ITRM980389A1

ITRM980389A1 - Formulazione disinfettante a base di cloro in soluzione alcolica

Info

Publication number: ITRM980389A1
Application number: IT98RM000389A
Authority: IT
Inventors: Hana Dannan; Federica Carninci; Antonello Russo
Original assignee: Eurospital S P A
Priority date: 1998-06-15
Filing date: 1998-06-15
Publication date: 1999-12-15
Also published as: AU4390699A; EP1087659A1; US20020045666A1; ATE236525T1; ES2196814T3; IT1299187B1; DE69906070D1; WO1999065305A1; DE69906070T2; US6462088B1; EP1087659B1; ITRM980389A0

Description

DESCRIZIONE

a corredo di una domanda di brevetto per invenzione avente per titolo: "Formulazione disinfettante a base di cloro in soluzione alcolica"

La presente invenzione concerne una formulazione disinfettante a base di cloro in soluzione alcolica. Più specificamente, l'invenzione riguarda un preparato germicida liquido contenente, come principi attivi, un’associazione di alcool con una N-cioroammina organica, che presenta un’elevata attività battericida e un'inaspettata stabilità nel tempo, mantenendo sostanzialmente inalterata la propria efficacia anche dopo una prolungata conservazione.

Come è noto, le proprietà battericide degli alcoli, conosciute da tempi remoti, sono state studiate scientificamente fin dall’inizio di questo secolo. Alcuni di tali prodotti, in primo luogo l’alcool etilico e l’alcool isopropilico, hanno raggiunto nel campo dei disinfettanti una notevolissima diffusione, anche in virtù dei vantaggi connessi con la loro solubilità in acqua, con la facilità di evaporazione e con la loro ridotta tossicità. In realtà, alcuni alcoli alifatici superiori risultano più potenti di quelli inferiori come antimicrobici, la massima efficacia essendo raggiunta dagli àlcoli con 6-8 atomi di carbonio; tuttavia, la bassa volatilità e l’odore sgradevole di tali composti ne hanno ridotto notevolmente l’impiego. Una certa limitata applicazione trovano anche alcuni alcoli aromatici, tra cui l'alcool benzilico e quello fenetilico, che soffrono comunque dell’inconveniente di una maggiore tossicità.

L'alcool etilico sviluppa la sua massima attività quando è in soluzione acquosa al 60-75% in peso, mentre soluzioni di concentrazione inferiore o anche superiore richiedono tempi più lunghi per esplicare gli stessi effetti germicidi. Entrambi gli alcoli a tre atomi di carbonio, n-propanolo e isopropanolo, mostrano attività superiore all’alcool etilico, con un livello massimo per concentrazioni intorno al 60% in peso. Nonostante la loro indubbia efficacia antibatterica, soto il profilo dello spettro d’azione gli alcoli alitatici presentano l’inconveniente di non avere alcuna azione distruttiva nei confronti degli organismi sporigeni.

Un altro prodotto il cui uso come disinfettante è consolidato sin dal secolo scorso è il cloro, che venne impiegato, in forma di cloruro di calce, per il trattamento delle acque reflue della città di Londra intorno alla metà del XIX secolo e, sempre negli stessi anni, fu utilizzato come disinfettante nella clinica del Dr. Semmelweis a Vienna, per combàttere la febbre puerperale. Sebbene il suo meccanismo d’azione non sia ancora perfettamente noto, si ritiene che il cloro esplichi la propria azione disinfettante liberando in acqua acido ipocloroso (HCIO), responsabile della distruzione dei microorganismi. Le concentrazioni di cloro attivo richieste per eliminare gran parte delle specie batteriche possono essere dell'ordine di 1 ppm, mentre concentrazioni superiori sono normalmente richieste per l’eliminazione di spore e micobatteri.

Nella pratica corrente, vengono genericamente indicati come disinfetanti a base di cloro tutti quelli che consistono in soluzioni acquose di cloro, ipoclorito o acido ipocloroso, e anche, in molti casi, altri composti organici o inorganici in grado di rilasciare cloro, come ad esempio le cloroammine (CINH2, CI2NH, CI3N), le N-clorosulfonammidi (ad es. la N-cloro-p-toluensolfonammide sale sodico o cloramina-T, e la N-clorobenzensolfonammide sale sodico o cloramina-B), gli acidi N-cloroisocianurici. Tali composti vengono concorrentemente impiegati anche per la loro azione di ossidanti chimici, che ne fanno i prodotti di più largo consumo per il trattamento di acque potabili, di acque per piscine e per impianti industriali alimentari.

In base a quanto precede, si può comprendere l’interesse nel formulare un disinfettante che contenga come principi attivi sia alcool che doro, e che possa quindi coniugare le attività antisettiche tipiche di queste due classi di composti, dando cosi un prodotto di migliorata potenza e con un più ampio spettro d’azione. Sebbene siano già noti numerosi disinfettanti in grado di combinare l’attività antibatterica degli alcoli con quella di altri agenti, quali lo iodio, i fenoli o la clorexidina, non risultano in commercio prodotti costituiti da associazioni di alcool con composti del cloro, e ciò in ragione della forte azione ossidante che il cloro esercita su tali composti organici, che sono notoriamente ossidabili con relativa facilità.

Come è noto, l’efficacia di un composto come ossidante è misurata da una parte da fattori termodinamici, in particolare dal suo potenziale di ossidazione standard, e dall’altra da fattori cinetici, che determinano la velocità della reazione di ossidazione. In effetti, benché in assenza di considerazioni sulla cinetica di reazione sia impossibile prevedere con esattezza le prestazioni di un sistema ossidante, una prima significativa indicazione è comunque contenuta nei valori dei potenziali di ossidazione. E sono appunto gli elevati valori del potenziale di ossidazione standard per la reazione di riduzione del cloro molecolare a ione cloruro e per quella di riduzione dell'acido ipocloroso a ione cloruro

rispettivamente pari a dare il più immediato indice della potenza degli, agenti a base di cloro come ossidanti (cfr. ad es. R. G. Rice e M. Gomez-Taylor, Environmental Health Perspectives, 69, 31-44, (1986)).

In effetti, è stato rilevato sperimentalmente (D. Coates e J. E. Death, Journal of Clinical Pathology, 31_, 148-152, (1978)) che miscele di vari alcoli o glicoli (metanolo, n-propanolo, isopropanolo, etanolo ed etandiolo) in soluzione acquosa a varie concentrazioni (dal 10 al 50% in peso) con ipoclorito di sodio ad un livello di cloro disponibile di 2000 ppm, pur esercitando un’interessante azione sporicida quando preparate di fresco, perdevano praticamente tutto il cloro disponibile in capo a poche ore. Per poter sfruttare la vantaggiosa attività biologica rilevata, pertanto, la pubblicazione citata suggerisce di conservare le soluzioni di alcool e di ipoclorito separate, e di miscelarle solo prima dell'uso.

Allo scopo di limitare per quanto possibile la reattività tra gli alcoli ed agenti disinfettanti a base di cloro si può pensare innanzitutto di impiegare in una possibile formulazione non l'ipoclorito di sodio, ma un composto ciorodonatore caratterizzato da un potenziale di ossidazione più basso, e che sia in grado di liberare il cloro molto più lentamente di quanto non avvenga con i comuni ipocloriti. Prodotti particolarmente adatti a tal fine risultano essere in generale le cloroammine, come può dedursi indicativamente dalla tabella che segue, che riporta i valori dei potenziali standard di ossidazione a 25°C in soluzione acquosa (secondo due diversi riferimenti bibliografici, a): R. G. Rice e M. Gomez-Taylor, loc. cit.; b): Ullmann's Encyclopedia of Industriai Chemistry, 5a ed., VCH Veriagsgesellschaft, A 28, 87 (1996)).

Pur non essendo potenti quanto il cloro, le cloroammine hanno il vantaggio di essere più stabili, perché meno rapidamente reattive. In acqua, esse si idrolizzano lentamente, generando acido ipocloroso secondo la reazione generale: in ragione del fatto che l'attività battericida di tali composti è dovuta alla liberazione di acido ipocloroso, il valore della costante di equilibrio di tale reazione viene utilizzato per esprimere l'efficacia delle cloroammine come disinfettanti. Dato che l'acido ipocloroso viene liberato gradualmente da questi composti, essi possono mantenere una capacità disinfettante attiva per periodi di tempo più lunghi rispetto agli ipocloriti.

Tra i possibili composti organici ed inorganici appartenenti alla famiglia delle cloroammine, la presente invenzione prende in considerazione due specifici agenti, già precedentemente menzionati, consistenti nei sali monosodici di due N-clorosolfonammidi, la N-cloro-ptoluensolfonammide sale sodico o cloramina-T,

e la N-clorobenzensolfonammide sale sodico o cloramina-B

entrambe già note come antisettici per uso topico e per la sterilizzazione dell’acqua, attivi contro un ampio spettro di microorganismi. Come per tutti gli altri disinfettanti a base di cloro, l’uso di tali agenti in formulazioni a base alcolica non era ritenuto commercialmente realizzabile secondo la pratica corrente, a causa della capacità ossidativa del cloro nei confronti degli alcoli.

Un’unica pubblicazione brevettale reperibile, il brevetto della ex Repubblica Democratica tedesca No. 2255, del 1943, descrive formulazioni antisettiche in cui sembrano coesistere una clorosolfonammide ed alcoli alifatici, ma si tratta di preparati in cui è presente, con funzione di colorante, un composto organico fortemente ossidabile, ad esempio il giallo naftolo S o il 2,4,4-trinitrofenolo sale sodico, il quale verrebbe protetto dall'ossidazione ad opera della cloramina, secondo il documento, dalla presenza dell’alcool. Dalle prove di confronto presentate nel brevetto, una soluzione di colorante giallo naftolo e cloraminaT in acqua distillata riscaldata a 40°C si deteriora rapidamente, come si evidenzia dal forte odore che si sprigiona da essa, mentre un'analoga soluzione in cui sia presente alcool etilico al 50% in volume non subisce variazioni di odore apprezzabili. Se poi la temperatura viene mantenuta a 50°C per 16 ore, il tenore di doro attivo nella soluzione di colorante e cloramina-T in acqua si riduce del 92% in peso, mentre il tenore di cloro attivo nella soluzione al 50% in alcool si riduce soltanto del 4,5% in peso. Una tale riduzione è comunque troppo forte perché un prodotto disinfettante possa essere considerato stabile secondo gli standard attuali. Inoltre, il documento non fornisce alcuna specifica indicazione che possa essere utilizzata per ottenere in generale soluzioni alcoliche di cloramina T o B di qualunque concentrazione desiderata che siano stabili per periodi di tempo molto lunghi, ma sembra suggerire che qualsiasi formulazione a base di N-clorosolfonammide e colorante, mescolata con alcoli, possa comportarsi come una soluzione stabile (nei limiti deducibili dall’esempio citato).

È stato invece trovato, secondo la presente invenzione, che una soluzione idroalcolica di cloramina-B o di cloramina-T può mantenersi stabile per tempi dell’ordine di diversi mesi, perdendo quote di cloro attivo dell'ordine di poche unità percentuali, a condizione che il pH della soluzione venga mantenuto superiore ad 8,5, e preferibilmente, superiore a 9,5. L'influenza critica del pH può trovare una spiegazione se si considera che le cioramine B e T, essendo degli elettroliti forti, si dissociano facilmente in soluzione acquosa, portando alla corrispondente forma anionica:

(in cui X può essere un atomo di idrogeno o il gruppo -CH3). Visto il carattere spiccatamente basico di tale specie, ci si aspetta che l’attacco di protoni eventualmente presenti in soluzione avvenga con estrema facilità tramite un equilibrio acido-base. Considerando che la specie attiva nella reazione di ossidazione degli alcoli è verosimilmente quella protonata, si può comprendere come il pH possa esercitare una notevole influenza su detta reazione, sfavorendola quanto più bassa è la concentrazione di protoni.

A titolo di verifica sperimentale delle ipotesi formulate nell’ambito dell’invenzione, si riporta nella seguente tabella il valore percentuale di cloro disponibile misurato in una soluzione acquosa ai 60% in peso di isopropanolo, contenente 10 g/l di cloramina-B (equivalenti a 2500 ppm di cloro attivo) e vari tamponi fosfato a seconda dei pH desiderato, mantenuta a 40°C per 4 settimane.

I ciati riportati nella tabella mostrano come oltre un limite di pH prossimo a 8,5 la stabilità del cloro in funzione del tempo aumenti drasticamente. Al di sopra di questo limite, la reazione di ossidoriduzione della cloramina con l’alcool sembra procedere con estrema lentezza, lasciando praticamente inalterata la concentrazione di cloro disponibile.

Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione una formulazione disinfettante a base di cloro in soluzione alcolica comprendente, in acqua, cloramina-T o cloramina-B come sopra definite e uno o più alcoli alifatici con fino a 12 atomi di carbonio, detta soluzione avente un pH non inferiore ad 8,5. Preferibilmente, tale valore desiderato del pH viene mantenuto nella formulazione mediante un apposito tampone.

Per poter esplicare il livello di attività germicida normalmente richiesto ad un prodotto disinfettante, la formulazione secondo l'invenzione contiene detta doramina-T o cloramina-B in concentrazione corrispondente a 1000-2500 ppm di cloro disponibile, la concentrazione ottimale essendo intorno a 1100-1150 ppm di cloro disponibile. A titolo di esempio, una composizione secondo l'invenzione contenente lo 0,5% in peso di cloramina-T ha un tenore di circa 1120 ppm di cloro attivo.

Preferibilmente, gli alcoli alifatici sono scelti tra alcool etilico, alcool n-propilico e alcool isopropilico, e sono presenti in concentrazione complessiva compresa tra il 40 e il 70% in peso. Si è rilevato sperimentalmente che la stabilità del cloro nelle soluzioni secondo l’invenzione, misurata dalla percentuale di cloro disponibile rispetto alla concentrazione iniziale dopo conservazione ad una temperatura prefissata per un determinato periodo di tempo, è leggermente superiore per le soluzioni con alcool isopropilico rispetto a quelle con alcool etilico. Questo dato, assieme al fatto che, come già notato, l'attività battericida dell’isopropanolo è superiore a quella dell’etanolo, porta a preferire il primo per le formulazioni disinfettanti dell'invenzione.

Oltre a possedere un elevato potere disinfettante nei confronti di un ampio spettro di microorganismi e, inoltre, un'apprezzabile attività sporicida, il preparato proposto ha anche la proprietà di rimuovere la colla dei ceroti, una prestazione di notevole importanza per il suo impiego negli ambulatori, nei centri di prelievo e nei reparti di degenza ospedalieri, e che non è ottenibile nei disinfettanti a base alcolica. Tale proprietà è garantita nelle forme di realizzazione preferite dell’invenzione dalla presenza nella composizione del tampone borato, il quale da una parte assolve alla funzione di mantenere il pH elevato (avendo il sistema H3BO3/H2BO3' un pK a 25°C intorno a 9,2, e quindi un pH di tamponamento compreso tra 8 e 10) e, dall’altra, facilita l’eliminazione dell'adesivo dei cerotti. È infatti noto che lo ione borato è in grado di rimuovere i residui delle colle a base di gomma comunemente impiegate in medicazioni adesive e cerotti.

L'inclusione del sistema acido borico/idrossido di sodio nella formulazione disinfettante secondo l'invenzione consegue anche il vantaggio di aggiungere le due funzioni sopra riferite senza interferire in alcun modo con il sistema cloramina - alcool né minarne la stabilità.

In effetti, le prove di confronto hanno evidenziato che tra gli altri possibili agenti in grado di dare una buona rimozione della colla, come ad esempio l’alcool benzilico e il diclorometano, il tampone borato è quello in grado di garantire la maggior stabilità del cloro. Il diclorometano, inoltre, presenterebbe inaccettabili problemi di tossicità per un prodotto disinfettante per uso topico come quello proposto.

Il campo di concentrazioni del tampone borato che permette di ottenere la massima stabilità è piuttosto limitato, a causa della possibilità di precipitazione del sodio borato. Questa può avvenire, in particolare, alle basse temperature e in eccesso di ioni sodio. In modo specifico, le concentrazioni ponderali ottimali dei componenti del tampone borato nella formulazione dell’invenzione sono le seguenti:

acido borico 0,153-0,155%

sodio idrossido 0,0396-0,064%.

Alcune forme di realizzazione particolarmente vantaggiose dell'invenzione hanno pertanto i seguenti parametri:

cloramina-T o cloramina-B 1000-2500 ppm di cloro disponibile alcool etilico o isopropilico 50-60% in peso

pH > 8,5.

acido borico 0,153-0,155% in peso

sodio idrossido 0,0396-0,064% in peso

acqua q.b. a 100%.

Preferibilmente, la cloramina è cloramina-T, in concentrazione pari a 1100-1150 ppm di cloro disponibile, e l'alcool è isopropanolo, al 50% in peso. Il pH di tali formulazioni preferite è compreso tra 10,4 e 10,8. Per garantire la massima stabilità del cloro nell'immagazzinamento del preparato per tempi non inferiori a parecchi mesi, è consigliabile confezionare il prodotto in contenitori opachi alla luce, preferibilmente scuri, per evitare che l'ossidazione dell’alcool venga catalizzata dalla radiazione elettromagnetica.

Alcune forme di realizzazione specifiche dell’invenzione verranno descritte a scopo meramente esemplificativo nel seguito, assieme ai risultati delie sperimentazioni effettuate su di esse.

ESEMPIO

Produzione di un preparato disinfettante a base di cloro in alcool La produzione di una formulazione preferita secondo l’invenzione viene effettuata ottenendo in primo luogo una soluzione di tampone in acqua e alcool isopropilico secondo la seguente procedura: 1. si pesano 21,71 g di idrossido di sodio (riducendone le dimensioni in mortaio) in 2 kg di acqua depurata e si controlla l'avvenuta dissoluzione (soluzione 1 );

2. si pesano 107,12 g di acido borico, si sciolgono in 5 kg di acqua depurata a 40-45°C e si controlla l’avvenuta dissoluzione (soluzione 2);

3. si unisce la soluzione 1 alla soluzione 2, si aggiungono 27,51 kg di acqua depurata e si mescola;

4. alla soluzione ottenuta si aggiungono gradualmente 35 kg di alcool isopropilico, mescolando.

La preparazione di flaconi di disinfettante da 900 mi a partire da cloramina-T e da un lotto di soluzione idroalcolica ottenuta come sopra avviene secondo la seguente procedura:

5. si dosano 900 g del liquido ottenuto dall’operazione 4 in ciascun flacone in materiale plastico o vetro marrone scuro;

6. si uniscono nel flacone 4,5 g di cloramina-T, chiudendo lo stesso con un tappo.

Il preparato così ottenuto può essere conservato a temperatura ambiente per almeno undici mesi senza subire apprezzabili perdite in cloro attivo. Nel caso si desideri, ottenere un prodotto commerciale con scadenza di diversi anni, si può confezionare il flacone con un apposito tappo dosatore nel quale il quantitativo prestabilito di cloramina sia tenuto separato dalla soluzione idroalcolica. Al momento dell’apertura del flacone, agendo sul tappo dosatore si provoca il mescolamento dei due componenti, ottenendo la formulazione finale che può comunque essere conservata allo stato miscelato per almeno sei mesi.

Prove di stabilità

Con il preparato così ottenuto, avente la seguente composizione ponderale:

cloramina-T 0,5% (1120 ppm di cloro attivo) alcool isopropilico 50%

acido borico 0,153%

sodio idrossido 0,0396%

acqua depurata q.b. a 100%

avente un pH pari a 10,8, e confezionato come sopra descritto, sono state effettuate prove di stabilità a temperatura ambiente, al fine di verificare la conservabilità del prodotto senza apprezzabili alterazioni per almeno undici mesi. I risultati di tali prove sono riportati nella seguente tabella.

È evidente dai dati che precedono che il preparato secondo l'invenzione presenta una stabilità ottimale nonostante la coesistenza del composto a base di cloro con l'alcool, non perdendo apprezzabilmente in tenore di cloro attivo anche dopo parecchi mesi di conservazione.

Allo scopo di verificare la stabilità del preparato nelle stesse condizioni sperimentali descritte nel brevetto DD 2255, precedentemente citato in relazione alla tecnica anteriore, è stata anche misurata la quantità di cloro attivo presente nello stesso dopo esposizione ad una temperatura di 50°C per diverse ore, ottenendo i risultati mostrati nella tabella seguente.

Considerando che il documénto di tecnica anteriore citato riporta (indicandola come soddisfacente) una quantità di doro attivo del 95,5% dopo 16 ore (perdita del 4,5%) si può comprendere il vantaggio apportato dalla formulazione secondo l'invenzione.

Prove di attività

1. Attività battericida intrinseca

Allo scopo di verificare l'attività del prodotto antisettico dell'invenzione, lo stesso preparato dell'Esempio è stato sottoposto ad una serie di prove in vitro a varie concentrazioni, utilizzando come microrganismi di prova un ceppo di Staphylococcus aureus, l'ATCC 6538, e un ceppo di Pseudomonas aeruginosa, l’ATCC 15442. Entrambi i ceppi sono stati fomiti dall'American Type Culture Collection (Maryland, USA).

Prima dell'uso i ceppi batterici, che erano stati mantenuti congelati, sono stati trapiantati su slants di Tryptone Soya Agar (TSA, Merck) e conservati in frigorifero a 4°C ± 1 °C. Al momento della preparazione, sono stati trapiantati tre volte di seguito su slants di TSA e incubati a 37°C ± 2°C per 18 ore, e due ore prima del test la coltura finale è stata sospesa in diluente usando 5 g di palline di vetro, e la sospensione è stata diluita fino ad ottenere una conta di circa 1,5 - 5 108 unità formanti colonie per mi di sospensione (cfu/ml). Il diluente utilizzato conteneva 1,0 g di peptone di carne e 8,5 g di NaCI in q.b. a 1000 mi di acqua distillata. Per effettuare il conteggio delle sospensioni batteriche in prova sono state preparate diluizioni 10-6 e 10'7 nel diluente citato, e da ognuna di esse è stato prelevato in doppio 1 mi, trasferendolo in piastre Petri, in 15 mi di TSA. Dopo incubazione delle piastre per 24 ore a 37°C ± 2°C si è proceduto alla conta delle colonie, e il numero di unità formanti colonie per mi è stato calcolato secondo la seguente formula: cfu/ml = C / (n . V . d), in cui C è la somma delle colonie contate su entrambe le piastre, n = 2 è il numero delle piastre, V è il volume della sospensione batterica posta in ciascuna piastra e d è il fattore di diluizione corrispondente alla diluizione effettuata. Il valore così ottenuto, indicato con N, rappresenta la conta batterica della sospensione di partenza.

Le prove di attività battericida, effettuate in accordo con la norma CEN/TC 216 PrEN 1040 del settembre 1996, consistevano nel porre in contatto le colture batteriche preparate come sopra con il prodotto in prova, a 20°C ± 2°C e per un tempo di contatto prefissato pari a 5 minuti, e nel verificare la riduzione della vitalità nelle colture conseguente all'azione del prodotto. Sulla base di prove preliminari è stato scelto come neutralizzante (per inattivare l'azione del disinfettante dopo il tempo di contatto stabilito) il tiosolfato di sodio allo 0,5% in peso. Il prodotto secondo l’invenzione è stato provato a varie concentrazioni ponderali effettive, risultanti dalla diluizione con acqua distillata. La concentrazione del prodotto di partenza era pari a 1 ,25 volte la concentrazione di prova effettiva.

In ciascun saggio il campione in prova (alla concentrazione di partenza), le sospensioni batteriche ed il neutralizzante sono stati preventivamente stabilizzati alla temperatura di 20°C ± 2°C, e 8 mi di ciascun campione in prova sono stati trasferiti in una provetta sterile e addizionati con 1 mi di sospensione batterica preparata come sopra. Trascorso il periodo di tempo di contatto prefissato (5 min.) il prodotto è stato inattivato trasferendone 1. ml in una provetta contenente 8 mi di neutralizzante e 1 mi di acqua distillata, ed agitando accuratamente. Trascorso il periodo di neutralizzazione (5 min. ± 10 sec.) sulla miscela neutralizzata è stato determinato in doppio il numero di microrganismi sopravvissuti mediante conteggio per inclusione in agar, incubando le piastre per 24 ore a 37°C ± 2“C ed effettuando il conteggio delle unità formanti colonie nello stesso modo descritto sopra per il conteggio del valore di cfu/ml delle sospensioni batteriche di partenza. Il valore numerico così ottenuto, indicato con Na, rappresenta la conta batterica in una sospensione esposta per 5 min. al prodotto in prova, effettuata però su una sospensione batterica 10 volte più diluita di quella di partenza. Pertanto, il calcolo della riduzione della vitalità batterica conseguente al contatto con il prodotto in prova può farsi applicando la seguente formula: riduzione della vitalità = N . 10-1 / Na.

La seguente tabella 4 riporta i risultati delle prove così eseguite per due diverse concentrazioni effettive di prodotto (pari all'80% e al 50% in peso rispettivamente) sia in termini di conta batterica (valori di N e Na) che in termini di riduzione della vitalità batterica. Nel conteggio delle cfu, è stato assegnato convenzionalmente il valore > 3,0 . 103 quando il numero di unità formanti colonie è maggiore di 300 in entrambe le piastre. Sulla base della norma sopra menzionata, il prodotto è considera.o in possesso di un'attività battericida se, nelle condizioni del saggio, la riduzione della vitalità batterica rilevata è pari ad un fattore almeno 105.

Come si può rilevare dai dati che precedono, il prodotto secondo l'invenzione risulta dotato di attività battericida intrinseca ad una diluizione dell'80% in peso rispetto alla formulazione come prodotta nell'Esempio.

2. Attività battericida nelle condizioni d'impiego per le mani

Prove analoghe alle precedenti sono state effettuate secondo la norma CEN prEN 12054 del luglio 1995 relativa al trattamento preoperatorio delle mani (surgical handrub), utilizzando i ceppi Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Enterococcus faecium ATCC 10541 e Escherichia coli K12 NCTC 10538, tutti forniti daH'American Type Culture Collection (Maryland, USA).

La preparazione delle sospensioni batteriche di partenza e il calcolo del numero di unità formanti colonie in dette sospensioni batteriche (N) erano gli stessi della prova precedente, con la sola differenza che la conta batterica delle sospensioni iniziali era di 1 - 3 · 108 cfu/ml circa. Anche la scelta del neutralizzante e la temperatura di esecuzione della prova (20°C ± 2°C) erano le stesse della prova precedente, ma la concentrazione effettiva di prodotto utilizzata era del 90% in peso, e le misure venivano effettuate per due diversi tempi di contatto: 2 minuti e 5 minuti.

Per ogni ceppo batterico è stata allestita una provetta contenente 9 mi di prodotto in prova e 1 mi di sospensione batterica, e al termine di ogni tempo di contatto 1 mi della miscela è stato trasferito in una provetta contente 8 mi di neutralizzante e 1 mi di acqua distillata. Dopo 5 minuti di neutralizzazione la miscela è stata vortexata ed è stato effettuato il conteggio in doppio con le stesse modalità della prova precedente, ottenendo i valori di cfu/ml dopo esposizione al prodotto (Na) per i tempi prestabiliti. Nel conteggio delle cfu, è stato assegnato convenzionalmente il valore < 3,0 · 102 quando il numero di unità formanti colonie è risultato minore di 300 in entrambe le piastre. In questo caso il materiale in esame è considerato battericida quando per ogni ceppo batterico esso causa una riduzione della conta batterica da 1 - 3 · 108 cfu/ml a non più di 3 · 102 cfu/ml dopo 5 minuti di contatto.

Come si nota dai dati della tabella, il prodotto secondo l'invenzione è risultato in possesso della desiderata attività battericida anche dopo un tempo di esposizione di soli 3 minuti.

3. Prova pratica di attività battericida sulle mani - confronto con isopropanolo ai 60%

Utilizzando un ceppo di Escherichia coli K12 NCTC 10538 acquisito presso il Centro Sieroterapico di Milano sono state condotte alcune prove per verificare l’attività antisettica e igienizzante del prodoto dell’Esempio nelle normali condizioni di impiego per il lavaggio delle mani. Per la prova sono stati utilizzati 12 volontari di entrambi i sessi, selezionati in base allo stato perfettamente indenne della cute, al buono stato di salute generale e all'assenza di patologie in atto e di trattamenti farmacologici in corso.

L’Escherichia coli è stato coltivato in due provette contenti 5 mi di TSB (Tryptone Soya Broth, Merck) per 24 ore a 37°C ± 2°C e le colture sono state inoculate in due bottiglie contenenti 1 I di TSB ognuna e incubate per 24 ore a 37°C ± 2°C. Questo liquido contaminante contiene circa 2 · 108 - 2 · 109 cfu/ml, il numero di colonie essendo stato determinato effettuando il conteggio in doppio per inclusione in agar, incubando le piastre a 37°C ± 1 °C per 24 ore.

All’inizio della prova, tutti i volontari hanno lavato le mani con un sapone a base di olio di lino per rimuovere lo sporco naturalmente presente, e le hanno poi asciugate con asciugamani di carta monouso. Hanno quindi immerso i polpastrelli di entrambe le mani nella sospensione di batteri per 5 secondi e le hanno quindi fatte asciugare all'aria per 3 minuti. Immediatamente dopo l’asciugatura i volontari hanno immerso per 1 minuto i polpastrelli contaminati delle due mani rispettivamente in due piastre Petri contenenti 10 mi di TSB, in modo da determinare il numero di microrganismi rilasciato prima del trattamento. Dal fluido così ottenuto sono state preparate diluizioni decimali 10‘3 - 1C-4 e per ogni diluizione 0,1 mi sono stati spatolati sulla superficie di piastre Petri contenti TSA usando palline di vetro. Le piastre sono state quindi incubate a 37°C ± 2°C per 24 ore, ed è stato contato in numero di colonie per ogni diluizione, calcolandone la media aritmetica. Il numero di colonie contato è stato trasformato in logaritmo decimale, ed è stato denominato Log x (valori di contaminazione basali).

Immediatamente dopo la determinazione dei valori iniziali, e senza ricontaminazione delle mani, 6 dei 12 volontari sono stati trattati con una soluzione di confronto di alcool isopropilico al 60% v/v e gli altri 6 con la soluzione dell' invenzione. I primi 6 hanno lavato entrambe le mani con 3 mi di isopropanolo per 30 secondi ed hanno poi ripetuto l’operazione con altri 3 mi di alcool per 60 secondi. Hanno infine sciacquato le mani per 5 secondi sotto acqua corrente. Gli altri 6 volontari hanno utilizzatori una garza imbevuta con 4 mi del prodotto in prova, detergendo la mani per 1 minuto, ed hanno quindi lasciato asciugare le mani al’aria per 2 minuti.

I volontari di entrambi i gruppi hanno poi immerso per 1 minuto i polpastrelli delle due mani rispettivamente in due piastre Petri, ed è stata ripetuta la stessa procedura sopra riportata per la determinazione del numero di colonie batteriche originate. I valori dei logaritmi decimali così ottenuti sono indicati come Log y (valori post-trattamento). I valori logaritmici di riduzione della conta batterica da quella basale a quella post-trattamento sono indicati come Log z.

In una seconda fase della prova l'intera procedura è stata ripetuta con gli stessi volontari, che però hanno utilizzato i prodotto a confronto in modo incrociato. Pertanto, per ciascun soggetto la seguente tabella 6 riporta sia i valori relativi al trattamento con isopropanolo che quelli relativi al trattamento con il preparato dell'invenzione.

È evidente dai risultati che precedono che la formulazione di cloramina-T in soluzione di alcool isopropilico al 50% secondo l’invenzione ha un’efficacia antisetica notevolmente superiore a quella del prodotto disinfetante di confronto, l’alcool isopropilico al 60%.

Prove di irritazione cutanea

Allo scopo di verificare la tollerabilità cutanea del prodotto dell’Esempio è stato eseguito un test su 3 conigli albini New Zealand maschi del peso di 2, 5-3, 5 kg, i quali sono stati selezionati a caso tra un certo numero di animali che erano stati preventivamente tenuti in quarantena per una settimana e poi sotoposti, prima della prova, ad un accurato esame per verificare la loro idoneità allo studio. Il dorso e i fianchi degli gli animali sono stati rasati 24 ore prima dell’inizio della prova, su un'area di circa 240 cm2, e un’area di circa 20 cm2 sul fianco destro è stata utilizzata per l'applicazione del campione di saggio, mentre la zona sinistra, non trattata, è servita da controllo. 0,5 mi del prodotto sono stati applicati mediante un quadrato di garza direttamente sulla cute e la garza è stata fissata con un cerotto. Il quadrato è stato fissato ulteriormente con un nastro adesivo ipoallergenico occlusivo e l’intero tronco dell’animale è stato protetto da una fasciatura elastica.

Circa 4 ore dopo l’applicazione, le fasciature e gli adesivi sono stati rimossi e la cute è stata detersa dall'eccesso del campione; le reazioni cutanee degli animali sono state valutate un'ora dopo la rimozione delle garze. Per la valutazione delle reazioni cutanee erano state stabilite le seguenti scale di punteggi:

Eritema e formazione di escare: 0 = assenza di eritema; 1 = eritema leggero (appena visibile); 2 = eritema ben visibile; 3 = eritema da moderato a grave; 4 = eritema grave (rosso barbabietola) o formazione di un'escara (danni in profondità).

Formazione di edema: 0 = assenza di edema; 1 = edema molto leggero (appena visibile); 2 = edema leggero (contorni ben definiti della tumefazione); 3 = edema moderato (bordi sollevati di circa 1 mm); 4 = edema forte (bordi sollevati più di 1 mm, tumefazione estesa oltre l'area di applicazione).

I valori delle reazioni cutanee rilevati in ciascuno dei tre conigli a 60 minuti, 24 ore, 48 ore e 72 ore dalla rimozione delle garze con il prodotto in prova, determinati con le scale di punteggi di cui sopra, sono stati sempre pari a 0, indicando una totale assenza di qualsiasi manifestazione eritematosa e/o edematosa.

La presente invenzione è stata descritta con riferimento particolare ad alcune sue forme di realizzazione specifiche, ma è da intendersi che variazioni e modifiche potranno essere ad essa apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Formulazione disinfettante a base di cloro in soluzione alcolica comprendente, in acqua, cloramina-T o cloramina-B e uno o più alcoli alitatici con fino a 12 atomi di carbonio, avente un pH non inferiore ad 8,5.
2. Formulazione secondo la rivendicazione 1 comprendente, inoltre, un tampone atto a mantenere il pH ad un valore non inferiore ad 8,5.
3. Formulazione secondo le rivendicazioni 1 o 2, in cui detta cloramina-T o cloramina-B è presente in concentrazione corrispondente a 1000-2500 ppm di cloro disponibile.
4. Formulazione secondo ognuna delle le rivendicazioni 1-3, in cui detti uno o più alcoli alitatici sono scelti tra alcool etilico, alcool npropilico e alcool isopropilico.
5. Formulazione secondo la rivendicazione 4, in cui detti alcool etilico e/o propilico sono presenti in concentrazione complessiva compresa tra il 40 e il 70% in peso.
6. Formulazione secondo ognuna delle le rivendicazioni 2-5, in cui detto tampone è tampone borato.
7. Formulazione secondo la rivendicazione 6, avente i seguenti parametri: cloramina-T o cloramina-B 1000-2500 ppm di cloro disponibile alcool etilico o isopropilico 50-60% in peso PH > 8,5. acido borico 0,153-0,155% in peso sodio idróssido 0,0396-0,064% in peso acqua q.b. a 100%.
8. Formulazione secondo la rivendicazione 7, in cui detta cloraramina è cloramina-T.
9. Formulazione secondo la rivendicazione 8, in cui la concentrazione di detta cloramina-T è pari a 1100-1150 ppm di cloro disponibile.
10. Formulazione secondo ognuna delle rivendicazioni 7-9, in cui detto alcool è alcool isopropilico.
11. Formulazione secondo la rivendicazione 10 in cui la concentrazione di detto alcool isopropilico è il 50% in peso.
12. Formulazione secondo ognuna delle rivendicazioni 7-11, in cui detto pH è compreso tra 10,4 e 10,8.
13. Formulazione disinfettante a base di cloro in soluzione alcolica secondo le rivendicazioni 1-12, sostanzialmente come sopra descritta