ITTO20100028A1

ITTO20100028A1 - Costrutto di acido nucleico, vettore e vaccino a dna includenti detto costrutto.

Info

Publication number: ITTO20100028A1
Application number: IT000028A
Authority: IT
Inventors: Augusto Amici; Raffaele Adolfo Calogero; Federica Cavallo; Guido Forni; Cristina Marchini
Original assignee: Univ Degli Studi Torino
Priority date: 2010-01-15
Filing date: 2010-01-15
Publication date: 2011-07-16

Description

DESCRIZIONE dell’invenzione industriale dal titolo: “Costrutto di acido nucleico, vettore e vaccino a DNA includenti detto costrutto”

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce al settore dei vaccini a DNA, in particolare a un costrutto di acido nucleico, preferibilmente clonato all’interno di un vettore plasmidico, utile per l’impiego come vaccino a DNA per il trattamento di patologie tumorali o patologie infiammatorie in un animale, preferibilmente un mammifero, ivi incluso l’essere umano.

L’efficacia della vaccinazione dipende dalla presenza, nel vaccino, di un antigene immunogenico atto ad indurre una risposta immunitaria specifica. L’intensità della riposta al vaccino è influenzata da numerosi meccanismi che regolano negativamente o positivamente l’intensità della reattività immunitaria. Tali meccanismi regolatori/soppressivi controllano l’appropriatezza dell’entità della risposta immunitaria indotta dall’antigene e impediscono che la risposta immunitaria diventi troppo intensa, persistente o incongrua. Per questo motivo, in numerose situazioni patologiche, quali ad esempio alcune malattie infettive o tumorali, i meccanismi immunologici regolatori/soppressori possono frenare la capacità del vaccino di indurre una risposta mediata dai linfociti T o una risposta basata sulla produzione di anticorpi. Le situazioni patologiche in cui si assiste a una limitata efficacia della vaccinazione sono frequenti e spesso sono proprio quelle nelle quali una vaccinazione efficace potrebbe rivestire un importante effetto terapeutico.

La domanda di brevetto internazionale WO 2006/073970 descrive una composizione di acido nucleico comprendente una prima molecola di acido nucleico codificante per un epitopo di un peptide o polipeptide antigenico e, separatamente, una seconda molecola di acido nucleico atta a produrre un siRNA atto a interferire con l’espressione di un gene pro-apoptotico in cellule dendritiche.

La domanda di brevetto internazionale WO2008071093 descrive cellule presentanti l’antigene geneticamente modificate in modo tale da esprimere un acido nucleico, ad esempio un siRNA o un microRNA, atto a inibire o modulare l’espressione di mRNA codificanti per una citochina immunosoppressiva, ad esempio IL-10.

Meng-Chi Yen et al., Clin Cancer Res 2009 ;15(2)January 15, 2009, pagine 641-649, insegna l’ottenimento di un’efficace risposta immune antitumorale mediante co-somministrazione di un vaccino a DNA codificante per l’antigene tumorale neu e un siRNA diretto contro l’enzima IDO (indolamina 2,3-diossigenasi). E’ inoltre descritto il potenziamento in vitro dell’effetto terapeutico del vaccino a DNA codificante per l’antigene neu mediante fusione con il siRNA diretto contro IDO.

Resta tuttavia la necessità di mettere a disposizione un sistema di vaccino a DNA che sia al contempo estremamente flessibile (ossia possa essere impiegato per la preparazione di vaccini contro svariate tipologie di malattie, ad esempio patologie tumorali e infettive di vario genere) ma che al contempo sia caratterizzato da un’incrementata efficacia terapeutico/preventiva.

Vi è inoltre la necessità di mettere a disposizione un vaccino a DNA che sia atto a indurre un’efficace risposta immunitaria anche in condizioni patologiche - quali ad esempio tumori, infezioni batteriche o altre malattie infettive -in cui un’abnorme esaltazione dei meccanismi regolatori impedirebbe l’induzione di un’efficace risposta immunitaria protettiva.

Tali necessità sono soddisfatte dal costrutto di acido nucleico secondo la presente invenzione, che si è rivelato particolarmente efficace per l’impiego come vaccino a DNA, preferibilmente in una forma clonata all’interno di un vettore, quale ad esempio un vettore plasmidico.

Costituiscono quindi oggetto dell'invenzione un costrutto di acido nucleico, un vettore (preferibilmente un vettore plasmidico) e una composizione immunogenica o di vaccino come definiti nelle rivendicazioni che seguono, il cui contenuto è da intendersi come parte dell'insegnamento tecnico della presente descrizione.

Come è mostrato nella sezione sperimentale nel seguito, il costrutto di acido nucleico della presente invenzione si è mostrato estremamente efficace come vaccino a DNA anche in condizioni patologiche in cui un vaccino tradizionale non avrebbe funzionato o avrebbe funzionato con scarsa efficacia.

Nel contesto della presente descrizione, il termine “animale” indica qualsivoglia animale, preferibilmente un mammifero, ivi incluso l’essere umano.

Il termine “siRNA” indica un “RNA interferente breve”, altresì denominato “small interfering RNA” o “short interfering RNA”. Un siRNA è una molecola di acido ribonucleico a doppio filamento, usualmente di circa 20-25 nucleotidi di lunghezza, più frequentemente 21 nucleotidi di lunghezza, atta a inibire l’espressione di un predeterminato gene mediante il meccanismo della interferenza dell’RNA (“RNA interference”). Più specificamente, una molecola a doppio filamento di siRNA comprende due nucleotidi sporgenti ad ognuna delle estremità 3’. Tale struttura risulta dall’attività dell’enzima Dicer, che è in grado di convertire lunghe molecole di RNA a forcina, dette shRNA (“RNA breve a forcina”, o “short hairpin RNA”), in siRNA. Tale meccanismo è anche utilizzato per la transfezione di un siRNA esogeno all’interno di una cellula. A tale scopo si usano, infatti, vettori, preferibilmente vettori plasmidici, in grado di produrre molecole di RNA a doppio filamento contenenti una forcina (shRNA), mediante trascrizione operata dalla RNA polimerasi III. Gli shRNA risultanti dalla trascrizione vengono poi processati a siRNA dall’enzima Dicer.

Il termine “miRNA” indica un “microRNA”, ossia una molecola di RNA a singolo filamento usualmente di 21-24 nucleotidi di lunghezza, derivante da una sequenza di DNA genomico che viene trascritta ma non tradotta. Il trascritto primario, detto primiRNA, viene processato in una struttura stem-loop detta pre-miRNA ed infine in un miRNA. Il miRNA è in grado di regolare verso il basso l’espressione di un predeterminato gene (down-regulation), poiché esso è almeno parzialmente complementare a una o più molecole di RNA messaggero bersaglio.

Una forma di realizzazione preferita dell’invenzione è rappresentata in figura 1, che mostra una mappa schematizzata di un costrutto di acido nucleico clonato all’interno di un vettore plasmidico, il costrutto comprendendo un primo inserto di acido nucleico, denominato nel seguito “ANTIGEN”, che consiste in una cassetta di espressione per un antigene immunogenico o una proteina reporter, ed un secondo inserto di acido nucleico, denominato nel seguito “FIXER siRNA”, che include una sequenza di acido nucleico atta a dare origine a un siRNA capace di inibire l’espressione di una citochina immunogenica o altro fattore regolativo delle cellule presentanti l’antigene.

Un vettore plasmidico idoneo per l’impiego nella presente invenzione comprende un’origine di replicazione batterica, un gene di resistenza a un antibiotico (ad esempio kanamicina o ampicillina), un promotore per la RNA polimerasi II, un sito multiplo di clonaggio, un segnale di terminazione della trascrizione. Un vettore plasmidico particolarmente preferito è il plasmide pVAX1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Stati Uniti d’America), approvato dalla Federal Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti d’America come scheletro plasmidico per la sperimentazione di vaccini a DNA nelle sperimentazioni cliniche umane. Questo vettore plasmidico contiene il gene per la resistenza alla kanamicina per la selezione in E. coli, il promotore immediato-precoce del citomegalovirus (CMV) umano per un alto livello di espressione in un’ampia gamma di cellule di mammifero, il segnale di poliadenilazione dell’ormone della crescita bovino per un’efficiente terminazione della trascrizione e poliadenilazione dell’mRNA, nonché un sito multiplo di clonaggio. Il sito multiplo di clonaggio consiste in una sequenza sintetica di DNA di circa 100 paia di basi, inserita fra il promotore eucariotico e il segnale di terminazione della trascrizione, che contiene una serie di siti unici di restrizione.

Nelle cellule presentanti l’antigene, le attività regolatorie negative/soppressive dipendono da una pluralità di fattori, fra i quali si citano a titolo esemplificativo l’interleuchina 10 (IL-10), le molecole regolatorie B7-H4, TEM8, l’enzima indolamina 2,3-diossigenasi (IDO), l’enzima cicloossigenasi-2 (COX-2) responsabile della produzione della prostaglandina E2 (PGE2).

Pertanto, il siRNA espresso dall’inserto “FIXER siRNA” impiegato nella presente invenzione, è preferibilmente scelto nel gruppo dei siRNA progettati per inibire l’espressione di un gene codificante per uno dei suddetti fattori regolatori. In una forma di realizzazione particolarmente preferita, il siRNA è progettato per inibire l’espressione del gene codificante per l’interleuchina 10 (IL-10).

La struttura di una forma di realizzazione preferita dell’inserto “FIXER siRNA” è rappresentata in dettaglio nelle figure 2 e 3.

La figura 2 è una rappresentazione schematica dell’inserto “FIXER siRNA” in cui sono visibili un promotore per la RNA polimerasi III e, a valle del promotore, le sequenze ripetute ed invertite senso e antisenso separate da una sequenza spaziatrice, il cui prodotto di trascrizione si ripiega per complementarietà dando origine a una struttura a forcina, chiamata shRNA (“short hairpin RNA”), caratterizzata da una porzione a doppio filamento di circa 19-22 paia di basi e da una porzione a singolo filamento che forma un’ansa di lunghezza variabile.

Idonei promotori per la RNA polimerasi III sono ad esempio il promotore per l’RNA U6 umano e murino e il promotore H1 umano. In una forma di realizzazione particolarmente preferita, il promotore dell’inserto “FIXER siRNA” è il promotore H1 umano, che è caratterizzato dai seguenti elementi: una TATA box localizzata tra la posizione –30 e –25 dall’inizio della trascrizione, un elemento prossimale (PSE) posto tra –66 e –47, e un elemento distale (DSE) localizzato tra –244 e –214.

Il promotore H1 umano trascrive efficientemente brevi trascritti che mancano del segnale di poliadenilazione, ed ha un punto di inizio della trascrizione a 25 nucleotidi a valle dalla TATA box, mentre la terminazione della trascrizione è garantita da un segnale costituito da una sequenza di cinque timidine posto a valle de frammento da trascrivere. Il trascritto prodotto sotto il controllo di tale promotore, si ripiegherà per auto-complementarietà dando origine a una struttura a forcina, cioè una molecola di RNA a doppio filamento con un loop intermedio determinato da una sequenza spaziatrice.

La molecola a forcina shRNA risultante dalla trascrizione delle sequenze ripetute ed invertite senso e antisenso separate da una sequenza spaziatrice contenute nell’inserto “FIXER siRNA”, dopo processamento da parte dell’enzima endogeno Dicer, è in grado di dare origine ai due filamenti del siRNA, uno dei quali è “senso” mentre l’altro è “antisenso” rispetto all’RNA messaggero bersaglio.

Il filamento senso è anche chiamato filamento guida, poiché funge da templato per il silenziamento genico sequenza-specifico da parte del macchinario dell’interferenza dell’RNA (“RNA interference”). La molecola di siRNA si assembla con il complesso RISC (“RNA-induced silencing complex”), che incorpora il filamento guida. Grazie all’associazione con il filamento guida, che è in grado di appaiarsi per complementarietà all’RNA messaggero bersaglio, il complesso RISC riconosce e taglia lo stesso RNA messaggero bersaglio, tra il decimo e l’undicesimo nucleotide a valle dell’estremità 5’ del filamento guida. La degradazione dell’RNA messaggero bersaglio è poi completata dalle RNasi citoplasmatiche.

La funzione dell’inserto “FIXER siRNA” è dunque quella di produrre molecole di siRNA capaci di silenziare una citochina immunogenica od altro fattore responsabile delle attività immunosoppressive e regolatorie nelle cellule transfettate con il vettore. Le molecole di siRNA prodotte dall’inserto “FIXER siRNA”, inibendo i meccanismi di regolazione negativa che possono interferire o limitare la capacità delle cellule di presentare l’antigene, facilitano la presentazione efficace della proteina o delle proteine codificate dall’inserto “ANTIGEN”.

La figura 3 mostra in maggiore dettaglio la struttura dell’inserto “FIXER siRNA” clonato a valle del promotore per la RNA polimerasi III. In particolare, è rappresentata la sequenza dei siti di restrizione, del segnale di inizio della trascrizione e del segnale di terminazione della trascrizione (SEQ ID NO:1). I siti di restrizione hanno lo scopo di consentire il clonaggio direzionale nel vettore delle sequenze nucleotidiche generanti i siRNA. Le sequenze nucleotidiche dei siti di restrizione e dei segnali di inizio e terminazione della trascrizione rappresentate in figura 3 sono fornite a puro titolo illustrativo e non limitativo della portata dell’invenzione. La scelta e l’impiego di sequenze alternative a quelle rappresentate rientra nelle capacità del tecnico medio del settore.

Secondo un’ulteriore forma di realizzazione preferita dell’invenzione, il costrutto di acido nucleico come descritto in precedenza comprende, oltre al primo e secondo inserto di acido nucleico, un terzo inserto di acido nucleico, denominato “FIXER miRNA”, atto a dare origine ad un miRNA artificiale (microRNA-based shRNA).

Nella forma di realizzazione specificamente illustrata in figura 4, l’inserto “FIXER miRNA” (ossia la sequenza di acido nucleico, preferibilmente DNA, in grado di fungere da stampo per la trascrizione del miRNA artificiale, che ha usualmente una lunghezza di circa 300 paia di basi) è inserito all'interno dell’inserto “ANTIGEN” fra la sequenza codificante per l'antigene o gli antigeni e il segnale di poliadenilazione. Studi condotti precedentemente, hanno indicato che la presenza di sequenze fiancheggianti il miRNA nativo sono richieste per il suo efficiente processamento. In considerazione di questo, sono stati disegnati dei microRNA-based shRNA utilizzando circa 125 basi che fiancheggiano in 5’ e 3’ la sequenza del pre– miR-30. E’ stato descritto che questi miRNA artificiali possono essere posti sotto il controllo di promotori riconosciuti dall'RNA polimerasi II o di quelli riconosciuti dall'RNA polimerasi III.

La presenza di tale inserto “FIXER miRNA” permette vantaggiosamente l'inibizione o la regolazione verso il basso di un'ulteriore molecola soppressoria espressa dalle cellule in grado di presentare l'antigene.

In una forma di realizzazione alternativa, l’inserto “ANTIGEN” e gli inserti “FIXER siRNA” e “FIXER miRNA” sono clonati in due plasmidi differenti.

Rientra pertanto nell’ambito della presente invenzione anche un costrutto di acido nucleico comprendente un primo inserto di acido nucleico denominato “FIXER siRNA” e un secondo inserto di acido nucleico denominato “FIXER miRNA”, il primo inserto essendo atto a dare origine a un siRNA capace di inibire l’espressione di una citochina immunogenica o altro fattore regolativo delle cellule presentanti l’antigene, il secondo inserto essendo atto a dare origine a un miRNA capace di regolare verso il basso l’espressione di una ulteriore citochina immunogenica o fattore regolativo delle cellule presentanti l’antigene.

Quando l’inserto “ANTIGEN” e gli inserti “FIXER siRNA” e “FIXER miRNA” sono utilizzati separatamente, cioè inseriti su due diversi plasmidi, il plasmide includente i due inserti FIXER potrà includere una sequenza di acido nucleico codificante per una proteina reporter, in sostituzione della sequenza di acido nucleico codificante per l’antigene o gli antigeni. Un esempio di proteina reporter è la GFP (Green Fluorescent Protein).

I costrutti di acido nucleico a due inserti che formano oggetto della presente invenzione sono progettati per essere utilizzati come vaccini a DNA in grado di attivare una più efficace risposta immunitaria contro l’antigene o gli antigeni codificati dall’inserto “ANTIGEN” quando è importante superare i meccanismi regolatori o soppressori.

Le piccole molecole di RNA codificate dagli inserti FIXER sono infatti in grado di interferire o bloccare l’espressione di molecole regolatorie o soppressorie che frenano o inibiscono l’attivazione delle cellule del sistema immunitario come Linfociti B, Linfociti T CD4+, Linfociti T CD8+, Linfociti NK etc. Il meccanismo con cui le piccole molecole di RNA, trascritte dagli inserti FIXER interferiscono con l’espressione della molecola che si vuole inibire è conosciuto come silenziamento post-trascrizionale, ovvero l’RNA messaggero viene degradato e/o la sua capacità di essere utilizzato dal macchinario traduzionale viene inibita.

Inoltre, a differenza della rimozione sistemica delle cellule regolatorie e soppressive ottenibile con trattamenti convenzionali, l’utilizzo dei due inserti, ANTIGEN e FIXER, in un unico plasmide rimuove la soppressione solo nelle cellule in cui gli inserti sono veicolati e, quindi, solo nelle cellule che presentano l’antigene codificato dall’inserto ANTIGEN. Conseguentemente, la soppressione viene inibita solo nelle cellule che, captando il plasmide, sono coinvolte nella presentazione dell’antigene. Tale inibizione selettiva e parcellizzata coinvolge solo un piccolo numero di cellule muscolari, del sistema immunitario e del sistema vascolare, cioè proprio quelle che sono criticamente coinvolte nell’induzione della risposta immunitaria verso l’antigene. Questa inibizione parcellizzata è quindi scevra dai gravi fenomeni autoimmunitari che fanno seguito al blocco sistemico, in tutti i compartimenti del sistema immunitario, delle importanti e fisiologiche molecole regolatorie e soppressorie della risposta immunitaria.

La sezione sperimentale che segue ha lo scopo di illustrare in dettaglio una forma di realizzazione dell’invenzione, ed è effettuata a puro titolo illustrativo e non limitativo.

SEZIONE SPERIMENTALE

Costruzione del plasmide pVAX1-EC-TM

Per costruire il plasmide pVAX1-EC-TM gli inventori sono partiti dal plasmide pCMV-EC-TM che esprime i domini extracellulare e transmembrana della p185neu di ratto (Amici et al 2000, Gene Ther., 7: 703). Il plasmide pVAX1 di Invitrogen (Carlsbad, CA, Stati Uniti d’America) è stato scelto come scheletro plasmidico perché approvato dalla Federal Drug Administration, Stati Uniti d’America, per l’utilizzo nell’essere umano. Il pCMV-EC-TM è stato digerito con gli enzimi di restrizione HindIII e XbaI (BioLabs, Beverly, MA, Stati Uniti d’America) per separare l’inserto dallo scheletro plasmidico.

Digestione di restrizione con l’enzima HindIII: DNA plasmidico (1 μg/μl) 10 μl tampone di restrizione 10X (NEB2) 10 μl HindIII (10U/μl) 5 μl

H2O 75 μl

100 μl volume finale La miscela è stata incubata a 37°C per 4 ore e il prodotto di digestione è stato controllato mediante elettroforesi su gel di agarosio all’1% usando come controlli un marcatore di peso molecolare ed il plasmide non digerito. Una volta accertata la linearizzazione del plasmide, il DNA è stato precipitato aggiungendo alla miscela 1/10 del volume di sodio acetato 3 M a pH 5,2 e 2 volumi di etanolo assoluto freddo. Il campione è stato tenuto 20 minuti in ghiaccio e poi centrifugato in una minicentrifuga a 14.000 rpm per 12 minuti. Il pellet è stato lavato tre volte con 1 ml di etanolo freddo al 70% e quindi è stato essiccato sotto vuoto per 5 minuti. Il pellet è stato poi risospeso in 84 μl di H2O e sottoposto a digestione enzimatica con l’enzima di restrizione XbaI.

Digestione di restrizione con l’enzima XbaI: DNA risospeso in H2O (1 μg) 84 μl tampone di restrizione 10X (NEB2) 10 μl

BSA 100X (100μg/ml) 1 μl XbaI (10U/μl) 5 μl

100 μl volume La miscela è stata incubata a 37°C per 4 ore e il prodotto di digestione è stato precipitato ed essiccato come è stato descritto precedentemente. Il DNA è stato risospeso in 30 μl di H2O. I due frammenti di DNA corrispondenti allo scheletro plasmidico (pCMV di 4400 paia di basi, bp) ed all’inserto (EC-TM di 2100 bp) sono stati separati mediante elettroforesi su gel di agarosio all’1%. La banda corrispondente all’inserto è stata tagliata ed il DNA è stato eluito dal gel utilizzando il Qiaquick gel extraction kit della Qiagen Italia. Parallelamente, il nuovo scheletro plasmidico pVAX1 (Invitrogen) in cui inserire il frammento di DNA corrispondente all’EC-TM della p185 di ratto, è stato digerito con gli stessi enzimi di restrizione ed è stato eluito dal gel di agarosio. I frammenti di DNA corrispondenti all’EC-TM di ratto ed al plasmide linearizzato pVAX1 sono stati usati per ottenere il pVAX-EC-TM mediante reazione di ligazione.

Reazione di ligazione:

DNA inserto (rECD-TM) (50 ng/μl) 2 μl DNA plasmidico linearizzato (pVAX1) (50<1 μl>ng/μl)

Tampone di reazione 10X per la T4 DNA ligasi 1 μl T4 DNA ligasi (400 U/μl) 1 μl H2O 5 μl 10 μl volume La reazione di ligazione è stata incubata a 16°C per 4 ore. Il prodotto di ligazione è stato poi utilizzato per trasformare il ceppo batterico di E. coli DH5 α. Le cellule batteriche sono state rese competenti con la tecnica del CaCl2.

Trasformazione del ceppo batterico DH5 α:

Cellule batteriche competenti 100 μl Prodotto di ligazione 5 μl Affinché il DNA plasmidico penetri nelle cellule competenti, queste ultime sono state tenute in ghiaccio per 40 minuti e sottoposte a shock termico ponendole a 42°C per 1 minuto e mezzo e quindi in ghiaccio per altri 2 minuti. Dopo aver aggiunto 1 ml di terreno di crescita LB, le cellule batteriche trasformate sono state incubate a 37°C per 1 ora per ripristinare le loro condizioni fisiologiche. La sospensione cellulare è stata quindi centrifugata a 6000 rpm per 1 minuti ed il pellet è stato risospeso in 100 μl di LB. Le cellule sono state seminate in piastre Petri contenenti terreno selettivo solido (LB con agar più kanamicina 60 μg/ml) e lasciate crescere a 37°C per 1 notte. La presenza di kanamicina permette la crescita solamente delle cellule che contengono il plasmide pVAX-EC-TM in cui è presente il gene per la resistenza alla kanamicina. I cloni ottenuti sono stati analizzati mediante lisi alcalina per individuare quello/i contenenti il plasmide ricombinante pVAX-EC-TM.

Costruzione di due plasmidi che codificano shRNA dell’IL-10: pVAX1-siRNA-IL10-1 e pVAX1-siRNA-IL10-2 Per la costruzione dei vettori che trascrivono per molecole di siRNA in grado di silenziare l’espressione dell’IL-10, è stato utilizzato il plasmide pGEMT in cui è stato inserito il promotore H1 umano riconosciuto dalla RNA Polimerasi III. Due sequenze di 19 nucleotidi del cDNA dell’IL-10 sono state utilizzate per la costruzione di questi vettori: una è omologa all’mRNA di topo e di uomo (siRNA-IL10-1), mentre l’altra è omologa solo alla sequenza dell’mRNA dell’IL10 di topo (siRNA-IL10-2). Come controllo è stata utilizzata la sequenza siRNA-IL10controllo, corrispondente alla sequenza del siRNA-IL10-2 alla quale però è stata apportata una mutazione in una singola base. Infatti è stato descritto che una singola base mutata all'interno della sequenza utilizzata non permette più l'innesco della reazione di degradazione del messaggero specifico. Le sequenze di IL-10 scelte hanno una lunghezza di 19 nucleotidi ed ognuna di esse è separata, grazie ad una breve sequenza spaziatrice di nove nucleotidi, dalla propria sequenza complementare invertita. I vettori costruiti dagli inventori sono quindi responsabili della generazione di molecole di RNA a doppio filamento, lunghe 19 nucleotidi e caratterizzate da due uracili a singolo filamento in posizione 3’ presenti in entrambe le catene di siRNA. Inoltre, come sequenza di terminazione della trascrizione riconosciuta dalla RNA polimerasi III, sono state inserite cinque timine a valle della sequenza di IL-10 orientata come antisenso.

La sequenza del promotore H1 umano (pH1), è stata isolata tramite PCR partendo da DNA genomico umano digerito con l'enzima di restrizione SacI. Per la reazione di amplificazione sono stati utilizzati i seguenti oligonucleotidi:

sequenza primer senso promotore-H1:

5’CCATGGAATTCGAACGCTGACGTC 3’ (SEQ ID NO:2) sequenza primer antisenso promotore-H1:

5’GCGCAAGCTTAGATCTGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC 3’ (SEQ ID NO:3)

L’amplificato di 234 bp, corrispondente al promotore H1, è stato clonato nel vettore pGEMT. All'estremità 5' dell'oligonucleotide antisenso, sono inseriti i siti di riconoscimento per gli enzimi di restrizione Bgl II e Hind III. Ciò permette un clonaggio direzionale. Infatti, digerendo il vettore ottenuto (pGEMT-pH1) con gli enzimi di restrizione Bgl II e Hind III, è stato possibile inserire a valle della sequenza del promotore H1, le sequenze per la generazione delle molecole di siRNA specifiche per l’IL-10. Queste ultime sono state ottenute per ibridazione delle seguenti coppie di oligonucleotidi:

siRNA-IL10-1-senso:

GATCCCCGTGAAGACTTTCTTTCAAATTCAAGAGATTTGAAAGAAAGTCTT CACTTTTTGGAAA (SEQ ID NO:4)

siRNA-IL10-1-antisenso:

AGCTTTTCCAAAAAGTGAAGACTTTCTTTCAAATCTCTTGAATTTGAAAGA AAGTCTTCACGGG (SEQ ID NO:5)

siRNA-IL10-2-senso:

GATCCCCCCTAGACAGAGCTCTCTAATTCAAGAGATTAGAGAGCTCTGTCT AGGTTTTTGGAAA (SEQ ID NO:6)

siRNA-IL10-2-antisenso:

AGCTTTTCCAAAAACCTAGACAGAGCTCTCTAATCTCTTGAATTAGAGAGC TCTGTCTAGGGGG (SEQ ID NO:7)

SiRNA controllo negativo-IL10-senso:

GATCCCCCCTAAACAGAGCTCTCTAATTCAAGAGATTAGAGAGCTCTGTTT AGGTTTTTGGAAA (SEQ ID NO:8)

SiRNA controllo negativo-IL10-antisenso:

AGCTTTTCCAAAAACCTAAACAGAGCTCTCTAATCTCTTGAATTAGAGAGC TCTGTTTAGGGGG (SEQ ID NO:9)

I vettori così ottenuti sono stati purificati e analizzati mediante sequenziamento. La figura 5 mostra le sequenze nucleotidiche delle cassette pH1-siRNA-IL-10 ottenute con le due diverse sequenze di IL-10 e con la sequenza mutata (controllo negativo). Tali sequenze sono designate come SEQ ID NO: 10, 11 e 12. Queste cassette sono state separate dal pGEMT mediante taglio di restrizione con EcoRI ed eluizione da gel. Le estremità coesive degli inserti sono state rese blunt utilizzando la DNA polimerasi (frammento di Klenow) e sono state clonate all’interno del pVAX1 e del pVAX1-EC-TM, entrambi tagliati con l’enzima di restrizione Eco721. Il sito di restrizione Eco721 è in posizione 2212 bp nel pVAX1, tra l’origine di replicazione batterica e il gene per la resistenza alla kanamicina. In questo modo sono stati ottenuti i plasmidi pVAX1-siRNA-IL10-1 (figura 6), pVAX1-siRNA-IL10-2 (figura 7) e pVAX1-siRNA-IL-10 controllo (figura 8).

Inoltre sono stati ottenuti i vettori pVAX1-EC-TM-siRNA-IL10-1 (figura 9), pVAX1-EC-TM-siRNA-IL10-2 (figura 10) in grado sia di codificare i domini extracellulare e transmembrana della p185neu sia di trascrivere gli siRNA per silenziare l’espressione dell’IL10. Invece il pVAX1-EC-TM-siRNA-IL10 controllo (figura 11) non dovrebbe innescare il silenziamento e viene utilizzato come controllo della vaccinazione a DNA.

Efficacia terapeutica dei plasmidi pVAX1/EC-TM-siRNA-IL-10-1 e pVAX1/EC-TM-siRNA-IL-10-2

I plasmidi pVAX1/EC-TM-siRNA-IL10-1 e pVAX1/EC-TM-siRNA-IL10-2 sono stati impiegati in protocolli di vaccinazione. L’inserto “FIXER siRNA” codifica siRNA inibitori della traduzione dell’IL-10 e l’inserto “ANTIGEN” codifica per l’antigene tumorale, in particolare per i domini extracellulare (EC) e transmembrana (TM) del prodotto proteico dell’oncogene ErbB-2 (Her-2/neu). L’efficacia dei vaccini che codificano l’EC-TM dell’ErbB-2 e il siRNA dell’IL-10 è stata valutata in un modello di topo trasgenico per l’oncogene ErbB-2 di ratto (topi BALB-neuT). Le femmine BALB-neuT sviluppano spontaneamente carcinomi mammari in tutte le ghiandole mammarie, con una progressione ben definita e riproducibile. La vaccinazione delle femmine BALB-neuT basata sull’elettroporazione di un plasmide codificante l’EC-TM del prodotto proteico dell’ErbB-2 di ratto (il plasmide tradizionale pVAX1-EC-TM) effettuata a 10 settimane di vita, quando le mammelle presentano iperplasia atipica e carcinomi in situ, ritarda significativamente la comparsa dei tumori e fa sì che il 30% dei topi trattati siano ancora completamente liberi da tumori palpabili ad un anno di vita, quando ormai tutti gli animali di controllo sono morti a causa dei tumori mammari. Tuttavia, se la vaccinazione con pVAX1-EC-TM viene ritardata fino a che le mammelle dei topi presentano, a livello microscopico, lesioni invasive, allora la vaccinazione con il plasmide tradizionale pVAX1-EC-TM risulta priva di effetto protettivo. Questo mancato effetto della vaccinazione è, in gran parte, da attribuirsi alle capacità soppressorie che la crescita progressiva del tumore ErbB-2 positivo esercita nei confronti del sistema immunitario. Quando invece i topi che presentano lesioni invasive nelle mammelle vengono vaccinati con i nuovi plasmidi a due moduli, il modulo ANTIGEN che codifica lo stesso antigene EC-TM del plasmide tradizionale ed il modulo FIXER che codifica un siRNA per l’IL-10 (EC-TM/pVAX1-siRNA-IL10-1; EC-TM/pVAX1-siRNA-IL10-2), entrambi i nuovi vaccini a due moduli risultano in grado di curare il 30% degli animali. Questi risultati sono rappresentati in figura 12, che mostra l’incidenza del carcinoma mammario nei topi BALB-neuT elettroporati con 50 μg dei diversi plasmidi alla diciottesima e ventesima settimana di vita. Topi con almeno un carcinoma mammario di diametro medio > 1 mm ed in crescita progressiva sono stati classificati come portatori di tumore. L’incidenza dei tumori nel gruppo elettroporato con pVAX1-EC-TM è significativamente diversa da quella del gruppo di topi elettroporati con pVAX1/EC-TM-siRNA-IL10-1 (P < 0,0005) o pVAX1/EC-TM-siRNA-IL10-2 (P < 0,0001).

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Costrutto di acido nucleico caratterizzato dal fatto di comprendere: (i) un primo inserto di acido nucleico consistente in una cassetta di espressione atta ad esprimere almeno un antigene immunogenico o proteina reporter, la cassetta comprendendo, operativamente collegate l’una all’altra, una o più sequenze di acido nucleico codificante/i l’almeno un antigene immunogenico o proteina reporter, un promotore per l’RNA polimerasi II e una sequenza di segnale di terminazione della trascrizione; e (ii) un secondo inserto di acido nucleico comprendente una sequenza atta a dare origine a un RNA interferente breve (siRNA) atto ad inibire l’espressione di un gene codificante per una citochina immunosoppressiva od altro fattore regolativo delle cellule presentanti l’antigene.
2. Costrutto di acido nucleico secondo la rivendicazione 1, ulteriormente caratterizzato dal fatto di comprendere (iii) un terzo inserto di acido nucleico comprendente una sequenza atta a dare origine a un microRNA (miRNA) atto a regolare verso il basso l’espressione di almeno un gene codificante per un’ulteriore citochina immunosoppressiva o fattore regolativo delle cellule presentanti l’antigene.
3. Costrutto di acido nucleico secondo la rivendicazione 2, in cui il terzo inserto di acido nucleico è clonato nel primo inserto di acido nucleico.
4. Costrutto di acido nucleico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in cui la cassetta di espressione è atta ad esprimere almeno un antigene immunogenico scelto fra antigeni tumorali, antigeni microbici e antigeni virali.
5. Costrutto di acido nucleico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, in cui la citochina immunosoppressiva od altro fattore regolativo delle cellule presentanti l’antigene è scelto dal gruppo che consiste di interleuchina 10 (IL-10), molecola regolatoria B7-H4, molecola TEM8, enzima indolamina 2,3-diossigenasi (IDO) ed enzima ciclossigenasi-2 (COX-2).
6. Costrutto di acido nucleico secondo la rivendicazione 5, in cui il promotore per la RNA polimerasi II è il promotore/enhancer del citomegalovirus (CMV).
7. Costrutto di acido nucleico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, in cui la cassetta di espressione comprende una sequenza polyA come segnale di terminazione della trascrizione.
8. Costrutto di acido nucleico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 7, in cui il secondo inserto di acido nucleico comprende una sequenza atta a dare origine a un RNA interferente breve (siRNA) situata a valle di un promotore per la RNA polimerasi III.
9. Costrutto di acido nucleico secondo la rivendicazione 8, in cui il promotore per la RNA polimerasi III è il promotore U6 o il promotore H1.
10. Costrutto di acido nucleico caratterizzato dal fatto di comprendere: (i) un primo inserto di acido nucleico comprendente una sequenza atta a dare origine a un RNA interferente breve (siRNA) atto ad inibire l’espressione di un gene codificante per una citochina immunosoppressiva od altro fattore regolativo delle cellule presentanti l’antigene; (ii) un secondo inserto di acido nucleico comprendente una sequenza atta a dare origine a un microRNA (miRNA) atto a regolare verso il basso l’espressione di almeno un gene codificante per un’ulteriore citochina immunosoppressiva o fattore regolativo delle cellule presentanti l’antigene; e opzionalmente (iii) un terzo inserto di acido nucleico consistente in una cassetta di espressione atta ad esprimere una proteina reporter, la cassetta comprendendo, operativamente collegate l’una all’altra, una o più sequenze di acido nucleico codificante la proteina reporter, un promotore per l’RNA polimerasi II e una sequenza di segnale di terminazione della trascrizione.
11. Costrutto di acido nucleico secondo la rivendicazione 10, in cui la citochina immunosoppressiva od altro fattore regolativo delle cellule presentanti l’antigene è scelto dal gruppo che consiste di interleuchina 10 (IL-10), molecola regolatoria B7-H4, molecola TEM8, enzima indolamina 2,3-diossigenasi (IDO) ed enzima ciclossigenasi-2 (COX-2).
12. Costrutto di acido nucleico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 11, che è clonato all’interno di un vettore.
13. Costrutto di acido nucleico secondo la rivendicazione 12, clonato all’interno di un vettore plasmidico comprendente un’origine di replicazione batterica e un gene per la resistenza ad un antibiotico.
14. Costrutto di acido nucleico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 13, per l’impiego come vaccino profilattico o terapeutico.
15. Composizione immunogenica o di vaccino comprendente una quantità efficace di almeno un costrutto di acido nucleico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 13 ed idonei eccipienti, veicoli e/o diluenti farmaceuticamente accettabili.
16. Composizione immunogenica o di vaccino, comprendente una quantità efficace di una combinazione di un costrutto di acido nucleico secondo la rivendicazione 1 e un costrutto di acido nucleico secondo la rivendicazione 10.
17. Composizione secondo la rivendicazione 16, in cui il costrutto di acido nucleico secondo la rivendicazione 1 è clonato all’interno di un primo vettore plasmidico e il costrutto di acido nucleico secondo la rivendicazione 10 è clonato all’interno di un secondo vettore plasmidico che è uguale o diverso dal primo vettore plasmidico.
18. Corredo di parti comprendente un costrutto di acido nucleico secondo la rivendicazione 1 e un costrutto di acido nucleico secondo la rivendicazione 10 come preparazione combinata per l’uso simultaneo, separato o sequenziale come vaccino profilattico o terapeutico.
19. Corredo di parti secondo la rivendicazione 17, in cui il costrutto di acido nucleico secondo la rivendicazione 1 è clonato all’interno di un primo vettore plasmidico e il costrutto di acido nucleico secondo la rivendicazione 10 è clonato all’interno di un secondo vettore plasmidico che è uguale o diverso dal primo vettore plasmidico.