ITTO940565A1 - Metodo per l'identificazione del virus a della vite (gva), anticorpi monoclonali (mab) contro gva e linea cellulare di ibridoma atta a pro - Google Patents
Metodo per l'identificazione del virus a della vite (gva), anticorpi monoclonali (mab) contro gva e linea cellulare di ibridoma atta a pro Download PDFInfo
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Abstract
Metodo per l'identificazione del virus A della vite (GVA) mediante il quale estratti di tessuti di viti vengono saggiati per la infezione a GVA con test diagnostico ELISA, la cui riuscita è dovuta ad un componente costituito da un anticorpo monoclonale (MAb) diretto contro un determinante antigenico di GVA che è stato prodotto da un ibridoma ottenuto dalla fusione di un mieloma della linea SP20Ag14 (ATCC) con uno splenocita di topo BALB/c immunizzato contro GVA e che ha le caratteristiche di una IgG1; il materiale sotto analisi, dopo essere stato catturato con il MAb o con anticorpi policlonali eventualmente catturati a loro volta con Proteina A, essendo posto a contatto prima con il MAb, poi con un anticorpo specifico contro il MAb coniugato ad un enzima oppure con il MAb coniugato ad un enzima ed infine con un substrato per l'enzima.
Description
D E S C R I Z I O N E
di brevetto per Invenzione Industriale
La presente invenzione è relativa ad un metodo di analisi adatto a consentire l'identificazione mediante test sierologici del virus A della vite (GVA) con un alto grado di specificità e sensibilità nelle viti allevate in pieno campo, facendo uso di anticorpi monoclonali (MAb) diretti contro un determinante antigenico delle particelle di GVA. L'invenzione è inoltre relativa ad anticorpi monoclonali contro GVA e ad una linea cellulare di ibridoma atta a produrre gli anticorpi stessi.
Il virus A della vite è un virus isolato per la prima volta nel 1980 in una vite presentante sintomi di legno riccio, una delle principali malattie da virus per la quale è richiesta l'esenzione negli ultimi regolamenti per la commercializzazione di materiale di propagazione certificato. Successivamente, in letteratura tale virus è stato riportato spesso associato a malattie del sistema fioematico della vite, quali i complessi del legno riccio e dell'accartocciamento fogliare. Attualmente, pur non essendo stata definita la sua precisa implicazione nell'eziologia di tali malattie, sono state riportate indicazioni abbastanza convincenti sulla possibilità che il virus A sia l'agente della "Kober stem grooving", una delle malattie del complesso del legno riccio.
La diagnosi di tale virus è effettuata con notevole difficoltà. I numerosi antisieri policlonali preparati in precedenza sono sempre stati caratterizzati da titoli molto bassi a causa delle proprietà intrinseche del virus che, pur somministrato in dosi sufficientemente elevate, stimola una debole risposta anticorpale degli animali immunizzati. Una dimostrazione indiretta di tale stato di cose è data dalla carenza di riferimenti al GVA nei numerosi lavori pubblicati sullo stato sanitario della viticoltura in diverse aree geografiche, in cui abbondano invece dati sulla diffusione di altri closterovirus più facilmente diagnosticabili quali GLRaV I e GLRaV III. Allo stesso tempo le concentrazioni virali riscontrate in vite risultano essere particolarmente basse (A.Minafra et al. 1992. Vitis 31:26-31). La combinazione di questi due parametri comporta un insufficiente livello di sensibilità sia di test sierologici diretti (che richedono anche buoni livelli di concentrazione antigenica) che di test immunoenzimatici come l'ELISA al fine di individuare infezioni di GVA in vite. Infatti, con tali condizioni i test sperimentati (precipitazioni in tubo, immunomicroscopia elettronica ed ELISA) sono risultati attendibili solo per l'individuazione del virus in tessuti di piante indicatrici erbacee artificialmente infettate.
Scopo della presente invenzione è quello di fornire un metodo per la diagnosi in vite di GVA che sia esente dagli inconvenienti dei metodi facenti uso degli antisieri policlonali noti e che consenta un'identificazione analitica specifica, precisa e con livelli di attendibilità decisamente elevati.
Sono ulteriori scopi dell'invenzione anche quelli di fornire anticorpi monoclonali (MAb) diretti contro GVA, una linea cellulare di ibridoma capace di produrre in quantità elevate tali anticorpi ed un protocollo ELISA particolarmente efficiente per il riconoscimento di GVA.
In base all'invenzione viene fornito un metodo per l'identificazione del virus A della vite (GVA) in un materiale biologico sotto analisi, caratterizzato dal fatto di comprendere le fasi di:
trattare il detto materiale sotto analisi con un anticorpo monoclonale (MAb) diretto contro un determinante antigenico del detto virus A; e accoppiare il detto anticorpo monoclonale con un marcatore atto ad evidenziare l'eventuale legame tra il detto materiale sotto analisi ed il detto anticorpo raonoclonale.
L’invenzione è inoltre relativa ad anticorpi monoclonali contro il virus A della vite, caratterizzati dal fatto che appartengono alla classe delle IgGl murine e sono diretti contro un epitopo di superficie del virus A.
L'invenzione è anche relativa ad un protocollo ELISA per l'identificazione del virus A della vite (GVA) in un materiale biologico, caratterizzato dal fatto di prevedere l'utilizzo di anticorpi policlonali per la cattura dell'antigene di virus A nel detto materiale biologico ed anticorpi monoclonali per la rivelazione dell'antigene catturato.
Infine, l'invenzione è relativa a linee cellulari dell'ibridoma PA3F4F5C11F10 avente numero di deposito DSM ACC2175 e varianti o mutanti delle stesse, atte a produrre anticorpi monoclonali contro il virus A della vite, nonché ad un kit diagnostico per effettuare l'identificazione del virus A della vite in un materiale biologico, caratterizzato dal fatto di comprendere almeno un anticorpo monoclonale diretto contro un determinante antigenico del virus A ed un anticorpo od antisiero specifico contro il detto anticorpo monoclonale.
Secondo la presente invenzione, non potendo incrementare i livelli di concentrazione virale nelle viti, si è operato al fine di incrementare la sensibilità dei preparati anticorpali utilizzati. Per fare ciò ai è ricorsi alla tecnologia degli anticorpi monoclonali con cui sono state selezionate linee cellulari murine secernenti anticorpi specifici. Per raggiungere l'obiettivo, topi BALB/c sono stati immunizzati con l'isolato PA3 di GVA purificato da foglie di Nicotlana benthamiana su cui il virus era stato trasmesso da una vite della varietà Perricone. Le purificazioni del virus sono state effettuate applicando il protocollo descritto da PL Monette e D. James (1990. Plant disease 74:898-900) e l'immunizzazione è consistita in tre somministrazioni di virus effettuate parte per via intraperitoneale e parte per via sottocutanea. Operando con le note tecniche di Kolher e Milstein, è stata ottenuta, in presenza di polietilenglicole, la fusione tra splenociti di topi immunizzati e mielomi della linea SP2/0 Agl4 (American Type Culture Collection) e, dopo incubazione in terreno selettivo per la crescita degli ibridomi, si è proceduto allo screening mediante ELISA indiretta con estratti di N. benthamiana infette e sane. Sono state individuate quattro linee positive che sono state clonate e subclonate col metodo della diluizione limite e denominate come PA3F4F5C11F10, PA3F4C6B7F10, PA3F4B9E10G9 e PA3F4D11F12F10. La produzione di massa è stata effettuata sia in vitro che in vivo. La conseguente purificazione è stata effettuata con cromatografia di affinità su colonne di Proteina A-separosio. Dalla determinazione dell'isotipo mediante ELISA è risultata l'appartenenza di tutte le quattro linee alle IgGl. Dalla identificazione degli epitopi eseguita mediante osservazione al microscopio elettronico di prove di decorazione con anticorpi marcati con oro colloidale è risultato che solo il MAb PA3.F5 riconosce particelle integre di GVA lungo tutta la sua lunghezza, mentre con gli altri MAb non si ha alcuna reazione. L'opposto si ha effettuando test ELISA sul virus dissociato con cloruro di calcio, con una sensibile attenuazione del segnale quando si usa il MAb PA3.F5 ed una amplificazione con i MAb PA3.D11, PA3.B9 e PA3.C6. Tali risultati dimostrano che PA3.F5 è specifico ad un determinante antigenico di superficie, mentre gli altri tre sono specifici a criptotopi.
La linea cellulare di ibridoma che produce gli anticorpi monoclonali secondo l'invenzione, e che fa pure parte del presente trovato, è stata denominata PA3F4F5C11F10 ed un campione rappresentativo della stessa è stato fatto oggetto di deposito, secondo la normativa del Trattato di Budapest, presso un centro autorizzato a norma della regola 28 EPC. In particolare, tale campione è stato depositato presso la DSM- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in data 15.06.1994 ed ha ricevuto numero indicativo ACC2175.
Gli anticorpi prodotti sono stati provati in quattro protocolli ELISA differenti su estratti di foglie di N. benthamiana infette, piccioli di foglie di viti allevate in serra ed in campo, trucioli di floema di talee di vite lignificate o espianti di viti allevate in vitro.
In particolare, nei test ELISA effettuati l'antigene da individuare nel materiale sotto analisi, dopo essere stato catturato con il MAb o con anticorpi policlonali, eventualmente disposti su piastre presensibilizzate con Proteina A, è posto a contatto prima con il MAb, poi con un anticorpo specifico contro il MAb coniugato ad un enzima oppure con il MAb coniugato ad un enzima, ed infine con un substrato per 1'enzima.
La diagnosi in N. benthamiana dà risultati altamente riproducibili con tutti i protocolli utilizzati. L'intensità delle reazioni si attenua nell'ordine seguente: espianti da coltura in vitro > viti allevate in serra > viti allevate in campo. Nell'ultimo caso la reazione è spesso troppo debole con il protocollo eseguito con il MAb PA3.F5 come unico anticorpo utilizzato. Tali risultati non sono stati migliorati quando si sono utilizzati gli altri MAb, separatamente o in varie combinazioni, includendo un cocktail di tutti e quattro.
Tutti i test comparativi, pertanto, sono stati eseguiti con PA3.F5, che, con questo tipo di campioni, non permette test soddisfacenti quando utilizzato per la sensibilizzazione delle piastre ma migliora sensibilmente la reazione di riconoscimento quando usato come secondo anticorpo. Risultati altamente riproducibili sono ottenuti con un protocollo in cui anticorpi policlonali sono usati per la sensibilizzazione e PA3.F5 come secondo anticorpo. L'intensità della reazione si incrementa mediante pre-sensibilizzazione delle piastre con proteina A. L’ELISA effettuata per comparazione solo con anticorpi policlonali dà un elevato background che spesso rende difficilmente interpretabili i risultati.
Il principale vantaggio dell’invenzione consiste quindi nella possibilità di superare le difficoltà della diagnosi in vite di GVA con antisieri policlonali, aventi titoli ridotti e scarsa specificità, mediante la produzione e l'uso di anticorpi monoclonali murini. I quattro MAb ottenuti sono specifici a GVA e possono essere tutti utilizzati per la diagnosi del virus nei tessuti dell'ospite indipendentemente dal loro tipo (nervature fogliari, piccioli, trucioli di talee) e dalle condizioni di allevamento delle piante (campo, serra, coltura in vitro). I test ELISA sono ugualmente soddisfacenti indipendentemente dalla origine dei MAb, se dovuta ad un determinante di superficie (PA3.F5) o a criptotopi (PA3.D11, PA3.B9 e PA3.C6). Tuttavia, solo PA3.F5 è in grado di decorare le particelle virali.
I MAb non danno risultati soddisfacenti in ELISA quando usati per la sensibilizzazione, probabilmente a causa della riduzione della loro attività dovuta al loro adsorbimento al polistirene delle piastre; ciò non consente il completo sfruttamento dei vantaggi propri degli anticorpi monoclonali. E' stato comunque messo a punto un efficiente protocollo ELISA, in cui per la cattura dell'antigene nel materiale biologico sotto analisi si utilizzano anticorpi policlonali a loro volta catturati su piastre presensibilizzate con proteina A, mentre il riconoscimento di GVA è effettuato da MAb, utilizzati come secondo anticorpo, coniugati all'enzima. Il principale risultato ottenuto è pertanto la possibilità di effettuare, in questo modo, indagini diagnostiche di larga scala con livelli di attendibilità sensibilmente più elevati di quelli ottenuti in precedenza con test sierologici.
Inoltre, gli anticorpi monoclonali in oggetto consentono la preparazione di kit diagnostici adatti a rilevare infezioni di GVA in tessuti di vite con un livello di sensibilità e di specificità non raggiungibili con corredi di anticorpi disponibili in precedenza.
Altri scopi e vantaggi dell'invenzione saranno chiari dagli specifici esempi non limitativi di realizzazione che seguono.
ESEMPIO 1 - PRODUZIONE DEGLI IBRIDOMI.
Topi BALB/c femmina di sei settimane sono immunizzati con una iniezione di 500 μl (250 μl per via intraperitoneale e 250 μl per via sottocutanea) di una emulsione di 300 μg di virus purificato in un egual volume di adiuvante completo di Freund. Quindici giorni più tardi ai topi viene fatta intraperitonealmente una seconda iniezione di 300 μg di virus in adiuvante incompleto di Freund e, 75 giorni dopo la prima immunizzazione, viene fatta una iniezione di 400 Mg di virus senza adiuvante. La fusione viene realizzata tre giorni più tardi, mescolando 2*10 splenociti con 2,4*10 SP2/0 Agl4 cellule mielomatose (American Type Culture Collection, Rockville) in presenza di un 50% di glicole polietilenico MW 1300-1600. Le cellule fuse vengono distribuite in 6 piastre di coltura da 96 pozzetti (Sterilin limited, Hounslow) in un mezzo di coltura del Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) contenente 2mM di L-glutammina, 20% di siero fetale bovino (FBS) e HAT (1*10<4 >M ipoxantina, 4*10 <7 >M aminopterina e 1,6*10<- >M timidina). Un giorno prima della fusione, nelle piastre di coltura sono introdotte cellule di alimentazione: macrofagi peritoneali di topi preparati mediante iniezione, 80 giorni prima, di 500 μl di pristano, alla concentrazione di 10 per ogni pozzetto. Dal quindicesimo al trentesimo giorno dopo la fusione, i fluidi supernatanti la coltura vengono esaminati per verificare la presenza di anticorpi contro GVA attraverso il test ELISA indiretto. Le cellule di ibridoma secementi anticorpi specifici contro il virus vengono clonate e subclonate attraverso il metodo della diluizione limite su uno strato di alimentazione di macrofagi peritoneali. Il subclonaggio viene ripetuto due volte e linee selezionate di ibridoma vengono coltivate nel mezzo HB101 con o senza il 5% di FBS.
ESEMPIO 2 - IDENTIFICAZIONE DEGLI ANTICORPI SPECIFICI A GVA.
I fluidi supernatanti la coltura dell'esempio 1 vengono esaminati con il test indiretto DAS-ELISA. Piastre di polistirene vengono prericoperte con IgG purificata (0,1 μg/pozzetto) da un antisiero policlonale a GVA in una soluzione di carbonato 0,05M tamponata a pH 9,6, vengono tenute in incubazione alla temperatura di 37 °C per 2 ore e quindi lavate per tre volte (3 minuti ciascuna) con PBS-T (PBS lx più 0,02% Tween 20). Quindi, succo di N. benthamiana infetta dall'isolato PA3 di GVA diluito 1:20 in una soluzione tampone di estrazione (PBS lx più 2% polivinilpirrolidone e 0,02% Tween 20) viene aggiunto e tenuto in incubazione a 37 °C per 2 ore, oppure per una notte a 4 °C. Le piastre vengono lavate ed addizionate di 100 μl/pozzetto di fluidi colturali di ibridoma diluiti 1:4 in PBS. Un anticorpo anti IgG murine di coniglio, coniugato alla fosfatasi alcalina, viene aggiunto e tenuto in incubazione a 37 °C per 2 ore prima di addizionare il substrato.
Vengono effettuati esami di estratti sani di N. benthamiana diluiti 1:20 in una soluzione tampone di estrazione. Vengono ritenute positive le reazioni con assorbenza pari a tre o più volte quelle degli estratti sani. Tutti i pozzetti che danno esito negativo vengono sottoposti ad un nuovo esame con anticorpi IgA e IgM antimurini coniugati.
Nella seguente tabella 1 sono riportate le proprietà degli anticorpi monoclonali specifici all'isolato PA3 di GVA.
Tabella 1
ESEMPIO 3 - DETERMINAZIONE DEGLI ISOTIPI.
La determinazione è effettuata sugli anticorpi MAb prodotti in un mezzo privo di siero. La determinazione viene realizzata per via indiretta attraverso l'eluizione delle IgG da colonne di proteina A-separosio (Sigma Chemical Co., St. Louis) con una soluzione 0,1M di citrato tamponata a pH 6 per IgGl, a pH 5 per IgG2a, a pH 4 per IgG2b e IgG3, e confermata in ELISA adottando un antisiero di coniglio antimurino per una sottoclasse specifica. Dalla determinazione è risultata l'appartenenza di tutte le quattro linee indicate in tabella 1 alle IgGl.
ESEMPIO 4 - PRODUZIONE DI FLUIDI ASCITICI.
Fluidi ascitici vengono prodotti attraverso l'iniezione peritoneale da 1 a 5*10 di cellule ibride in topi BALB/c, in cui sono stati iniettati, un giorno prima, 500 μl di adiuvante incompleto di Freund. Si ottiene una elevata concentrazione anticorpale nel fluido ascitico.
ESEMPIO 5 - PURIFICAZIONE DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI.
Gli anticorpi MAb vengono purificati dai fluidi ascitici o dai fluidi supernatanti la coltura per cromatografia ad affinità effettuata su colonne di proteina A-separosio.
ESEMPIO 6 - PROTOCOLLI ELISA PER L'IDENTIFICAZIONE DEL GVA.
Vengono adottati cinque differenti protocolli ELISA (indicati in tabella 2 con 1, 2, 3, 4 e P) impiegando estratti da foglie di N. benthamiana infette da GVA, piccioli di foglie basali di due mesi di viti cresciute in serra o in campo, trucioli di talee mature od espianti di vite cresciuti in vitro. La proteina A (Pharmacia, Uppsala) e gli anticorpi monoclonali e policlonali vengono entrambi impiegati ad una concentrazione di lpg/ml. L'antisiero policlonale di coniglio A 110 (titolo 1:16) è stato ottenuto da M. Conti e l'antisiero, anch'esso di coniglio, BA-453 (titolo 1:16) è stato prodotto in loco nel corso di precedenti studi. I valori di assorbanza (a 405 nm) vengono letti con un fotometro Titertek Multiscan (Flow Laboratories, Mc Lean). Tutte le viti sottoposte ad esame per valutare la presenza di GVA risultano affette da differenti malattie, con prevalenza dell'accartocciamento fogliare e del legno riccio.
In tabella 2 sono indicati i protocolli ELISA utilizzati per la diagnosi di GVA in tessuti degli ospiti.
Tabella 2
In tabella 3 vengono invece confrontati i cinque protocolli ELISA per la diagnosi di GVA in tessuti di vite.
Tabella 3
I valori di assorbenza riportati in tabella 3 relativi al caso GVA-infette si riferiscono a determinazioni effettuate su dieci viti differenti, mentre i valori relativi al caso GVA-esenti si riferiscono a valori medi di tre determinazioni effettuate su 53 viti differenti.
Come appare evidente dalla tabella 3, i protocolli più efficienti per la diagnosi in vite di GVA sono quelli indicati con i numeri 1, 3 e 4, ovvero quelli in cui vengono utilizzati anticorpi policlonali per la cattura dell’antigene nel materiale biologico ed anticorpi monoclonali per la reazione di riconoscimento In ogni caso i risultati che si ottengono con i MAb song nettamente migliori di quelli di confronto eseguiti solo con antisieri policlonali (P) in cui l'elevato background rende comunque difficilmente rilevabili i campioni positivi.
ESEMPIO 7 - IMMUNOMICROSCOPIA ELETTRONICA
L'inuminomieroscopia elettronica (decorazione) viene eseguita come indicato da Milne e Luisoni in " Milne R.G., Luisoni E. - Rapid immune electron microscopy of virus preparations. Methods Virol (1977) - 6:265:281" e l'immunoetichettatura con oro è effettuata come descritto da Hu et al. in "Hu J.S. et al. - Use of monoclonal antibodies to characterize grapevine leafroll associated closteroviruses. Phytopatology (1991) 80:920-925". In questo ultimo test, prima della colorazione con una soluzione acquosa al 2% di acetato di uranile, viene impiegato un anticorpo di capra antimurino coniugato con particelle d'oro di 10 nm di diametro (Sigma Chemical Co., St.Louis). I reticoli vengono esaminati con un microscopio elettronico Philips 210C.
I risultati del test sono riportati nella tabella 4 che segue.
TABELLA 4
I simboli e indicano rispettivamente l’esito positivo e l'esito negativo della prova.
I risultati indicano che il MAb PA3.F5 è monospecifico contro un epitopo di superficie del virus A.
Claims (14)
- R I V E N D I C A Z I O N I 1. Metodo per l'identificazione del virus A della vite (GVA) in un materiale biologico sotto analisi, caratterizzato dal fatto di comprendere le fasi di: - trattare il detto materiale sotto analisi con un anticorpo monoclonale (MAb) diretto contro un determinante antigenico del detto virus A; e accoppiare il detto anticorpo monoclonale con un marcatore atto ad evidenziare l'eventuale legame tra il detto materiale sotto analisi ed il detto anticorpo monoclonale.
- 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il detto anticorpo monoclonale presenta le caratteristiche di una IgG murina.
- 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che viene utilizzato un anticorpo monoclonale diretto contro un epitopo di superficie del virus A della vite.
- 4. Metodo secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto di utilizzare un protocollo ELISA in cui un vettore solido, preferibilmente piastre in polistirene, presensibilizzato con proteina A, viene trattato con un siero policlonale diretto contro il GVA, successivamente con il materiale sotto analisi e poi con il detto anticorpo monoclonale (MAb), usato come secondo anticorpo, preferibilmente coniugato ad un enzima, e con un substrato per l'enzima.
- 5. Kit diagnostico per effettuare l'identificazione del virus A della vite in un materiale biologico, caratterizzato dal fatto di comprendere almeno un anticorpo monoclonale diretto contro un determinante antigenico del virus A ed un anticorpo od antisiero specifico contro il detto anticorpo monoclonale.
- 6. Kit diagnostico secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto di comprendere almeno un anticorpo monoclonale appartenente alla classe delle IgG murine e diretto contro un epitopo di superficie del virus A.
- 7. Anticorpi monoclonali contro il virus A della vite, caratterizzati dal fatto che appartengono alla classe delle IgGl murine e sono diretti contro un epitopo di superficie del virus A.
- 8. Anticorpi monoclonali secondo la rivendicazione 7, caratterizzati dal fatto che sono ottenibili da una linea cellulare dell'ibridoma PA3F4F5C11F10 (DSM ACC2175) e da varianti o mutanti dello stesso.
- 9. Linee cellulari di ibridoma producenti anticorpi monoclonali secondo la rivendicazione 7 o 8.
- 10. Linee cellulari dell'ibridoma PA3F4F5C11F10 avente numero di deposito DSM ACC2175 e varianti o mutanti delle stesse, atte a produrre anticorpi monoclonali contro il virus A della vite.
- 11. Protocollo ELISA per l'identificazione del virus A della vite (GVA) in un materiale biologico, caratterizzato dal fatto di prevedere l'utilizzo di anticorpi policlonali per la cattura dell'antigene di virus A nel detto materiale biologico ed anticorpi monoclonali per la rivelazione dell'antigene catturato.
- 12. Protocollo ELISA secondo la rivendicazione 11, caratterizzato dal fatto che i detti anticorpi monoclonali sono coniugati ad un enzima e che viene utilizzato per la rivelazione un substrato per l'enzima.
- 13. Protocollo ELISA secondo la rivendicazione 11, caratterizzato dal fatto che la rivelazione viene ottenuta mediante utilizzazione di secondi anticorpi od antisieri policlonali specifici contro i detti anticorpi monoclonali e diversi da quelli utilizzati per la cattura dell'antigene.
- 14. Protocollo ELISA secondo la rivendicazione 12 o 13, caratterizzato dal fatto che i detti anticorpi policlonali sono adsorbiti su un vettore solido presensibilizzato mediante pro teina A.
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