ITTO20110468A1 - Derivati di adenosina o deossiadenosina modificati in posizione 8 e loro procedimento di sintesi - Google Patents

Description

“Derivati di adenosina o deossiadenosina modificati in posizione 8 e loro procedimento di sintesiâ€

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda derivati di adenosina o deossiadenosina idonei all’impiego nella sintesi di oligonucleotidi, nonché un procedimento per la sintesi dei suddetti derivati.

A partire dagli anni Ottanta si à ̈ largamente diffusa la possibilità di preparare oligonucleotidi sintetici utilizzando apparecchi commerciali (sintetizzatori) e protocolli consolidati, come ad esempio il metodo del fosforoammidito. La possibilità di sintetizzare oligonucleotidi ha a sua volta reso possibili numerose applicazioni che richiedono l’utilizzo di oligonucleotidi, quali ad esempio i test diagnostici, gli esperimenti di inibizione genica, lo studio del meccanismo molecolare dei farmaci e, infine, applicazioni di chimica supramolecolare con possibili ricadute nel campo della costruzione di dispositivi elettronici. Alla base di tali applicazioni vi à ̈ la forte selettività dei pattern dei legami ad idrogeno, del tipo Watson e Crick o di tipo Hoogsteen, che permette prevedibilmente di legare gli oligonucleotidi sintetici tra loro o con quelli naturali, che a loro volta sono depositari dell'informazione genetica. Attraverso l'informazione chimica contenuta negli oligonucleotide sintetici à ̈ perciò possibile "dialogare" con l'informazione genetica contenuta nelle cellule sotto forma di acidi nucleici (DNA e RNA) al fine di leggerne l'informazione, ossia rivelare la presenza di una determinata sequenza di basi oppure modificarla.

La sintesi chimica permette altresì di legare agli oligonucleotidi sintetici una gamma di gruppi funzionali capaci di aggiungere nuove funzionalità all'oligonucleotide, come ad esempio gruppi funzionali fluorescenti, intercalanti, o gruppi leganti determinate proteine o determinati farmaci.

La funzionalizzazione dell’oligonucleotide sintetico à ̈ usualmente effettuata tramite modifiche post-sintetiche oppure direttamente sul sintetizzatore, usando fosforoammiditi modificati rispetto a quelli normalmente impiegati. La funzionalizzazione sul sintetizzatore offre il vantaggio di un migliore controllo chimico e migliori garanzie per un'efficace purificazione del composto finale.

E’ disponibile in commercio una serie di fosforoammiditi modificati con una ventina di sostituenti funzionali, per ottenere ad esempio filamenti con un gruppo amminico (-NH2) terminale per indirizzare ulteriori modifiche post-sintetiche; con un gruppo tiolico (-SH) terminale per permettere l'ancoraggio dell'oligonucleotide su superfici di oro; con un gruppo dabcile terminale da usare come molecola quencher in combinazione con un sostituente fluorescente sull'altra estremità del filamento per la realizzazione di sonde fluorescenti del tipo "molecular beacon"; con biotina per legare l'avidina; con colesterolo per modificare l'uptake cellulare; con sostituenti fluorescenti per la realizzazione di sonde; con psoralene per intercalare nel doppio filamento formato con il filamento complementare e legarlo covalentemente in seguito ad irraggiamento, etc.

In alcuni di questi ammiditi, il gruppo funzionale à ̈ legato direttamente al fosforo (in tal caso non contengono la base nucleosidica); in altri casi, invece, à ̈ legato alla posizione C8 delle purine o alla posizione C6 delle pirimidine. Le modifiche delle basi azotate in queste posizioni consentono generalmente di mantenere inalterato il riconoscimento dei filamenti complementari secondo i legami di Watson e Crick. Quando à ̈ presente la base, la modifica può essere introdotta all'interno di un filamento dell’oligonucleotide sintetico ed eventualmente essere incorporata più volte nello stesso filamento.

Fra i numerosi esempi di basi puriniche e pirimidiniche modificate descritte in letteratura, si citano Pieles et al. Nucleic Acid Res. 1989, 17 8967-78, che descrivono la preparazione di un derivato della 8-deossiadenosina legata allo psoralene che à ̈ capace, dopo l'inserimento in un oligonucleotide, di legare covalentemente il filamento complementare dopo opportuno irraggiamento luminoso. Secondo il metodo di sintesi descritto, l'accoppiamento tra adenosina e psoralene avviene sfruttando la preformata 8-mercaptoadenosina con un alchil derivato dello psoralene secondo lo schema seguente: 8HS-dA Pso-O-linker-Tos Pso-O-linker-S-dA In Catglilialoglu et al. Tetrahedron Lett.

2006, 47, 711-14 à ̈ descritta la derivatizzazione della 8-Br deossiadenosina con alchilanti allo zolfo. Tale descrizione à ̈ limitata alla formazione di nucleosidi alchilati con corte catene alchiliche prive di ulteriori funzionalizzazioni. I nucleosidi modificati ottenuti sono utilizzati esclusivamente per studi strutturali e non vi à ̈ alcuna indicazione circa la possibilità di impiego nella sintesi di oligonucleotidi sintetici.

In Navacchia et al. Macromol. Rapid Commun.

2010, 31, 351-355 à ̈ descritta la derivatizzazione di 8-Br deossiadenosina con un linker ditioalchilico a catena corta, per ottenere un derivato della deossiadenosina da polimerizzare in presenza di FeCl3ottenendo in tal modo polimeri capaci di auto-organizzarsi utili in applicazioni nel campo dell’elettronica.

I procedimenti disponibili nello stato della tecnica per la sintesi di adenosine o deossiadenosine modificate presentano tuttavia lo svantaggio di richiedere procedure piuttosto complesse e di non conseguire rese elevate. Inoltre, i derivati dell’adenosina modificati in posizione 8 descritti nello stato della tecnica contengono catene tioalchiliche non più lunghe di 3-5 atomi di carbonio, che non sempre consentono di legare un sostituente funzionale con sufficiente capacità di adattamento. Scopo della presente invenzione à ̈ quello di superare gli inconvenienti dello stato della tecnica.

Questi ed altri scopi sono raggiunti tramite i derivati di adenosina o deossiadenosina modificati in posizione 8, aventi la formula generale (I) definita nell’annessa rivendicazione indipendente 1 e tramite il procedimento di sintesi dei suddetti derivati come definito nell’annessa rivendicazione indipendente 8. Le rivendicazioni dipendenti definiscono ulteriori caratteristiche dei derivati e del loro procedimento di sintesi e formano parte integrante della descrizione.

Il procedimento di sintesi dei derivati di adenosina o deossiadenosina modificati in posizione 8 che forma oggetto dell’invenzione presenta il vantaggio di conseguire elevate rese e di richiedere procedure meno complesse rispetto a quelle descritte nello stato della tecnica per l’ottenimento di altri derivati di adenosina. Inoltre, i derivati di adenosina modificata in posizione 8 ottenuti con il procedimento dell’invenzione sono vantaggiosamente atti ad essere coniugati con un’ampia gamma di molecole funzionali, quali cromofori, fluorofori ed intercalanti. Essi sono inoltre atti ad essere incorporati negli oligonucleotidi sintetici, in quanto sono compatibili con i protocolli di sintesi impiegati nei sintetizzatori commerciali di oligonucleotidi, permettendo quindi la sintesi di filamenti di DNA o RNA modificati utili per aggiungere potenzialità all'interazione con il filamento complementare per le più disparate applicazioni biochimiche.

Ulteriori caratteristiche e vantaggi dei derivati e del procedimento dell’invenzione appariranno dalla descrizione dettagliata che segue, effettuata a puro titolo di esempio non limitativo, con riferimento agli schemi di reazione 1, 2 e 3, che illustrano rispettivamente la sintesi del fosforoammidito della 2’-deossiadenosina modificato in posizione 8 con un linker bis-tioalchilico e coniugato con psoralene (schema 1) o con acridina (schema 2) e la sintesi del fosforoammidito della 2’-deossiadenosina modificato in posizione 8 con un linker tioalchinilico (schema 3).

Si sottolinea in particolare che con le reazioni di sintesi illustrate negli schemi 1, 2 e 3 i presenti inventori ritengono che catene bistioalchiliche o tioalchiniliche di lunghezza maggiore dei linker descritti nello stato della tecnica possono essere fatte reagire con la 8-bromodeossiadenosina, con minime modifiche alle condizioni di reazione, per introdurre direttamente (schema 3) o tramite ulteriori reazioni (schemi 1 e 2) un’ampia varietà di gruppi funzionali, quali cromofori, fluorofori, intercalanti, alchilanti, reagenti per la click-chemistry, etc., esemplificati dai composti in seguito descritti. L'ottenimento dei derivati in seguito riportati à ̈ sorprendente anche perché non era mai stato dimostrato in precedenza che fosse possibile proteggere selettivamente i diversi gruppi funzionali presenti sulla risultante adenosina modificata, per ottenere fosforoammmiditi utilizzabili per la sintesi di oligonucleotidi con normali sintetizzori automatici commerciali.

Schema 1

NH2NH2

N N H S N N

Br S

H O N N H O N SH N O H SO

H2O, TEA, 100 °C, 2h

OH OH 2

1 Br

O O<O>3

NH2

S N N S H O N N

O O<O>O

OH 4

NH2

S N N S DMTr O N N

O O<O>O

5

OH

H N DPA

S N N S DMTr O N N

O<O>O

6 OH

H N DPA S N N S DMTr O N N

O O<O>O

O P O

7 N CN

La Br-deossiadenosina (1) viene fatta reagire con esan-1,6-ditiolo, a dare il derivato della deossiadenosina modificata in posizione 8, indicato con (2) nello schema 1. La reazione avviene in un mezzo acquoso, preferibilmente acqua e trietilammina (TEA preferibilmente 10 eq.), ad una temperatura preferibilmente compresa fra 80-100° C, più preferibilmente di circa 100°C, e per un tempo di reazione preferibilmente compreso fra 1.5 – 2.5 ore, più preferibilmente di circa 2 ore.

La reazione procede con rese quantitative. Grazie al fatto che la reazione à ̈ effettuata in un mezzo acquoso, il derivato (2) può essere isolato selettivamente per estrazione con solvente organico senza processi cromatografici, il che fornisce un importante vantaggio sintetico.

Il gruppo tiolico terminale del derivato (2) viene facilmente coniugato con una molecola funzionale, quale ad esempio lo psoralene, sotto forma di Br-metilpsoralene (3), a dare il derivato (4).

La reazione avviene preferibilmente in solvente organico,dimetilformammide anidra, in presenza di carbonato di calcio ad una temperatura preferibilmente compresa fra 60-80° C, più preferibilmente di circa 80°C, e per un tempo di reazione preferibil mente compreso fra 2.5-3.15 ore, più preferibilmente di circa 3 ore.

Il derivato (4) può essere isolato come prodotto solido al termine delle procedure di work-up, di nuovo senza tediosi e costosi processi cromatografici.

Il derivato (4) à ̈ poi opzionalmente trasformato nel prodotto finale (7), che à ̈ un fosforoammidito protetto, attraverso un processo in tre passaggi, le cui condizioni di reazione sono descritte in dettaglio nella parte sperimentale che segue. In breve, il processo di protezione in tre passaggi prevede innanzitutto la protezione selettiva dell’ossidrile in posizione 5’ del residuo di zucchero con cloruro di dimetossitritile (DMT) a dare il composto (5), che può essere purificato mediante cromatografia. Segue poi il passaggio di protezione dell’ammino-gruppo in posizione 7 dell’anello purinico come ammide dell’acido difenilacetico a dare il composto (6), che può anch’esso essere purificato mediante cromatografia. Infine l’ossidrile in posizione 3’ del residuo di zucchero del composto (6) viene fosfitilato a dare il composto (7), che può essere purificato mediante cromatografia.

Schema 2

NH2NH2N N H S NN

Br S

H O N N H O N

SH N

O H SO

H2O, TEA, 100 °C, 2h

OH OH 2

1 Cl N O

Cl

O

NH2N S NNS H O N N

Cl O

OH 4 O DMTr-Cl, Py

20 h

NH2

N S N N S DMTr O N N

Cl O

5

1) Me3SiCl, Py, 30 min OH

O 2) DPA-Cl, 90 min

3) NH4OH (aq), 20 min

H N DPA

N S NNS DMTr O N N

Cl O

ClP(N<i>Pr2)OCH2CH2CN

DIPEA, CH2Cl2, 60 min

6 OH O

H N DPA N S NNS DMTr O N N Cl O

O P O

7 N CN Il primo passaggio di sintesi à ̈ identico a quello descritto precedentemente con riferimento allo schema 1, portando all’ottenimento del derivato (2) dello schema 2. Il gruppo tiolico terminale del derivato (2) viene facilmente coniugato con acridina, impiegata sotto forma di diclorometossiacridina (3), a dare il derivato (4).

La reazione avviene preferibilmente in solvente organico,dimetilformammide anidra, in presenza trietilammina (TEA) ad una temperatura preferibilmente compresa fra 60-80° C, più preferibilmente di circa 80°C, e per un tempo di reazione preferibilmente compreso fra 15-17 ore, più preferibilmente di circa 17 ore.

Il derivato (4) Ã ̈ facilmente isolato come prodotto solido al termine delle procedure di work-up, senza tediosi e costosi processi cromatografici.

Seguono poi opzionalmente i tre passaggi di protezione descritti in precedenza con riferimento allo schema 1.

Schema 3

NH2NH2

N N

N N

Br S

H O N N H O N

SH N

O O

OH H2O, TEA, 100 °C, 2h OH 2a

1

DMTr-Cl, Py

20 h

NH2H N DPA

N

N N

S SNDMTr O N NNDMTr O N O

O OH OH 3a 4a

H N DPA NNS DMTr O N N O

5a O

P O N CN

La Br-deossiadenosina (1) viene fatta reagire con es-5-in-1-tiolo, a dare il derivato della deossiadenosina modificata in posizione 8, indicato con (2a) nello schema 3. La reazione avviene in un mezzo acquoso, preferibilmente acqua e trietilammina (TEA), ad una temperatura preferibilmente compresa fra 80-100° C, più preferibilmente di circa 100°C, e per un tempo di reazione preferibilmente compreso fra 1.5-2.5, più preferibilmente di circa 2 ore.

La reazione procede con rese quantitative. Anche in questo caso, il derivato (2a) dello schema 3 può vantaggiosamente essere isolato senza processi cromatografici.

La reazione dello schema 3 à ̈ particolarmente vantaggiosa in quanto consente di ottenere un derivato idoneo all’impiego nella click chemistry in pochissimi passaggi di semplice realizzazione. Tale derivato, avente un -C≡CH terminale, può vantaggiosamente essere coniugato con una molecola contenente un gruppo azide, secondo le metodologie della click-chemistry. A titolo di esempio, molecole contenenti un gruppo azide atte ad essere coniugate con il derivato avente un -C≡CH terminale sono 6-carbossi-fluoresceina azide, 5-carbossitetrametil rodamina azide, biotina azide, ferrocene-azide (al riguardo si veda il sito www.baseclick.eu).

In termini generali, il procedimento di sintesi della presente invenzione, illustrato in dettaglio mediante i tre schemi di reazione esemplificativi sopra discussi, consente di attaccare un linker con legame tiolico direttamente sulla posizione C8 dell’adenosina, deossiadenosina, 2’-O-alchil adenosina o 2’-O-silil adenosina. La specificità di questa reazione à ̈ resa possibile dalla sintesi in ambiente acquoso, che garantisce la giusta solubilità e reattività dei reagenti e permette l’isolamento del prodotto senza la necessità di impiegare costose e tediose metodiche cromatografiche. Questo tipo di sintesi à ̈ specifico per l’anello dell’adenina, in quanto il diverso potenziale chimico della guanina, in condizioni di reazioni simili, porterebbe alla formazione di guanosina.

PARTE SPERIMENTALE

Strumentazione

Le analisi HPLC-MS sono state effettuate con un HPLC Agilent 1100 interfacciato con uno spettrometro Bruker Esquire 3000+ operante in modalità ESI. Per la parte cromatografica à ̈ stata usata una colonna Zorbax C8 (4,6 x 150 mm, 5 5 µm) con un gradiente lineare da 70 a 90% di acetonitrile (ACN) in acqua in 20 minuti ad un flusso di 0,5 mL/ minuti e rivelazione UV a 260 nm.

Gli spettri NMR sono stati registrati con uno spettrometro Varian Mercury operante a 400 mHz.

Gli oligonucleotidi sono stati sintetizzati con un sintetizzatore automatico Gene Assembler II , utilizzando i protocolli originari, dove non diversamente indicato. Per la purificazione preparativa RP-18 sono state utilizzate speciali colonne FPLC Pharmacia con un gradiente generato da una pompa peristaltica operante a 1.2 mL/minuto, raccogliendo frazioni da 8 mL.

Materiali

La 8-Br-2'-deossiadenosina à ̈ stata acquistata da Berry & Associates, Dexeter, MI, Stati Uniti d’America.

Sintesi del 4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsoralene Il composto citato nel titolo à ̈ stato preparato seguendo la procedura descritta da Pieles et al. (Nucleic Acids Res. 17, 8967-78, 1998).

24 h, 80 %

In breve: 228 mg di trimetossi-psoralene sono stati sciolti in 26 ml di acido acetico (AcOH) e addizionati di 1.89 mL di bromometiletere (2.85 g, 22.8 mmol) e mescolati a temperatura ambiente (T.a.). Dopo 24 ore à ̈ stata aggiunta una nuova porzione di bromometiletere (2.85 g) e la reazione à ̈ stata continuata per altre 24 ore. La miscela di reazione à ̈ stata quindi raffreddata in bagno di ghiaccio per 2 ore, quindi filtrata e il solido ottenuto à ̈ stato lavato con etere etilico e concentrato sotto vuoto per dare 120 mg del prodotto desiderato. La soluzione madre, combinata col liquido di lavaggio à ̈ stata concentrata sotto vuoto e ha fornito un nuova porzione di precipitato che à ̈ stato lavato e seccato come sopra (136 mg). I due precipitati sono stati giudicati di purezza comparabile da analisi NMR, riuniti e successivamente usati senza ulteriori purificazioni. (Resa 80 %).

Sintesi della 8-tiopentantiolo-2'-deossiadenosina

N H2

H S N N

S

5 N N

H O O

O H

Ad una sospensione di 8-bromo-2'-deossiadenosina commerciale (330 mg 1.0 mmol) in acqua (625 mL) sono stati aggiunti 1,5-pentanditiolo (680 mg , 3 mmol) e trietilammina (1.5 mL, 10 mmol). La miscela à ̈ stata riscaldata a 100 °C per due ore (con refrigerante a ricadere). Un controllo per HPLC-MS ha permesso di giudicare soddisfacente la conversione e la reazione à ̈ stata estratta a caldo con etil-acetato (EtOAc) 2x100 mL. La fase organica à ̈ stata concentrata sotto vuoto e il residuo à ̈ stato utilizzato senza ulteriori purificazioni (Resa 80 %). E' opportuno conservare il prodotto sotto vuoto fino alla successiva reazione per prevenire la formazione di disolfuri.

Sintesi della 8-tiopentan-tiometilpsoralen-2'-deossiadenosina

O

O

O NH2

S N N

S

5 N N

H O

O

O H

Una soluzione di 8-tiopentantiolo-2'deossiadenosina (400 mg 1.0 mmol), 3-bromometilpsoralene (340 mg 1.0 mmol) Ca2CO3(600 mg) in metilformammide anidra (14 mL) à ̈ stata scaldata a 80 °C per 4 ore. Il prodotto di reazione à ̈ stato estratto con EtOAc (2x 25 mL), e lavato con acqua (4 x 10 mL). Il prodotto indicato nel titolo à ̈ stato ottenuto per evaporazione a pressione ridotta della fase organica e usato senza ulteriori purificazioni. (Resa 85 %) .

Sintesi della 5'-O-dimetossitritil-8-tiopentantrimetilpsoralen-2'-deossiadenosina

O O O NH2

S

N N

S

Ph 5 N N

MeO O

O

O H

OMe

Il prodotto di protezione dell'idrossile 5' del derivato precedentemente descritto à ̈ stato preparato sciogliendo quest'ultimo (625 mg, 1 mmol) in 8 mL di piridina anidra, aggiungendo dimetossitritilcloruro fresco (400 mg, 1.2 mmol). La reazione viene condotta sotto agitazione a T. a. in atmosfera inerte per 1 ora. Il grezzo di reazione viene concentrato a piccolo volume per evaporazione sotto vuoto, diluito in EtOAc (40 mL ) e lavato con acido citrico al 10% p/v in acqua. (4 x 10 mL) e infine con acqua (2 x 10 mL). La fase organica vine purificata su gel di silice eluendo con CH2Cl2/MeOH 98/2 v/v ottenendo il prodotto desiderato con resa dell'80%.

Sintesi della 5'-O-dimetossitritil-4-difenilacetamide-8-tiopentan-trimetilpsoralen-2'-deossiadenosina

O O Ph

O O H N Ph

S

N N

S

Ph 5 N N

MeO O

O

O H

OMe

Il composto del titolo à ̈ stato ottenuto sciogliendo il derivato dimetossitritilato del coniugato adenosina-psoralene (928 mg 1.0 mmol) in 5 mL di piridina anidra. A questo si aggiunge in atmosfera inerte trimetilsililcloruro (0.635 mL 5 mmol) la miscela si lascia in agitazione a T. a. per 30 minuti. Si aggiunge poi difenilacetilcloruro (227 mg 1.2 mmol) e si lascia sotto agitazione per ulteriori 2 ore.

Si spegne l'eccesso di cloruranti con 1 mL di MeOH per 15 minuti, dopo di che si aggiunge ammoniaca al 30 % p/p in acqua (1 mL) e si lascia reagire per 30 minuti eseguendo nel frattempo TLC di controllo (in CH2Cl2/MeOH 5% v/v) per controllare l'avvenuta rimozione dei gruppi SiMe3dall'OH in 2' e dell'eventuale prodotto bis-acetilato. Il grezzo di reazione viene evaporato a secco sotto vuoto, ripreso con CH2Cl2100 mL e lavato con acido citrico al 10 % p/v in acqua (2 x 25 mL) e infine con 2 x 25 mL di acqua. Il prodotto viene purificato su gel di silice eluendo con CH2Cl2/MeOH/Et3N 98/2/1 v/v/v.

Sintesi del 5'-O-dimetossitritil-4-difenilacetamide-8-tiopentan-trimetilpsoralen-2'-deossiadenosina-3'-O-cianoetil-diisopropilfosforammmidito (sintesi del fosforammidito)

O O Ph

O O N Ph

S N N

S

Ph 5 N

MeO N

O

O

O O

OMe P

N N

Il prodotto derivato dalla precedente reazione (1.122 g 1.0 mmol) viene sciolto in CH2Cl2anidro (5 mL) e addizionato di etildiisopropilammina (0.85 mL, 5 mmol), cianoetil-diisopropil clorofosfito (0.36 mL, 1.6 mmol). La reazione viene mantenuta agitata in atmosfera inerte a T. a. per 30 minuti. La reazione viene diluita con 30 mL di CH2Cl2e lavata con NaHCO3(8% p/v in acqua) e successivamente con brina (10% p/v NaCl in acqua).

Il prodotto viene purificato per cromatografia su silice in gradiente di etilacetato/cicloesano/trietilammina da 20/80/10 e 90/10/10 recuperando un solido spugnoso con resa del 50%. Sintesi della 8-tiopentantio-acridin-2'-deossiadenosina

O

N NH2

Cl N

N

S S

N

O N

H O

O H

L'8-tiopentantiolo-2-deossiadenosina (400 mg 1.0 mmol) viene sciolto in dimetilformammide (DMF) anidra (10 mL) e trietilammina (1.3 mL, 10 mmol) insieme a 2,9-dicloro-6-metossiacridina (600 mg, 2 mmol). La miscela viene scaldata a 80 °C in un tubo chiuso per 17 ore. Il prodotto viene tirato a secco e cromatografato su gel di silice eluendo con CH2Cl2/MeOH 90/10 per dare il prodotto del titolo, un solido giallo/verde fluorescente, con una resa del 70 %.

Sintesi della 5'O-dimetossitritil-8-tiopentantioacridin-2'-deossiadenosina

O

N NH2

Cl

N

S S N

NON

O

O H

O

O

L'8-tiopentantioacridina-2'-deossiadenosina (630 mg, 1.0 mmol) viene sciolta in 8 mL di piridina anidra e addizionata di dimetossitritil-cloruro fresco (400 mg, 1.2 mmol). La miscela viene lasciata reagire per 1 ora a T. a. in atmosfera anidra, dopo di che viene concentrata a piccolo volume, disciolta in etilacetato (40 mL) e lavata con con acido citrico al 10% p/v in acqua. (4 x 10 mL) e infine con acqua (2 x 10 mL). La fase organica viene purificata su gel di silice eluendo con CH2Cl2/MeOH/trietilammina 97/2/1 v/v ottenendo il prodotto desiderato con resa del 65%.

Sintesi della 5'O-dimetossitritil-4-difenilacetamide-8-tiopentantio-acridin-2'-deossiadenosina

O

N O

NH

Cl

N

S S<N>

N

O N

O

O H

O

O

Il precedente composto (930 mg 1.0 mmol) viene protetto sull'ammino gruppo dell'adenosina sciogliendolo in piridina anidra (5 mL) e facendolo reagire in atmosfera anidra per 30 minuti con trimetilsililcloruro (0.635 mL 5.0 mmol) sotto agitazione a T. a. Si addiziona la miscela di difenilacetilcloruro (277 mg 1.2 mmol) e si lascia reagire per 2 ore. Si aggiunge MeOH (1 mL) e dopo 15 minuti NH4OH (1 mL al 30% p/v). Come nel corrispondente derivato dello psoralene, si segue la rimozione del protettore sililico e dell'eventuale ammide bisprotetta. Si ripete il work-up già descritto e si purifica su gel di silice con CH2Cl2/trietilammina 99/1 ottenendo una resa del 70%.

Sintesi del 5'O-dimetossitritil-4-difenilacetamide-8-tiopentantio-acridin-2'-deossiadenosina-3'-O cianoetil-diisopropil-fosforoammidito

O

N

Cl

O

S NH

S

N

N

O O N

N

O O

O O PN

N

Il composto precedente (1.120 g, 1 mmol) viene sciolto in diclorometano anidro (5 mL) e etildiisopropilammina (0.85 mL, 5 mmol) ed infine addizionato di cianoetil-diisopropil clorofosfito (0.36 mL, 1.6 mmol). La reazione viene mantenuta agitata in atmosfera inerte a T. a. per 30 minuti. La reazione viene diluita con 30 mL di CH2Cl2e lavata con Na-HCO3(8% p/v in acqua) e successivamente con brina (10% p/v NaCl in acqua). Il prodotto viene purificato per cromatografia su silice in gradiente di etilacetato/cicloesano/trietilammina da 20/80/10 e 90/10/10 recuperando un solido spugnoso con resa del 50%.

Sintesi di S-esa-5-inil-etantioato

O

S

Il 6-cloro-1-esino (0.60 mL, 5 mmol) viene sciolto in DMF anidra (5 mL). Alla soluzione viene aggiunto potassio etantioato quindi si lascia a 50°C sotto agitazione per 3 ore. La miscela di reazione viene estratta con Et2O (2 x 15 mL) e lavata con H2O (5 x 30 mL). Il solvente viene portato a secco al rotavapor ed il prodotto utilizzato senza ulteriore purificazione ( resa quantitativa).

Sintesi di esa-5-inil-1-tiolo

S H

L'S-esa-5-inil-etanetioato (780 mg, 5 mmol) viene gocciolato in una soluzione di LiAlH4(500 mg, 10 mmol) in THF anidro (15 mL). Si lascia reagire 5 minuti quindi si aggiunge H2O fino a quando non c’à ̈ più sviluppo di gas. Si acidifica con acido citrico quindi si estrae con Et2O (2 x 10 mL). Il solvente viene portato a secco al rotavapor ed il prodotto utilizzato senza ulteriore purificazione (resa 60%).

Sintesi di 8-tioesa-5-inil-2'-deossiadenosina

N H2

N

N

S

H O N

O N

O H

Ad una sospensione di 8-bromo-2'-deossiadenosina commerciale (330 mg 1.0 mmol) in acqua (625 mL) sono stati aggiunti esa-5-ino-1-tiolo (342 mg, 3 mmol) e trietilammina (1.5 mL, 10 mmol). La miscela à ̈ stata riscaldata a 100 °C per due ore (con refrigerante a ricadere). Il prodotto di reazione à ̈ stato estratta a caldo con etilacetato (EtOAc) (2 x 100 mL). La fase organica à ̈ stata concentrata sotto vuoto e il residuo à ̈ stato purificato su gel di silice eluendo con CH2Cl2/MeOH/trietilammina 89/10/1 per dare il prodotto desiderato con resa del 30%.

Sintesi di 5'-dimetossitritile-8-tioesa-5-inil-2'-deossiadenosina

MeO

NH2

N

N

S

O N

O N

MeO

OH

La 8-tioesa-5-ino-2'-deossiadenosina (363 mg 1.0 mmol) viene sciolta in 8 mL di piridina anidra, e addizionata di dimetossitritilcloruro fresco (400 mg, 1.2 mmol). La reazione viene condotta sotto agitazione a T. a. in atmosfera inerte per 1 ora. Il grezzo di reazione viene concentrato a piccolo volume per evaporazione sotto vuoto, diluito in EtOAc (40 mL) e lavato con acido citrico al 10% p/v in acqua. (4 x 10 mL) e infine con acqua (2 x 10 mL). La fase organica vine purificata su gel di silice elunedo con CH2Cl2/MeOH 95/5 v/v ottenendo il prodotto desiderato con resa del 78%.

Sintesi di 5'-dimetossitritile-8-tioesa-5-inil-2'-deossiadenosina-4-N-difenilacetammide

O

MeO

H N

N

N

S

O N

O N

MeO

O H

Il composto precedentemente ottenuto (557 mg, 1.0 mmol) viene sciolto in piridina anidra (5 mL) e fatto reagire, in atmosfera di azoto sotto agitazione, con trimetilsililcloruro (0.635 mL, 5.0 mmol). Dopo 30 minuti si aggiunge il difenilacetil cloruro (277 mg 1.2 mmol) e la reazione viene continuata per 2 ore. Si aggiunge MeOH (1 mL) e dopo 15 minuti di NH4OH (1 mL al 30% p/v) . Come nel corrispondente derivato dello psoralene, si segue la rimozione del protettore sililico e dell'eventuale ammide bis-protetta. Si ripete il work-up già descritto e si purifica su gel di silice con CH2Cl2/MeOH/trietilammina 89/10/1 ottenendo una resa del 90%.

Sintesi di 8-tioesa-5-inil- 5'- O -dimethoxytrityl -4-difenilacetamide-2'-deoxyadenosine 3'-O’-cianoetil- diisopropilfosphoroamidito

O

MeO

H N

N

N

S

O N

O N

MeO

O N

P O

N

Viene preparata una soluzione contenente il composto precedentemente descritto (557 mg, 1 mmol) in diclorometano anidro (5 mL) e etildiisopropilammina (0.85 mL, 5 mmol). A questa soluzione si aggiunge il cianoetil-diisopropil clorofosfito (0.36 mL, 1.6 mmol). La reazione viene mantenuta agitata in atmosfera inerte a T. a. per 30 minuti. La reazione viene diluita con 30 mL di CH2Cl2e lavata con NaHCO3(8% p/v in acqua) e successivamente con brina (10% p/v NaCl in acqua).

Il prodotto viene purificato per cromatografia su silice in gradiente di etilacetato/cicloesano/trietilammina da 20/80/10 e 90/10/10 recuperando un solido spugnoso con resa del 60%. Sintesi degli oligonucleotidi

Gli ammiditi corrispondenti ai tre coniugati (con psoralene, acridina, alchino) vengono diluiti in acetonitrile alla concentrazione di 0.1 mM (0.08 mM nel caso del derivato dell'acridina un po' meno solubile), come un qualsiasi fosforoammidito, e caricati sul sintetizzatore Gene Assembler II+ nella posizione corrispondente a quella della base modificata X. Vengono effettuate delle sintesi di oligonucleotidi aventi la seguente sequenza: 5'CGTGCXTCCTAGC3' utilizzando i protocolli standard per la scala di sintesi 1.3 µmolare prendendo la precauzione di allungare di due minuti i tempi di accoppiamento per la base X.

Le letture effettuate sul catione del dimetossitritile rimosso successivamente alla reazione di accoppiamento forniscono i seguenti risultati:

P1-norm (oligo non modificato X = A):

efficienza dell'accoppiamento pari a 96.9 %

P1-pso (X = A coniugata con psoralene): efficienza dell'accoppiamento pari a 99.9 %

P1-acr (X = A coniugata con acridina): efficienza dell'accoppiamento pari a 97.6%

P1-ino (X = A coniugata con alchino):

efficienza dell'accoppiamento pari a 98.5%

Come si vede dai risultati, i protocolli standard di accoppiamento (seppure coi tempi allungati di due minuti) forniscono una normale incorporazione delle adenosine modificate nell'oligonucleotide sintetizzato con efficienza del tutto paragonabile se non superiore a quella dell'ammidito standard.

L'efficienza rimane comparabile anche con la base successiva, la citidina in posizione 5 dove: P1-norm:

efficienza dell'accoppiamento pari a 99.0%

P1-pso:

efficienza dell'accoppiamento pari a 102.8%(*) P1-acr: ;efficienza dell'accoppiamento pari a 98.6% ;P1-ino: ;efficienza dell'accoppiamento pari a 100.8% ;(*) un errore del 2-3% nella lettura dell'assorbimento del catione à ̈ nella norma per questo tipo di apparecchio.

A fine sintesi le cartucce vengono asciugate con getto di aria e deposte all'interno di un vial in plastica da 1.6 mL fornito di tappo ermetico. La cartuccia viene riempita di ammoniaca acquosa al 30% p/v, chiusa e lasciata overnight (16 ore) a 50 °C per permettere lo sblocco dal CPG e la rimozione dei gruppi protettori. Al mattino la cartuccia viene raffreddata e aperta e il liquido trasferito in una provetta da 12 mL. La cartuccia viene lavata tre volte con 1 mL di acqua milli-Q e le fasi acquose riunite alla precedente soluzione ammoniacale. Il contenuto della provetta viene liofilizzato in centrifuga sotto vuoto, e il risultante precipitato viene sciolto in 500 µL di trietilammonio acetato (TEA) 0.1 M in acqua milli-Q e purificato su colonna preparativa RP-18 1.6x 12 cm in 0.1M di TEA in acqua milli-Q in gradiente da 0 a 20 % di acetonitrile.

Le opportune frazioni vengono controllate in HPLC prima di essere riunite e nuovamente liofilizzate. Si recuperano rispettivamente:

P1-norm: 68.8 OD, pari a 0.59 µmol con resa com plessiva del 36% rispetto al CPG utilizzato;

P1-pso: 64.15 OD, pari a 0.55 µmol con resa complessiva del 28% rispetto al CPG utilizzato;

P1-acr: 63.32 OD, pari a 0.54 µmol con resa complessiva del 31% rispetto al CPG utilizzato;

P1-ino: 104.64 OD, pari a 0.89 µmol con resa complessiva del 45% rispetto al CPG utilizzato.

Gli spettri di assorbimento UV dei quattro oligonucleotidi sintetizzati sono quelli attesi: λmax270 nm, P1-pso mostra un secondo assorbimento a 340 nm, P1-acr mostra un secondo assorbimento che si estende da 320 a 450 nm, mentre l'assorbimento del gruppo alchinilico in P1-ino non à ̈ misurabile nel visibile.

P1-pso e P1-Acr fluorescono per eccitazione a 350 nm e 370 nm rispettivamente, mostrando curve di emissione simili a quelle riportate in derivati di questo tipo.

Gli oligonucleotidi purificati mostrano l'atteso valore di massa in spettrometria ESI:

P1-norm:

massa esatta calcolata 3908.7 misurata 3908.8 P1-pso:

massa esatta calcolata 4282.8 misurata 4283.0 P1-acr:

massa esatta calcolata 4283.7 misurata 4284.3

(contiene 1 atomo di Cl) P1-ino:

massa esatta calcolata 4020.7 misurata 4020.7

Claims (16)

1. RIVENDICAZIONI 1. Derivato di adenosina o deossiadenosina modificato in posizione 8, di formula generale (I): R2 NH N N R1L S N N Z formula (I) in cui: R1à ̈ scelto dal gruppo che consiste di -C≡CH, -SH, -triazolil-G e –SG’, in cui G e G’ sono scelti indipendentemente l’uno dall’altro nel gruppo che consiste di residui di cromofori, fluorofori e intercalanti; L à ̈ scelto fra -(CH2)n- e –(CH2-CH2-O)m-CH2-, in cui n à ̈ un numero intero compreso fra 3 e 12 ed m à ̈ un numero intero compreso fra 1 e 3; R2à ̈ idrogeno oppure un gruppo protettore di gruppi amminici; Z à ̈ scelto tra <R>5<O CH>2 O<R>5<O CH>2 O R4O<O> R( ) 4O R<CH>2p 3e , in cui R3à ̈ scelto fra idrogeno, -OH, -O-alchile C1-C3lineare o ramificato e -O-PG, in cui -PG à ̈ un gruppo protettore di gruppi ossidrilici; p à ̈ un numero intero scelto fra 1 e 2; R4à ̈ scelto fra idrogeno e un gruppo protettore di gruppi ossidrilici; R5à ̈ scelto fra idrogeno o un gruppo protettore di gruppi ossidrilici.
2. 2. Derivato secondo la rivendicazione 1, in cui L à ̈ -(CH2)n-, n à ̈ 5, R1à ̈ –SG’ e G’ à ̈ un cromoforo, un fluoroforo o un intercalante.
3. 3. Derivato secondo la rivendicazione 2, in cui G’ à ̈ psoralene o acridina.
4. 4. Derivato secondo la rivendicazione 1, in cui L à ̈ -(CH2)n-, n=3 e R1à ̈ -C≡CH, oppure triazolil-G in cui G à ̈ un residuo di cromoforo, fluoroforo o intercalante.
5. 5. Derivato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, in cui R2Ã ̈ un gruppo protettore di gruppi amminici scelto fra benzoile (Bz), acetile (Ac) e difenilacetile (DPA).
6. 6. Derivato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5, in cui R3à ̈ –O-PG, in cui -PG à ̈ un derivato sililato, preferibilmente terzbutildimetilsilil (TBDMS).
7. 7. Derivato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, in cui R4Ã ̈ un fosforoammidito, preferibilmente diisopropilammino fosforoammidito.
8. 8. Derivato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 7, in cui R5Ã ̈ dimetossitritile (DMT).
9. 9. Procedimento di sintesi di un derivato di adenosina o deossiadenosina modificato in posizione 8 secondo la rivendicazione 1, comprendente i passaggi di: (i) far reagire in un mezzo acquoso una 8-bromoadenosina o 8-bromodeossiadenosina di formula (1a): NH2 N N Br N N Z ' formula (1a) in cui Z' à ̈ scelto fra: <H O CH>2 O <HO CH>2 O HO<O> H O R(<CH>2 )p 3e , in cui R3à ̈ scelto fra idrogeno, -OH, -O-Alchile C1-C3lineare o ramificato e -O-PG, in cui -PG à ̈ un gruppo protettore di gruppi ossidrilici; p à ̈ un numero intero scelto fra 1 e 2; con un alchilante allo zolfo di formula (1b) HS-L-R1’ formula (1b) in cui: L à ̈ scelto fra -(CH2)n- e –(CH2-CH2-O)m-CH2-, in cui n à ̈ un numero intero compreso fra 3 e 12 ed m à ̈ un numero intero compreso fra 1 e 3; e R1’ à ̈ scelto fra -C≡CH e –SH, ottenendo per mezzo di ciò un derivato di adenosina o deossiadenosina modificato in posizione 8 di for mula (1c): NH2 N N <R'>1 L S N N Z ' formula (1c) in cui R1’, L e Z' hanno i significati indicati in precedenza; (ii) quando R’1nella formula (1c) ha il significato di –SH, opzionalmente coniugare il derivato di formula (1c) con un cromoforo, fluoroforo o intercalante G’, ottenendo per mezzo di ciò un derivato di formula (1c) in cui R’1ha il significato di – SG’; o quando R’1nella formula (1c) ha il significato di -C≡CH, opzionalmente coniugare il derivato di formula (1c) con un cromoforo, fluoroforo o intercalante G contenente un gruppo azide, ottenendo per mezzo di ciò un derivato di formula (1c) in cui R’1ha il significato di triazolil-G; e (iii) opzionalmente proteggere le seguenti posizioni del derivato di formula (1c): il gruppo ossidrilico in posizione 5’ del residuo di zucchero; il gruppo amminico in posizione 7 dell’anello purinico; e il gruppo ossidrilico in posizione 3’ del residuo di zucchero.
10. 10. Procedimento secondo la rivendicazione 9, in cui il mezzo acquoso comprende acqua e trietilammina (TEA).
11. 11. Procedimento secondo la rivendicazione 9 o 10, in cui la reazione fra la 8-bromoadenosina o 8-bromodeossiadenosina di 2 di circa 100°C.
12. 12. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 9 a 11, in cui il gruppo ossidrilico in posizione 5’ del residuo di zucchero à ̈ protetto con dimetossitritile (DMT).
13. 13. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 9 a 12, in cui il gruppo amminico in posizione 7 dell’anello purinico à ̈ protetto con benzoile (Bz), acetile (Ac) o difenilacetile (DPA), preferibilmente difenilacetile (DPA).
14. 14. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 9 a 13, in cui il gruppo ossidrilico in posizione 3’ del residuo di zucchero à ̈ protetto con fosforoammidito, preferibilmente diisopropilammino fosforoammidito.
15. 15. Oligonucleotide comprendente un derivato di adenosina o deossiadenosina modificato in posizione 8 secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 8.
16. 16. Uso di un derivato di adenosina o deossiadenosina modificato in posizione 8 secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 8, nella sintesi di oligonucleotidi.