ITMI972866A1 - Processo di selezione di linfociti t cd4+ per la transduzione di geni anti-hiv - Google Patents
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Description
"PROCESSO DI SELEZIONE DI LINFOCITI T CD4+ PER LA TRANSDUZIO-NE DI GENI ANTI-HIV"
La presente invenzione ha per oggetto linfociti T CD4+ ingegnerizzati così da esprimere una molecola di superficie cellulare e capaci di essere infettati da HIV in vitro e/o in vivo.
L'invenzione riguarda inoltre un metodo di selezione positiva di linfociti T CD4+ iniettabili da HIV e vettori retrovirali per la trasduzione di cellule mononucleate di sangue periferico e di linfociti T CD4+.
Sfondo dell' invenzione
La prevenzione o il trattamento dell'infezione da v dell'Immunodeficienza umana (HIV) è una delle possibili applicazioni della terapia genica (Nature 335, 395-396, 1988).
Diversi studi hanno suggerito il potenziale dell'immunizzazione intracellulare per l'inibizione della replicazione e della diffusione di HIV. In questa strategia, l'obiettivo è di sostituire progressivamente le cellule del paziente suscettibili all'infezione di HIV con cellule modificate geneticamente per trasportare molecole capaci di interferire con diversi stadi del ciclo vitale di HIV. Allo scopo, sono state proposte proteine strutturali e regolatorie (Celi 58, 205-214, 1989 e 65, 241-248, 1991), KNA decoys (TIG, 10, 139-144, 1994), RNA anti-senso (Science 261, 1004-1012, 1993) , e ribozimi (Gene Therapy 1, 38-45, 1994; J. Virol. 65, 5531-5534, 1991) . Rapporti sulla attività anti-HIV hanno dimostrato variabili livelli di induzione di resistenza in linee cellulari trasdotte. In particolare, un clone della linea cellulare umana CEM T che esprime stabilmente la proteina mutante RevMIO era resistente all'infezione da HIV mentre l' inibizione della replicazione virale fu ottenuta in altre linee cellulari umane esprimendo KNA antisenso nelle cellule (Science 258, 1485-1488, 1992) . Inoltre, l'espressione costitutiva di trascritti dell'elemento responsivo chimerico neo-Rev (RRE) soppresse la funzione della proteina di transdominio Rev di HIV-1 in cellule CEM (Hum. Gen. Ther. 5, 193-201, 1994) .
L'espressione di sequenze derivate da RRE (New Biol. 4, 66-74, 1992; J.Virai 68, 8254-8264,1994)o di un decoy TAR (Celi 63, 601-608, 1990; Gene Therapy 2, 377-384, 1995) inibì la replicazione di HIV-1 in linee di linfociti umani T CD4+. Tuttavia sono disponibili solo dati limitati sui linfociti primari, inclusi recenti studi che descrivono diversi metodi di trasferimento genico in cellule mononucleate di sangue periferico (PBMC) da pazienti infettati da HIV (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91,11581-11585,1994; J.Virol 69, 4045-4052,1995).
Non sono attualmente disponibili metodi che consentano la trasduzione di PBMC o di altre cellule derivate dal midollo osseo che consentano di ottenere linee cellulari trasdotte capaci di essere infettate da HIV. Tali cellule costituirebbero un modello ideale per lo studio dell'immunizzazione intracellulare contro HIV.
I metodi convenzionali, basati sulla selezione negativa di cellule trasdotte contenenti il gene della resistenza alla neomicina (NeoR) portano per lo più a linfociti CD8+ scarsamente sensibili all'infezione da HIV.
Si è ora trovato un sistema di selezione positiva che consente di ottenere linfociti T CD4+ che mantengono la capacità di essere infettati da HIV in vitro e/o in vivo. Il metodo dell'invenzione consente pertanto di ottenere PBMC e linfociti T CD4+ trasdotti con vettori recanti geni anti-HIV, la cui espressione ed effetto possono essere convenientemente studiati.
Breve descrizione dell'invenzione
Si è trovato che è possibile trasdurre e selezionare positivamente PBMC che mantengono la capacità di essere infettati da HIV conferendo a PBMC la capacità di esprimere una molecola di superficie cellulare (Blood 83, 1988-1997, 1994). Ciò può essere ottenuto utilizzando opportuni vettori retrovirali contenenti sequenze di DNA che codificano per dette molecole di superficie cellulare.
Pertanto, in un suo primo aspetto, l’invenzione fornisce PBMC o linfociti T CD4+ ingegnerizzati così da esprimere una molecola di superficie cellulare e capaci di essere infettati da HIV in vitro e/o in vivo.
L'invenzione fornisce inoltre un metodo di selezione positiva di linfociti T CD4+ iniettabili da HIV che comprende la trasduzione di cellule mononucleate di sangue periferico con vettori retrovirali che contengono sequenze di DNA codificanti per molecole di superficie cellulare e la successiva immunoselezione positiva con anticorpi contro dette molecole di superficie.
Costituiscono oggetto dell'invenzione anche i vettori retrovirali per la trasduzione di cellule mononucleate di sangue periferico contenenti geni anti-HIV e DNA codificante per una molecola di superficie cellulare.
Un ulteriore aspetto dell'invenzione è costituito dall'uso dei linfociti trasdotti e selezionati secondo l'invenzione come modello sperimentale di immunizzazione intracellulare contro HIV.
Descrizione, dettagliata dell’invenzione
L'ingegnerizzazione di PEMC o linfociti T CD4+ può essere effettuata utilizzando vettori retrovirali che contengono sequenze codificanti per molecole di superficie cellulare o per frammenti di esse. Molecole di superficie cellulare adatte comprendono ad esempio recettori di fattori di crescita eventualmente privati del dominio intracellulare allo scopo di eliminare l'eventuale ruolo funzionale della molecola di superficie cellulare trasdotta. Preferibilmente, si impiega la forma mutata, priva del dominio intracellulare, del recettore a bassa affinità del fattore di crescita dei nervi (Blood 83,1988-1997, 1994). Il DNA vettore viene convertito nel virus corrispondente con metodi convenzionali utilizzando il metodo dell'elettroporazione o protocolli di transfazione, in note linee cellulari "packaging".Secondo l'invenzione possono essere utilizzati vettori retrovirali convenzionali, ad esempio, il vettore LXSN,dotato di un sito Hpa I dove è possibile inserire il gene che codifica per la molecola di superficie cellulare ed eventuali geni anti-HIV (Mol. Celi. Biol. 10, 4239-4242, 1990) .
Poiché la molecola di superficie cellulare trasdotta non è espressa sulla maggior parte delle cellule emopoietiche umane, è possibile una quantificazione dei livelli di espressione per immunocolorazione.e analisi FACS.
Le cellule trasdotte possono essere immunoselezionate con anticorpi poli- o preferibilmente monoclonali capaci di riconoscere la molecola di superficie trasdotta.
Esempi di geni anti-HIV che possono essere inseriti nei linfociti T CD4+ trasdotti e selezionati in accordo con l'invenzione comprendono: sequenze target (decoy) per fattori di trascrizione del virus HIV (per esempio,TAT);
ribozimi diretti contro BNA virali;
geni codificanti per mutanti dominanti-negativi di proteine di HIV; mutanti naturali non patogeni di HIV che interferiscono con la replicazione e il packaging di HIV (per esempio,mutante F-12);
varie combinazioni di quanto sopra.
Secondo un protocollo preferito, PBMC da donatori sani sieronegativi per HIV sono sottoposti a immunodeplezione di cellule CD8+ utilizzando anticorpi monoclonali anti-CD8 coniugati a microsfere magnetiche.La popolazione di linfociti arricchita in cellule CD4+ così ottenuta viene quindi stimolata con FHA e interleuchina-2 (IL-2) oppure con IL-2 da sola. La trasduzione del gene codificante per il recettore privo del dominio intracellulare del fattore di crescita dei nervi a bassa affinità Δ LNGFR) viene effettuata co-coltivando i linfociti con linee cellulari produttrici per un periodo variabile da 2-6 giorni, preferibilmente per 4 giorni circa. L'immunoselezione delle cellule ΔLNGFR+ viene quindi effettuata con microsfere magnetiche rivestite di anticorpi monoclonali.
I linfociti T ottenibili in accordo con l'invenzione, oltre all'utilità per l'identificazione di molecole inibitorie di HIV,possono costituire un miglioramento sostanziale verso la progettazione di protocolli efficaci che conportino l'impiego di linfociti T ingegnerizzati in studi clinici. Infatti, il trasferimento genico in cellule somatiche per mezzo di vettori retrovirali richiede la condizione che,nel paziente sieropositivo, possa favorire la diffusione delle-particelle di HIV infettive dalle cellule infettate a quelle non infettate. Per questi motivi, è essenziale selezionare esclusivamente cellule trasdotte che contengono geni anti-HIV prima della reinfusione nel paziente.
L'invenzione sarà ora descritta in maggior dettaglio nei seguenti esenpi.
Esempio1
Selezione positiva basata_su ΔLNGFR
PBMC da donatori sani sieronegativi per HIV furono isolati con gradiente di densità Ficoll-Hypaque (Pharmacia Uppsala, Svezia). I linfociti purificati furono seminati in piastre a 24 pozzetti (Falcon, Lincoln Park,NJ)e messi in coltura per 72 ore con fitoemagluttinina (2 pg/mL; PHA-L, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germania) e IL-2 (lOOU/mL; Cetus, Emeryville, CA) in terreno RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY) addizionato di 1 mM glutammina (GIBCO), 100 U/ml di antibiotici, 50% di siero umano (HS). Alternativamente, la stimolazione fu effettuata con IL-2 da sola per 6-8 giorni e le cellule furono coltivate come sopra descritto. Le cellule stimolate furono quindi lavate due volte e risospese in terreno contenente IL-2 ricombinante umana (100 U/mL, Cetus, Emeryville, CA). Il trasferimento genico fu effettuato per cocoltivazione di PEMC stimolati con PHA con la linea cellulare packaging ecotropica E86 (J. Virol. 62, 1120-124, 1988) per coprecipitazione standard con fosfato di calcio. Tale linea cellulare era stata preventivamente trasfettata con il vettore LXSN nel cui sito Hpa I era stato inserito il DNA codificante per ΔLNGFR (Blood 83, 1988-1997, 1994).
48 ore dopo la trasfezione, i surnatanti E86 furono raccolti ed inpiegati per infettare la linea cellulare packaging anfotropica AM12 (J. Virol. 59, 284-291, 1986) per 16 ore in presenza di 8 Ug/mL di polibrene. Le cellule ΔLNGFR+ trasdotte furono arricchite per immunoselezione positiva con microsfere magnetiche rivestite con IgG di capra anti-topo (Dynal A.S., Oslo, Norvegia). 4x10<6 >cellule/mL furono incubate con anticorpo monoclonale anti a 4°C per 30 minuti, lavato due volte in un terreno contenente 2% di FCS e risospeso nel terreno con le microsfere magnetiche a 4°C per 30 minuti.Si effettuò la selezione magnetica e le microsfere furono separate dalle cellule dopo incubazione per una notte a 37'C in atmosfera di C02 al 5%. Inoltre, allo scopo di migliorare la frequenza di PBMC CD4+ trasdotti, le cellule Furono incubate con microsfere magnetiche coniugate con anticorpi monoclonali anti-CD8 umani (Hiltenyi Biotech. , Bergisch, Germania) per 20 minuti a 4°C e le cellule CD8+ furono allontanate per separazione magnetica, così da rimuovere l'effetto soppressivo non litico sulla replicazione di HIV esercitato dai linfociti T CD8+.
ESEMPIO 2
Fenotipizzazione della superficie cellulare
L'espressione sulla superficie cellulare di ΔLNGFR fu controllata per citometria di flusso impiegando l anticorpo monoclonale murino anti-ΔLNGFR umano 20.4 (American Type Culture Collectio, Rockville,MD) con un metodo di marcatura fluorescente indiretta. Il fenotipo della superficie cellulare dei linfociti T fu determinato per citometria di flusso impiegando anticorpi monoclonali di capra anti-CD4 o CD8 umani coniugati con fluorosceina isotiocianato (FITC) o rodamina (Coulter immunology , Hialeah, FL). 3x105 cellule furono colorate con 100 U1 di anticorpo monoclonale diluito 1:100 a 4<°>C per 30 minuti, lavato 2 volte nel terreno con 2% FCS e risospese in 0,2 mi di terreno senza FCS per l'analisi FACS, oppure in 100 μΐ di anticorpo monoclonale secondario coniugato a FITC (Coulter).
Esempio 3
Infezione acuta delle cellule PEMC trasdotte con HIV-1
I PBMC ottenuti in accordo con l'esempio precedente (2,5xl0<5 >cellule-mL) furono piastrati in piastre a 24 pozzetti ed incubate con il virus derivato dal clone molecolare NL 4-3 (J. Virol.59, 284-291,1986) affetto da AIDS secondo metodi convenzionali. Le cariche virali furono titolate con PEMC stimolati con PHA ottenuti da donatori sieronegativi per HIV-1 utilizzando la valutazione della ID50 e il metodo accumulativo di Reed-Muench (Koup,R.A., Ho,D.D.,and Poli, G. (1993). Isolation and quantitation of HIV in peripheral blood. In: Currents protocols in Immunology. (Greene Publisching associates and Wiley-InterScience, NIH-Bethesda MD) pp. 12.2.1-11). Con questi criteri, il virus NL 4-3 conteneva approssimativamente 10^ unità infettive (IU)/mL, mentre l'isolato primario,denominato CSL-1,conteneva 10^ IU/mL.
L'incubazione dei PEMC fu effettuata a molteplicità di infezione variabili fra 0,01 e 4. Le cellule furono mantenute in RPMI 1640 addizionato di PCS al 10% e rIL-2 ricombinante (100 U/ml) per tutta la durata dell'infezione.
I surnatanti dalla cultura furono raccolti ogni 3 giorni, conservati a -80'C fino alla valutazione della attività di transcriptasi inversa (RT)che fu misurata secondo il metodo descritto in J. Virol.62 139-147,1988.5μ1 dì ogni sumatante da cultura furono aggiunti a 25 μl di una miscela contenente Oligo(dT) (Pharmacia; Uppsala, Svezia) impiegati come primer per un templato poli(A) (Pharmacia),MgCl2, e dTTP marcato con 32P (Amersham International pie, Amersham, UK). 6 yl della miscela di reazione furono depositati su carta DE81 ed essicati all'aria dopo 2 ore di incubazione a 37°C. Il filtro fu lavato 5 volte in lxSSC e 2 volte con etanolo al 95%; la carta fu quindi essiccata e il contenuto di radioattività fu analizzato con un contatore di scintillazione (Canberra-Packard, Meriden, CT). L'attività RT, espressa come cpm/μl di surnatante di cultura, è riportata nella figura in confronto a PBMC e CD4+ selezionati per mezzo del gene della resistenza a neomicina (G418). La radioattività di fondo delle culture non infettate era sempre inferiore a 50 cpm/μΐ.
I risultati dimostrano che le cellule ΔLNGFR+ erano infettate produttivamente da NL4-3 con livelli di RT simili a cellule di controllo ma maggiori rispetto a quelle ottenute in cellule selezionate con metodi convenzionali (G418).Risultati simili,con valori sempre nettamente più elevati per cellule CD4+ selezionate secondo l'invenzione rispetto a cellule selezionate con il metodo tradizionale, sono stati ottenuti anche utilizzando cellule deplete in CD8 e utilizzando l'isolato primario di HIV-1. Ancora, risultati simili sono stati ottenuti sia con il virus NL 4-3 che con l'isolato primato CSL-1, utilizzando un protocollo di stimolazione diretta di PBMC per mezzo della sola interleuchina-2 (J. Immunol. 154, 2448-2459, 1995): tale metodo, evitando 1'impiego di mitogeni, è particolarmente utile per esperimenti di trasferimento genico.L'efficiente replicazione di entrambi i tipi di HIV nelle cellule trasdotte secondo l'invenzione a livelli paragonabili rispetto a linfociti isolati non modificati, dimostra che la trasduzione del marker selezionabile di per sè non altera la capacità delle cellule di sostenere produttivamente la replicazione di HIV.·
Claims (7)
- RIVENDICAZIONI 1. Linfociti T CD4+ ingegnerizzati così da esprimere una molecola di superficie cellulare e capaci di essere infettati da HIV in vitro e/o in vivo.
- 2. Linfociti T CD4+ secondo la rivendicazione 1 ottenibili per trasduzione con vettori retrovirali contenenti sequenze di DNA che codificano per una molecola di superficie cellulare ed eventualmente geni anti-HIV.
- 3. Linfociti T CD4+ secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui la molecola di superficie cellulare è una forma troncata, priva del dominio intracellulare, del recettore a bassa affinità del fattore di crescita dei nervi.
- 4. Uso dei linfociti T CD4+ delle rivendicazioni 1-3 come modello sperimentale di immunizzazione intracellulare contro HIV.
- 5. Un metodo di selezione positiva di linfociti T CD4+ iniettabili da HIV che comprende la trasduzione di cellule mononucleari di sangue periferico con vettori retrovirali che contengono sequenze di DNA codificanti per molecole di superficie cellulare e la successiva immunoselezione positiva con anticorpi contro dette molecole di superficie.
- 6. Vettori retrovirali per la trasduzione di cellule mononucleate di sangue periferico e di linfociti T CD4+ contenenti geni anti-HIV e DNA che codifica per una molecola di superficie cellulare.
- 7. Vettori secondo la rivendicazione 6 in cui il DNA che codifica per molecole di superfici cellulari è un DNA che codifica per una forma tronca, priva del dominio intracellulare, del recettore a bassa affinità del reattore del fattore di crescita dei- nervi.
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