ITRC990005A1 - Bioprocesso per la produzione di biomassa microalgale contenente olioessenziale ricco in acido docosaesanoico, attraverso la coltura di cry - Google Patents

Description

Descrizione di Invenzione Industriale

Descrizione dell’ invenzione avente per titolo “ Bioprocesso per la produzione di biomassa microalgale contenente olio essenziale ricco in acido docosaesanoico, attraverso la coltura di Crypthecodinium “

Questa invenzione industriale consente di produrre con un processo fotoeterotrofo o prevalentemente eterotrofo cellule monoalgali oleifere ricche in acidi grassi poiinsaturi a lunga catena della classe omega-3.

In particolare queste cellule oleifere, coltivate in condizioni aerobiche in adatti substrati contenuti in bioreattori industriali, contengono acidi poiinsaturi a lunga catena con netta predominanza di acido docosaesanoico (abbreviato DHA, C 22 : 6 omega-3) particolarmente importante nell’alimentazione umana per i benefici effetti che apporta come cardioprotettore e per l’azione preventiva che esercita nelle turbe neurologiche.

Diversi Autori, Conquer (1), Innis (2), Pohl (3), Simoupolos (4), Leaf (5), Horrocks (6), McLennan (7), Tuttle (8) e Kyle (9), in questi ultimi anni, hanno riportato lavori scientifici sull’ importanza della presenza degli acidi grassi poiinsaturi essenziali nell’ alimentazione umana.

Gli esperti nutrizionisti della FAO e WHO (10) hanno raccomandato di integrare il latte vaccino utilizzato per l’infanzia con acido docosaesanoico e acido arachidonico per l importanza che queste due sostanze esercitano nelle funzioni neurologiche dell’organismo.

L’acido docosaesanoico è importante dal punto di vista nutrizionale sia per l’uomo che per gli animali di allevamento; infatti gli organismi superiori non possono sintetizzare questo composto.

La risorsa primaria di acidi poiinsaturi è rappresentata dalle microalghe marine, che attraverso la catena alimentare giungono all’uomo.

La produzione di olii poiinsaturi omega-3 sono tradizionalmente ottenuti per estrazione dall’ ittiofauna marina.

L’utilizzazione di olio di fegato di merluzzo, come integratore alimentare rappresenta una buona fonte di DHA, però contiene anche un altro acido grasso ( eicosapentanoico ) che ne riduce gli effetti benefici ; tra l’altro l’uso di quest’olio come integratore modifica negativamente l 'appetibilità dell’alimento.

L’incremento dell’inquinamento chimico, ogni anno maggiore, di parte delle acque marine rende l’olio di pesce sempre meno sicuro dal punto di vista igienico, come fonte di approvvigionamento di questo importante acido poiinsaturo.

Noi abbiamo pensato di sviluppare una nuova tecnica colturale della microalga marina Crypthecodinium cohnii (Seligo) basata sul condizionamento dei fattori ambientali di una coltura artificiale al fine di incrementare la biosintesi dell’acido docosaesanoico.

Con questa tecnica è oggi possibile produrre un olio aigaie alimentare secondo gli standar produttivi americani ( GMP & GRAS ) tali da impiegarlo sia come nutraceutico nel late per l’infanzia, sia come integratore alimentare per adulti.

Il principale oggetto di questa invenzione è la produzione di cellule oleifere monoalgali ricche in olio essenziale attraverso la coltura di questa alga in bioreatore aerato ed in condizioni fotoeterotrofe o prevalentemente eterotrofe, utilizzabili soprattutto come integratore alimentare nutraceutico. Per bioreatore intendiamo qualsiasi contenitore chiuso fornito di adatti strumenti di controllo per la crescita e lo sviluppo axenico della coltura microalgale e finalizzato alla produzione di biomassa come ad esempio il fermentatore industriale di tipo stirred tank o air lift, o anche vasche di coltura.

L’agitazione della coltura può essere effettuata con agitatore elicoidale, elica marina o turbina tipo Rushton.

La coltura verrà condotta modulando i fatori ambientali e nutrizionali in modo tale da avere una migliore utilizzazione delle fonti di carbonio e dei nutrienti minori, non possibili in condizioni naturali.

Noi abbiamo pensato di utilizzare le colture microalgali per processi biotecnologici per la produzione di cellule oleifere monoalgali ricche tra gli altri in :

acido laurico (C12 :0), acido miristico (C14 :0), acido paimitico (C 16 :0), acido stearico (Gl 8 :0), acido oleico (CI 8 :1), acido docosaesanoìco (C 22 :6) .

Costituisce oggeto del presente brevetto la produzione e l’utilizzazione di biomasse microalgali di Crypthecodinium cohnii (Seligo) finalizzate a costituire direttamente un integratore alimentore per uso umano e zootecnico o indirettamente per utilizzare la biomassa come materia prima per l’estrazione dell’olio ricco in DHA.

L’elemento principale dell’invenzione, per la produzione biotecnologica di cellule oleifere monoalgali, è la coltura di questa alga in condizioni controllate di macro, micro nutrienti e fattori di crescita, in ambiente termoregolato con un fotoperiodo variabile e programmato.

Lo sviluppo delle microalghe potrà avvenire in condizioni fotoeterotrofe o prevalentemente eterotrofe in soluzioni nutritive costituite da sali minerali e composti organici, come riportato da Turile e Collaboratori (9).

Le due condizioni di coltura portano entrambe alla produzione di olio aigaie ricco in DHA, ma nel caso della coltura fotoeterotrofa si ha un ulteriore arricchimento in carotenoidi dell’olio prodotto.

La presente invenzione include anche il procedimento di integrazione dei mangimi zootecnici con biomassa microalga] e per elevare il contenuto in DHA nelle carne degli animali di allevamento, tradizionalmente consumate dall’ uomo.

L’acido docosaesanoico può essere direttamente integrato nel metabolismo umano o animale utilizzando la farina o l’olio microalgale, o diversamente utilizzando l’acido docosaesanoico opportunamente estratto dall’olio, Un’altra finalità della presente invenzione include anche l’utilizzazione della biomassa monoalgale di Crypthecodinium cohnii come esaltatore di sapidità all’aroma di frutti di mare (ostriche) per alimenti a base di pesce, crostacei e molluschi.

Da questa biomassa è anche possibile ottenere un alcoolato aigaie per aromatizzare alimenti a base di frutti di mare.

Questo processo, a differenza dei sistemi tradizionali di coltura microalgale autotrofa, condotta in vasche aperte, per la produzione di acidi grassi poiinsaturi, presenta il vantaggio di poter condurre la coltura ad alta densità aigaie, in assenza di luce ed in condizioni axeniche.

Quest’ultimo fattore è importante quando la biomassa ed i loro derivati debbono essere utilizzati per l’alimentazione umana.

Noi abbiamo condotto presso il laboratorio di ricerca della Società Agrobiosystem di Saponara (Messina), le ricerche finalizzate alla produzione biotecnologica di cellule monoalgali oleifere ricche in DHA e carotenoidi.

Un ceppo microalgale di Crypthecodinium cohnii contrassegnato ABS è stato da noi depositato presso il Dunstaffhage Marine Laboratory CCAP di Oban, Scotland, United Kingdom e assegnato con il numero di accesso 1104 /2 .

Il bioprocesso produttivo di questa invenzione è illustrato nel seguente esempio che non è limitativo nel tipo di condizionamento della coltura e ne definisce i parametri di sviluppo e la tecnologia utilizzata.

Esempio :

Produzione di biomassa aigaie di Crypthecodinium cohnii in condizioni fotoeterotrofe variabili e programmate.

La microalga isolata da detrito organico marino o diversamente fornita da Istituzioni per la collezione di microalghe, è stata prima coltivata in un terreno di arricchimento al fine di avere una coltura madre axenica adatta per le successive subcolture e dopo è stata studiata dal punto di vista biochimico per definire le migliori condizioni di sviluppo.

A tal riguardo sono state eseguite presso il laboratorio Agrobiosystem una serie di prove di coltura della microalga con diversi substrati artificiali agarizzati.

Dopo diverse colture sperimentali è stato prescelto un tipo di terreno particolarmente adatto alle finalità prefissate.

L’alga è stata mantenuta in coltura pura a 27°C in condizioni eterotrofe in un terreno nutritivo agarizzato, qui di seguito specificato.

Dopo successivi passaggi è stata preparata una coltura aigaie d’innesto eterotrofa, in beuta con soluzione nutritiva dello stesso tipo sotto riportato. Questa coltura è servita per l’inoculo di 8 litri di soluzione nutritiva precedentemente sterilizzata e raffreddata a 27°C e contenuta in un bioreattore da 14 litri Chemap a Alfa Lavai, Svizzera, modello CF 3000. La soluzione nutritiva era costituita da 1⁄4 di acqua marina filtrata e 3⁄4 di acqua demineralizzata addizionata di glucosio 15,4 g / litro, acetato di sodio 4,4 g / litro, succinato di sodio 2,2 g / litro, estratto di lievito 4,4 g / litro, idrolizzato di proteine di soia 3,6 g / litro.

Alla suddetta soluzione nutritiva sono stati aggiunti microelementi, vitamine e fattori di crescita.

Nellarco dei primi 3 giorni di coltura, per incrementare la quantità di biomassa, sono state aggiunte soluzioni nutritive contenente glucosio, estratto di lievito, idrolizzato di proteine di soia, acetato e succinato di sodio.

La coltura d’innesto era costituita da una sospensione microalgale contenente 25 g. litro (peso secco) di biomassa.

Il bioreattore era equipaggiato con un sistema automatico di controllo modello CBC 10 per il rilevamento e controllo dei seguenti parametri : pH, p02, temperatura, agitazione, addizione dei nutrienti temporizzato.

Tra le altre cose il bioreattore era provvisto di un particolare agitatore elicoidale adatto per ridurre l’azione di stress sulle microalghe.

Il bioreattore era anche provvisto di una lampada fluorescente che illuminava la coltura nel periodo programmato di illuminazione.

La coltura è stata condotta in condizioni axeniche secondo le norme G.M.P.( Good Manufacturing Practices) e si è seguito un ciclo produttivo in feed batch, integrando più volte i composti organici della soluzione nutritiva

Particolare attenzione è stata posta sul rapporto carbonio/azoto della soluzione nutritiva per incrementare la biosintesi lipidica.

La coltura è stata mantenuta eterotroficamente a 27 °C per 3 giorni, al termine dei quali si è provveduto a fornire energia luminosa per altri 2 giorni con un fotoperiodo di 16 ore di buio e 8 ore di luce.

In queste condizioni si è formata una biomassa aigaie adatta per il recupero dell’olio ricco in acido docosaesanoico e carotene.

La condizione fotoeterotrofa imposta dopo 3 giorni di coltura eterotrofa consente alle cellule monoalgali di entrare in una fase stazionaria, molto attiva per la biosintesi dei lipidi e dei carotenoidi.

Con questo processo si ottiene un biomassa aigaie contenente un olio essenziale, tra l’altro ricco in carotenoidi i quali preservano il prodotto dall’ossidazione e contribuiscono a valorizzare l’alimento oggetto di integrazione lipidica.

La biomassa al gale prodotta può essere recuperata dal brodo di coltura attraverso la centrifugazione , la flocculazione o la filtrazione.

Successivamente la biomassa viene ripetutamente lavata con acqua demineralizzata sterile e quindi può essere utilizzata fresca o in alternativa conservata dopo un opportuno processo di stabilizzazione biologica come racidificazione e la pastorizzazione, o la disidratazione da effettuarsi con le usuali tecniche industriali.

Questa biomassa prodotta, oltre ad essere ricca in DHA, è anche ricca in proteine di alto valore biologico che ne consente anche l’utilizzo come integratore proteico.

Da questa biomassa, attraverso l’estrazione con solvente esano, abbiamo recuperato l’olio aigaie.

Le analisi quali-quantitative dell’olio estratto sono state fatte, previa formazione degli esteri metilici, per gascromatografia.

Le analisi sono state effettuate con un gascromatografo Dani, modello 86. 10 munito di colonna capillare e di rivelatore a ionizzazione di fiamma.

Questo strumento era provvisto di integratore analitico Hewlett Packard per il calcolo delle aree percentuali.

Il profilo gascromatografico ha rivelato un’abbondanza di acido docosaesanoico tale da giustificare il bioprocesso sotto il profilo industriale. L’olio aigaie prodotto ha la seguente composizione media in acidi grassi :

L’olio aigaie prodotto, opportunamente deodorato con soluzione alcoolica può essere utilizzato tal quale come integratore lipidico per alimenti nutraceutici.

L’olio essenziale prodotto con questa tecnologia è da considerarsi naturale e pertanto adatto come integratore nei prodotti funzionali.

La biomassa aigaie ed il relativo olio estratto da Crypthecodinium cohnii possono essere considerati GRAS (Generalmente Riconosciuto Come Sicuro) poiché derivano da un organismo marino esente da tossine, molto studiato dal punto di vista tossicologico e da lunghi anni utilizzato come fitoplancton in pescicoltura.

Qualora si desideri concentrare l acido docosaesanoico e separarlo dalle altre frazioni, l’olio può essere idrolizzato chimicamente o enzimaticamente in modo tale da ottenere dai trigliceridi i rispettivi acidi grassi.

Quando l’idrolisi è completa, la soluzione è acidificata e gli acidi grassi liberi vengono estratti con un adatto solvente.

Infine la soluzione estrattiva può essere refrigerata a bassa temperatura fin tanto che possano cristallizzare soltanto gli acidi saturi e recuperare quindi l’acido docosaesanoico.

Questo acido può quindi essere utilizzato come additivo alimentare o in alternativa per applicazioni nell’industria farmaceutica.

Claims (7)

1. Rivendicazioni : 1) Un bioprocesso per la produzione di cellule monoalgali oleifere, ricche in proteine ed acido docosaesanoico, attraverso la coltura sommersa fotoeterotrofa o prevalentemente eterotrofa di microalghe marine della specie Crypthecodinium cohnii (Seligo) coltivate in bioreattori industriali rigorosamente controllati nei parametri di processo. a) Un processo per la produzione di olio aigaie alimentare attraverso l’estrazione dell’olio contenuto nella biomassa costituita da microalghe marine della specie Crypthecodinium cohnii (Seligo) coltivate in bioreattori industriali rigorosamente controllati nei parametri di processo. b) Un bioprocesso come rivendicato al punto 1, la cui elevata biosintesi di acido docosaesanoico è dovuta al condizionamento dei fattori ambientali e nutrizionali. c) Un bioprocesso come rivendicato al punto 1, nel quale le microalghe sono coltivate e si moltiplicano in condizioni fotoeterotrofe variabili e programmate, in una soluzione nutritiva costituita da sali inorganici come nitrato di sodio, fosfato monopotassico, cloruro ferrico, solfato di rame, solfato di zinco, sodio molibdato, cloruro di cobalto, cloruro di manganese. Questa soluzione nutritiva è arricchita con i seguenti composti organici e supplementata con vitamine e fattori di crescita : Glucosio 15,4 g / litro, acetato di sodio 4,4 g / litro, succinato di sodio 2,2 g / litro, estratto di lievito 4,4 g / litro, idrolizzato di proteine di soia 3,6 g / litro, tiamina cloridrata, cianocobalamina e biotina. d) Un bioprocesso come rivendicato al punto 1 nel quale la soluzione nutritiva precedentemente detta comprende acqua di mare o acqua di mare commerciale. e) Un bioprocesso come rivendicato al punto 1 nel quale la soluzione nutritiva è costituita da un quarto di acqua di mare o dal corrispettivo valore ponderale dei sali marini commerciali contenuti nell’acqua marina artificiale. f) Un bioprocesso come previsto al punto 1 nel quale la soluzione nutritiva può essere addizionata di precursori lipidici come ad esempio sodio glicerofosfato. g) Un bioprocesso come rivendicato al punto 1 nel quale la soluzione nutritiva comprende carbonio organico come risorsa energetica. h) Un bioprocesso come rivendicato al punto 1 nel quale le microalghe sono coltivate in presenza dei seguenti composti organici : glucosio, acetato di sodio, succhiato di sodio, estratto di lievito, idrolizzato di proteine di soia. i) Un bioprocesso come rivendicato al punto 1 nel quale il rapporto tra glucosio, acetato e succinato è di 7 : 2 : 1. 1) Un bioprocesso come rivendicato al punto 1 nel quale la fonte azotata della soluzione nutritiva è prevalentemente costituita da azoto organico.
2. 2) Un bioprocesso come rivendicato al punto 1 nel quale la coltura alla fine del 3° giorno viene condotta in condizioni fotoeterotrofe per l’apporto di una sorgente luminosa con un flusso fotonico alla superficie della coltura pari a 50 μ mol m2.s. a) Un bioprocesso come rivendicato ai punti 1,2 nel quale la coltura nella fase stazionaria presenta una limitata presenza di risorsa azotata. b) Un bioprocesso come rivendicato ai punti 1, 2 nel quale il rapporto tra carbonio organico ed azotato è nella fase stazionaria pari a 3 : 1. c) Un bioprocesso come rivendicato ai punti 1,2 nel quale la coltura è condotta ad una temperatura compresa tra 14°C e 36°C, preferibilmente a 27°C ; ed un pH compreso tra 5,50 e 8,0 preferibilmente 6, 5-7, 2. d) Un bioprocesso come rivendicato ai punti 1,2 nel quale la coltura è fatta sviluppare in una struttura artifiaciale costituita da un contenitore della soluzione nutritiva come fermentatore o bioreattore, o recipiente di coltura provvisto di sistema di controllo dei parametri chimico-fisici. e) Un bioprocesso come rivendicato ai punti 1,2 nel quale la coltura è ossigenata artificialmente attraverso idonei sistemi capaci di raggiungere e mantenere un livello di ossigeno disciolto di circa 10-70% del livello di saturazione. f) Un bioprocesso come rivendivato ai punti 1,2 nel quale la coltura microalgale a fine ciclo produttivo ha una densità di circa 20-50 g (peso secco) per litro di soluzione nutritiva. g) Un bioprocesso come rivendicato ai punti 1,2 nel quale l’intero ciclo produttivo si sviluppa in 4-5 giorni con un sistema di alimentazione in feed batch dei nutrienti prescelti.
3. 3) Un bioprocesso come rivendicato ai punti 1,2 nel quale il ceppo microalgale oltre ad essere di tipo naturale può essere di tipo mutante o ricombinante capace di incrementare le rese in olio e la percentuale di acido docosaesanoico. a) Un bioprocesso come rivendicato ai punti 1,2 nel quale il ceppo microalgale di tipo naturale, mutante o ricombinante può crescere e biosintetizzare DHA, in una soluzione nutritiva costituita da composti economicamente più vantaggiosi per il processo, al fine di ridurre il costo di produzione della biomassa e dei relativi prodotti da essa derivati. b) Un bioprocesso come rivendicato ai punti 1,2,3 nel quale la biomassa prodotta ha un contenuto in olio estraibile di almeno del 23 %, e la produttività, riferita al bioreattore, ed espressa in acido docosaesanoico, è di almeno 4 g. per litro di soluzione nutritiva.
4. 4) Un bioprocesso come rivendicato ai punti 1,2,3 nel quale la biomassa, alla fine del ciclo viene separata dalla soluzione nutritiva per centrifugazione e lavorata per l’estrazione dell’olio ricco in acido docosaesanoico. a) Un bioprocesso come rivendicato ai punti 1,2, 3, 4 nel quale la biomassa aigaie può essere utilizzata per integrare il metabolismo umano o animale con acido docosaesanoico, attraverso l’alimentazione con farina aigaie o con l’olio da essa derivato. b) Un bioprocesso come rivendicato ai punti 1 ,2,3,4 nel quale la biomassa aigaie può essere utilizzata come esaltatore di sapidità all’ aroma di frutti di mare (ostriche) per alimenti a base di pesce, crostacei, molluschi. c) Un bioprocesso come rivendicato ai punti 1,2, 3, 4 nel quale la biomassa può essere trattata con soluzione alcoolica per recuperare un alcoolato aigaie ricco in aroma di frutti di mare.
5. 5) Un bioprocesso come rivendicato ai punti 1,2, 3, 4 nel quale la biomassa viene estratta con adatti solventi, compreso esano, per un tempo di contatto di almeno 4 ore al fine di estrarre l’olio aigaie. a) Un bioprocesso come rivendicato ai punti 1,2, 3, 4, 5 nel quale algale è recuperato per allontanamento del solvente attraverso la distillazione.
6. 6) Un bioprocesso come rivendicato ai punti 1,2, 3, 4, 5 nel quale l’olio aigaie prodotto ha un colore giallo arancio per la presenza di carotene ed è liquido a temperatura ambiente. a) Un bioprocesso come rivendicato ai punti 1,2, 3, 4, 5, 6 nel quale l’olio aigaie prodotto, contenga almeno il 25% in peso di acido docosaesanoico in forma di trigliceride.
7. 7) Un bioprocesso come rivendicato ai punti 1,2, 3, 4, 5, 6 nel quale l’olio aigaie prodotto può essere utilizzato come integratore alimentare negli oli vegetali, generalmente consumati per uso alimentare. Per la ricchezza e qualità del contenuto in acido docosaesanoico presente, quest’olio può essere in ogni caso utilizzato per la preparazione di alimenti funzionali. Sebbene questa invenzione sia stata qui descritta con un certo grado di particolarità, si capisce bene che la stessa possa essere modificata da qualsiasi biotecnologo nei dettagli del processo, rielaborando parti del brevetto senza poter modificare però lo spirito e lo scopo dell’ invenzione come sopra rivendicati. E’ altresì evidente che eventuali modifiche rientrano nell’ ambito della presente invenzione, però il concetto base produttivo che qui rivendichiamo non potrà risultare, in questo caso, stravolto.