ITRM20100435A1 - Zeoliti ad azione neuroprotettiva - Google Patents
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Description
"Zeoliti ad azione neuroprotettiva"
Campo dell’invenzione
La presente invenzione si riferisce a zeoliti ad azione neuro protettiva. In particolare l'invenzione riguarda una zeolite clinoptilolite attivata caratterizzata da un’elevata attività antiossidante nei mitocondri e neuro protettiva, in grado quindi di portare beneficio in quelle neuropatologie nelle quali la produzione di ROS gioca un ruolo rilevante quali la demenza di Alzeimer o la malattia di Parkinson.
Arte nota
Le specie reattive dell'ossigeno (ROS, reactive oxigen species), come H2O2, e i radicali OH• e O2•, svolgono importanti funzioni fisiologiche (es. macrofagi) ma possono anche causare un vasto danno cellulare, il cosiddetto stress ossidativo, un disequilibrio tra la produzione di ROS e le capacità di difesa antiossidante della cellula che può colpire: lipidi, proteine, carboidrati e DNA. Questo fenomeno à ̈ stato associato strettamente ad una serie di patologie umane come malattie cardiovascolari, diabete, cancro e malattie neurodegenerative.
Le zeoliti comprendono circa 150 tipi diversi di composti di origine naturale o sintetica con strutture e caratteristiche chimicofisiche diverse fra loro. Chimicamente le zeoliti sono dei silicoalluminati di sodio, potassio, calcio o magnesio.
Le zeoliti sono sostanze cristalline la cui struttura à ̈ caratterizzata da un reticolo costituito da tetraedri legati tra loro con ponti ossigeno. Il reticolo cristallino contiene spazi vuoti in forma di gabbie e canali, questi ultimi occupati solitamente da molecole di H2O e altri cationi, che possono essere scambiati. I canali sono sufficientemente larghi da permettere il passaggio di molecole ospiti. Le fasi ricche d'acqua possono disidratare; la disidratazione avviene solitamente a temperature al di sotto dei 400°C, ed à ̈ largamente reversibile.
La zeolite clinoptilolite à ̈ di origine vulcanica, à ̈ molto stabile rispetto agli altri tipi di zeolite ed à ̈ particolarmente adatta per applicazioni in campo farmaceutico. Essa ha una struttura cristallina costituita da due tetraedri di SiO4ed AlO4legati mediante ponti ossigeno che genera spazi liberi e canali nei quali possono essere accolti cationi e molecole anche relativamente grandi. Le cariche negative delle unità alluminato e silicato sono neutralizzate dalla presenza di cationi quali protoni, calcio, magnesio, sodio, potassio. Questi ioni possono essere sostituiti da altri cationi, quali metalli pesanti o ione ammonio. Tale possibilità viene definita capacità di scambio cationico e rappresenta una delle caratteristiche preminenti della Clinoptilolite.
Le zeoliti vengono utilizzate per numerose applicazioni tecniche e farmaceutiche legate alle loro caratteristiche chimicofisiche quali la capacità di scambio cationico, di adsorbimento, di setaccio molecolare ed infine di supporto per catalizzatori utilizzabili in reazioni organiche.
Un’applicazione farmaceutica della zeolite clinoptilolite con dimensioni di 0,5 µm à ̈ stata messa a punto da T. Lelas in EP 1316530, ottenuta mediante un particolare processo di micronizzazione. I rischi derivanti dall’assorbimento di tali particelle così piccole nel tratto gastro-intestinale sono stati evidenziati di recente da H. Danz et al. in US 2009/0226492, che hanno realizzato una zeolite clinoptilolite micronizzata da usare in campo farmaceutico adatta per assorbire metalli pesanti e caratterizzata da dimensioni comprese fra 6 e 9 µm.
Una modificazione del sistema di micronizzazione messa a punto da A. Lelas in WO 2009/133413 ha portato all’ottenimento di una zeolite clinoptilolite ad alta mesoporosità e dimensioni delle particelle ancora più piccole, comprese fra 100 nm e 2 µm con rapporti Si/Al indicativi di una zeolite ricca in silicati. Tale procedimento ha lo scopo di innalzare la capacità delle particelle di legare tossine, metalli, batteri, e virus che entrano, attraverso il tratto gastro-intestinale, la pelle e le mucose, nell’organismo animale ed umano, disintossicandolo.
Secondo gli inventori, particelle di dimensioni così ridotte incrementano il rischio del loro assorbimento nel tratto gastrointestinale con possibili danni alla funzionalità cellulare ed inoltre si possono verificare interazioni fra le particelle che, secondo quanto riportato da A. Lelas, hanno la capacità di legare molecole di maggiori dimensioni oltre a strutture molto grandi quali batteri e virus, con il rischio conseguente di poter legare stabilmente anche proteine, oligoelementi essenziali, ed eventuali farmaci associati alla zeolite con innegabili rischi per la salute dovuti al fatto che l'organismo viene privato non solo delle molecole potenzialmente dannose ma anche di composti indispensabili alla sua funzionalità .
Inoltre, la purificazione della zeolite effettuata da Lelas in WO 2009/133413 in ambiente acido comporta una complicazione il cui vantaggio à ̈ dubbio in quanto le impurezze generalmente presenti in quella naturale sono bassissime ed inoltre non vengono cedute neanche nell’ambiente acido gastrico. Infine, tenendo conto della scala della capacità di scambio cationico, sorge qualche dubbio circa la possibilità di un rapido scambio dei sali di ammonio o di calcio con altri cationi per ottenere sali con un’unica specie chimica, con conseguenti limitazioni nella loro applicazione rispetto a quella naturale contenente cationi più facilmente scambiabili. Infatti la stabilità dell’interazione elettrostatica tra i cationi e le cariche negative della zeolite potrebbe rallentare e/o limitare la capacità di scambio cationico, come evidenziato dal test esemplificativo della Ca-MC (sale di calcio della zeolite) con il mercurio nel quale sono state utilizzate concentrazioni molto basse (60 ppb) che non vengono totalmente adsorbite da 1 g di zeolite a pH 8,1. Al contrario à ̈ stato verificato che la zeolite clinoptilolite oggetto della presente invenzione à ̈ in grado di adsorbire 6 mg per 1 g di zeolite a pH 7, una quantità circa 100 volte maggiore.
A conoscenza degli inventori non sono state studiate applicazioni delle zeoliti per contrastare l'azione dei ROS, in particolare a livello mitocondriale e con effetto neuro protettivo.
Sommario dell'Invenzione
È stato ora trovato e costituisce oggetto della presente invenzione un metodo per ottenere una zeolite particolarmente efficace in campo medico, soprattutto nel contrastare i radicali liberi (ROS) che non presenta gli inconvenienti dei prodotti noti.
L'invenzione si riferisce in particolare alla zeolite clinoptilolite.
La zeolite dell'invenzione à ̈ una zeolite disidratata, micronizzata e attivata caratterizzata da una distribuzione bimodale di particelle, come appresso descritto, in grado di svolgere in particolare un’azione neuro protettiva a livello mitocondriale attraverso un meccanismo di diminuzione dello stress ossidativo, essendo in grado di legare, oltre ai metalli pesanti e ione ammonio, anche tossine e radicali liberi.
Il processo per ottenere la zeolite dell'invenzione à ̈ caratterizzato da uno stadio di riscaldamento della zeolite ad una temperatura preferibilmente superiore a 400°C e da una successiva micronizzazione e attivazione in uno o più stadi fino a raggiungere una dimensione delle particelle nell'intervallo 1-60 Î1⁄4m e potenziale ζ negativo.
Ulteriori oggetti risulteranno evidenti dalla descrizione dettagliata dell'invenzione che segue.
Breve descrizione delle figure
La Figura 1 Ã ̈ un grafico NMR della ZCD contenente gli andamenti globali dei tre campioni A, B e C saggiati;
la Figura 2 Ã ̈ un grafico NMR della ZCD non attivata, campione A;
la Figura 3 Ã ̈ un grafico NMR della ZCD attivata una volte, campione B;
la Figura 4 Ã ̈ un grafico NMR della ZCD attivata due volte, campione C;
la Figura 5 riporta la produzione di ROS (Reactive Oxigen Species) nei mitocondri di cellule SHSY-SY pretrattate con Zeolite attivata una volta, campione B;
la Figura 6 riporta la produzione di ROS (Reactive Oxigen Species) nei mitocondri di cellule SHSY-SY pretrattate con Zeolite attivata due volte, campione C;
la Figura 7 riporta l’effetto neuroprotettivo dei diversi tipi di Zeolite in cellule neuronali SHSY-SY dopo esposizione a H2O2. Le cellule sono state trattate con differenti concentrazioni di Zeolite 24 ore prima dell’esposizione a H2O2;
la Figura 8 riporta l’effetto della deidratazione sulla neuro protezione indotta da Zeolite attivata una sola volta, camp A e corrispondente idratato, in cellule neuronali SHSY-SY dopo esposizione a H2O2. Le cellule sono state trattate con differenti concentrazioni di Zeolite 24 ore prima dell’esposizione a H2O2.
Descrizione dettagliata dell'invenzione Secondo la presente invenzione, con il termine di attivazione si intende una variazione strutturale derivante dalla modificazione del rapporto molare Si/Al con corrispondente incremento delle cariche negative presenti sulle particelle, che determina un aumento del valore negativo del potenziale ζ e della capacità di scambio ionico. Pertanto per zeolite attivata si intende la zeolite modificata strutturalmente come sopra indicato, derivante dal processo combinato di riscaldamento e micronizzazione secondo la presente invenzione. La micronizzazione può essere condotta in uno o più stadi su materiale preventivamente macinato, in condizioni anidre, fino a raggiungere per il 70%, preferibilmente l'80%, più preferibilmente l'85%, ancor più preferibilmente il 90% rapporti di Si/Al della zeolite nell'intervallo di 1:1-1:4, preferibilmente 1:1 - 1:3.
Il processo per il trattamento della zeolite à ̈ caratterizzato da uno stadio di riscaldamento da condurre prima della micronizzazione ad una temperatura preferibilmente superiore a 300°C, più preferibilmente superiore a 400°C, più preferibilmente compresa nell'intervallo 400-500°C, ancor più preferibilmente 420-450°C per circa 15-30 minuti.
Preferibilmente il riscaldamento à ̈ effettuato in tamburo rotante. E' comunque possibile adottare per questo stadio temperature inferiori a 400°C, benché ciò comporti un allungamento dei tempi di trattamento. Durante questa fase di riscaldamento si ha una disidratazione delle particelle di zeolite che devono essere mantenute in condizioni anidre anche nel trattamento successivo di micronizzazione.
Dopo il trattamento termico la zeolite viene sottoposta ad uno o più stadi di micronizzazione, tipicamente con il processo descritto in EP1316530, fino ad ottenere particelle di dimensioni comprese nell’intervallo 0,001-70 µm, preferibilmente nell’intervallo 1-60 µm.
Vantaggiosamente il trattamento di micronizzazione viene condotto su una zeolite preventivamente macinata alle dimensioni medie di 80-120 µm. La micronizzazione produce una modificazione della granulometria delle particelle la cui caratteristica à ̈ data da uno spostamento delle dimensioni verso valori nettamente inferiori di 50-60 µm accompagnati da un incremento di particelle di 8-35 µm.
A seguito del processo secondo l'invenzione, cioà ̈ a seguito della combinazione di disidratazione e micronizzazione in condizioni anidre, si ha una modificazione della struttura dei silicoalluninati, in particolare del rapporto Si/Al con incremento delle strutture caratterizzate da valori 1:2 e 1:1 e diminuzione di quelle 1:3 e 1:4, come spiegato nel seguito. Tale modificazione comporta un corrispondente incremento delle cariche negative presenti sulle particelle che si localizzano su atomi di ossigeno resi liberi a seguito della rottura di alcuni legami che essi formavano a ponte fra silicio ed alluminio.
La misura dell'attivazione e la modificazione strutturale con diminuzione del rapporto Si/Al sono messe in evidenza dalle analisi NMR come mostrato nelle Figure 1-4.
Da prove su un campione esaminato all'NMR, la zeolite secondo l'invenzione à ̈ caratterizzata da tre strutture prevalenti costituite da bande di risonanza a circa -106,7 ppm T(1Al o 0Al) (46,81%) (rapporti di aree dei picchi di assorbimento all’NMR) nelle quali ogni atomo di silicio à ̈ legato mediante ponte ossigeno ad un atomo di alluminio con un rapporto molare Si/Al 1:1 ed a circa -100,82 T(2Al o 1Al) (24,68%) nelle quali ogni atomo di silicio à ̈ legato mediante ponte ossigeno a due atomi di alluminio con un rapporto molare Si/Al 1:2 con basse percentuali di banda di risonanza a circa -96,29 T(3Al o 2Al) (12,15%) costituite da silicio legato a tre atomi di alluminio mediante ponte ossigeno con un rapporto molare Si/Al 1:3, sono presenti anche piccole quantità di silicati e silicoalluminati diversi in quantità di circa il inferiore al 15% in peso.
La zeolite ottenuta con il metodo dell’invenzione à ̈ ulteriormente caratterizzata da una mesoporosità con diametro dei pori di circa 30-40 Ã…, preferibilmente circa 35-38 Ã…, una superficie di circa 20-30 m<2>/g, preferibilmente circa 25-28 m<2>/g ed infine da un potenziale ζ negativo derivante dalle cariche elettrostatiche superficiali presenti sulle particelle che determinano un campo elettrico responsabile della ridistribuzione dei cationi presenti nello spazio che le circonda, preferibilmente nell’intervallo compreso fra -24 e -30 mV.
I valori negativi del potenziale ζ aumentano con la micronizzazione dimostrando che si verifica un incremento delle cariche negative presenti sulle particelle che concordano con le modificazioni strutturali evidenziate dall’analisi all’NMR. Tale andamento dimostra quindi che il processo di micronizzazione non comporta solo una diminuzione delle dimensioni delle particelle ma produce anche un’attivazione delle stesse che incrementa la loro capacità di scambio cationico (tipicamente compresa fra 0,01 e 8,5 meq/gr), confermata anche da una minore capacità di cessione in acqua degli ioni presenti nei loro canali (Na<+>, K<+>, Ca<2+>, Mg<2+>) che vengono trattenuti maggiormente a seguito dell’incremento della quantità di carica, soprattutto in ambiente neutro. Inoltre vi à ̈ un aumento della capacità di neutralizzazione dei radicali liberi a seguito di una maggiore disponibilità di elettroni in grado di formare legami stabili con essi.
La diminuzione di cariche disponibili derivante dalla presenza di acqua nella zeolite à ̈ evidenziata dal più basso valore di potenziale ζ della zeolite idratata attivata una sola volta.
La combinazione delle caratteristiche prima riportate permette alle particelle di non essere assorbite a livello intestinale e di legare più rapidamente e stabilmente i radicali liberi esplicando l’attività neuro protettrice.
E' stato dimostrato sperimentalmente che la combinazione del riscaldamento e successiva micronizzazione in condizioni anidre provoca una modificazione strutturale della zeolite così trattata. Tale modificazione strutturale à ̈ stata studiata come riportato nella parte sperimentale.
La zeolite clinoptilolite così disidratata (ZCD) ed attivata si à ̈ dimostrata molto più attiva di quella idratata nella protezione dallo stress ossidativo.
La zeolite ottenuta con il processo secondo l’invenzione può essere impiegata in campo cosmetico, dietetico e farmaceutico in varie forme per uso come agente terapeutico nell’uomo e nell’animale per contrastare l'azione dei ROS a livello mitocondriale con effetto neuroprotettivo.
In particolare la zeolite dell'invenzione à ̈ impiegabile per la prevenzione e il trattamento di tutte le condizioni e patologie riconducibili alla presenza dei ROS nell'organismo, ivi comprese quelle cutanee, come i danni da esposizione solare, i tumori o le ferite e ulcerazioni della pelle.
Le formulazioni possono essere: tavolette, pastiglie, capsule, sciroppi, sospensioni, creme e unguenti contenenti la zeolite dell’invenzione come principio attivo in quantità da 0,1 a 99,9 % in peso in combinazione con uno o più eccipienti e veicoli farmaceuticamente accettabili in quantità da 99,9 a 0,1 % in peso.
Gli eccipienti sono quelli noti nell’arte e ad esempio scelti fra, riempitivi, leganti, lubrificanti, emollienti, emulsionanti, solventi, tensioattivi, umettanti, preservanti, antiossidanti, stabilizzanti, coloranti, profumanti, controllori di pH e altri additivi funzionali.
Altri eccipienti da usare per preparare le composizioni in funzione della specifica via di somministrazione risulteranno evidenti per qualsiasi esperto del ramo.
Le formulazioni sono impiegabili per la preparazione di prodotti farmaceutici, dietetici e integratori alimentari o mangimi o prodotti cosmetici per l'uomo e per l'animale.
Le composizioni possono ulteriormente contenere o essere somministrate in associazione con vitamine, agenti antiinfiammatori, antiossidanti, epatoprotettori, astringenti per applicazioni nel tratto gastrointestinale, antiflogistici, chemioterapici e altri farmaci e integratori alimentari in sé noti, ivi compresi i prodotti omeopatici ed i prodotti di origine naturale.
Le formulazioni secondo la presente invenzione possono essere ottenute direttamente per addizione della zeolite attivata dell'invenzione ad uno o più eccipienti secondo le usuali metodologie note nell'arte [S. C. Gad (Ed.) Pharmaceutical Manufacturing Handbook: Production and Processes, Wiley (2008)].
Le compresse possono ad esempio essere ottenute mediante operazioni di compressione, omogeneizzazione, granulazione.
Le formulazioni liquide possono essere ottenute per omogenizzazione della zeolite con uno o più eccipienti in soluzioni liquide a base acquosa o idroalcolica o oleosa, preferibilmente con l'aggiunta di agenti umettanti in sé noti.
Lozioni, emulsioni e creme possono essere ottenute addizionando la zeolite oggetto della presente invenzione ai componenti base delle predette forme farmaceutiche quali acidi grassi ed emulsionanti oltre ad eventuali principi attivi farmaceutici o di origine naturale. Inoltre essa può entrare nelle formulazioni di prodotti cosmetici nella generalità delle loro applicazioni quali corpo, occhi, viso gambe, eventualmente in combinazione con filtri solari in sé noti.
La zeolite oggetto della presente invenzione, a differenza di tutti gli altri antiossidanti usati in terapia, una volta somministrata per via orale non viene assorbita ed agisce nell’intestino senza interferire con i processi biologici dell’organismo. Essa inoltre non à ̈ tossica ed à ̈ caratterizzata dall’assenza di qualsiasi tipo di reazione avversa che à ̈ invece presente in tutti gli antiossidanti, comprese le vitamine, che, agendo per via sistemica, comportano la loro possibile interferenza con vari processi biologici dell’organismo. Inoltre la loro metabolizzazione può comportare problemi di interazioni a livello epatico e renale con farmaci, integratori, alimenti o sostanze assunte contemporaneamente alla loro somministrazione. La zeolite oggetto della presente invenzione può essere formulata e/o somministrata in combinazione con uno o più farmaci e/o principi attivi coadiuvandone l'azione, infatti, non interferisce con alcun tipo di sostanza, compresi i farmaci. Tale caratteristica dipende dalla sua struttura che non consente l’interazione con composti ad alto peso molecolare e lipofili quali i farmaci. Inoltre tutti i principi attivi agiscono per via sistemica e quindi vengono assorbiti rapidamente nell’intestino e, una volta passati in circolo, non possono interferire con la zeolite che rimane nell’intestino, non essendo assorbita.
La zeolite oggetto della presente invenzione presenta un valore di potenziale ζ negativo ed una maggiore capacità di scambio cationico rispetto alle zeoliti dell'arte nota; inoltre à ̈ esente da problemi di eventuale assorbimento intestinale, evitando così eventuali rischi di tossicità cellulare.
Gli esempi seguenti hanno lo scopo di illustrare l'invenzione e non sono da considerare in alcun modo limitativi della relativa portata.
Esempi
Disidratazione della zeolite clinoptilolite
Nella presente invenzione à ̈ stata utilizzata una zeolite
naturale clinoptilolite costituita da alluminosilicato di metalli
alcalini ed alcalino-terrosi avente, prima dei trattamenti, la
seguente formula generale empirica:
(Ca,K2,Na2,Mg)4Al8Si40O96.24H2O
che viene trattata a 420°C per 20’ in tamburo rotante per ottenerne
la disidratazione. La zeolite clinoptilolite disidratata (ZCD) si à ̈
dimostrata, infatti, molto più attiva di quella idratata nella quale
l’interazione delle molecole di acqua con le cariche negative
presenti nei canali, con conseguente azione schermante, ne fa
diminuire la polarità , condizionandone in parte la capacità di
interazione con cationi, radicali liberi e tossine. E’ stata quindi
macinata portando le particelle a dimensioni massime di 80-120
µm e le sue caratteristiche sono le seguenti:
Composizione mineralogica
Clinoptilolite 84 %
Cristobalite 8 %
Ilite 4 %
Plagioclasio 3-4 %
Quarzo tracce
Minerali carbonatici tracce
Composizione chimica
SiO2 65,0 – 71,3 % Co < 3 ppm Al2O3 11,5 – 13,1 % Cu 3 ppm CaO 2,7 - 8,2 % Sn < 1 ppm K2O 2,2 - 3,4 % Pb 10 ppm Fe2O3 0,7 – 1,9 % As 0,8 ppm MgO 0,6 – 1,2 % Cd < 0,1 ppm
Na2O 0,2 - 1,3 % Hg 0,021 ppm
TlO2 0,1 - 0,3 % Si/Al 4,8 – 5-4
Dati fisici e meccanici
Temp. di rammollimento 1260 °C Porosità 24 – 32 %
Punto di fusione 1340 °C Diametro dei pori 0,4 nm (4 angstrom) Punto di colatura 1420 °C Densità relativa 70 %
Forza di compressione 33 MPa Bianchezza 70%
Peso specifico 2200–2440 Kg/m<3>Durezza Mhos 1,5 – 2,5
Peso volume 1600 – 1800 Kg/ m<3>Grindability secondo VTI kVTI=1,628 Aspetto ed odore grigio-verde e senza odore
Capacità di scambio ionico
Totale scambiato 0,64 – 0,98 mol/Kg K<+>0,22–0,45 mol/Kg
0,08 – 0,19 mol/Kg Na<+>0,01–0,19 mol/Kg
Capacità di scambio parziale min. 0,70 mol/Kg
Capacità di scambio totale 1,2 – 1,5 mol/Kg
Capacità di assorbimento di vapore della roccia disidratata al
valore di umidità relativa 52% 7,5 – 8,5 g H2O/100 g
valore di umidità relativa 98% 13,5 – 14,5 g H2O/100 g
Attivazione della ZCD
La ZCD viene sottoposta ad un processo di micronizzazione
basato sulla collisione delle particelle tra di loro che provoca contemporaneamente una diminuzione delle loro dimensioni ed un’attivazione delle stesse attraverso una loro modificazione strutturale. La distribuzione delle dimensioni delle particelle nella
ZCD non attivata mostra un andamento della curva di distribuzione delle dimensioni delle particelle caratterizzata da
una maggiore ampiezza e con valori di D(95) e D(98) più elevati nell’intervallo di 80-115 µm. La ZCD attivata una volta mostra una granulometria caratterizzata da una distribuzione più stretta ed
uno spostamento dei valori di D(90) e D(98) verso dimensioni nettamente inferiori di 35-58 µm accompagnati da un incremento
di particelle di 10-35 µm. La ZCD attivata due volte mostra
un’ulteriore leggera diminuzione delle dimensioni con valori di D(90) e D(98) rispettivamente di 30 e 50 µm ed un incremento delle particelle di 8-30 µm.
La diminuzione delle dimensioni delle particelle accompagnata da un aumento della loro superficie attiva non era però in grado di spiegare il notevole incremento dell’attività biologica e quindi à ̈ stato effettuato uno studio strutturale mediante NMR su di esse per verificare le eventuali modificazioni generate dalla micronizzazione.
Struttura della ZCD attivata
I campioni in polvere sono stati inseriti in rotori da 4 mm di diametro e sigillati con tappi Kel-F. Gli spettri NMR di silicio sono stati eseguiti ad una frequenza di 79,49 MHz con uno spettrometro Bruker Avance 400. L’impulso a p/2 à ̈ stato ottimizzato a 3 ms e sono state accumulate 400 scansioni con un tempo di riciclo ottimizzato a 60 s. Per tutti i campioni la velocità di rotazione à ̈ stata fissata a 12 KHz. Gli spettri sono stati collezionati con un numero di punti nel dominio dei tempi pari a 1024 ed à ̈ stata applicata una trasformata di Fourier utilizzando 2048 punti. La calibrazione dei chemical shifts à ̈ stata eseguita utilizzando TMS (tetrametilsilano) come riferimento esterno.
Gli spettri di silicio sono stati deconvoluti utilizzando una forma di riga gaussiana ed per ogni picco sono stati inseriti come parametri iniziali per la deconvoluzione l’intensità , il chemical shift (in ppm) e la larghezza di riga a metà altezza (Dn1/2) ottenuta dallo spettro sperimentale. Mediante la procedura di deconvoluzione spettrale sono stati ottenuti gli integrali di tutti i picchi costituenti lo spettro.
Le analisi sono state effettuate su campioni di ZCD non attivata, attivata una volta e due volte.
La zeolite clinoptilolite oggetto della presente invenzione mostra due centri di simmetria (tetraedrica) che provocano sovrapposizione delle bande di risonanze delle varie unità . Infatti, negli spettri ottenuti si osservano 5 picchi attribuiti alle unità (bande di risonanza) Q0 (-112,5 ppm), T(1Al o 0Al) (-106,7 ppm), T(2Al o 1Al) (-100,82 ppm), T(3Al o 2Al) (-96,29 ppm) e spalla (-87,28 ppm) rispettivamente. Le unità Q0 sono atomi di silicio che hanno come secondi vicini (atomi legati ad esse attraverso un ponte ossigeno) 4 atomi di silicio; le unità T(1Al) sono atomi di silicio che hanno come secondi vicini 3 atomi di silicio ed 1 atomo di alluminio; le unità T(2Al) sono atomi di silicio che hanno come secondi vicini 2 atomi di silicio e 2 di alluminio; le unità T(3Al) sono atomi di silicio che hanno come secondi vicini 1 atomo di silicio e 3 di alluminio; infine le unità T(4Al) Q4 sono atomi di silicio che hanno come secondi vicini 4 atomi di alluminio.
Plottando gli spettri uno sull’altro come in figura 1 si evidenziano alcune differenze per quello che riguarda le intensità delle unità Q0, T(2Al o 1Al) e T(3Al o 2Al) mentre T(1Al o 0Al) e la spalla sono piuttosto costanti in tutti campioni. Ogni spettro à ̈ stato deconvoluto per ottenere le aree delle 3 unità separatamente.
Gli spettri deconvoluti insieme alle singole componenti sono stati sovrapposti agli spettri sperimentali e sono riportati nelle figure 2, zeolite non attivata (Campione A), figura 3 zeolite attivata una volta (Campione B) e 4 zeolite attivata due volte (Campione C).
Nella Tabella 1 sono riportati i risultati della deconvoluzione spettrale, cioà ̈ le aree dei picchi delle unità Q0, T(1Al o 0Al), T(2Al o 1Al), T(3Al o 2Al), spalla (dati quantitativi).
Tabella 1
Campione Q0 T(1Al o 0Al) T(2Al o 1Al) T(3Al o 2Al) spalla (-112,5 ppm) (-106,7 ppm) (-100,82 (-96,29 ppm) (-87,28 ppm) ppm)
A 14,42 43,65 16,76 21,18 4,0
B 13,19 46,81 24,68 12,15 3,18 C 13,06 48,19 23,07 12,29 3,39
Il campione A mostra valori nettamente più alti dell’unità T(3Al o 2Al) e nettamente inferiori dell’unità T(2Al o 1Al). Tale andamento dimostra che l’attivazione alla quale viene sottoposta la ZCD provoca una modificazione della struttura della zeolite grezza che, nel campione B sottoposto ad un’unica attivazione, mostra un incremento del 7,2 % di T(1Al o 0Al), relativamente modesto, un incremento notevole di T(2Al o 1Al) del 47,7 % ed una diminuzione di T(3Al o 2Al) del 42,5 % e della spalla del 20,0 %, mentre Q0 resta praticamente costante. Nella ZCD sottoposta a due attivazioni (campione C) si manifesta uno spostamento dell’incremento verso T(1Al o 0Al) con un 10% rispetto al campione B, mentre T(2Al o 1Al) aumenta del 37,6% e diminuiscono T(3Al o 2Al) del 41,9 % e la spalla del 15,2 %. E’ evidente che gli urti fra le particelle comportano una trasformazione di T(3Al o 2Al) e della spalla in T(1Al o 0Al) ma soprattutto in T(2Al o 1Al).
Tali andamenti dimostrano molto chiaramente che l’incremento di attività delle particelle attivate deriva dalla modificazione della struttura della zeolite che comporta una diminuzione del numero di legami silicio/alluminio con conseguente aumento degli atomi di ossigeno che supportano cariche negative responsabili delle interazioni con metalli pesanti, radicali liberi e tossine nei canali.
Granulometria
La determinazione della distribuzione delle dimensioni delle particelle à ̈ stata effettuata con uno strumento Mastersizer 2000 della Malvern, apparecchio basato su tecnica di diffrazione laser (detta anche LALLS). Unità di dispersione per sospensioni Hydro S (volume 50-120 ml). Le analisi sono state effettuate in H2O demineralizzata con pompa centrifuga e stirrer posizionati a 2800-3000 rpm, sonda ultrasuoni in vasca accesa durante la misura per migliorare la disaggregazione delle particelle. I dati ottenuti sono riportati nelle Tabelle 2 e 3.
Tabella 2
Campione D(10) D(20) D(30) D(40) D(50) D(60) D(70) D(80) D(90) D(95) D(98)
A 2,43 3,71 5,46 8,14 12,30 18,26 26,51 38,79 61,39 84,96 115,20
µm µm µm µm µm µm µm µm µm µm µm Tabella 3
Campione D(10) D(50) D(90) D(98)
B 2,43 µm 10,99 µm 34,35 µm 52,33 µm C 2,11 µm 8,42 µm 30,80 µm 50,53 µm
L’esame dei dati evidenzia chiaramente che la ZCD attivata una volta (Campione B) mostra una granulometria caratterizzata da una distribuzione più stretta ed uno spostamento dei valori massimi verso dimensioni nettamente inferiori di 50-60 µm accompagnati da un incremento di particelle di 10-34 µm. La ZCD attivata due volte (campione C) mostra un’ulteriore leggera diminuzione delle dimensioni massime ed un incremento delle particelle di 8-30 µm.
Potenziale ζ
La determinazione del potenziale ζ à ̈ stata effettuata con uno Strumento Zetasizer Nano della Malvern, tecnica Laser Doppler Electrophoresis. Le polveri sono state disperse in H2O (5mg in 4 ml) demi ed analizzate con cuvetta capillare da 0,75 ml misurate con metodo PALS (Phase Analysis Light Scattering).
I dati analitici mostrano un potenziale negativo che indica la presenza di cariche negative sulle particelle ed un suo incremento, anche se leggero, in funzione dell’entità dell’attivazione: Campione A (non attivato) -26,2, Campione B (attivato una sola volta) -27,8 e Campione C (attivato due volte) -28,4. Tale andamento indica un aumento delle cariche negative generate dalla micronizzazione e conferma quanto evidenziato dallo studio strutturale all’NMR.
Mesoporosità e superficie delle particelle
La determinazione dell’area superficiale e della porosità delle particelle à ̈ stata effettuata mediante uno strumento NOVA della Quantachrome, basato sulla tecnica del fisisorbimento di gas. La misura à ̈ stata effettuata dopo 16 ore di degassaggio sotto vuoto a 300°C; l’isoterma di adsorbimento e desorbimento à ̈ stata determinata con gas Azoto a temperatura di 77K (N2liquido). L’Area Superficiale Specifica (SSA) à ̈ stata calcolata con BET multipoint nel campo 0,05<P/P0<0,18 in adsorbimento mentre la Mesoporosità à ̈ stata calcolata su isoterma di desorbimento sia con metodo BJH sia con metodo DFT.
Le analisi hanno evidenziato che la zeolite clinoptilolite oggetto della presente invenzione à ̈ caratterizzata da mesopori delle dimensioni di 38 – 39 Ã… e da una superficie di 27-28,5 m<2>/g. La micronizzazione non provoca una netta modificazione della mesoporosità mentre vi à ̈ un leggero incremento della superficie dimostrando che l’incremento dell’attività non à ̈ dovuta principalmente alla mesoporosità ed alla superficie attiva delle particelle ma alla modificazione della struttura delle stesse con incremento delle cariche, come dimostrato dallo studio NMR.
Capacità di cessione
E’ stata effettuata la determinazione della capacità di cessione dei cationi presenti nelle particelle che neutralizzano le cariche negative presenti sull’alluminosilicato sia al fine di verificare la possibilità di rilascio di ioni potenzialmente tossici, come riportato da A. Lelas e I. Cepanec in WO 2009/133413 A1, sia per confermare l’incremento della polarizzazione delle particelle dopo l’attivazione.
Le determinazioni sono state effettuate a pH 2 e pH 7 per simulare le condizioni dello stomaco e dell’intestino umano senza aggiungere altri componenti dei succhi gastrici che potevano interferire formando sali poco solubili con molti cationi, come i fosfati. 0,5 g di campione sono stati sospesi in 100 ml di acqua deionizzata a pH 7 oppure in HCl 10<-2>N, tenuti in agitazione per 1 ora e quindi lasciati decantare e stabilizzare per una notte. La sospensione à ̈ stata quindi centrifugata ed il surnatante à ̈ stato separato dal solido, filtrato e sottoposto ad analisi di Assorbimento Atomico (AA) mediante apparecchio Perkin-Elmer Analist 100.
La cessione à ̈ maggiore a pH 2 per tutti i cationi ed in particolare per Na<+>, K<+>, Mg<2+>e Ca<2+>, con andamenti caratteristici in funzione della struttura, confermando che il silicoalluminato si comporta da base coniugata forte dei corrispondenti acidi deboli e quindi protonabile. La zeolite non attivata (Campione A) mostra la maggiore capacità di cessione, soprattutto di metalli alcalinoterrosi, mentre la prima attivazione (Campione B) fa diminuire nettamente le quantità di metalli alcalino-terrosi ceduti con un incremento di quelli alcalini, valori ancora più marcati dopo la seconda attivazione (Campione C). Tale andamento indica una maggiore capacità di interazioni elettrostatiche delle zeoliti attivate che confermano un incremento delle cariche negative legata alle modificazioni strutturali prima riportate derivanti dalla micronizzazione.
Tutti i cationi potenzialmente tossici, quali ad esempio i metalli pesanti, vengono ceduti in concentrazioni dell’ordine di ppb per Kg di zeolite confermando un elevato grado di purezza del materiale di partenza e dimostrando che, almeno nel caso della zeolite oggetto della presente invenzione, non à ̈ necessaria alcuna purificazione. Le quantità cedute sono ancora inferiori a pH 7, come prevedibile, in quanto la reazione di idrolisi dei silicatoalluminati strutturali non à ̈ così marcata. La conferma à ̈ data dal valore del pH impartito all’acqua dalla polvere messa in sospensione che tende alla neutralità .
A pH 7 si verifica una netta diminuzione della cessione che si sposta verso i metalli alcalini per tutti i campioni confermando ulteriormente che l’entità dell’attivazione condiziona la cessione; infatti, la zeolite doppiamente attivata mostra valori ancora più bassi di metalli ceduti.
Capacità di scambio cationico
0,1 g di campione di zeolite sono stati sospesi in 100 ml di H2O deionizzata a pH 7 o in soluzione a pH 2 per HCl contenente 1 ml di una delle soluzioni standard a 1000 mg/l dei metalli da analizzare in modo da avere una concentrazione finale di 10 mg/l di metallo. La dispersione à ̈ stata quindi dibattuta per circa due ore e lasciata decantare per una notte. Si à ̈ separato il surnatante che à ̈ stato filtrato su filtro a 4 µm. Le analisi sono state effettuate mediante spettrofotometro di Assorbimento Atomico Perkin-Elmer Analist 100.
Il pH influenza in modo rilevante la capacità di scambio cationico che risulta superiore a pH 7 rispetto a pH 2. A pH acido l’attività di scambio resta comunque alta dimostrando che anche la zeolite protonata à ̈ un ottimo scambiatore. Tale andamento à ̈ particolarmente evidente per il piombo che si lega a pH 2 per circa il 75 % della quantità iniziale mentre a pH 7 si lega totalmente. Anche per il mercurio si ha una capacità di scambio nettamente superiore a quella dimostrata dalle particelle ad elevata mesoporosità di A. Lelas (52 ppb per 1 g di polvere) con valori 100 volte superiori intorno a 6 mg per 1 g di zeolite attivata. La capacità di scambio cationico aumenta nettamente con l’attivazione e pertanto il campione A non attivato mostra valori nettamente inferiori a quelli del campione B attivato una sola volta, mentre il campione C risulta il più attivo di tutti.
Le zeoliti attivate oggetto della presente invenzione mostrano una scala di selettività di seguito riportata:
Cs<+>>NH4<+>>Pb<2+>>Ba<2+>>Cu<2+>>Hg<2+>>Cd<2+>>Ni<2+>>Co<2+>>K<+>>Na<+>>Ca<2+>>Mg<2>
<+>>Zn<2+>
che evidenzia una bassissima interazione con oligo-elementi essenziali da un punta di vista biologico come lo zinco.
Inibizione della produzione di ROS da parte della Zeolite clinoptilolite
L'effetto della zeolite attivata una volta (Campione B) e due volte (Campione C) Ã ̈ stato studiato in un modello sperimentale di produzione di ROS mitocondriale tramite microscopia confocale in cellule vive neuronali come descritto di seguito. Questo modello permette di determinare i livelli di ROS generati nei mitocondri.
In breve, la linea cellulare di neuroblastoma SH-SY5Y à ̈ stata inizialmente differenziata in cellule con fenotipo neuronale, mediante trattamento in vitro con acido retinoico per 7 giorni (Uberti et al. 1997); successivamente, seguendo la metodologia descritta da Koopman et al. (Cytometry A 2006 69(12):1184-92), al terreno di coltura à ̈ stato aggiunto 5-clorometil-2',7'-diclorodiidrofluoresceina (CM-H2DCF) e la sua conversione ossidativa in CM-DCF all’interno delle cellule à ̈ stata monitorata attraverso la determinazione dell'intensità luminosa con microscopia confocale e un'immagine in tempo reale. Per la localizzazione dei mitocondri nelle cellule é stato utilizzato il MITOTRACKER DEEP RED. Le cellule sono state successivamente eccitate con una crescente intensità del laser e l'intensità della fluorescenza di CM-DCF à ̈ stata misurata nelle regioni di interesse (mitocondri). L'intensità dell'emissione della fluorescenza à ̈ stata calcolata come valore del livello medio di verde per pixel e corretta per il background.
Nel nostro studio le cellule sono state preincubate con concentrazioni crescenti sia di Campione B che di Campione C (da 0,6 ng/ml a 2,5 ng/ml) per 24 o 48 ore prima dell'eccitazione del laser. Abbiamo rilevato che alla concentrazione di 2,5 ng/ml sia il Campione B che il Campione C impedivano l'induzione da parte del laser della produzione di ROS nei mitocondri di cellule neuronali SH-SY5Y differenziate. Le Figure 5 e 6 mostrano i risultati degli esperimenti. Per il Campione C l'effetto era già evidente dopo un'esposizione di 24 ore.
Effetti neuroprotettivi di zeolite in un modello sperimentale di morte cellulare indotta da ROS
La linea cellulare SH-SY5Y di neuroblastoma à ̈ stata differenziata con acido retinoico per una settimana in modo da acquisire il fenotipo neuronale. Dopo la differenziazione in cellule tipo-neuronali, le cellule sono state esposte a concentrazioni crescenti di zeolite non attivata, campione A, attivata una sola volta, campione B, e due volte campione C (0,5-5,0 ng/ml) per 24 ore. La vitalità cellulare à ̈ stata monitorata dopo una esposizione delle cellule ad una breve esposizione di H2O2.
Esperimenti precedenti eseguiti nel nostro laboratorio (Uberti et al. 2002) dimostravano che un'esposizione di queste cellule a concentrazioni crescenti di H2O2in un range da 0,5mM a 2mM, per periodi diversi di tempo, con un range da 1 min a 20 min, dava come risultato un significativo aumento della produzione di ROS. L’effetto si dimostrava essere concentrazione- e tempodipendente, e la morte cellulare era più facilmente individuabile 24 ore dopo l'esposizione all'H2O2. Il modello sperimentale di morte neuronale indotta da ROS utilizzato nei nostri studi à ̈ riconosciuto e validato da molti anni dalla comunità scientifica. Sulla base di questi presupposti, le cellule sono state esposte a H2O2per 5 minuti e poi alle cellule à ̈ stato aggiunto terreno fresco per altre 24 ore. L'H2O2causava una riduzione della vitalità cellulare di circa il 70% in confronto alle cellule non trattate considerate come controllo.
Come mostrato in Fig. 6, noi troviamo che il trattamento con concentrazioni crescenti di Campione B e Campione C previene la morte cellulare dose dipendente indotta da H2O2.
I composti testati mostrano un'efficacia diversa risultando la zeolite atttivata due volte più attivo di zeolite attivata una volta.
La zeolite non attivata non mostra alcun effetto neuro protettivo. La Fig. 8 mostra che la deidratazione dei zeolite incrementa l’effetto neuroprotettivo del composto.
Metodi
Cultura cellulare
La linea cellulare umana SH-SY5Y di neuroblastoma à ̈ coltivata in terreno 1:1 Ham's F12:Dulbecco modified Eagle's medium (DMEM) supplementato con 10%(v/v) di siero fetale di vitello, 2mM di glutamina, 50 µg/ml di penicillina e 100µg/ml di streptomicina e tenuta a 37°C in atmosfera umidificata con il 5% di CO2. Per differenziare, la coltura cellulare à ̈ stata trattata per 1 settimana con 10µM di acido retinioico. Si à ̈ proceduto alla crescita e al differenziamento come dal protocollo Uberti et al. 1007.
Trattamento farmacologico
Zeolite à ̈ stata aggiunta al terreno di crescita delle cellule 24 o 48 ore prima del pulse con H2O2,o della stimolazione con luce laser come indicato.
Valutazione della vitalità cellulare
La vitalità cellulare à ̈ stata misurata mediante un metodo colorimetrico quantitativo con MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2,5-difeniltetrazolio bromuro), che rivela l'attività mitocondriale delle cellule vive. Le cellule neuronali differenziate SH-SY5Y nella piastra a 96 pozzetti vengono tenute per 5 min con H2O2e in seguito viene aggiunto MTT 500µg/ml( concentrazione finale) ad ogni pozzetto quindi, le cellule vengono incubate per altre 3 ore a 37°C. MTT viene rimosso e le cellule lisate con dimetilsolfossido. L'assorbanza a 595 nm à ̈ stata misurata usando un lettore per micropiastre Bio-Rad 3350. Le cellule del controllo sono state trattate nel medesimo modo ma senza l'H2O2e i valori di differenza dell'assorbanza erano espressi come percentuale del controllo.
Rilevamento delle specie reattive ossigeno (ROS)
La linea cellulare SH-SY5Y di neuroblastoma à ̈ stata dapprima differenziata in una con fenotipo tipo-neuronale attraverso un trattamento con acido retinoico per 7 giorni in accordo con Koopman et al. 2006, alle cellule veniva aggiunta 5-colorometil-2',7'-diclorodiidrofluoresceina (CM-H2DCF) e la sua conversione ossidativa in CM-DCF à ̈ stata monitorata attraverso una funzione dell'intensità della luce con la microscopia confocale e un immagine in tempo reale dopo aver aumentato l'intensità del laser. Per la localizzazione dei mitocondri alle cellule veniva aggiunto MITOTRACKER DEEP RED. Le cellule venivano poi eccitate dalla intensità crescente del laser e l'intensità della fluorescenzaa di CM-DCF à ̈ stata misurata selettivamente nei mitocondri.
L'intensità dell'emissione della fluorescenza à ̈ stata calcolata come valore del livello medio di verde per pixel e corretta per il background.
Conclusioni
I risultati riportati nella parte sperimentale svelano un'inaspettata proprietà della zeolite secondo la presente invenzione come antiossidante nei mitocondri e un marcato effetto neuroprotettivo suggerendo che le zeoliti ottenute con il trattamento qui descritto presentano un'azione terapeutica in quelle neuropatologie nelle quali la produzione di ROS gioca un ruolo rilevante.
L'effetto neuroprotettivo à ̈ dipendente dall’attivazione del composto ed infatti per il Campione C (attivato due volte) risulta maggiore del Campione B (attivato una sola volta). Nel nostro modello, la Zeolite non attivata non mostra proprietà neuroprotettive. La rimozione di acqua tramite calore incrementa in modo evidente l’attività neuroprotettiva indotta dalla zeolite della presente invenzione come risulta evidente dai dati sperimentali relativi al Campione B ed al corrispondente Campione idratato attivato una sola volta come il B.
Bibliografia
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Uberti D, Piccioni L, Colzi A, Bravi D, Canonico PL, Memo M (2002)
Pergolide protects SH-SY5Y cells against neurodegeneration induced by H2O2.
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Koopman WJH, Verkaart S, van Emst-de Vries SE, Grefte S, Smeitink JAM, Willems P (2007)
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Front Biosci. 2006 May 1;11:1722-32.
Claims (16)
- RIVENDICAZIONI 1. Zeolite disidratata, micronizzata e attivata da impiegare in campo cosmetico e farmaceutico caratterizzata da dimensioni delle particelle nell'intervallo 0,001-70 mm, preferibilmente 1-60 mm, potenziale ζ negativo, preferibilmente nell'intervallo da -24 a -30 mV, e avente per circa il 70%, preferibilmente l'80%, più preferibilmente l'85%, ancor più preferibilmente il 90% un rapporto molare Si/Al che varia da 1:1 a 1:4.
- 2. Metodo per ottenere la zeolite secondo la rivendicazione 1 comprendente uno stadio di riscaldamento condotto ad una temperatura superiore a 300°C, preferibilmente superiore a 400°C e almeno uno stadio di micronizzazione in condizioni anidre.
- 3. Metodo secondo la rivendicazione 2 in cui lo stadio di riscaldamento à ̈ condotto prima della micronizzazione ad una temperatura compresa nell'intervallo 400-500°C, preferibilmente 420-450°C per circa 15-30 minuti.
- 4. Composizione comprendente almeno un eccipiente o veicolo farmacologicamente accettabile in combinazione con la zeolite secondo la rivendicazione 1 per la preparazione di un prodotto cosmetico, un farmaco, un prodotto dietetico o prodotto veterinario o mangime.
- 5. Composizione secondo la rivendicazione 4 comprendente una quantità di zeolite da 0,1 a 99,9% in peso, e almeno un eccipiente o veicolo farmacologicamente accettabile in quantità da 99,9 a 0,1% in peso.
- 6. Composizione secondo le rivendicazioni 4-5 che à ̈ un farmaco per la prevenzione e il trattamento delle patologie indotte dalla presenza di radicali liberi nell'uomo e nell'animale.
- 7. Composizione secondo le rivendicazioni 4-5 che à ̈ un prodotto dietetico per l'uomo e per l'animale.
- 8. Composizione secondo le rivendicazioni 4-5 che à ̈ una composizione cosmetica per l'uomo e per l'animale.
- 9. Composizione secondo le rivendicazioni 4-8 somministrabile per via orale sotto forma di tavolette, pastiglie, capsule, sciroppi, sospensioni o topica in forma di creme e unguenti.
- 10. Composizione secondo le rivendicazioni 4-9 comprendente ulteriormente principi attivi convenzionali di natura nutrizionale e/o farmacologica e/o cosmetica scelti fra vitamine, agenti antiinfiammatori, antiossidanti, epatoprotettori, astringenti per applicazioni nel tratto gastrointestinale, antiflogistici, chemioterapici e altri farmaci e integratori alimentari in sé noti, ivi compresi i prodotti omeopatici e i filtri solari.
- 11. Uso della zeolite secondo la rivendicazione 1 per la preparazione di un composto farmaceutico o cosmetico, un integratore alimentare o prodotto dietetico per la somministrazione all'uomo o all'animale.
- 12. Uso secondo la rivendicazione 11 in cui il composto à ̈ un medicamento per la prevenzione e il trattamento delle affezioni indotte dalla presenza di radicali liberi nell'uomo e nell'animale
- 13. Uso secondo la rivendicazione 11 per contrastare l'azione dei ROS a livello mitocondriale con effetto neuroprotettivo.
- 14. Uso secondo la rivendicazione 11 in cui la zeolite esplica un'attività antiossidante e neuroprotettiva a livello mitocondriale.
- 15. Uso secondo la rivendicazione 12 in cui le patologie sono scelte fra malattie cardiovascolari, diabete, cancro e malattie neurodegenerative, in particolare demenza di Alzeimer o malattia di Parkinson
- 16. Uso secondo la rivendicazione 12 in cui le affezioni sono le affezioni cutanee, come i danni da esposizione solare, i tumori o le ferite e ulcerazioni della pelle.
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