ITRM20000658A1 - Metodo per l'identificazione di cultivar di albicocco, oligonucleotidi da impiegare nello stesso metodo e kit relativo. - Google Patents
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo: "METODO PER L'IDENTIFICAZIONE DI CULTIVAR DI ALBICOCCO, OLIGONUCLEOTIDI DA IMPIEGARE NELLO STESSO METODO E KIT RELATIVO "
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda un metodo per l'identificazione di cultivar di albicocco (Prunus Armeniaca) di origine campana rispetto a cultivar di origine non campana, metodo che consente inoltre l'identificazione di singole cultivar.
L'albicocco (Prunus Armeniaca) è una pianta che è intensamente coltivata in Italia specialmente nell'Italia meridionale. La sua importanza è anche legata alle vaste possibilità d'impiego del suo frutto, l'albicocca, specialmente da parte dell'industria. Con le albicocche si possono non solo ottenere cultivar con frutti per il consumo fresco, caratterizzate da una pezzatura piccola o medio-piccola e da uno scarso contenuto zuccherino, ma anche cultivar i cui frutti sono utilizzati per la produzione di succhi di frutta e marmellate che, presentando maturazione media oppure tardiva, hanno normalmente un colore più accentuato e un tenore zuccherino sicuramente più alto. Un altro impiego delle albicocche è quello per la produzione di frutta sciroppata e per l’essiccazione. Le molteplici possibilità di lavorazione delle albicocche (essiccate, sciroppate, produzioni di nettari e, oppure marmellate-confetture) assumono una posizione di rilievo nell'agricoltura soprattutto nella zona della Campania. Proprio per la destinazione finale risulta importante avere la possibilità di determinare l'identità di una cultivar, riconoscibile da tutta una serie di caratteristiche morfologiche e fisiologiche che ne orientano le possibilità di impiego, anche in stadi precoci. Inoltre vista la crescente sensibilità verso problematiche brevettuali di difesa dei diritti di proprietà industriale uno strumento idoneo all'identificazione univoca di una varietà risulta estremamente importante.
A tutt'oggi non risultano descritte tecniche affidabili di identificazione varietale che consentano la distinzione tra varietà appartenenti a due o più gruppi di varietà caratterizzati da caratteristiche comuni,' anche per esempio la semplice appartenenza ad una zona geografica definita. Le caratterizzazioni varietali si sono finora limitate a caratterizzazioni di tipo morfologico, oppure fenologico cioè caratterizzazioni che per identificare la varietà richiedono che quest'ultima sia osservata nel pieno del suo sviluppo e sono soggette a influenze ambientali. Identificazioni di tipo morfologico oppure fenologico su piccole parti di una varietà sono ovviamente improponibili.
Sono descritte nello stato della tecnica varie metodiche strumentali, sostanzialmente di biologia molecolare, per identificare le varietà. Queste tecniche si sono dimostrate insoddisfacenti sotto vari aspetti. Ad esempio per alcune di queste tecniche è necessario che la varietà in oggetto abbia delle caratteristiche specifiche (la tecnica degli RFLP o Restriction Fragment Length Polymorphism su siti polimorfici è possibile solo per quelli che cambiano sito di restrizione con ciò limitando di molto il numero dei potenziali siti polimorfici e le potenzialità dell'analisi varietale relativa). Inoltre queste tecniche presentano numerosi svantaggi. In particolare gli RFLP richiedono un gran numero di enzimi di restrizione differenti da impiegare sul DNA estratto dalle cultivar oggetto di studio e la ricerca è casuale. La tecnica, che utilizza il metodo di Southern con l 'impiego 'di una sonda genica, risulta quindi complessa, laboriosa, costosa. Inoltre la presenza di sonde marcate con radioisotopi costituisce un fattore di rischio ulteriore per gli operatori che in genere ne sconsiglia l'impiego.
Altra tecnica proposta è quella dei microsatelliti. Tuttavia anche nel caso di questa metodica esistono degli svantaggi legati alla necessità di impiegare un sistema elettroforetico sufficientemente discriminativo per distinguere variazioni di 2 basi sulla lunghezza totale di un amplimero compreso tra 70 e 200 bp e che richiede una tecnica particolarmente raffinata e pertanto generalmente costosa.
Per quanto riguarda invece i RAPD accoppiati alla tecnica PCR la metodica si dimostra particolarmente interessante e si basa sull'amplificazione di DNA genomico estratto dalla specie o cultivar di interesse. Per l'amplificazione vengono impiegati oligonucleotidi di 10 basi disegnati a sequenza arbitraria. La dimensione così esigua degli oligonucleotidi assicura una complementarità "Random" al DNA genomico in molte regioni di questo. Infatti l'appaiamento tra due filamenti di DNA richiede una complementarità della sequenza del 30%; quindi tra l'oligonucleotide e il DNA genomico ci deve essere una sequenza di tre basi complementari. L'appaiamento degli oligonucleotidi a più regioni del DNA e la successiva amplificazione di queste regioni genererà prodotti di amplificazione che daranno informazioni sull'eventuale presenza di polimorfismi. Tali polimorfismi possono essere usati per costruire mappe genetiche o come marcatori genetici. Inoltre in generale le metodiche RAPD-PCR presentano elevata precisione, velocità e sensibilità, non subiscono alcun tipo di influenza dall’ambiente e, soprattutto, sono applicabili in qualunque stato della pianta dopo la germinazione del seme. Inoltre presentano facilità d'uso, sono economiche e non implicano uso di materiale radioattivo come nel caso degli RFLP.
Nonostante queste lusinghiere premesse restava tuttavia il problema di applicare la tecnologia RAPD-PCR ad una particolare popolazione di cultivar e soprattutto di identificare un oligonucleotide (o più oligonucleotidi) che fosse in grado di identificare le varie cultivar. Tenuto conto che normalmente vengono impiegati oligonucleotidi decamerici e tenuto conto che sono disponibili quattro alternative (quattro basi) per ogni monomero del decamero impiegato da un semplice calcolo statistico (quattro possibilità di scelta per ogni monomero del decamero) risulta che la molecola utilizzabile è una su 1.048.576 (410). Da quanto precede si può sicuramente sostenere che aver identificato la particolare sequenza e pertanto il particolare oligonucleotide decamerico è certamente sorprendente e non derivabile facilmente dallo stato della tecnica.
Inoltre è stato sorprendentemente trovato che la presente invenzione consente di ottenere una differenziazione tra cultivar campane e cultivar non campane e inoltre una identificazine di differenti cultivar sia di origine campana che non campana. Nell'ambito della presente invenzione con il termine cultivar campane di albicocco si intendono cultivar autoctone dell'areale vesuviano, cioè cultivar di albicocco originarie e storicamente coltivate nell'areale vesuviano.
Forma pertanto oggetto della presente invenzione un metodo per l'identificazione di cultivar campane di Prunus Armeniaca da cultivar non campane, con impiego della tecnica RAPD-PCR, caratterizzato dal fatto di impiegare un primer costituito dall 'oligonucleotide decamerico
La tecnica RAPD-PCR viene generalmente eseguita mediante le seguenti operazioni:
a) estrazione di DNA genomico dalla(e) cultivar da analizzare;
b) determinazione della concentrazione del DNA estratto tenendo conto che, di regola, da 100 mg di tessuto fogliare si ottengono 200-500 ng di DNA; c) preparazione del campione per l'amplificazione mediante PCR-RAPD in modo che contenga una quantità di DNA estratto compresa tra 5 e 10 ng, preferibilmente 7,5 ng e denaturazione del campione stesso;
d) ibridazione con un primer con sequenza random ricca in CG (40-70%)
e) polimerizzazione e
f) analisi dei prodotto di amplificazione per via elettroforetica.
E' comunque da intendersi che il metodo della presente invenzione può essere eseguito con ogni variante della tecnica RAPD-PCR nota in arte, differente dalla metodica sopra esposta.
E' da segnalare come nel metodo appena descritto e come del resto ribadito in precedenza, sia fondamentale l'impiego del particolare oligonucleotide che consente di discriminare cultivar di origine campana da cultivar di origine non campana.
Forma pertanto ulteriore oggetto dell'invenzione l'oligonucleotide decamerico di sequenza d'ora innanzi indicato anche come 0L41, nonché composizioni che lo comprendano unitamente ad un veicolo chimicamente compatibile .
Tuttavia gli inventori della presente invenzione hanno sorprendentemente trovato la possibilità di identificare particolari cultivar di interesse commerciale sia tra cultivar di origine campana che tra cultivar di origine non campana. E' stata perciò sviluppata un'ulteriore metodologia che, partendo dai risultati del metodo precedentemente esposto (che ha portato cioè alla distinzione tra cultivar di origine campane e cultivar di origine non campane) e quindi agendo rispettivamente su cultivar di origine campana e non campana, riesce a identificare specifiche cultivar.
Forma pertanto ulteriore oggetto della presente invenzione un metodo per l'identificazione di specifiche cultivar campane e non campane riconosciute come tali dal metodo citato in precedenza, caratterizzato dal fatto di impiegare un primer scelto dalla seguente classe di oligonucleotidi decamerici:
Analogamente al precedente anche questo metodo può essere realizzato secondo la metodologia RAPD-PCR precedentemente esposta in relazione alla identificazione di cultivar campane che comprende:
a) estrazione di DNA genomico dalla (e) cultivar da analizzare;
b) determinazione della concentrazione del DNA estratto tenendo conto che, di regola, da 100 mg di tessuto fogliare si ottengono 200-500 ng di DNA
c) preparazione del campione per l'amplificazione mediante PCR-RAPD in modo che contenga una quantità di DNA estratto compresa tra 5 e 10 ng, preferibilmente 7,5 ng e denaturazione del campione stesso
d) ibridazione con un primer tra quelli in precedenza indicati con sequenza random ricca in CG (40-70%)
e) polimerizzazione
f) analisi del prodotto di amplificazione per via elettroforetica.
Anche in questo caso una qualunque variante della tecnica RAPD-PCR tra quelle note in arte può essere utilizzata per la esecuzione del metodo della invenzione.
Formano ulteriore oggetto della presente invenzione anche i singoli oligonucleotidi decamerici impiegati nel metodo per la identificazione delle singole cultivar campane oligonucleotidi che hanno le seguenti sequenze:
nonché
composizioni che li comprendano unitamente ad un veicolo chimicamente compatibile.
Un veicolo chimicamente compatibile ai fini della presente invenzione è un qualunque veicolo tra quelli noti in arte in quanto compatibili con oligonucleotidi.
Il metodo della presente invenzione può venire vantaggiosamente impiegato per la identificazione delle seguenti cultivar campane Baracca, Cafona, Ceccona, Cerasona, Nennella, Pellecchiella, Piciona, Pollastrella, Portici, Prete, Prete bello, San Francesco, Schiavona, Voccuccia di Fracasso e delle seguenti cultivar non campane Arcot, Ninfa, Bella di Imola, Reale d'Imola, Tyrinka, Tyrinthos. Esempio 1
Nel seguito viene riportato un esempio di identificazione di cultivar campane da cultivar non campane che prevede l'amplificazione PCR del DNA estratto dalle foglie delle diverse cultivar di albicocco utilizzando l'oligonucleotide di 10 basi in precedenza indicato. E' preferibile eseguire l'estrazione del DNA su campioni di foglie non completamente distese (giovani) con il kit della QIAGEN (Dneasy Plant Tissue) . Bisogna poi determinare la concentrazione del DNA· estratto, poiché la quantità di DNA stampo da utilizzare negli esperimenti di amplificazione sia il più possibile precisa; tale concentrazione si trova tra 5 e 10 ng, preferibilmente 7,5 ng. Tale determinazione può essere effettuata mediante fluorimetria: si allestisce una curva con DNA standard di sperma di salmone {50μg/ml). I campioni di DNA sono preparati con un fluoroforo (Hoechst 33258: bisbenzimidazolo), diluito a 0,75μ9/ml1, in TNE filtrato (Tris 100 mM, 10 mM EDTA, 1.0 M NaCl, pH 7,4). Ogni campione viene diluito con TNE e portato ad un volume finale di 1 mi con la miscela TNE-fluoroforo . Al fluorimetro sono poi effettuate delle letture alla lunghezza d'onda di eccitazione 365 nm e di emissione 458 nm.
La miscela di reazione per PCR comprende 2,5 μl di un tampone termofilico (500mM KC1, lOOmM Tris-HCl pH 9,0, 1% Triton X-100), 2,5 μl di MgClz 25mM, 5 μl di dNTP (0,4 mM per ogni dNTP), 3,0 μl di ogni oligonucleotide (1,2 μΜ) fornito nel kit alla concentrazione di 10 μΜ, 2U di Taq polimerasi, 7,5 ng di DNA stampo. Il volume finale della miscela è di 25 μl e ad esso si aggiunge una goccia di olio minerale. Il programma per l'amplificazione mediante PCR è il seguente: dopo una iniziale denaturazione di 5 minuti a 94°C vengono eseguiti 45 cicli di reazione nel seguente ordine: 1) denaturazione a 94°C per 1 minuto; 2) ibridazione a 35°C per 2', 3) polimerizzazione a 72°C per 2 minuti. Al termine dei 45 cicli si effettua una ulteriore polimerizzazione di 4 minuti a 72°C. I prodotti di amplificazione ottenuti vanno poi analizzati su gel di agarosio al 2% contenente bromuro di etidio. La corsa elettroforetica (200 mV per 40 minuti) viene eseguita in tampone TAE (0,04 M Tris-acetato, 0,001 M EDTA pH 8,0) e i gels vengono analizzati al transilluminatore.
La differenziazione tra cultivar campane e non campane secondo la metodologia della presente invenzione è determinata dalla' presenza di una banda di amplificazione (di circa 400 paia di basi) presente solo nelle cultivar campane allorché viene utilizzato l 'oligonucleotide "marker" di sequenza (indicato anche 0L41).
Esempio 2
Caratterizzazione di singole cultivar campane e non campane all'interno di una popolazione la cui origine campana o non campana è già stata determinata. Secondo la presente invenzione il metodo è anche applicato a una serie di cultivar per le quali sono stati già sviluppati marker oligonucleotidici decamerici specifici. In particolare sono riconoscibili con la metodologia della presente invenzione le seguenti cultivar campane: Baracca, Cafona, Ceccona, Cerasona, Nennella, Pellecchiella, Piciona, Pollastrella, Portici, Prete, Prete bello, San Francesco, Schiavona, Voccuccia di Fracasso e le seguenti cultivar non campane: Arcot, Ninfa, Bella di Imola, Reale di Imola, Tyrinka, Tyrinthos.
Per l'identificazione tra le precedenti varietà delle varietà Arcot, Cafona, Tyrinka e Tyrinthos viene impiegato il marker di sequenza 5'AAGGCTCACC3 ' {indicato come OL39); per l'identificazione delle varietà Baracca, Cerasona, Piciona, Portici, San Francesco e Schiavona viene utilizzato il marker di sequenza
(indicato come 0L3); per le varietà Bella di Imola, Ninfa, Pellecchiella, Reale d'Imola e Voccuccia di Fracasso viene utilizzato il marker di sequenza
(indicato come OL28); per le varietà
Ceccona, Pollastrella, Prete e Tyrinka viene utilizzato il marker (indicato come 0L4)? per le varietà Nennella, Prete bello viene utilizzato il marker (indicato come OL44). La tecnica e la metodologia da seguire sono analoghe a quelle riportate nell'Esempio 1.
La certificazione delle cultivar oggetto di studio è determinata dal confronto dei profili di amplificazione ottenuti con quello del controllo (cultivar certificate inserite nel kit).
Per l'ottenimento dei risultati della presente invenzione è necessario standardizzare la metodica soprattutto per quanto riguarda una serie di parametri. Pertanto secondo la presente invenzione viene utilizzata una concentrazione minima di DNA genomico di 5-10 ng, preferibilmente 7,5 ng, una concentrazione definita di oligonucleotide primer di 0,6-2,0 μΜ, preferibilmente 1,2 μΜ, una concentrazione di ioni magnesio sotto forma di MgCl2 di 2-3 mM (preferibilmente 2,5 mM) e un thermocycler di tipo PTC-100-MY-Research.Inc-Genenco) .
Formano ulteriore oggetto della presente invenzione kit da usarsi in metodiche RAPD-PCR sia per l'identificazione dell'appartenenza di una cultivar alle cultivar campane sia per la determinazione all'interno del gruppo delle cultivar campane e non campane, di una particolare cultivar. Il kit sostanzialmente prevede una quantità operativamente adatta di un oligonucleotide e un campione di DNA sia di una cultivar campana e, oppure di una particolare cultivar campana o non campana (a seconda che il kit sia indirizzato alla distinzione tra varietà campane e non campane oppure alla identificazione di una particolare varietà all'interno delle varietà campane e non campane). Nel caso della distinzione tra varietà campane e non campane l'oligonucleotide impiegato è quello identificato all'interno della presente descrizione con il termine 0L41; nel caso di distinzione tra più varietà il marker è scelto tra la classe di oligonucleotidi caratterizzati dalle sigle 0L3, 0L4, OL28, OL39 e OL44 così come indicate all'interno della presente descrizione.
Secondo gli oligonucleotidi presenti nel kit esso può essere impiegato per uso simultaneo sequenziale o combinato in almeno uno dei metodi sopra descritti.
Esempio 3
Identificazione di cultivar di albicocco campane da cultivar non campane.
Provetta n. 1: Oligonucleotide identificato quale marker, 0L41 (sequenza: , 10 μΜ) Provetta n. 2: DNA estratto da una cultivar certificata campana (controllo positivo, 5 ng/μl).
Il tampone termofilico, la TAQ, il cloruro di magnesio, i dNTP possono essere acquistati separatamente alla PROMEGA ed utilizzati alle concentrazioni indicate nel kit.
Allestimento di ciascun campione per l'esperimento di RAPD-PCR:
• 2,5 μl di tampone termofilico (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 9, 1% Triton X-100)
• 2,5 μl di MgCl2 (2,5 mM finale)
• 5 μl di una soluzione di dNTP* (2,0 mM di ciascun dNTP; 0,4 mM finale nel saggio) ;• 3 μl dell'oligonucleotide (provetta n. 1) ;• 2 U di TAQ ;• 7,5 ng di DNA stampo (estratto dalla cultivar che si vuole certificare) ;Portare al volume finale di 25 μl con H20 distillata ;Per i controlli positivi al DNA stampo vanno sostituiti 1,5 μl dalla provetta n. 2. ;• La soluzione di dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP, 100 mM) è preparata unendo nello stesso tubo volumi uguali di ciascun nucleotide (la soluzione ottenuta risulterà 25 mM di ciascun nucleotide) e diluendo ulteriormente tale soluzione 12,5 volte con H20 distillata (es. 10 μl di soluzione 115 μl di H20). ;Esempio 4 ;Identificazione di differenti cultivar di albicocco campane e non campane in cui vengono inseriti gli oligonucleotidi identificati quali "markers" delle differenti cultivar {come da tabella inserita al punto 1) ed il DNA estratto da tali cultivar (certificate) da utilizzare come controlli positivi nei saggi di amplificazione mediante RAPD-PCR. ;Provetta n. 1: 0L3 , 10 μΜ), marker di Baracca, Cerasona, Piciona, Portici, San Francesco, Schiavona. ;Provetta n. 2: 0L4 10 μΜ) , marker di Ceccona, Pollastrella, Prete,’Tyrinka. ;Provetta n. 3: 0L28 10 μΜ), marker di Bella d'Imola, Ninfa, Pellecchiella, Reale d'Imola, Voccuccia di Fracasso.· ;Provetta n. 4: OL39 , 10 μΜ), marker di Arcot, Cafona, Tyrinka, Tyrinthos. ;Provetta n. 5: OL44 10 μΜ), marker di Nennella, Prete bello. ;Provetta Arcot: DNA estratto dalla cultivar certificata Arcot (controllo positivo, 5 ng/μl) Provetta Baracca: DNA estratto dalla cultivar certificata Baracca (controllo positivo, 5 ng/μl) Provetta Bella d'Imola: DNA estratto dalla cultivar certificata Bella d'Imola (controllo positivo, 5 ng/μl) ;Provetta Cafona: DNA estratto dalla cultivar certificata Cafona (controllo positivo, 5 ng/μl) Provetta Ceccona : DNA estratto dalla cultivar certificata Ceccona (controllo positivo, 5 ng/μl) Provetta Cerasona: DNA estratto dalla cultivar certificata Cerasona (controllo positivo, 5 ng/μl) Provetta Nennella: DNA estratto dalla cultivar certificata Nennella (controllo positivo, 5 ng/μl) Provetta Ninfa: DNA estratto dalla cultivar certificata Ninfa (controllo positivo, 5 ng/μl) Provetta Pellecchiella: DNA estratto dalla cultivar certificata Pellecchiella (controllo positivo, 5 ng/μl) ;Provetta Piciona: DNA estratto dalla cultivar certificata Piciona (controllo positivo, 5 ng/μl) Provetta Pollastrella: DNA estratto dalla cultivar certificata Pollastrella (controllo positivo, 5 ng/μl) ;Provetta Portici: DNA estratto dalla cultivar certificata Portici (controllo positivo, 5 ng/μl) Provetta Prete. DNA estratto dalla cultivar certificata Prete (controllo positivo, 5 ng/μl) Provetta Prete bello: DNA estratto dalla cultivar certificata Prete bello (controllo positivo, 5 μl) Provetta Reale d'Imola: DNA estratto dalla cultivar certificata Reale d'Imola (controllo positivo, 5 ng/μl) ;Provetta San Francesco: DNA estratto dalla cultivar certificata San Francesco (controllo positivo, 5 ng/μl) ;Provetta Schiavona: DNA estratto dalla cultivar certificata Schiavona (controllo positivo, 5 ng/μl) Provetta Tyrinka : DNA estratto dalla cultivar certificata Tyrinka (controllo positivo, 5 ng/μl) Provetta Tyrinthos: DNA estratto dalla cultivar certificata Tyrinthos (controllo positivo, 5 ng/μl) Provetta Voccuccia di Fracasso: DNA estratto dalla cultivar certificata Voccuccia di Fracasso (controllo positivo, 5 ng/μl) ;Il tampone termofilico, la TAQ, il cloruro di magnesio, i dNTP possono essere acquistati separatamente alla PROMEGA ed utilizzati alle concentrazioni indicate nel kit ;Allestimento di ciascun campione per l'esperimento di RAPD-PCR: ;• 2,5 μl di tampone termofilico (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 9, 1% Triton X-100) ;• 2,5 μl di MgCl2(2,5 mM finale) ;• 5 μl di una soluzione di dNTP (2,0 mM di ciascuna dNTP; 0,4 mM finale nel saggio) ;• 3 μl dell'oligonucleotide (provette n. 1-5) • 2 U di TAQ ;• 7,5 ng di DNA stampo (estratto dalla cultivar che si vuole certificare) ;Portare al volume finale di 25 μl con H20 distillata ;Per i controlli positivi al DNA stampo vanno sostituiti 1,5 μl dalle provette contenenti i DNA di riferimento. ;*La soluzione di dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP, 100 mM) è preparata unendo nello stesso tubo volumi uguali di ciascun nucleotide (la soluzione ottenuta risulterà 25 mM di ciascun nucleotide) e diluendo ulteriormente tale soluzione 12,5 volte con H20 distillata (es. 10 μl di soluzione 115 μl di HzO).
Nel caso di identificazione di una cultivar ignota, oltre ad allestire i campioni di RAPD-PCR con il DNA genomico estratto da tale cultivar, dovranno essere eseguiti controlli con il DNA di tutte le cultivar fornite nel Kit utilizzando uno qualsiasi degli oligonucleotidi del Kit, per poter confrontare i profili di amplificazione del campione che si vuole certificare con quello dei controlli. L'analisi può terminare qui se è utilizzato l'oligo marker della cultivar in esame, oppure richiedere la replica dell'esperimento con un altro oligo inserito nel kit e così via.
Nel caso di verifica della identità di una determinata cultivar si può scegliere per l'amplificazione RAPD-PCR direttamente l'oligo marker e allestire il controllo solo col DNA della stessa cultivar già certificata, inserito nel kit.
Claims (12)
- RIVENDICAZIONI. 1. Metodo per l'identificazione di cultivar campane di Prunus Armeniaca da cultivar non campane, con impiego della tecnica RAPD-PCR, caratterizzato dal fatto di impiegare un primer costituito dall'oligonucleotide decamerico
- 2. Oligonucleotide decamerico
- 3. Metodo per l'identificazione attraverso la metodica RAPD-PCR di specifiche cultivar campane e non campane, riconosciute come tali dal metodo di cui alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di impiegare un primer scelto dalla seguente classe di oligonucleotidi decamerici:
- 4. Metodo secondo le rivendicazioni 1 o 3, in cui dette varietà campane appartengono alla classe formata da Baracca, Cafona, Ceccona, Cerasona, Nennella, Pellecchiella, Piciona, Pollastrella, Portici, Prete, Prete bello, San Francesco, Schiavona, Voccuccia di Fracasso e dette varietà non campane appartengono alla classe formata da Arcot, Ninfa, Bella di Imola, Reale d'Imola, Tyrinka, Tyrinthos.
- 5. Oligonucleotide decamerico
- 6. Oligonucleotide decamerico
- 7. Oligonucleotide decamerico
- 8. Oligonucleotide decamerico
- 9. Oligonucleotide decamerico
- 10. Kit per metodica RAPD-PCR per la determinazione dell'appartenenza di una cultivar all'insieme delle cultivar campane comprendente una quantità operativamente adatta di un oligonucleotide quale rivendicato nella rivendicazione 2 e di un campione di DNA di una cultivar campana assieme a quantità di tampone termofilico, di TAQ, di cloruro di magnesio, per uso sequenziale simultaneo o combinato nel metodo secondo la rivendicazione 1.
- 11. Kit per metodica RAPD-PCR per la determinazione di una particolare cultivar all'interno di una popolazione di cultivar campane o all'interno di una popolazione di cultivar non campane comprendente almeno un primer decamerico e almeno un campione di DNA della cultivar da identificare, per uso simultaneo sequenziale o combinato in un metodo RAPD-PCR.
- 12. Kit secondo la rivendicazione 11, in cui detto almeno un primer decamerico è scelto dalla classe formata dae detta cultivar campana o non campana appartiene alla classe formata dalle seguenti cultivar campane: Baracca, Cafona, Ceccona, Cerasona, Nennella, Pellecchiella, Piciona, Pollastrella, Portici, Prete, Prete bello, San Francesco, Schiavona, Voccuccia di Fracasso e dalle seguenti cultivar non campane: Arcot, Ninfa, Bella di Imola, Reale d'Imola, Tyrinka e Tyrinthos, per uso simultaneo sequenziale o combinato nel metodo secondo la rivendicazione 3.
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