥＣ
−６エンドトキシン、天然大腸菌、ＬＡＬ−ＲＭ、及び
ザイモサンＡのサンプルを試験した。結果を表１に示
す。
【００２１】
【表１】
【００２２】試験したＬＡＬ−ＲＷ調製物は、両方の試
薬で陰性であった（＜０．００５のＬＡＬ反応性単
位）。両方の試薬は、精製ＥＣ−６及び天然大腸菌のサ
ンプルに対して類似の応答を示した。ＬＡＬ−ＲＭ又は
ザイモサンＡのサンプルをこれら２種の試薬で試験した
ときに有意な差が見られた。ＫＱＣＬ試薬は、ＬＡＬ−
ＲＭ又はザイモサンＡのいずれかで試験したときに陽性
結果を示した。対照的に、セロビオースで解凍したＫＱ
ＣＬ試薬を用いてＬＡＬ−ＲＭ又はザイモサンＡのいず
れかで試験したが、ＬＡＬ反応性は見られなかった。こ
れら結果は、反応混合液中に有効量のセロビオースを含
めることにより、試験サンプルが、グルカン汚染物質又
は不純物からの干渉を受けることなく、速度論的発色ア
ッセイで、エンドトキシンについて分析され得ることを
示すものである。
薬で陰性であった（＜０．００５のＬＡＬ反応性単
位）。両方の試薬は、精製ＥＣ−６及び天然大腸菌のサ
ンプルに対して類似の応答を示した。ＬＡＬ−ＲＭ又は
ザイモサンＡのサンプルをこれら２種の試薬で試験した
ときに有意な差が見られた。ＫＱＣＬ試薬は、ＬＡＬ−
ＲＭ又はザイモサンＡのいずれかで試験したときに陽性
結果を示した。対照的に、セロビオースで解凍したＫＱ
ＣＬ試薬を用いてＬＡＬ−ＲＭ又はザイモサンＡのいず
れかで試験したが、ＬＡＬ反応性は見られなかった。こ
れら結果は、反応混合液中に有効量のセロビオースを含
めることにより、試験サンプルが、グルカン汚染物質又
は不純物からの干渉を受けることなく、速度論的発色ア
ッセイで、エンドトキシンについて分析され得ることを
示すものである。
【００２３】実施例６ この実施例は、セロビオースをＬＡＬ試薬と共存凍結乾
燥させると、セロビオースが、速度論的発色ＬＡＬ試薬
のグルカン類に対する応答を効果的に阻害することを示
すものである。ＫＱＣＬ試薬と、ＫＱＣＬ試薬を３５ｍ
ｇ／ｍｌのセロビオースと共存凍結乾燥させることによ
り調製された本発明の試薬との間で比較を行った。両方
の調製物を用いて、ＬＡＬ−ＲＷ、精製ＥＣ−６エンド
トキシン、天然大腸菌エンドトキシン、ＬＡＬ−ＲＭ
（１：２０００）、及びザイモサンＡ（１５９ｎｇ／ｍ
ｌ）のサンプルを試験した。結果を表２に示す。
燥させると、セロビオースが、速度論的発色ＬＡＬ試薬
のグルカン類に対する応答を効果的に阻害することを示
すものである。ＫＱＣＬ試薬と、ＫＱＣＬ試薬を３５ｍ
ｇ／ｍｌのセロビオースと共存凍結乾燥させることによ
り調製された本発明の試薬との間で比較を行った。両方
の調製物を用いて、ＬＡＬ−ＲＷ、精製ＥＣ−６エンド
トキシン、天然大腸菌エンドトキシン、ＬＡＬ−ＲＭ
（１：２０００）、及びザイモサンＡ（１５９ｎｇ／ｍ
ｌ）のサンプルを試験した。結果を表２に示す。
【００２４】
【表２】
【００２５】両方の試薬は、精製ＥＣ−６及び天然大腸
菌のサンプルに対して類似の応答を示した。しかしなが
ら、セロビオースの存在下では、ＬＡＬ−ＲＭでもザイ
モサンＡのサンプルでも、ＬＡＬ反応性は測定されなか
った。これら結果は、有効量のセロビオースを添加する
ことにより、エンドトキシンの調製物が、グルカン類か
らの干渉を受けることなく、分析され得ることを示すも
のである。更に、セロビオースを、この実施例で使用し
たＫＱＣＬ試薬のようなＬＡＬ試薬に添加し、次いで凍
結乾燥することができる。
菌のサンプルに対して類似の応答を示した。しかしなが
ら、セロビオースの存在下では、ＬＡＬ−ＲＭでもザイ
モサンＡのサンプルでも、ＬＡＬ反応性は測定されなか
った。これら結果は、有効量のセロビオースを添加する
ことにより、エンドトキシンの調製物が、グルカン類か
らの干渉を受けることなく、分析され得ることを示すも
のである。更に、セロビオースを、この実施例で使用し
たＫＱＣＬ試薬のようなＬＡＬ試薬に添加し、次いで凍
結乾燥することができる。
【００２６】実施例７ この実施例は、濁度法ＬＡＬエンドトキシンアッセイに
おいて、セロビオースが、同じくグルカン応答を遮断す
ることを示すものである。濁度法ＬＡＬ試薬である Py
rogentR 5000（Bio Whittaker,カタログ番号Ｎ３８３，
Ｎ３８４）を添付の使用説明書に記載された通りに使用
して、濁度法ＬＡアッセイを行った。このアッセイの、
ＬＡＬ−ＲＷ、精製ＥＣ−６エンドトキシン、天然大腸
菌エンドトキシン、ＬＡＬ−ＲＭ、及びザイモサンＡへ
の応答を、３５ｍｇ／ｍｌのセロビオースの存在下又は
不存在下で測定した。結果を表３に示す。
おいて、セロビオースが、同じくグルカン応答を遮断す
ることを示すものである。濁度法ＬＡＬ試薬である Py
rogentR 5000（Bio Whittaker,カタログ番号Ｎ３８３，
Ｎ３８４）を添付の使用説明書に記載された通りに使用
して、濁度法ＬＡアッセイを行った。このアッセイの、
ＬＡＬ−ＲＷ、精製ＥＣ−６エンドトキシン、天然大腸
菌エンドトキシン、ＬＡＬ−ＲＭ、及びザイモサンＡへ
の応答を、３５ｍｇ／ｍｌのセロビオースの存在下又は
不存在下で測定した。結果を表３に示す。
【００２７】
【表３】
【００２８】精製ＥＣ−６エンドトキシン及び天然大腸
菌エンドトキシンの両方に対し、セロビオースの存在下
でも不存在下でも陽性結果が得られた。しかしながら、
セロビオースの不存在下では、ＬＡＬ−ＲＭ及びザイモ
サンＡの両方に応答して陽性結果が得られた。アッセイ
中でのセロビオースの存在は、PyrogentR 5000試薬のＬ
ＡＬ−ＲＭ及びザイモサンＡに対する応答を阻害した。
これら結果は、ＬＡＬ濁度法アッセイ中でのセロビオー
スの存在により、ＬＡＬ中のグルカン応答経路が阻害さ
れ得ることを示すものである。
菌エンドトキシンの両方に対し、セロビオースの存在下
でも不存在下でも陽性結果が得られた。しかしながら、
セロビオースの不存在下では、ＬＡＬ−ＲＭ及びザイモ
サンＡの両方に応答して陽性結果が得られた。アッセイ
中でのセロビオースの存在は、PyrogentR 5000試薬のＬ
ＡＬ−ＲＭ及びザイモサンＡに対する応答を阻害した。
これら結果は、ＬＡＬ濁度法アッセイ中でのセロビオー
スの存在により、ＬＡＬ中のグルカン応答経路が阻害さ
れ得ることを示すものである。
【００２９】実施例８ この実施例は、ゲル−クロット法ＬＡＬエンドトキシン
アッセイにおいて、セロビオースが、グルカン応答を遮
断することを示すものである。このアッセイの、ＬＡＬ
−ＲＷ、精製ＥＣ−６エンドトキシン、天然大腸菌エン
ドトキシン、ＬＡＬ−ＲＭ、及びザイモサンＡへの応答
を、３５ｍｇ／ｍｌのセロビオースの存在下又は不存在
下で測定した。堅いゲルが試験管の底に生成した後にそ
の試験管を１８０°反転してもゲルがそのままの場合に
陽性結果とした。結果を表４に示す。
アッセイにおいて、セロビオースが、グルカン応答を遮
断することを示すものである。このアッセイの、ＬＡＬ
−ＲＷ、精製ＥＣ−６エンドトキシン、天然大腸菌エン
ドトキシン、ＬＡＬ−ＲＭ、及びザイモサンＡへの応答
を、３５ｍｇ／ｍｌのセロビオースの存在下又は不存在
下で測定した。堅いゲルが試験管の底に生成した後にそ
の試験管を１８０°反転してもゲルがそのままの場合に
陽性結果とした。結果を表４に示す。
【００３０】
【表４】
【００３１】精製ＥＣ−６エンドトキシン及び天然大腸
菌エンドトキシンの両方に対し、セロビオースの存在下
でも不存在下でも陽性結果が得られた。しかしながら、
セロビオースの不存在下では、ＬＡＬ−ＲＭ及びザイモ
サンＡの両方に応答してゲル−クロットが生成した。ア
ッセイ中でのセロビオースの存在は、ＬＡＬ−ＲＭ及び
ザイモサンＡに応答してゲル−クロットが生成するのを
阻害した。これら結果は、ゲル−クロットアッセイ中で
のセロビオースの存在により、ＬＡＬ中のグルカン応答
経路が阻害され得ることを示すものである。
菌エンドトキシンの両方に対し、セロビオースの存在下
でも不存在下でも陽性結果が得られた。しかしながら、
セロビオースの不存在下では、ＬＡＬ−ＲＭ及びザイモ
サンＡの両方に応答してゲル−クロットが生成した。ア
ッセイ中でのセロビオースの存在は、ＬＡＬ−ＲＭ及び
ザイモサンＡに応答してゲル−クロットが生成するのを
阻害した。これら結果は、ゲル−クロットアッセイ中で
のセロビオースの存在により、ＬＡＬ中のグルカン応答
経路が阻害され得ることを示すものである。
【図１】速度論的発色性ＬＡＬ（ＫＱＣＬ）試薬の、異
なる濃度のＬＡＬ−反応性物質（ＬＡＬ−ＲＭ）に対す
る用量−応答曲線を示す。
なる濃度のＬＡＬ−反応性物質（ＬＡＬ−ＲＭ）に対す
る用量−応答曲線を示す。
【図２】速度論的発色性ＬＡＬ（ＫＱＣＬ）試薬の、異
なる濃度のザイモサンＡに対する用量−応答曲線を示
す。
なる濃度のザイモサンＡに対する用量−応答曲線を示
す。
【図３】種々の濃度のセロビオースの存在下での、速度
論的発色性ＬＡＬ（ＫＱＣＬ）試薬の、ＬＡＬ−ＲＭに
対する及びザイモサンＡに対する用量−応答曲線を示
す。
論的発色性ＬＡＬ（ＫＱＣＬ）試薬の、ＬＡＬ−ＲＭに
対する及びザイモサンＡに対する用量−応答曲線を示
す。
Claims (24)
- 【請求項１】 試験サンプル中のエンドトキシンを検出
するのに適する変形細胞分解産物中のグルカン感受性経
路を阻害する方法であって、該変形細胞分解産物を、該
変形細胞分解産物中の該グルカン感受性酵素的経路を阻
害するのに有効な量のβ−１，４−グルカンと接触させ
る段階を含んでなり、該β−１，４−グルカンの全ての
グリコシド結合が、β−１，４−グリコシド結合である
方法。 - 【請求項２】 β−１，４−グルカンが、２又はそれを
越えるグルコースモノマーを含むポリマーである、請求
項１記載の方法。 - 【請求項３】 β−１，４−グルカンがセロビオースで
ある、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 有効量のセロビオースが１００ｎｇ／ｍ
ｌ〜１００ｍｇ／ｍｌである、請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 有効量のセロビオースが１００ｎｇ／ｍ
ｌ〜７０ｍｇ／ｍｌである、請求項３記載の方法。 - 【請求項６】 有効量のセロビオースが１５〜５０ｍｇ
／ｍｌである、請求項３記載の方法。 - 【請求項７】 有効量のセロビオースが１５〜４０ｍｇ
／ｍｌである、請求項３記載の方法。 - 【請求項８】 有効量のセロビオースが１５〜３５ｍｇ
／ｍｌである、請求項３記載の方法。 - 【請求項９】 有効量のセロビオースが１５〜２５ｍｇ
／ｍｌである、請求項３記載の方法。 - 【請求項１０】 β−１，４−グルカンが少なくとも１
の化学部分を含み、該化学部分がβ−１，３−グリコシ
ド結合を含まず、そして該化学部分がβ−１，３−グリ
コシド結合によっては該β−１，４−グルカンに結合し
ていない、請求項１記載の方法。 - 【請求項１１】 β−１，４−グルカンと試験サンプル
が、接触の段階の前に予備混合されている、請求項１記
載の方法。 - 【請求項１２】 試験サンプルが、接触の段階の前に変
形細胞分解産物に添加される、請求項１記載の方法。 - 【請求項１３】 試験サンプルが、接触の段階の後に変
形細胞分解産物に添加される、請求項１記載の方法。 - 【請求項１４】 変形細胞分解産物が、Limulus polyph
emus、Tachypleus tridentatus、Tachypleus gigas、及
び Carcinoscorpius rotundicauda からなる群から選択
されるカブトガニの変形細胞から調製される、請求項１
記載の方法。 - 【請求項１５】 エンドトキシンが、速度論的発色法、
エンドポイント発色法、ゲル−クロット法、濁度法、及
び酵素結合免疫吸着アッセイ法からなる群から選択され
る方法により検出される、請求項１記載の方法。 - 【請求項１６】 変形細胞分解産物が、凍結乾燥されて
から接触の段階の前に解凍されたものである、請求項１
記載の方法。 - 【請求項１７】 変形細胞分解産物が、凍結乾燥されて
から接触の段階の後に解凍されたものである、請求項１
記載の方法。 - 【請求項１８】 試験サンプル中のエンドトキシンの存
在を特異的に検出するための試薬であって：変形細胞分
解産物；及びβ−１，４−グルカンであって、全てのグ
リコシド結合がβ−１，４−グリコシド結合であるβ−
１，４−グルカンを含んでなる試薬。 - 【請求項１９】 β−１，４−グルカンが、２又はそれ
を越えるグルコースモノマーを含むポリマーである、請
求項１８記載の試薬。 - 【請求項２０】 β−１，４−グルカンがセロビオース
である、請求項１９記載の試薬。 - 【請求項２１】 凍結乾燥された試薬である、請求項１
８記載の試薬。 - 【請求項２２】 試験サンプル中のエンドトキシンの存
在を検出するためのキットであって：変形細胞分解産
物；β−１，４−グルカンであって、全てのグリコシド
結合がβ−１，４−グリコシド結合であるβ−１，４−
グルカン；及び該キットをエンドトキシンの検出に用い
るための使用説明書を含んでなるキット。 - 【請求項２３】 β−１，４−グルカンが、２又はそれ
を越えるグルコースモノマーを含むポリマーである、請
求項２２記載のキット。 - 【請求項２４】 β−１，４−グルカンがセロビオース
である、請求項２３記載のキット。
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|---|---|---|---|
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