ITPI20010025A1 - Composizioni farmaceutiche a basso dosaggio di farmaci antilipoliticiutili nella terapia anti-invecchiamento e nella prevenzione delle pato - Google Patents

Description

Titolo

Composizioni farmaceutiche a basso dosaggio di farmaci antilipolitici utili nella terapia antiinvecchiamento e nella prevenzione delle patologie età associate.

Riassunto

Si descrivono composizioni farmaceutiche di farmaci antilipolitici, a basso dosaggio, utili per riprodurre nelle specie animali che ne abbisognano gli effetti benefici propri delle restrizioni dell'apporto calorico al fine di ritardare l'invecchiamento biologico e la comparsa di malattie associate con l'età anziana.

L'invecchiamento biologico è un fenomeno universale, comune cioè a tutte le specie viventi che fondino il proprio metabolismo energetico sull'utilizzazione di zuccheri e di ossigeno. E’ caratterizzato da un progressivo declino di tutte le funzioni dell'organismo e da un aumento con l'età della probabilità di ammalarsi sempre più gravemente e di exitus (1). I meccanismi biochimicofunzionali responsabili del decadimento senile delle funzioni di tutte le cellule, tessuti, organi ed apparati di tutti gli esseri viventi sono complessi e ancora non del tutto precisati, ma è certo il ruolo dei radicali tossici dell'ossigeno (2) e delle reazioni di glicazione non enzimatica (3), ed è certo anche il fatto che le alterazioni prodotte da questi agenti aggressivi e non riparate si riflettono in un progressivo cambiamento della struttura (ad esempio, con accumulo di dolicolo) e in un profondo deterioramento delle funzioni delle membrane e degli organuli cellulari, con conseguente alterazione della risposta agli stimoli ormonali, e quindi con pregiudizio per la prontezza e l'entità degli adattamenti delle prestazioni funzionali cellulari al mutare dei bisogni di funzione dell'organismo (4). Il progredire del processo di invecchiamento è descrivibile dal progressivo accumulo di dolicolo, che rappresenta perciò un biomarcatore di invecchiamento (5).

L’alterazione della costituzione lipidica dei tessuti in corso di invecchiamento non è fatto sorprendente. E’ ben noto che in corso di invecchiamento aumenta l’adiposità e si modifica la distribuzione corporea del tessuto adiposo, aumentano i livelli plasmatici di colesterolo, trigliceridi e acidi grassi liberi, l’accumulo di componenti lipidiche nelle pareti arteriose e la frequenza delle lesioni aterosclerotiche (6).

Vi è ormai accordo unanime che le alterazioni provocate dall'invecchiamento possono essere ritardate da opportuni interventi sullo "stile di vita". E' noto che la dieta e l'esercizio fisico sono i cardini degli interventi di prevenzione dell'invecchiamento sia negli animali da esperimento sia nell'uomo (7,8). In particolare, nei roditori di laboratorio, ed anche nei primati, la restrizione calorica è capace di ritardare l'invecchiamento biologico e la comparsa di malattie associate con l'età anziana (7). Nei roditori la restrizione dietetica aumenta la vita media ed anche la durata massima di vita, dimostrandosi cosi capace di rallentare i meccanismi dell'invecchiamento, ritardando nel tempo la comparsa di praticamente tutti i segni e i sintomi dell'invecchiamento, ed anche la comparsa delle più disparate patologie età associate, inclusi diabete e neoplasie (7). Merita ricordare che la restrizione calorica previene l'accumulo di dolicolo nelle membrane delle cellule degli organismi anziani (4). L'effetto benefico della restrizione calorica varia con la durata del trattamento: è massimo se la restrizione è iniziata immediatamente al termine dello sviluppo; è ridotto ma sempre significativo se la restrizione è iniziata alla mezza età; è trascurabile se la restrizione è iniziata a età successive; si riduce se la restrizione è interrotta, ma può restare pur sempre significativo (7). Gli effetti della restrizione calorica sull'accumulo di dolicolo nei tessuti variano parallelamente agli effetti della restrizione calorica sulla longevità (5). Le alterazioni del metabolismo lipidico possono essere controllate anche con un’opportuna terapia farmacologica. Tra i farmaci in uso per la normalizzazione del quadro lipemico meritano particolare attenzione gli agenti antilipolitici, quali il 3,5-dimetilpirazolo, l’acido nicotinico e suoi esteri ed ammidi, l’acido 5-metil-pirazin-2-carbossilico-4-ossido (Acipimox) e suoi derivati, la cui somministrazione prolungata ha effetti benefici sulla lipemia totale, la colesterolemia e la trigliceridemia.

Riassunto dell' invenzione.

La presente invenzione riguarda composizioni farmaceutiche a basso dosaggio di noti agenti antilipolitici che sono utili, quando sono somministrate a digiuno, per indurre processi di autofagia/proteolisi nell’animale compreso l’uomo; dette composizioni, se desiderato, sono utili per indurre il rimodellamento cellulare nell’animale e nell’uomo che ne abbisogni, attraverso un regime di somministrazione intersettimanale; infine le composizioni dell’invenzione sono utili per riprodurre e potenziare gli effetti con cui la restrizione calorica ritarda la comparsa delle alterazioni senili e delle malattie associate con l'età anziana.

Un ulteriore oggetto della presente invenzione è la preparazione e produzione di animali ad invecchiamento ritardato ottenuti mediante la somministrazione di dette composizioni farmaceutiche.

Descrizione dettagliata dell'invenzione.

Sono state studiate le alterazioni età-dipendenti della sensibilità ai farmaci antilipolitici somministrati a digiuno, a ratti Sprague Dawley di diversa età. Sono quindi stati valutati gli effetti della somministrazione in vivo ripetuta cronicamente con cadenza settimanale sui livelli di dolicolo, quale parametro indicativo della capacità di mantenimento dell’integrità della costituzione delle membrane e della velocità dell’invecchiamento biologico. Il dosaggio è stato effettuato per HPLC (4). E’ stato, inoltre, verificato l’effetto del trattamento su una funzione cellulare connessa con il mantenimento di organuli e citomembrane perché responsabile della rimozione di membrane e organuli alterati, l’autofagia. L’autofagia è stata stimata dalla velocità della proteolisi epatocitaria in assenza o in presenza di aminoacidi nel mezzo di incubazione mediante dosaggio HPLC della vaiina liberata (9,10). Gli effetti del trattamento farmacologico sono stati confrontati con gli effetti di un trattamento di restrizione calorica ad azione anti-invecchiamento. Il farmaco antilipolitico di scelta è stato l’acido 5-metil-pirazin-2-carbossilico-4-ossido (Acipimox) e sono state utilizzate sue soluzioni in fisiologica tamponata a pH 2,1. La somministrazione è stata eseguita per via intragastrica. Sono stati saggiati gli effetti di diverse dosi del farmaco (1, 2, 5 e 50 mg/Kg di peso corporeo). Sono stati utilizzati ratti maschi e femmine Sprague-Dawley di 2, 6, 12 e 24 mesi di età. Sono riportati solo i dati ottenuti mediante la somministrazione ad animali a digiuno da 16-18 ore, non essendo gli effetti del farmaco risultati significativi nell’animale alimentato. L'effetto antilipolitico del farmaco è stato verificato dosando i livelli plasmatici di acidi grassi liberi (FFA) e le conseguenze sul metabolismo glucidico sono state valutate dalle variazioni della glicemia utilizzando kits da laboratorio disponibili in commercio. Le ripercussioni sul metabolismo proteico sono state valutate dalle variazioni della valinemia, un buon indicatore dell<1 >autofagia-proteolisi epatica, dosata per HPLC (9,10).

L’andamento dei pesi corporei dimostra che il trattamento è ben tollerato dagli animali, e che la somministrazione cronica del farmaco ai dosaggi massimi utilizzati non incide significativamente su questo parametro biologico (fig. 1).

Un esperimento preliminare su ratti giovani (3 mesi di età) ha confermato che una singola somministrazione del farmaco antilipolitico riduce in misura significativa in meno di un'ora i livelli plasmatici di acidi grassi liberi e i valori glicemici, e aumenta la valinemia dopo una latenza compatibile con i tempi di induzione del processo di autofagia-proteolisi epatica (Tabella 1). La tabella mostra che il farmaco ha già effetto significativo alla dose di 1 mg/Kg di peso corporeo, e che dosi più elevate prolungano la durata di azione sui livelli plasmatici di acidi grassi non esterificati e rendono un po’ più marcata l’ipoglicemia; l’effetto di aumento della valinemia pare un po’ ritardato alle dosi più alte, forse per il maggiore consumo dell’ aminoacido in condizione di bassa disponibilità degli altri substrati ossidabili.

In un successivo esperimento sono stati valutati gli effetti della somministrazione di una singola dose di 5 mg del farmaco (Acipimox)/Kg di peso corporeo a ratti maschi Sprague Dawley di 3, 6, 12 e 24 mesi di età. La Tabella 2 (i cui dati sono proposti graficamente nelle figure A e B) mostra che l’età ha un effetto significativo sui tassi plasmatici di FFA (P<0,01), che il trattamento con il farmaco antilipolitico abbassa in maniera significativa i livelli degli FFA nel plasma (P<0,01), che l’effetto inibente varia con il tempo trascorso dalla somministrazione (P<0,01) in misura diversa in funzione dell’età (P<0,01); nell’insieme comunque non si osservano differenze importanti di effetto del farmaco tra animali di diversa età. La Tabella 3 (in grafico figure C e D) mostra che negli stessi animali le variazioni glicemiche dopo la somministrazione dell’agente antilipolitico seguono le variazioni dei tassi plasmatici di FFA: il trattamento causa un’ipoglicemia che raggiunge un minimo intorno alle 2 ore e persiste poi per oltre 3 ore (fino a 5-6 ore). Anche in questo caso non si osserva alcuna differenza significativa tra gli effetti del farmaco in funzione dell’età degli animali. La Tabella 4 (in grafico figure E e F) mostra gli effetti del trattamento antilipolitico sulla valinemia, l’indicatore da noi saggiato per misurare l’aumento della proteolisi. La concentrazione piasmatica dell’ aminoacido aumenta in tutti i gruppi di età a partire dalla seconda ora e raggiunge i valori massimi intorno alla 3.a-4.a ora. L’esperimento fu ripetuto in gruppi di ratti Sprague Dawley di sesso femminile delle stesse età con risultati sostanzialmente identici.

In conclusione, i risultati ottenuti indicano che, indipendentemente dal sesso e dall’età, il trattamento farmacologico conserva la propria efficacia antilipolitica e stimola importanti aggiustamenti metabolici al vuoto di substrati energetici provocato dalla soppressione della lipolisi ed opera a dosaggi del farmaco (Acipimox) molto bassi (1-2 mg/Kg di peso corporeo, pari a 1/3 -1/4 della dose giornaliera abitualmente somministrata nell’uomo per il suo impiego come farmaco ipolipemizzante).

Sono stati quindi valutati gli effetti di dosi basse del farmaco somministrate settimanalmente per tutta la durata della vita sulle variazioni di composizione dei lipidi strutturali. Gruppi di ratti sono stati stabulati dall’età di 2 mesi a dieta libera (AL), a dieta ristretta ad azione anti-invecchiamento (alimentazione libera a giorni alternati a giorni di digiuno, EOD), a dieta libera con un giorno di digiuno settimanale seguito da trattamento per via intragastrica con soluzione fisiologica (DF), e a dieta libera con un giorno di digiuno settimanale e trattamento per via intragastrica con Acipimox (DA). Nel corso dell’ esperimento è stato verificato se la somministrazione cronica del farmaco alterasse l’efficacia del trattamento. Le Tabelle 5 e 6 (in grafico figure G e H) mostrano gli effetti della somministrazione acuta di una dose pari a 5,0 mg/Kg di peso corporeo di Acipimox sui livelli plasmatici di FFA, glucosio e vaiina di ratti maschi rispettivamente di 6 e di 12 mesi di età mai trattati (controlli) o cronicamente trattati (AD) con Acipimox (5,0 mg/kg p.c.) una volta alla settimana. I risultati dimostrano che il pretrattamento cronico con Acipimox riduce gli effetti di una dose acuta del farmaco su FFA, glicemia e valinemia, ma che tali effetti rimangono comunque altamente significativi.

La Figura 2 mostra il comportamento dei livelli di dolicolo nel lobo mediano del fegato di tali animali. I risultati dimostrano che negli animali AL il dolicolo epatico aumenta in maniera impressionante con l’aumentare dell’età, come già osservato (4); che il trattamento di digiuno settimanale DF può avere un qualche effetto benefico, però molto contenuto tanto da essere al limite della significatività; che il trattamento DA (cioè l’aggiunta del farmaco antilipolitico a basso dosaggio al digiuno settimanale) ha un effetto benefico altamente significativo e previene l’accumulo senile in misura praticamente totale. Nella figura è riportato anche l’effetto di prevenzione dell’accumulo di dolicolo ottenibile con una restrizione dietetica ad azione antiinvecchiamento consistente in giorni di assoluto digiuno regolarmente intervallati a giorni di alimentazione a volontà, cioè da 3 a 4 giorni di digiuno alla settimana (trattamento EOD). Il confronto dimostra che i benefici ottenibili con il mite trattamento DA sono praticamente identici a quelli ottenuti con una dieta EOD, che comporta restrizioni alimentari tanto severe da causare la perdita di circa il 30% del peso corporeo.

Va sottolineato che l’effetto benefico del trattamento prolungato con Acipimox nelle condizioni sperimentali sopra esposte non è però attribuibile all’effetto antilipolitico del farmaco. Il farmaco è, infatti, inattivo se somministrato ad animali alimentati; né i suoi effetti si manifestano in animali digiuni cui sia stata fornita da bere ad libitum una soluzione di saccarosio a concentrazione sufficiente a prevenire lipoglicemia, in luogo dell’acqua di fonte, dopo la somministrazione del farmaco a digiuno.

Sono stati quindi valutati gli effetti sulla funzione di autofagia-proteolisi atti a verificare l’ipotesi che una ripetuta stimolazione della autofagia/proteolisi contribuisca a migliorare il mantenimento dell’ integrità delle citomembrane e concorra a determinare le condizioni che impediscano l’accumulo patologico del dolicolo.

Gli esperimenti sono stati effettuati su epatociti isolati secondo la tecnica di Seglen, incubati in Krebs-Ringer bicarbonato pH 7,4 (gas 02/C02) a 37°C in presenza di una miscela di aminoacidi che non includeva la vaiina, di concentrazione pari a 0; 0,5; 1; 2; 4 volte la concentrazione fisiologica del plasma venoso del ratto digiuno. La velocità di proteolisi è stata misurata valutando il rilascio di vaiina nel mezzo di incubazione con tecnica HPLC (9,10). La Figura 3 mostra che negli animali a dieta libera, a partire dai 12 mesi, l’attivabilità della proteolisi da riduzione della concentrazione di aminoacidi nel mezzo di incubazione cala progressivamente con l’aumentare dell’età. I ratti con trattamento dietetico DF (digiuno un giorno alla settimana) mostrano una funzione di proteolisi assai simile a quella degli animali AL. L’aggiunta al trattamento sperimentale della somministrazione settimanale di Acipimox in contemporanea con il digiuno previene totalmente le alterazioni senili della attivabilità del processo di autofagia da carenza di aminoacidi nel mezzo di incubazione. Anche in questo caso, per confronto sono riportati gli effetti del trattamento dietetico EOD. All’età di 6 mesi, quando ancora non si vedono segni di deterioramento senile, il trattamento EOD mostra effetti di aumento della capacità proteolitica epatocitaria che non sono osservabili nei ratti AD. A età più avanzate, però, quando nei ratti AL gli effetti dell’invecchiamento divengono significativi, i trattamenti AD e EOD risultano possedere effetti benefici praticamente identici.

In conclusione, i dati dimostrano che il trattamento cronico con farmaci anti-lipolitici previene le alterazioni età-dipendenti della composizione lipidica delle membrane e degli organuli cellulari, ma che i meccanismi di questa azione, diversamente da quanto atteso, non sono spiegabili come una conseguenza a livello dei diversi tessuti dell’azione del farmaco sulla lipolisi adipocitaria. L’identità degli effetti del trattamento con farmaci antilipolitici e delle severe restrizioni dietetiche ad azione anti-invecchiamento, alla luce della precedente scoperta delazione dei farmaci antilipolitici sulla funzione del processo di autofagia proteolisi (11) e del chiarimento che la restrizione dietetica antiinvecchiamento agisce stimolando periodicamente il meccanismo dell’autofagia (12), indica che i farmaci antilipolitici a basse dosi a digiuno e le severe restrizioni caloriche operano i loro effetti anti-invecchiamento con lo stesso meccanismo fisiologico: la stimolazione di un importante meccanismo riparatore delle strutture cellulari, Γ autofagia.

Sulla base dei risultati sperimentali sopra esposti, sono pertanto oggetto della presente invenzione composizioni farmaceutiche di farmaci antilipolitici, a basso dosaggio, utili per riprodurre nelle specie animali che ne abbisognano, gli effetti benefici propri delle restrizioni dell'apporto calorico al fine di ritardare l'invecchiamento biologico, e la comparsa di malattie associate con l'età anziana. I farmaci antilipolitici sono scelti nel gruppo di acido nicotinico e suoi derivati esteri ed ammidi utili allo scopo, acido 5-metil-pirazin-2-carbossilico-4-ossido e suoi analoghi, 3,5-dimetil-pirazolo. Agente antilipolitico particolarmente preferito dell’invenzione è l’acido 5-metil-pirazin-2-carbossilico-4-ossido (Acipimox).

Le dosi del farmaco, che possono variare in funzione dello stato di salute del paziente, sono comprese nell’intervallo da 0,5 a 2,5 mg per Kg di peso corporeo nell’uomo nel caso dell’uso di Acipimox, e più generalmente almeno un quinto, o meno, della dose che per i singoli farmaci è abitualmente raccomandata per espletare la loro attività terapeutica come farmaci antilipolitici. Le composizioni farmaceutiche dell’invenzione sono preparate in modo convenzionale e sono utili per la loro somministrazione per via orale nella forma di compresse a pronto rilascio, compresse masticabili e/o nella forma di gomme ad assorbimento per linguale o nella forma di soluzioni da assumere dopo diluizione con liquidi, In tutte le preparazioni farmaceutiche dell’invenzione si eviterà l’uso come eccipienti di carboidrati ed altre sostanze nutritive di rapida assimilazione ad uso energetico, che sono controindicati negli scopi dell’invenzione stessa.

In considerazione del fato che possa essere oneroso e poco gradito ridurre al 60% ed oltre, l’abituale apporto calorico o, alternare periodi di alimentazione ad libitum con periodi di astinenza assoluta dal cibo o praticare tratamenti dietetici che alternino giorni di alimentazione libera con giorni di digiuno a persone che abbisognino di un tratamento terapeutico restritivo, si ritiene, che, al contrario, possa essere accettabile interporre nella dieta setimanale abituale un giorno che preveda accanto ad una restrizione dall’ assunzione del cibo l’induzione per via farmacologica di processi autofagici ati a surrogare con pari efficacia tratamenti psicologicamente più restrittivi. Un’ulteriore applicazione della presente invenzione concerne la produzione di animali a invecchiamento ritardato, otenuti secondo il procedimento dell’invenzione, utili per gli usi della ricerca sperimentale.

Claims (1)

1. Rivendicazioni a) Composizioni farmaceutiche di farmaci antilipolitici, a basso dosaggio, utili per riprodurre nelle specie animali che ne abbisognano gli effetti benefici propri delle restrizioni dell'apporto calorico al fine di ritardare l'invecchiamento biologico e la comparsa di malattie associate con l'età anziana. b) Composizioni farmaceutiche, in cui in accordo alla rivendicazione 1, il principio attivo è scelto nel gruppo di acido nicotinico e suoi derivati esteri ed ammidi utili allo scopo, acido 5-metil-pirazin-2-carbossilico-4-ossido e suoi analoghi, 3,5-dimetil-pirazolo. c) Composizioni farmaceutiche che, in accordo alle rivendicazioni 1 e 2, sono idonee per la somministrazione di una dose del principio attivo compresa nell’ intervallo da 0,5 a 2,5 mg per Kg di peso corporeo nell’uomo e più generalmente intorno ad almeno un quinto o meno della dose che per i singoli farmaci è abitualmente raccomandata per espletare la loro attività terapeutica come farmaci antilipolitici. d) Composizioni farmaceutiche in cui, in accordo alla rivendicazione 1, il principio attivo particolarmente preferito dell’invenzione è l’acido 5-metil-pirazin-2-carbossilico-4-ossido (Acipimox). e) Formulazioni farmaceutiche, utili per la somministrazione orale contenenti, in accordo alla rivendicazioni 1, 3 e 4, come singolo dosaggio quantità pari ad almeno 100 mg o sue frazioni di acido 5-metil-pirazin-2-carbossilico-4-ossido (Acipimox) per la preparazione di un medicamento utile per il trattamento preventivo dell'invecchiamento biologico e delle patologie età-associate. f) Composizioni farmaceutiche di cui alla rivendicazioni 1, 2 e 3 da utilizzarsi per la somministrazione a digiuno di bassi dosaggi di un agente lipolitico, da utilizzarsi per la produzione di modelli animali ad invecchiamento ritardato.