ITRM20000327A1 - Proteina di fusione, particelle virali chimeriche che la espongono sul capside, piante infettate con tali particelle, loro usi e composizion - Google Patents
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo: "PROTEINA DI FUSIONE, PARTICELLE VIRALI CHIMERICHE CHE LA ESPONGONO SUL CAPSIDE, PIANTE INFETTATE CON TALI PARTICELLE, LORO USI E COMPOSIZIONI CHE LI COMPRENDONO"
DESCRIZIONE
Campo dell'invenzione
La presente invenzione si riferisce al campo dei virus vegetali ricombinanti, che esprimono sulla loro superficie regioni antigeniche di proteine appartenenti ad organismi patogeni virali o batterici, ed al loro uso come immunogeni.
Stato della tecnica
Virus vegetali ricombinanti che presentano sulla superficie peptidi antigenici di origine eterologa sono noti in arte, così come il loro uso a scopo vaccinale (1,2).
Si tratta in particolare di virus vegetali asimmetria icoasedrica (CPMV: cowpea mosaic virus; TBSV: Tornato Bushy Stunt Virus) o elicoidale (PVX: Potato virus X; TMV : Tobacco Mosaic Virus; AMV: Alfalfa Mosaic Virus), i quali vengono ingegnerizzati in modo da presentare il peptide antigenico fuso all'estremità C- o N- terminale della CP (proteina del capsìde), sito generalmente localizzato nella parte esterna dello stesso capside, in modo da assicurare al peptide la massima esposizione.
In considerazione delle loro caratteristiche fisico-chimiche e delle loro proprietà biologiche tali particelle virali ricombinanti costituiscono un progresso rispetto ad altri sistemi di immunizzazione noti in arte. I vettori virali vegetali ricombinanti infatti generalmente:
non comportano problemi di sicurezza propri invece dei vaccini tradizionali basati sul patogeno ucciso oppure dello stesso vivo, ma attenuato nella sua virulenza, che pure si caratterizzano per una particolare efficacia;
presentano tendenzialmente, al contempo, una buona immunogenicità ed un basso costo, a differenza dei vaccini basati su sub-unità antigeniche del patogeno purificate, che pure si caratterizzano per una notevole sicurezza di impiego;
comportano la presentazione dell'epitopo senza modifiche chimiche, a differenza dei vaccini in cui la proteina antigeriica è prodotta mediante la tecnologia del DNA ricombinante in sistemi eterologhi;
non sono vincolati alla somministrazione per via parenterale a differenza dei vaccini tradizionali ma anche di quelli a sub-unità o basati sul determinate antigenico, dato che possono generalmente essere somministrati sia per via intra-nasale, sia per via orale (3,4).
Il perfezionamento e la messa a punto di virus vegetali ricombinanti ha messo in luce una serie di problemi riguardanti la costruzione e la funzionalità delle particelle virali chimeriche. In particolar modo:
la presenza nel capside di proteine chimeriche può determinare spesso problemi per l'assemblaggio della particella virale ricombinante, che può essere inibito così come anche il movimento della particella a lunga distanza. Sia la lunghezza che le caratteristiche chimico-fisiche del peptide esogeno (determinante antigenico)<' >sono fattori che concorrono alla costituzione della particella virale chimerica. L'autoassemblaggio della CP virale ricombinante, infatti, può essere impedito o reso difficoltoso sia per ragioni di ingombro sterico dovuto alle dimensioni del polipeptide fuso, sia per ragioni di carattere conformazionale del peptide esogeno (determinante antigenico), dovute alla sua natura e non alle sue dimensioni. In entrambi i casi, ciò rende incompatibili le interazioni tra le varie molecole di CP ricombinanti con conseguente inibizione del loro assemblaggio. Inoltre, la presenza del peptide esogeno (determinante antigenico) può tradursi in una inibizione del trasporto delle particelle virali chimeriche dal luogo di infezione primaria al resto della pianta, che avviene attraverso le interazioni tra il virione formato e altre proteine codificate da geni virali.
il virus ricombinante può presentare problemi di stabilità ed in particolare esso stesso può ricombinare all'interno della cellula vegetale. La ricombinazione avviene per selezione di mutanti per delezione di regioni peptidiche che causano l'inibizione dell'assemblaggio, che comporta, nella maggior parte dei casi, la perdita del peptide esogeno (determinante antigenico) unitamente a qualche aminoacido della CP virale.
Inoltre, quand'anche si riesca ad ottenere una particella virale chimerica stabile che non ricombina all'interno della cellula, possono sorgere problemi relativi all'antigenicità e all'immunogenicità dell'epitopo esposto sulle particelle virali chimeriche. In particolare:
l'esposizione dell'epitopo sul capside può essere tale da mantenere la sua antigenicità, ma conferire alla particella virale una scarsa o nulla immunogenicità; in tal senso può essere necessaria la somministrazione di un adiuvante.
le particelle virali ricombinanti sebbene dotate di immunogenicità possono non essere in grado di suscitare la produzione di anticorpi neutralizzanti .
In particolare i problemi di assemblaggio e stabilità hanno caratterizzato lo sviluppo di particelle di virus X della patata (PVX) (5) che presentino esposte nel capside proteine di fusione comprendenti la CP (proteina del capside) ed un peptide di interesse. Infatti vettori derivati dal virus PVX sono noti in arte e largamente utilizzati per esprimere in <' >piante proteine eterologhe derivanti dall'espressione di geni clonati nel vettore virale in assetto autonomo e non come parti di fusione della CP.
Unica eccezione è costituita dalla costruzione di una CP virale fusa al peptide 2A del "foot-andmouth disease virus" (FMDV). Questo peptide ha la funzione di catalizzare con buona efficienza la scissione del legame peptidico di qualsiasi proteina o peptide ad esso fuso. Ciò permette di esprimere nelle piante CP chimeriche e CP normali, le quali nel loro assemblaggio includono le CP chimeriche. Con questo vettore modificato sono state ottenute CVPs che trasportano una proteina reporter (GFP) (6), ma nessun esempio è stato riportato circa la possibilità di utilizzare tale vettore come "sistema di presentazione" di epitopi a scopo vaccinale, né semplicemente che particelle così ottenute mostrino immunogenicità. In tal senso è comunque necessario sottolineare come in seguito alla adozione di questa procedura nella formazione della particella virale sono preferite le CP non ricombinanti rispetto alle CP ricombinanti. Ciò fa sì sia privilegiato l'assemblaggio di CP normali e che comunque in esito alla adozione di questa tecnica le particelle virali che presentano CP ricombinanti nel capside le presentino ad una concentrazione particolarmente bassa.
In tal senso non sorprende che il virus PVX ricombinante con le tecniche note in arte non sia stato fino a adesso utilizzato come sistema di presentazione di antigene.
Infatti la impossibilità di presentare una certa quantità di determinanti antigenici della presente invenzione esposti sul capside costituisce un ostacolo di rilievo ai fini della utilizzazione del virus per scopi vaccinali posto che è ben noto in arte che ai fini della immunizzazione è necessario disporre di un sistema di presentazione che concentri il maggior numero di determinanti antigenici sulla superficie.
Ciò è valido per qualsiasi determinante antigenico, a maggior ragione i determinanti di agenti patogeni difficilmente neutralizzabili come ad esempio HIV.
HIV è notoriamente infatti uno dei patogeni più difficili da contrastare anche mediante terapia vaccinale, ed una serie enorme di difficoltà ha fino ad oggi impedito la elaborazione di un vaccino profilattico anti-HIV efficace. Tali difficoltà derivano innanzitutto dall'alto grado di variabilità delle regioni più fortemente immunogeniche della proteina di rivestimento virale gpl20 e dall'inaccessibilità da parte del sistema immunitario verso alcuni epitopi della proteina gp41 cruciali per l'ingresso del virus nella cellula bersaglio, oltre che dalla sua natura retrovirale .
Per HIV in particolare, inoltre, sembra che la capacità di ottenere una risposta non solo umorale ma anche cellulo-mediata sia presupposto imprescindibile per l'acquisizione dell'immunità al virus (7,8) anche se risposte umorali efficaci sembrano comunque essere importanti per la prevenzione dell'infezione (9,10).
La produzione di anticorpi neutralizzanti il virus, si è rivelata particolarmente difficoltosa. In tal senso non solo nei pazienti sieropositivi tali anticorpi sono generalmente presenti a titoli molto bassi (11,12), ma preparazioni di sieri policlonali da questi individui non hanno anche mostrato un elevato grado di protezione in esperimenti di immunizzazione passiva in modelli animali sperimentali.
Una serie di prospettive è stata comunque aperta dalla individuazione di un epitopo della proteina di rivestimento gp41 del virus HIV-1 che mappa nella porzione C-terminale dell'ectodominio della gp41 stessa e che è altamente conservato tra i vari sottotipi di HIV (il che lo rende candidato alla formulazione di un vaccino multicomponente) (9). Questo epitopo viene riconosciuto da un anticorpo monoclonale, denominato 2F5, dimostratosi in grado di neutralizzare un largo spettro di ceppi di laboratorio e isolati primari divergenti di HIV-1 (13), e di proteggere efficacemente dall'infezione macachi esposti a dosi infettanti di SHIV in seguito a trasferimento passivo dell'anticorpo stesso per via vaginale, singolarmente o in forma combinata con altri due anticorpi monoclonali neutralizzanti (14,15).
Nonostante questi dati positivi non è stato fino ad ora possibile costruire una sistema di esposizione di tale epitopo capace di suscitare una risposta immunitaria efficace. Sulla base di conoscenze ormai acquisite circa l'inefficacia di metodi di immunizzazione basati su peptidi come tali, sono stati utilizzati sia metodi di esposizione dell'epitopo su antigeni di superficie di virus animali (16,17), sia metodi di coniugazione a proteine "carrier" (18). Nel primo caso, si sono ottenuti risultati interessanti se 1'epitopo viene esposto nel sito immunogenico dell'antigene emagglutinina del virus dell'influenza, dimostrando che al di fuori del suo contesto naturale 1'epitopo può indurre risposte anticorpali neutralizzanti. Nel secondo caso è stato invece dimostrato che se il peptide viene coniugato all'albumina di siero bovino (BSA) in singola copia, le risposte anticorpali che si ottengono sono notevolmente inferiori rispetto allo stesso carrier che contenga copie multiple dell'epitopo, avvalorando l'ipotesi secondo la quale il sistema immunitario viene stimolato in maniera differente dipendentemente dal numero di molecole di un determinato epitopo con cui viene ad interagire .
Sommario dell'invenzione
Le difficoltà ed i problemi evidenziati nella parte che precede sono superati dalla presente invenzione, che ha per oggetto una proteina di fusione comprendente:
- una porzione amino-terminale comprendente un determinante antigenico avente un numero di residui aminoacidici minore o uguale a 35 ed una percentuale di aminoacidi idrofilici tale da conferire solubilità in ambiente acquoso a detto determinante antigenico, e
- una porzione carbossi-terminale comprendente una proteina del capside di un virus PVX o una variante di detta proteina del capside,
detta porzione amino-terminale essendo fusa a detta porzione carbossi-terminale in modo che detto determinante antigenico è in fase con detta proteina del capside o con detta variante.
Tale proteina di fusione ha mostrato infatti in presenza di un polinucleotide avente le funzioni del genoma di PVX, ed in particolare in presenza di genomi di PVX ricombinanti codificanti anche per la proteina di fusione stessa, di assemblarsi dando origine ad una particella virale correttamente assemblata e quindi stabile.
Il corretto assemblaggio è dimostrato dalla capacità del virione chimerico di manifestare tutte le fasi della sintomatologia infettiva sia in termini di diffusione spaziale, sia nella cinetica temporale, in maniera del tutto comparabile al virione di tipo selvatico. In tal senso, le particelle virali chimeriche ottenute mostrano una stabilità analoga a quelle naturali, come dimostrato dal fatto che dopo ripetuti cicli di infezione e produzione le sequenze esogene vengono mantenute intatte sia a livello genomico, sia nel capside, non riscontrando riarrangiamenti o delezioni di sequenze nucleotidiche o aminoacidiche .
Per la costruzione delle proteine di fusione della presente invenzione possono essere utilizzati determinanti antigenici derivati da agenti patogeni di natura sia batterica che virale, in particolare da virus appartenenti alle famiglie caliciviridae, togaviridae, flaviviridae, coronaviridae, arenavirìdae, reoviridae, hepadnaviridae, parvoviridae, papovaviridae, adenoviridae, herpeviridae, poxviridae, picornaviridae, ortho e paramyxoviridae, rhabdoviridae, bunyaviridae e retroviridae .
In particolare i determinanti antigenici della proteina di fusione della presente invenzione sono determinanti antigenici per un agente patogeno scelti da gruppo costituito da HIV, HCV, EBV e virus influenzale, più in particolare i determinanti derivati da antigeni scelti dal gruppo costituito da gpl20 di HIV, gp41 di HIV, EBNA-3A di EBV, EBNA-3B di EBV, EBNA-3C di EBV, proteina della matrice del virus influenzale, emagglutinina del virus influenzale, NS3 di HCV, E2 di HCV ed E1 di HCV; specificamente i determinanti antigenici aventi una sequenza riportata nella lista di sequenze annessa da SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, e da SEQ ID NO:17 a SEQ ID NO:30. Devono comunque intendersi incluse nella presente invenzione anche mimotopi di tali determinanti antigenici, epitopi cioè che, pur avendo differente struttura primaria rispetto agli epitopi cui vengono riferiti, sono caratterizzati da una struttura secondaria e terziaria tale da mostrare proprietà antigeniche e immunogeniche del tutto comparabili alla loro relativa controparte.
Le particelle chimeriche virali aventi sul capside le proteine di fusione della presente invenzione che comprendono nella parte aminoterminale i determinanti antigenici sopra elencati (ma tale considerazione si estende in base alle conoscenza di cui allo stato della tecnica o i relativi mimotopi oltre ai vantaggi sopra elencati) sono infatti sorprendentemente buoni immunogeni, comprovata dal buon esito di test ELISA condotti con anticorpi specifici e con sieri prelevati da topi immunizzati mediante le particelle virali ricombinanti della presente invenzione.
Di particolare interesse sono le proteine di fusione comprendenti nella porzioni amino-terminale l'epitopo di sequenza SEQ ID NO:1 (vedi infra) Per quanto riguarda la porzione carbossi-terminale della proteina di fusione della presente invenzione, è stata utilizzata la proteina del capside del ceppo X3 di PVX, ma essa può essere costituita dalla proteina del capside (CP) di un qualunque ceppo del virus PVX, ma anche da una sua variante. Per variante della proteina del capside di PVX ai fini della presente invenzione si intende un qualunque polipeptide, ad esempio corrispondente o comprendente un mutante ovvero una parte di tale proteina, capace di assicurare in presenza di un polinucleotide avente le funzioni del genoma di PVX in un ambiente adatto, l'assemblaggio della particella virale chimerica. In particolare sono compresi polipeptidi che costituiscono parte della proteina del capside, ed anzi il polipeptide aventi gli aminoacidi 4-292 della proteina stessa deve considerarsi una forma di realizzazione preferita.
Sono incluse nella presente invenzione anche le varianti delle proteine di fusione della presente invenzione. Per variante della proteina di fusione della presente invenzione deve intendersi ogni polipeptide che corrisponde o comprende un mutante di tale proteina ovvero parte di essa, in quanto capace in presenza di un polinucleotide avente le funzioni del genoma di PVX di dare luogo a particelle chimeriche virali capaci di assemblarsi correttamente e/o di presentare immunogenicità .
Oggetto della presente invenzione sono anche tutti i polinucleotidi (costituiti da DNA RNA o cDNA naturali o sintetiche) codificanti per le proteine di fusione della presente invenzione ovvero per loro varianti. Di particolare interesse è il caso in cui tali polinucleotidi codificanti per le proteine di fusione della presente invenzione sono inclusi in polinucleotidi aventi le funzioni del genoma di PVX, o coesistenti essi stessi nel genoma di un virus PVX a formare genomi PVX ricombinanti ovvero loro equivalenti funzionali, i quali devono considerarsi anch'essi oggetto della presente invenzione.
Oggetto della presente invenzione sono anche particelle chimeriche virali che presentano sul capside almeno una delle proteine di fusione della presente invenzione ovvero una loro variante. In particolare sono preferite le particelle che includono nel capside un genoma ricombinante codificante anche per la proteina di fusione della presente invenzione e/o per una sua variante.
Tali particelle oltre ai vantaggi tipici delle particelle virali vegetali elencate nella esposizione di cui allo stato della tecnica (in particolare sicurezza per mammiferi ed uomo), presenta una notevole stabilità e capacità di corretto assemblaggio. Soprattutto comunque esso presenta il notevole vantaggio ai fini della immunizzazione di presentare al sistema immunitario dell'ospite numerose molecole di peptide immunogenico concentrate su un'unica particella che funge in tal modo da "carrier". Il virione vegetale arriva ad essere costituito da circa 1500 molecole di CP ricombinanti che espongono altrettante molecole di peptide-determinante antigenico, con evidenti vantaggi alla luce delle conoscenze dello stato della tecnica.
Le particelle chimeriche della presente invenzione mostrano tutte infatti, oltre ad una notevole stabilità anche una sorprendente capacità immunogenica .
In particolare tra tutte le particelle virali chimeriche prodotte, quella contenente l'epitopo riconosciuto dall'anticorpo monoclonale 2F5 (EDLEKWAS SEQ ID NO: 1) in seguito ad esperimenti di immunizzazione in topi immunocompetenti, oltre che essere estremamente stabile ha mostrato la capacità di dare luogo ad una ottima risposta immunitaria, sia dal punto di vista della specificità, che dei titoli anticorpali. Infatti, solo i sieri dei topi immunizzati con le CVPs (particelle virali chimeriche) mostrano una reattività nei confronti del peptide ELDKWAS, con titoli anticorpali comparabili a quelli riportati in protocolli sperimentali utilizzando sistemi tradizionali di presentazione dell'epitopo (17, 18, 19), che comportano i problemi di sicurezza e costi di produzione della tecnica nota che ne limitano l'eventuale utilizzo a scopo vaccinale. I risultati sono illustrati estesamente in seguito e schematizzati nelle figure 6 e 7.
Inoltre, tali particelle, che costituiscono una forma di realizzazione preferita, hanno mostrato la capacità di riprodursi seguendo una cinetica più rapida di quelle di tipo selvatico (il tempo di comparsa della sintomatologia dell'infezione è anticipato di circa 1/3) e le rese che si ottengono nella preparazione delle CVPs sono raddoppiate (essendo di 0.4-0.5 mg/g di tessuto fresco per PVX-2F5 e di 0.2-0.3 mg/g di tessuto fresco per PVX) rispetto a quelle di particelle non chimeriche, a parità di condizioni utilizzate sia per l'infezione, sia per la purificazione.
In ogni caso un vantaggio delle particelle chimeriche della presente invenzione è infatti dato dalla possibilità di somministrare tali particelle non solo per via parenterale ma anche per via mucosale, intranasale e/o orale. In seguito alla somministrazione delle particelle della presente invenzione per tali vie è conseguito il ritrovamento di IgA specifiche per 1'iramunogeno sia sieriche che secretorie dopo immunizzazione per via intranasale, che conferma la validità della strategia per indurre immunità sia a livello mucosale, sia sistemico. E' da sottolineare che il risultato è stato raggiunto con quantità di immunogeno relativamente bassa (50 μ9/άθ3θ/3ε^ ίπιβη3) e senza l'utilizzo di adiuvante. Tali risultati risultano notevolmente migliorati ricorrendo all 'utilizzo di citochine immunomodulstorie come adiuvanti. In particolare 1 'interferon di tipo I utilizzato come adiuvante nelle strategie vaccinali che utilizzano le particelle chimeriche della presente invenzione producono un effetto sorprendente di potenziamento della risposta immunitaria, sia umorale che cellulo-mediata . In tal senso, tali adiuvanti, ma anche ogni altro adiuvante individuabile dal tecnico del ramo in base alle sue conoscenze, non solo possono essere forniti unitamente alla particella in composizioni appositamente preparate, le quali devono considerarsi incluse nella presente invenzione, ma possono essere prodotti negli stessi ospiti vegetali nei quali viene prodotto la particella virale chimerica immunogena. In tal senso incluso nell'oggetto della presente invenzione è anche un kit per la immunizzazione di un mammifero ed, in particolare, di esseri umani comprendente
- una composizione come quelle sopra descritte non comprendenti un adiuvante; ed
- una composizione comprendente un adiuvante unitamente ad un veicolo farmaceuticamente compatibile ,
laddove dette composizioni mescolate insieme danno luogo ad una composizione utilizzabile per la immunizzazione di detto mammifero.
Particolarmente sorprendente si è dimostrata la risposta anticorpale, ottenuta con le particelle virali chimeriche della presente invenzione, nei confronti di HIV, valutata come attività in grado di inibire l'infezione di HIV in saggi di neutralizzazione in vitro. I titoli di neutralizzazione si collocano in un ambito da 1/40 a 1/120, corrispondenti alle diluizioni limite alle quali i sieri mostrano una inibizione dell'infezione del 90%,secondo la risposta individuale degli animali.
In tal senso le particelle chimeriche virali della presente invenzione che espongono sul capside determinanti antigenici per HIV ed in particolare il determinante antigenico di SEQ ID N0:1, costituiscono forme di realizzazione particolarmente preferite.
Un ulteriore vantaggio delle particelle virali chimeriche della presente invenzione, è il fatto che esse costituiscono un sistema di veicolazione dell'antigene particolarmente efficace, suscettibile sia di somministrazione parenterale che di somministrazione intranasale o orale.
Ciò costituisce un notevole vantaggio in considerazione dell'uso della particella della presente invenzione a scopi vaccinali. La somministrazione per via parenterale comporta infatti una reazione solo al livello sistemico e non al livello delle mucose. In tal senso dato che è ben noto che la maggior parte dei patogeni utilizza le vie mucosali come vie d'accesso dell'ospite, strategie di vaccinazione che contemplino l'induzione di una risposta immune mucosale presentano il vantaggio di consentire una risposta anticorpale immediata all'agente patogeno.
Una tale risposta può essere provocata in seguito alla somministrazione dell'antigene direttamente nelle mucose ovvero per via intranasale o orale, modalità di somministrazione quest'ultima di per sé particolarmente agevole e vantaggiosa .
Secondo la presente invenzione 1'immunogeno può essere somministrato anche senza procedure di purificazione direttamente per via orale, veicolato dal tessuto della pianta edibile. Al fine di ottenere un'efficiente immunizzazione attraverso la via orale devono essere superati diversi ostacoli, quali la degradazione dell'irnmunogeno a pH acido o da parte di proteasi del tratto gastrointestinale e la breve esposizione dell'irnmunogeno ai siti deputati alla risposta immunitaria. Da questo punto di vista, studi recenti (2) dimostrano che i sistemi vegetali possono funzionare come strumenti efficaci per la produzione e la somministrazione di vaccini. Inoltre, al pari dei sistemi basati su liposomi e microcapsule, è quanto mai atteso che le cellule vegetali possano naturalmente proteggere e veicolare 1'antigene in esse contenuto, permettendone il rilascio nel tratto gastrointestinale e favorendo la sua presentazione al sistema linfoide ad esso associato. Questo aspetto ha delle implicazioni notevoli, specialmente per gli agenti infettivi trasmessi attraverso le mucose e per i quali un'immunità locale assume un'importanza cruciale. Inoltre la somministrazione per via orale è in generale più agevole e non traumatica soprattutto in soggetti quali anziani e bambini.
Ulteriori vantaggi della presente invenzione consistono nel fatto che la particella virale così prodotta costituisce un sistema di produzione dell'antigene caratterizzato da costi molto bassi, dato che è richiesta esclusivamente l'infezione di ospiti vegetali e la loro crescita in serre controllate, e che garantiscono alta sicurezza del prodotto da somministrare.
Ospiti vegetali della presente invenzione possono essere piante monocotiledoni e dicotiledoni, o un qualsiasi tessuto o parte di esse. In particolare, sono comprese nell'oggetto della presente invenzione cellule o protoplasti, derivate dalle piante della presente invenzione, che esprimano le particelle virali della presente invenzione, anche costituite in aggregati cellulari o tessuti.
Date le proprietà sopra indicate inclusi nella presente invenzione sono quindi anche le particelle virali della presente invenzione ovvero le piante o cellule vegetali che le comprendono per uso come medicamento. In particolare costituisce oggetto della presente invenzione l'uso di tali particelle per la preparazione di medicamenti utilizzabili nel trattamento preventivo di malattie infettive in particolare AIDS, epatite virale, influenza e una patologia associata alla presenza del virus EBV.
Oggetto della presente invenzione sono anche le composizioni comprendenti almeno una proteina di fusione come sopra definito o una sua variante, almeno una particella virale come sopra definito o una sua variante, unitamente ad un veicolo compatibile. Un veicolo compatibile ai fini della presente invenzione è un qualsiasi veicolo tra quelli noti in arte, chimicamente e/o farmaceuticamente compatibile con il polipeptide e/o con la particella virale della presente invenzione .
Di particolare rilievo sono le composizioni che includono estratti, purificati e non, delle particelle virali chimeriche dalle piante come sopra definite.
In particolare, costituiscono oggetto della invenzione le composizioni sopra definite che consistono in vaccini comprendenti le particelle virali della presente invenzione. Sono da considerarsi incluse tutte le formulazioni che prevedono la purificazione delle particelle virali chimeriche, la preparazione delle stesse anche in forma non purificata e la loro somministrazione, a scopo vaccinale, attraverso le vie classiche e per via intra-nasale e orale.
La preparazione e somministrazione delle particelle della presente invenzione può essere eseguita tramite una qualsiasi tecnica tra quelle note in arte in quanto utilizzabile allo scopo. In particolare, è utilizzabile la tecnica di somministrazione che include la stimolazione di cellule dendritiche.
Le proteine di fusione, le particelle virali e le piante della presente invenzione possono essere quindi prodotte utilizzando procedimenti noti in arte. In generale, può essere utilizzata la tecnologia del DNA ricombinante per la costruzione delle CP virali fuse ai peptidi che costituiscono le proteine di fusione della presente invenzione, mediante una prima fase eseguita in E. coli e successivamente, mediante infezione degli ospiti vegetali con plasmidi contenenti il genoma ricombinante del virus, utilizzando metodiche classiche di virologia vegetale.
In particolare per la preparazione di una proteina di fusione della presente invenzione può essere utilizzato un procedimento comprendente le seguenti operazioni:
a. clonaggio della proteina del capside come sopra definita, in un vettore; e
b. clonaggio del determinante antigenico come sopra definito fuso a detta proteina del capside nel vettore risultante dalla operazione a.
La preparazione della particella chimerica virale della presente invenzione può essere effettuata mediante un procedimento comprendente la operazione di sostituzione della proteina del capside di un virus PVX, in detto virus PVX.
La pianta della presente invenzione può essere preparata mediante un procedimento, comprendente le seguenti operazioni:
al. infezione di una pianta con una particella virale della presente invenzione;
bl . coltivazione della pianta ottenuta in esito alla operazione alici. estrazione di detta particella virale da detta pianta.
Sono inoltre inclusi nell'oggetto della presente invenzione, l'uso della proteina di fusione, delle particelle chimeriche virali, della pianta e delle cellule vegetali della presente invenzione :
per la preparazione di farmaci per il trattamento di una patologia associata ad un agente patogeno di natura batterica o virale, in particolare per il trattamento dì una patologia associata ad un agente patogeno scelto dal gruppo costituito da HIV, HCV, EBV e virus influenzale; e - per la derivazione di metodi diagnostici per una patologia associata ad un agente patogeno di natura batterica o virale, in particolare per la derivazione di metodi diagnostici per una patologia associata ad un agente patogeno scelto dal gruppo costituito da HIV, HCV, EBV e virus influenzale.
Inoltre sono inclusi anche l'uso di una determinate antigenico o di una antigene come sopra definito, ovvero di una proteina del capside del virus PVX per la preparazione della proteina di fusione, della particella chimerica virale, della pianta oppure delle cellule vegetali della presente invenzione; l'uso della pianta della presente invenzione, per la produzione di una particella chimerica virale della presente invenzione.
L'invenzione verrà meglio descritta con l'ausilio delle figure annesse.
Descrizione delle figure
La figura 1 mostra lo schema della costruzione di PVX ricombinante, per la produzione di CVPs che espongono sulla loro superficie peptidi esogeni. La CP di tipo selvatico di PVX è stata clonata come frammento di restrizione Nhel-Xhol nei corrispondenti siti di pBS. Oligonucleotidi a doppia elica, codificanti per i peptidi esogeni sono stati fusi, in frame con la CP, utilizzando i siti Sall-Nhel. La CP chimerica così ottenuta è stata inserita nel genoma di PVX come frammento di restrizione Sall-Xhol.
La figura 2 mostra la foglia di una pianta di Nicotiana benthamiana infettata con il PVX-2F5 e con il PVX Wt (di tipo selvatico) come controllo. Il tempo di comparsa e la sintomatologia osservati sulle piante infettate con il PVX ingegnerizzato sono stati del tutto paragonabili a quelli ottenuti con il PVX Wt (di tipo selvatico). Estratti di foglie sistemiche sono state analizzate mediante RT-PCR. ed ELISA allo scopo di verificare la corretta espressione della sequenza clonata.
La figura 3 mostra l'esito di un saggio ELISA eseguito sulle particelle virali chimeriche estratte da piante infettate con PVX e PVX-2F5, utilizzando l'anticorpo monoclonale 2F5.
La figura 4 mostra la scheda di immunizzazione per via intra-nasale. I topi sono stati immunizzati con 50 μ9 di virus per dose. Le frecce rivolte verso il basso indicano i prelievi effettuati, le frecce rivolte verso l'alto le dosi di virus somministrate, i numeri rappresentano i giorni dalla prima dose.
La figura 5 mostra la scheda di immunizzazione per via intra-peritoneale. I topi sono stati immunizzati con 50 μg di virus per dose. Le frecce rivolte verso il basso indicano i prelievi effettuati, le frecce rivolte verso l'alto le dosi di virus somministrate, i numeri rappresentano i giorni dalla prima dose.
Le figure 6 e 7 mostrano i risultati di test ELISA effettuata con sieri diluiti 1:50. La risposta immunitaria IgG e IgA é stata rivelata utilizzando anticorpi coniugati alla perossidasi diretti contro anticorpi IgG o IgA di topo. Sulle l'asse delle ascisse sono indicati i giorni dei prelievi, e su quello delle ordinate il valore del1'assorbenza (O.D. 405nm). Ogni linea rappresenta la risposta di un singolo animale.
Descrizione dettagliata della invenzione
La presente invenzione è stata elaborata in esito alla osservazione che polipeptidi comprendenti la CP di PVX e, fusi alla sua parte amino-terminale, alcuni epitopi della proteina gp41 del virus HIV con particolare riferimento all'epitopo ELDKWAS riconosciuto dall'anticorpo monoclonale 2F5, danno luogo a particelle virali chimeriche correttamente assemblate, che non ricombinano in seguito alla infezione in pianta, e che sono capaci di suscitare una risposta anticorpale neutralizzante rispetto all'epitopo che risulta esposto all'esterno della particella virale stessa .
In tal senso si è provveduto a costruire una serie di polipeptidi di. fusione attraverso le metodiche della tecnologia del DNA ricombinante. La strategia sperimentale seguita per il raggiungimento dell'obiettivo è stata caratterizzata alle seguenti fasi:
1. Preparazione delle CP virali ricombinanti A questo scopo è stato utilizzato il plasmide pBlueScript (pBS), opportunamente modificato nel suo polylinker in modo da inserire alcuni siti per enzimi di restrizione, necessari per le fusioni geniche tra peptidi esogeni e CP virale.
I peptidi esogeni utilizzati sono quelli derivati dalla proteina di rivestimento di HIV-l e da proteine antigeniche di altri agenti patogeni quali HCV, EBV ed il virus della influenza, in grado di essere riconosciuti dal sistema immunitario dell'ospite e di indurre anticorpi capaci di interferire con il processo di infezione del virus. I peptidi sono stati scelti sulla base delle loro caratteristiche immunogeniche.
In particolare sono stati utilizzati:
a) l'epitopo riconosciuto dall'anticorpo monoclonale umano 2F5 e avente la sequenza canonica ELDKWAS, ovvero dallo stesso epitopo comprendente variazioni della sequenza nel primo e/o negli ultimi due aminoacidi (E, A e S), rimanendo invariato il nucleo centrale corrispondente alla sequenza LDKW (SEQ ID NO: 1);
b) epitopi dalle regioni N e C terminali dell'ectodominio della gp41 di HIV-l ( tra cui i peptidi di sequenza SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:9);
c) mimotopi della gpl20 e gp41 (SEQ ID NO:II, SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:15), ovverosia epitopi che, pur avendo differente struttura primaria rispetto agli epitopi cui vengono riferiti, sono caratterizzati da una struttura secondaria e terziaria tale da mostrare proprietà antigeniche e immunogeniche del tutto comparabili alla loro relativa controparte. Sulla base di queste caratteristiche, i sieri di pazienti definiti "long-term non-progressors" , ovvero soggetti che in seguito a sieroconversione non mostrano alcuna progressione della malattia a lungo termine, sono stati utilizzati per identificare una serie di mimotopi della gpl20 e gp41 (19) di HIV-1 che sono stati fusi alla CP di PVX;
d) epitopi derivati da antigeni di altri agenti patogeni tra i quali EBV (Epstein-Barr Virus) (tra cui i peptidi di sequenza da SEQ ID NO: 17 a SEQ ID NO: 24), virus influenzale (tra cui i peptidi di sequenza SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26) ed HCV (tra cui i peptidi di sequenza da SEQ ID NO: 27 a SEQ ID NO: 30).
La CP virale utilizzata è stata la proteina del capside di PVX (in particolare quella avente la sequenza SEQ ID NO: 31), ovvero una proteina comprendente gli aminoacidi 4-237, che conserva tutte le caratteristiche strutturali e funzionali di quella naturale, cioè in grado di produrre particelle virali stabili, anche in presenza di peptidi esogeni.
Ai fini del clonaggio sono state utilizzate le sequenze nucleotidiche codificanti per tali peptidi e per la CP. In particolare per quanto riguarda gli epitopi di HIV e la CP sono state utilizzati in particolare polinucleotidi aventi le sequenze riportate nella lista di sequenze annessa come SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 32.
Una volta ottenute, le fusioni geniche sono state sequenziate per verificarne la correttezza.
2 . Infezione di ospiti.vegetali con il virus ricombinante
Il genoma infettivo del virus, per la produzione di particelle virali chimeriche, è stato ottenuto sostituendo la CP naturale del virus con quella ricombinante ottenuta in vi tro. Il genoma virale ricombinante, clonato in un plasmide che ne consente la replicazione in E. coli , è stato preparato da colture batteriche e utilizzato per infettare ospiti suscettibili (principalmente tabacco, ma anche patata e pomodoro). Alla comparsa della sintomatologia infettiva, le foglie sono state campionate e conservate per le analisi successive .
3. Verifica della stabilità della particelle virali chimeriche
La presenza del peptide esogeno (determinante antigenico) e la sua stabilità all'interno del genoma virale è stata saggiata, utilizzando la tecnica della reazione a catena della polimerasi (POR), su RNA totale estratto da foglie che manifestavano una sintomatologia infettiva sia a livello della foglia inoculata, sia a livello sistemico .
Tali polipeptidi di fusione, una volta espressi nelle piante, hanno mostrato la capacità di assemblarsi correttamente, unitamente al genoma ricombinante di PVX, dando luogo ad una particella virale chimerica. Per la produzione di una particella virale la cellula vegetale infettata produce un mRNA, a partire da un promotore virale forte derivato dal virus del mosaico del cavolfiore (CaMV), corrispondente al RNA genomico di PVX e codificante per la CP virale fusa ai peptidi esogeni, unitamente ad una RNA polimerasi specifica del virus e a proteine coinvolte nel movimento della particella virale all'interno dei tessuti della pianta (5).
I risultati hanno confermato l'integrità delle fusioni geniche dopo 3 cicli successivi di generazione e produzione di particelle virali chimeriche .
In seguito alla verifica della sussistenza della infezione sia al livello della foglia che al livello sistemico, i dati ottenuti sono stati significativi della stabilità di particelle chimeriche in cui la proteina del capside è costituita da una proteina di fusione che presenta alla porzione amino-terminale un determinante antigenico con una lunghezza al di sotto dei 30-35 aminoacidi e la presenza di una numero sufficiente di aminoacidi idrofilici,.in quantità sufficiente da garantire la stabilità del determinante stesso in ambiente acquoso. In particolare tutte le proteine testate hanno dato risultato positivo.
4. Verifica_ della_ immunogenicità della particelle virali chimeriche della invenzione
Le particelle virali chimeriche della invenzione sono state verificata per le proprietà immunogeniche . A questo fine sono state estratte le particelle e sottoposte ad una serie di test ELISA In particolare per quanto riguarda le particelle che presentano esposto la proteina di fusione comprendente il determinante antigenico avente la sequenza SEQ ID NO: 1, la sua presenza e la corretta antigenicità nel capside delle particelle chimeriche virali corrispondenti è stata dimostrata ad ogni ciclo con un test ELISA secondo i risultati mostrati nella figura 3.
Anche le altre proteine testate hanno dato buoni esiti al test ELISA dimostrando che oltre che caratterizzati da stabilità le proteine di fusione testate mostrano una buona immunogenicità.
5. Somministrazione_ delle_ particelle_ virali chimeriche a topi immunocompetenti e analisi della risposta immunitaria
Le particelle virali chimeriche purificate sono state utilizzate per immunizzare topi immunocompetenti attraverso le vie di somministrazione intra-peritoneale, intra-nasale e orale. In quest'ultima sono stati aggiunti gruppi di topi sperimentali trattati con IFN-cc murino come citochina immunostimolante, anch'essa somministrata per via orale a diverse concentrazioni. I risultati hanno dimostrato la validità del sistema di presentazione del peptide esogeno {determinante antigenico) , con risposte anticorpali ad alto titolo (i sieri mostrano reattività contro il peptide fino a diluizioni di 1:10.000), con buona capacità neutralizzante (fino al 100%) e, soprattutto, con l'induzione di immunità mucosale (presenza di IgA secretorie).
6. Somministrazione ad animali a scopo vaccinale di polipeotidi
Tale somministrazione è stata effettuata secondo un processo costituito dalle seguenti fasi:
- infezione di ospiti vegetali con il genoma di un virus vegetale ricombinante (virus X della patata o PVX) per la produzione delle proteine del capside virale (CP) di fusione, di cui sopra;
coltivazione delle piante infettate in condizioni tali da produrre le CP ricombinanti le quali, in seguito ad autoassemblaggio, producono particelle virali chimeriche (CVPs), che espongono sulla loro superficie i peptidi esogeni;
- somministrazione di tali CVPs ad animali da esperimento a scopo vaccinale, non escludendo la semplice produzione di anticorpi contro il peptide di interesse.
Tale somministrazione ha avuto ad oggetto CVPs purificate, estratti grezzi di materiale vegetale contenente le CVPs, materiale vegetale non processato. E' stato effettuato su topi ma avrebbe potuto essere effettuato su altri mammiferi.
I risultati sono riportati nelle Fig. 6 e 7.
Si è data finora della presente invenzione una descrizione di carattere generale. Con l'aiuto dei seguenti esempi, verrà ora fornita una descrizione più dettagliata di specifiche forme di realizzazione, finalizzate a far meglio comprendere scopi, caratteristiche, vantaggi e modalità operative dell'invenzione.
ESEMPI
Esempio 1Costruzione dei vettori comprendenti una proteina di fusione con oli epitooi di HIV La costruzione della proteina di fusione di PVX ricombinante per gli .epitopi di HIV è stata ottenuta secondo la strategia schematizzata nella figura 1. Il polylinker del plasmide pBlueScript (pBS) è stato modificato in modo tale da inserire in ordine i siti di restrizione Sali, Nhel e Xhol: il sito Nhel ha consentito di inserire in fase con la CP un qualsiasi olìgonucleotide a doppia elica codificante per un peptide di interesse, mentre gli altri siti hanno consentito di sostituire la CP di tipo selvatico nel genoma di PVX con quella chimerica ottenuta in pBS. Questa strategia ha comportato nel caso specifico la delezione dei primi 9 nucleotidi (3 aminoacidi) del gene della CP di PVX, inclusa la tripletta di inizio della traduzione (ATG).Dopo appaiamento di due oligonucleotidi a singola elica è stato ottenuto un oligonucleotide a doppia elica che codifica per l'epitopo. L'epitopo è preceduto dal codone di inizio della traduzione ATG e la sequenza codificante è affiancata dalle estremità coesive corrispondenti ai siti di clonaggio Sali e Nhel; successivamente 1'oligonucleotide a doppia elica è stato inserito nei corrispondenti siti di restrizione di pBS dove era stato precedentemente clonato il gene della proteina del capside di PVX, deleta dei primi 3 aminoacidi, con gli enzimi Nhel e Xhol. In tal modo è stato ottenuto un gene che codifica per una proteina del capside ricombinante che porta al suo N-terminale un peptide di fusione che costituisce l'epitopo di interesse. Questa strategia è stata utilizzata per inserire gli epitopi descritti precedentemente.
Il gene codificante per la proteina del capside ricombinante è stato recuperato come frammento di restrizione Sali-Xhol e clonato negli stessi siti di restrizione del plasmide PVX201 (10), contenente il cDNA corrispondente al genoma di PVX, sostituendo la proteina del capside di tipo selvatico con quella chimerica.
Esempio 2: Infezione delle piante e produzione delle particelle virali chimeriche (CVPs)
Il plasmide PVX201 è stato preparato da una coltura di E. coli ed utilizzato per infettare piante di N. benthamiana e S. tuberosum. Il DNA plasmidico è stato quindi cosparso su due foglie della pianta da infettare (circa 15 ug/foglia), previo trattamento della foglia con sostanze abrasive per permetterne la penetrazione. A distanza di circa 7 giorni, a livello della foglia inoculata sono comparsi i primi sintomi dell'avvenuta infezione, che nel corso di altri 4-5 giorni si è trasformata in infezione sistemica, evidenziabile dalla sintomatologia a livello delle foglie di nuova formazione all'apice della pianta evidenziata nella Fig. 2.Nel corso dell'infezione le piante sono state mantenute in fitotrone a temperatura di 25°C e in condizioni circadiane di 14h di luce e 10 di buio. Alla comparsa dei primi sintomi a livello sistemico è stata prelevata una piccola quantità di tessuto fogliare, che è stata sottoposta ad analisi di RT-PCR per verificare la presenza della sequenza esogena nel gene della proteina di fusione chimerica. Le reazioni di RT-PCR sono state eseguite utilizzando un Kit Perkin Elmer, secondo le istruzioni della casa fornitrice, e utilizzando come stampo 1 ug di RNA totale estratto da foglie infettate (con il virus ricombinante o con quello di tipo selvatico) e utilizzando come primers (inneschi) oligonucleotidi corrispondenti al peptide esogeno (determinante antigenico) (primer senso) e alla CP virale (primer antisenso} .
Dopo circa 15 giorni dall'infezione, le foglie che presentavano una evidente sintomatologia infettiva sono state raccolte e sottoposte ad una estrazione delle particelle virali chimeriche. Il tessuto vegetale è stato ridotto a polvere in un mortaio in presenza di azoto liquido e la polvere è stata successivamente risospesa nel tampone salino di estrazione, contenente 0.1M Tris-borato pH 6.8, e le particelle virali purificate su un gradiente di CsCl. Successivamente, è stato eseguito un test ELISA per verificare la corretta antigenicità dell'epitopo espresso sulle particelle virali chimeriche. Nella figura 3 è mostrato il test ELISA eseguito sulla particella virale chimerica contenente l'epitopo ELDKWAS (SEQ ID N0:1) e riconosciuto dall 'anticorpo monoclonale 2F5. Il test è stato eseguito facendo adsorbire su una piastra per ELISA 100 ul di un antisiero policlonale anti-PVX, in tampone carbonato, diluito 1:5000, a 4° per circa 16h. Dopo un lavaggio in lx PBS sono stati aggiunti 50 ul di un estratto fogliare contenente le particelle virali chimeriche e 50 ul di lx PBS, e le piastre sono state incubate per Ih a 37°C. Successivamente, le piastre sono state lavate per 3 volte con lx PBS, è stato aggiunto 1'anticorpo 2F5, diluito 1:150, e l'incubazione è stata proseguita per Ih a 37°C. Dopo ulteriori 3 lavaggi in lx PBS è stato aggiunto un anticorpo secondario anti-IgG umane coniugato con la perossidasi, diluito 1:5000, e avviata la reazione di colorazione. La lettura della piastra è stata effettuata a vari intervalli, con un tempo massimo di 30'. Infine, le particelle virali chimeriche sono state utilizzate per successivi cicli di infezione per valutare la stabilità delle particelle stesse ed accertare che no vi siano ricombinazioni a livello del sito di inserzione della sequenza codificante per il peptide esogeno (determinante antigenico). Ad ogni ciclo è stato ripetuto il test ELISA.
Esempio 3: Immunizzazione di topi immunocompetenti
Le particelle virali chimeriche purificate sono state quindi utilizzate per immunizzare topi immunocompetenti secondo le schede riportate nelle figure 4 e 5, attraverso le vie di somministrazione intra-peritoneale, intra-nasale.
Esempio 4: Analisi della risposta immunitaria I sieri ottenuti dai topi immunizzati in esito agli esperimenti riportati nell'esempio 3, sono stati progressivamente aliquotati e conservati a -20°C per tutta la durata dell'esperimento. Alla fine dell'esperimento sono stati eseguiti saggi ELISA per valutare la presenza di diverse classi di immunoglobuline, in particolare IgG e IgA sieriche e IgA fecali specifiche per l'epitopo ELDKWAS, utilizzando un peptide sintetico contenente la sequenza aminoacidica. Il peptide è stato diluito alla concentrazione di 4pg/ml in tampone carbonato e 100μl di tale soluzione vengono distribuiti in ogni pozzetto di una piastra da titolazione, la quale viene incubata a 4°C per 16 ore. Successivamente, sono stati eseguiti 3 lavaggi in lx PBS/0.2% Teewn20 e 1 lavaggio in lx PBS. Ad ogni pozzetto viene in seguito aggiunta una soluzione contenente 2% latte (formulat 1, Dicofarra)/0.2% gelatina e la piastra viene incubata a 37°C per 2 ore. Dopo 3 lavaggi in lx PBS/0.2% Teewn20 e 1 lavaggio in lx PBS, sono stati aggiunti i sieri diluiti 1:50 in 2% latte e proseguita l'incubazione a 4°C per 16 ore. Quindi, la piastra è stata lavata come sopra descritto ed è stato aggiunto 1'anticorpo rivelatore coniugato con l'enzima perossidasi. Dopo incubazione a 37°C per 1 ora è stato aggiunto il substrato dell'enzima e la reazione è stata quantificata mediante lettura spettrofotometrica a 405 nm. I dati riportati nelle figure 6 e 7 dimostrano la presenza nei sieri dei topi di una ottima risposta specifica verso il peptide di interesse con la produzione sia di IgG e IgA sieriche, sia di IgA fecali, indice di una avvenuta risposta immunitaria a livello mucosale, peraltro evidente nel protocollo di immunizzazione intra-nasale .
La presente invenzione è stata fin qui descritta facendo riferimento a forme di realizzazione presentate a scopo esemplificativo e non limitative. E' da intendersi che possono essere individuate dal tecnico del ramo ulteriori forme di realizzazione che sono incluse nella portata delle rivendicazioni annesse.
LISTA DI SEQUENZE
INFORMAZIONI GENERALI:
(i) DEPOSITANTI: ISTITUTO SUPERIORE DI SANITÀ' e ENTE PER LE NUOVE TECNOLOGIE, L'ENERGIA E L'AMBIENTE (ENEA)
(ii) TITOLO DELL'INVENZIONE: "PROTEINA DI FUSIONE, PARTICELLE VIRALI CHIMERICHE CHE LA ESPONGONO SUL CAPSIDE, PIANTE INFETTATE CON <' >TALI PARTICELLE, LORO USI E COMPOSIZIONI CHE LI COMPRENDONO"
(iii) NUMERO DI SEQUENZE: 32
(iv) INDIRIZZO DI CORRISPONDENZA:
(A) DESTINATARIO: Società Italiana Brevetti (B) INDIRIZZO: Piazza di Pietra, 39
(C) CITTÀ: Roma
(D) PAESE: Italia
(E) CODICE POSTALE: 1-00186
(v) FORMA LEGGIBILE AL CALCOLATORE:
(A) TIPO DI SUPPORTO:
(B) COMPUTER: IBM PC compatibile
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS Rev. 5.0 (D) SOFTWARE: Microsoft Word 6.0
(viii) INFORMAZIONI SULL'AGENTE
(A) NOME: Tonon, Gilberto(Ing.)
(B) RIFERIMENTO:
(ix) INFORMAZIONI PER TELECOMUNICAZIONI
(A) TELEFONO: 06/695441
(B) TELEFAX: 06/69544830
(C) TELEX: 612287 ROPAT
(1) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 1
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 7 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: HIV
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: epitopo di gp41
riconosciuto dal MAb 2F5
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 1 è Giu ovvero un qualunque altro aminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 6 è Ala ovvero un qualunque altro aminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 7 è Ser ovvero un qualunque altro aminoacido
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 1:
Xaa Leu Asp Lys Trp Xaa Xaa
1 5
(2) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 2:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 21 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: polinucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: HIV
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza codificante per epitopo di gp 41 riconosciuto dal MAb2F5
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 2:
GAA CTT GAT AAG TGG GCT TCT 21
(3) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 3:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 13 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: HIV
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME:
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: epitopo C14.1-2
dell <1 >ectodominio della proteina gp41
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 3:
Met Gin Trp Giu Arg Giu Ile Asp Asn Tyr Thr Ser Leu 1 5 10
(4) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 4:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 39 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: polinucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: HIV
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza codificante
per epitopo C14.1-2 di ectodominio di gp 41
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 4:
ATG CAG TGG GAA AGA GAA ATT GAC AAT TAC ACA 33 AGC TTA 39
(5) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 5:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 20 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: HIV
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(B) NOME: C14.1-3
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: epitopo C14.1-3
dell 'ectodominio della proteina gp41
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 5:
Met Gin Trp Giu Arg Giu Ile Asp Asn Tyr Thr Ser Leu 1 5 10
Ile Tyr Ser Leu Leu Giu
15 20
(6) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 6:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 60 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: polinucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: HIV
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza codificante
per epitopo C14.1-3 di ectodominio di gp 41
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 6:
ATG CAG TGG GAA AGA GAA ATT GAC AAT TAC ACA 33
AGC TTA ATA TAC TCA TTA CTA GAA AAA 60
(7) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 7:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 28 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: HIV
(ìx) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(C) NOME: C14.1-4
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: epitopo C14.1-4
dell 'ectodominio della proteina gp41
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 7:
Met Gin Trp Giu Arg Giu Ile Asp Asn Tyr Thr Ser Leu 1 5 10
Ile Tyr Ser Leu Leu Giu Lys Ser Gin Thr Gin Gin Giu
15 20 25
Lys
(8) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 8:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 81 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: polinucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: HIV
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza codificante per epitopo C14.1-4 di ectodominio di gp 41
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 8:
ATG CAG TGG GAA AGA GAA ATT GAC AAT TAC ACA 33
AGC TTA ATA TAC TCA TTA CTA GAA AAA TCG CAA 66
ACC CAA CAA GAA AAG 81
(9) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 9: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 15 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: HIV
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) NOME: N14.1-2
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI : epìtopo N14.1-2
dell<' >ectodominio della proteina gp41
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 9:
Gin Gin Asn Asn Leu leu Arg Ala Ile Giu Ala Gin Gin
1 5 10
His
15
(10) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 10: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 36 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(11) TIPO DI MOLECOLA: poiinucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: HIV
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza codificante
per epitopo N14.1-2 di ectodominio di gp 41
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 10:
CAA CAG AAT AAC CTT CTC AGA GCT ATT GAA GCA CAA CAG 33
CAT 36
(11) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 11.:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 11 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(E) NOME: KSS
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: mimotopo delle proteine
gp41 e gp 120 di HIV
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 11:
Cys Lys Ser Ser Gly Lys Leu Ile Ser Leu Cys
1 5 10
(12) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 12:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 33 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: polinucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza codificante
per il mimotopo KSS delle proteine gp41 e gp 120 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 12:
TGT AAG TCT TCA GGT AAA CTT ATT TCT TTG TGC 33
(13) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 13: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 11 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(F) NOME: GTK
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: mimotopo delle proteine gp41 e gp 120 di HIV
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 13:
Cys Gly Thr Lys Leu Val Cys Phe Ala Ala Cys
1 5 10
(14) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 14: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 33 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: polinucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza codificante
per il mimotopo GTK delle proteine gp41 e gp 120 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 14:
TGT GGT ACT AAG CTT GTT TGT TTT GCT GCA TGC 33
(15) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 15: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 11 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(G) NOME: KRI
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: mimotopo delle proteine
gp41 e gp 120 di HIV
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 15:
Cys Lys Arg Ile Val Ile Gly Pro Gin Thr Cys
1 5 10
(16) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 16: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 33 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: polinucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza codificante
per.il mimotopo KRI delle proteine gp41 e gp 120 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 16:
TGT AAG AGA ATT GTT ATC GGT CCA CAA ACT TGC 33
(17) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 17: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 9 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: EBV
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: epitopo dall<1 >antigene EBNA 3A di EBV
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 17: Arg Pro Pro Ile Phe Ile Arg Arg Leu
1 5
(18) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 18: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 9 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: EBV
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: epitopo dall'antigene EBNA 3A di EBV
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 18:
Phe Leu Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Leu
1 5
(19) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 19: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 9 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: EBV
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: epitopo dall<1 >antigene EBNA
3A di EBV
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 19:
Arg Leu Arg Ala Giu Gin Val Lys
1 5
(20) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 20: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 9 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: EBV
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: epitopo dall<1 >antigene EBNA 3A di EBV
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 20:
Tyr Pro Leu His Giu Gin His Gly Met
1 5
(21) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 21: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 9 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: EBV
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: epitopo dall<1 >antigene EBNA 3A di EBV
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 21:
Gin Ala Lys Trp Arg Leu Gin Thr leu
1 5
(22) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 22: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 9 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: EBV
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: epitopo dall<1 >antigene EBNA
3B di EBV
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 22:
Ala Val Leu Leu His Giu Giu Ser Met
1 5
(23) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 23: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 9 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: EBV
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: epitopo dall<1 >antigene EBNA 3B di EBV
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 23:
Ile Val Thr Asp Phe Ser Val Ile Lys
1 5
(24) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 24: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 9 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: EBV
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: epitopo dall'antigene EBNA
3C di EBV
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 24:
Gin Pro Arg Ala Pro Ile Arg Pro Ile
1 5
(25) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 25: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 9 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: virus influenzale
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: epitopo dalla proteina della matrice MP
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 25:
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1 5
(26) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 26: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 24 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: virus influenzale
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: epitopo dalla emagglutinina HA-1
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 26:
Asn Asp Lys Pro Phe Gin Asn Val Asn Lys Ile
1 5 10
Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Lys Tyr Val Lys Gin
15 20
Asn Thr
(27) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 27: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 9 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: HCV
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: epitopo dall'antigene NS3 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 27: Gly Ala Val Gin Asn Giu Ile Thr Leu
1 5
(28) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 28: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 9 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: HCV
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: epitopo dall<1 >antigene E2 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 28: Thr Ile Asn Tyr Thr Ile Phe Lys Ile
1 5
(29) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 29: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 15 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi ) ORIGINE :
(A) ORGANISMO: HCV
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: epitopo dall<1 >antigene E2 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 29: Arg Cy Asp Leu Giu Asp Arg Asp Arg Ser Giu Leu
1 5 10
Ser Pro Leu
<15>
(30) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 30: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 10 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(li) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: HCV
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: epitopo dall<1 >antigene E1 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 30: Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly
1 5 10
(31) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 31: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 239 aminoacidi
(B) TIPO: aminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
{ii) TIPO DI MOLECOLA: polipeptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: PVX
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(H) NOME: CP
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: proteina del capside del virus PVX ceppo X3
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 31:
Met Ser Ala Pro Ala Ser Thr Thr Gin Ala Thr Gly Ser 1 5 10
Thr Thr Ser Thr Thr Thr Lys Thr Ala Gly Ala Thr Pro 15 20 25
Ala Thr Ala Ser Gly Leu Phe Thr Ile Pro Asp Gly Asp 30 35 40 Phe Phe Ser Thr Ala Arg Ala Ile Val Ala Ser Asn Ala
45 50
Val Ala Thr Asn Giu Asp Leu Ser Lys Ile Giu Ala Ile
55 60 65
Trp Lys Asp Met Lys Val Pro Thr Asp Thr Met Ala Gin
70 75
Ala Ala Trp Asp Leu Val Arg His Cys Ala Asp Val Gly 80 85 90
Ser Ser Ala Gin Thr Giu Met Ile Asp Thr Gly Pro Tyr 95 100 105 Ser Asn Gly Ile Ser Arg Ala Arg Leu Ala Ala Ala Ile
110 115
Lys Giu Val Cys Thr Leu Arg Gin Phe Cys Met Lys Tyr 120 125 130
Ala Pro Val Val Trp Asn Trp Met Leu Thr Asn Asn Ser 135 140 145 Pro Pro Ala Asn Trp Gin Ala Gin Gly Phe Lys Pro Giu
150 155
His Lys Phe Ala Ala Phe Asp Phe Phe Asn Gly Val Thr
160 165 170
Asn Pro Ala Ala Ile Met Pro Lys Giu Gly Leu Ile Arg
175 180
Pro Pro Ser Giu Ala Giu Met Asn Ala Ala Gin Thr Ala 185 190 195
Ala Phe Val Lys Ile Thr Lys Ala Arg Ala Gin Ser Asn 200 205 210 Asp Phe Ala Ser Leu Asp Ala Ala Val Thr Arg Gly Arg
215 220
Ile Thr Gly Thr Thr Thr Ala Giu Ala Val Val Thr Leu
225 230 235
Pro Pro Pro
(32) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 32:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 712 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: polinucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: PVX
(ii) TIPO DI MOLECOLA: Polinucleotide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza codificante per la proteina del capside di PVX ceppo X3
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 32:
ATG TCA GCA CCA GCT AGC ACA ACA CAG GCC ACA GGG 36 TCA ATA CCT CAA CTA CCA CGA AAA CTG CAG GCG CAA 72 CTC CTG CCA CAG CTT CAG GCC TGT TCA CCA TCC CGG 108 ATG GGG ATT TCT TTA GTA CAG CTC GTG CCA TAG TAG 144 CCA GCA ATG CTG TCG CAA CAA ATG AGG ACC TCA GCA 180 AGA TTG AGG CTA TTT GGA AGG ACA TGA AGG TGC CCA 252 CAG ACA CTA TGG CAC AGG CTG CTT GGG ACT TAG TCA 288 GAC ACT GTG CTG ATG TGG GAT CAT CTG CTC AAA CAG 324 AAA TGA TAG TAC AGG TCC TTA TTC CAA CGG CAT CAG 360 CAG AGC TAG ACT GGC AGC AGC AAT CAA AGA GGT GTG 396 CAC ACT TAG GCA ATT TTG CAT GAA GTA TGC TCC AGT 432 GGT ATG GAA CTG GAT GTT AAC TAA CAA CAG TCC ACC 468 TGC TAA CTG GCA AGC ACA AGG TTT CAA GCC TGA GCA 504 CAA ATT CGC TGC ATT CGA CTT CTT CAA TGG AGT CAC 540 CAA CCC AGC TGC CAT CAT GCC CAA AGA GGG GCT CAT 576 CCG GCC ACC GTC TGA AGC TGA AAT GAA TGC TGC CCA 612 AAC TGC TGC TTT TGT GAA GAT TAC AAA GGC CAG GGC 648 ACA ATC CAA CGA CTT TGC CAG CCT AGA TGC AGC TGT 684 CAC TCG AGG TCG TAT CAC TGG AAC AAC AAC CGC TGA 720 GGC TGT TGT CAC TCT ACC ACC ACC ATA A 748
Claims (31)
- RIVENDICAZIONI 1. Proteina di fusione comprendente: - una porzione amino-terminale comprendente un determinante antigenico avente un numero di residui aminoacidici minore o uguale a 35 ed una percentuale di aminoacidi idrofilici tale da conferire solubilità in ambiente acquoso a detto determinante antigenico, e - una porzione carbossi-terminale comprendente una proteina del capside di un virus PVX o una variante di detta proteina del capside, detta porzione amino-terminale essendo fusa a detta porzione carbossi-terminale in modo che detto determinante antigenico è in fase con detta proteina del capside o con detta variante.
- 2. Proteina di fusione secondo la rivendicazione 1, in cui detto determinante antigenico è un determinante antigenico per un agente patogeno scelto da gruppo costituito da HIV, HCV, EBV e virus influenzale.
- 3. Proteina di fusione secondo la rivendicazione 2, in cui detto determinante antigenico è derivato da un antigene scelto dal gruppo costituito da gpl20 di HIV, gp41 di HIV, EBNA-3A di EBV, EBNA-3B di EBV, EBNA-3C di EBV, proteina della matrice del virus influenzale, emagglutinina del virus influenzale, NS3 di HCV, E2 di HCV ed E1 di HCV.
- 4. Proteina di fusione secondo la rivendicazione 3, in cui detto determinante antigenico è scelto dal gruppo costituito dai determinanti antigenici aventi una sequenza riportata nella lista di sequenze annessa da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, e da SEQ ID NO:17 a SEQ ID NO:30.
- 5. Proteina di fusione secondo la rivendicazione 3, in cui detto determinante antigenico è un determinante antigenico avente la sequenza riportata nella lista di sequenze annessa come SEQ ID NO:l.
- 6 . Proteina di fusione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, in cui detta proteina del capside del virus PVX ha la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO:31 .
- 7. Polinucleotide codificante per la proteina di fusione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 e/o per una variante di detta proteina di fusione.
- 8. Polinucleotide avente le funzioni del genoma del virus PVX comprendente il polinucleotide secondo la rivendicazione 7.
- 9. Polinucleotide secondo la rivendicazione 8, in cui detto polinucleotide avente le funzioni del virus PVX è costituito dal genoma di un virus PVX.
- 10. Particella virale chimerica caratterizzata dal fatto di comprendere come proteina del capside almeno una proteina di fusione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 , detta particella virale chimerica presentando esposta all'esterno il determinante antigenico della porzione amino- terminale di detta proteina di fusione .
- 11. Particella virale chimerica secondo la rivendicazione 10, in cui il genoma virale è costituito dal polinucleotide secondo la rivendicazione 8 oppure 9.
- 12. Pianta caratterizzata dal fatto di comprendere al suo interno almeno una particella chimerica virale secondo la rivendicazione 10 oppure 11.
- 13. Cellule vegetali caratterizzate dal fatto di essere derivate dalla pianta secondo la rivendicazione 12 e di esprimere la particella chimerica virale secondo la rivendicazione 10 oppure 11.
- 14. Cellule vegetali secondo la rivendicazione 13, dette cellule essendo costituite in aggregati cellulari o tessuti.
- 15. Composizione comprendente una proteina di fusione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, una particella chimerica virale secondo la rivendicazione 10 oppure 11, un estratto da una pianta secondo la rivendicazione 12 e/o cellule vegetali secondo la rivendicazione 13 o 14, unitamente ad un veicolo chimicamente o farmaceuticamente compatibile.
- 16. Composizione secondo la rivendicazione 15, detta composizione comprendendo ulteriormente un adiuvante.
- 17. Composizione secondo la rivendicazione 15 oppure 16, detta composizione essendo formulata per la somministrazione per via orale.
- 18. Composizione secondo la rivendicazione 15 oppure 16, detta composizione essendo formulata per la somministrazione per via mucosale.
- 19. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 15 a 18, in cui detta composizione è un vaccino.
- 20. Kit per la immunizzazione dì un mammifero comprendente - una composizione secondo la rivendicazione 15, 17 o 18 quando dipendenti dalla rivendicazione 15; ed - una composizione comprendente un adiuvante unitamente ad un veicolo farmaceuticamente compatibile, laddove dette composizioni mescolate insieme danno luogo ad una composizione utilizzabile per la immunizzazione di detto mammifero.
- 21. Proteina di fusione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, una particella chimerica virale secondo la rivendicazione 10 oppure 11, un estratto da una pianta secondo la rivendicazione 12 e/o cellule vegetali secondo la rivendicazione 13 o 14, per uso come medicamento.
- 22 . Uso della proteina di fusione secondo la rivendicazione 1, di una particella chimerica virale secondo la rivendicazione 10 oppure 11 quando dipendenti dalla rivendicazione 1, di una pianta secondo la rivendicazione 12 quando dipendente dalla rivendicazione 1, oppure di cellule vegetali secondo la rivendicazione 13 o 14 quando dipendenti dalla rivendicazione 1, per la preparazione di farmaci per il trattamento di una patologia associata ad un agente patogeno di natura batterica o virale.
- 23. Uso della proteina di fusione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6, di una particella chimerica virale secondo la rivendicazione 10 oppure 11 quando dipendenti da una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6, di una pianta secondo la rivendicazione 12 quando dipendente da una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6, oppure di cellule secondo la rivendicazione 13 oppure 14 quando dipendenti da una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6, per la preparazione di farmaci per il trattamento di una patologia associata ad un agente patogeno scelto dal gruppo costituito da HIV, HCV, EBV e virus influenzale.
- 24. Uso della proteina di fusione secondo la rivendicazione 1, di una particella chimerica virale secondo la rivendicazione 10 oppure 11 quando dipendenti dalla rivendicazione 1, di una pianta secondo la rivendicazione 12 quando dipendente dalla rivendicazione 1, oppure di cellule vegetali secondo la rivendicazione 13 o 14 quando dipendenti dalla rivendicazione 1, per la derivazione di metodi diagnostici per una patologia associata ad un agente patogeno di natura batterica o virale.'
- 25. Uso della proteina di fusione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6, di una particella chimerica virale secondo la rivendicazione 10 oppure 11 quando dipendenti da una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6, di una pianta secondo la rivendicazione 12 quando dipendente da una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6, oppure di cellule secondo la rivendicazione 13 oppure 14 quando dipendenti da una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6, per la derivazione di metodi diagnostici per una patologia associata ad un agente patogeno scelto dal gruppo costituito da HIV, HCV, EBV e virus influenzale.
- 26. Uso di una determinate antigenico come definito nelle rivendicazioni da 1 a 5 o di una antigene come definito nella rivendicazione 3, per la preparazione della proteina di fusione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, della particella chimerica virale secondo la rivendicazione 10 oppure 11, pianta secondo la rivendicazione 12 oppure di cellule vegetali secondo la rivendicazione 13 oppure 14.
- 27. Uso di una proteina del capside di PVX per la preparazione della proteina di fusione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, della particella chimerica virale secondo la rivendicazione 7, pianta secondo la rivendicazione 8 oppure di cellule secondo la rivendicazione 9 o 10.
- 28. Uso della pianta secondo la rivendicazione 12 oppure delle cellule secondo la rivendicazione 13 oppure 14, per la produzione di una particella chimerica virale secondo la rivendicazione 10 oppure 11.
- 29. Procedimento per la preparazione di una proteina di fusione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 comprendente le seguenti operazioni : a. clonaggio della proteina del capside come definita nella rivendicazione 1 oppure 6, in un vettore; e b. clonaggio del determinante antigenico come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 fuse a detta proteina del capside nel vettore risultante dalla operazione a.
- 30. Procedimento per la preparazione di una particella chimerica virale secondo la rivendicazione 10 oppure 11, comprendente la operazione di sostituzione della proteina del capside di un virus-PVX, in detto virus PVX, con la proteina secondo una qualsiasi delle rivendicazione da 1 a 6.
- 31. Procedimento per la preparazione di una pianta secondo la rivendicazione 12, comprendente le seguenti operazioni: a1. infezione di una pianta con una particella virale secondo la rivendicazione 10 oppure 11; b1. coltivazione della pianta ottenuta in esito alla operazione al. c1. estrazione di detta particella virale da detta pianta.
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