ITMI942358A1 - Peptidi ad attivita' antiinfiammatoria - Google Patents
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "PEPTIDI AD ATTIVITÀ ANTI INFIAMMATORIA"
La presente invenzione si riferisce a peptidi derivati da proteine da shock termico ed al loro uso nel trattamento di stati infiammatori.
Le proteine da shock termico ( "heat-shock protein"; da qui in poi HSP) vengono prodotte in condizioni di stress cellulare, in particolare da micobatteri. Organismi procarioti, quali micobatteri, esprimono alti livelli di HSP, alcune delle quali, ad esempio una proteina da 65 kDa, sono antigeni immuno-dominanti, per cui si ipotizza per esse un uso come vaccino, ad esempio, antitubercolotico [Kaufmann, S.H.E. et al., Eur. J. Immunol., 12/ 351 (1987)]. La domanda di brevetto HO 89/12455 accenna all'uso di una proteina di questa classe, o di un suo fralimento, con particolare riferimento ad una proteina da 65 kDa, come vaccino contro infezioni non-virali e per indurre una risposta immunitaria.
Particolari proteine facenti parte della stessa classe sono state descritte come utili in varie patologie. Ad esempio, la domanda di brevetto HO 90/10449 riporta l'uso di una HSP avente un peso di 65 kDa nella diagnosi e nel trattamento del diabete mellito insulinodipendente. La stessa proteina è stata riconosciuta possedere un epitopo microbatterio-specifico implicato nella patogenesi dell'artrite autoimmune [Gaston, J.F. et al., Nature, 331/ 171 (1988)].
La sequenza di una HSP avente un peso di 10 kDa viene riportata da Baird, P.N. et al., J. Gen. Microb., 135, 931-939 (1989) che la descrivono come proveniente dal Mycobacterium tuberculosis BOG, mentre Mehra, V. et al., J. Exp. Med., 125, 275-284 (1992) descrivono una proteina omologa e di uguale peso proveniente da Mycobacterium leprae. Barnes, P.F. et al., J. Immun., 148. 1835-1840 (1992) descrivono una proteina da 10 kDa proveniente da Mycobacterium tuberculosis come antigene altamente immuno-reattivo ipoteticamente utile come vaccino antitubercolotico. Hartman, D.J. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82, 3394-3398 (1992) hanno identificato nel mammifero una proteina omologa alle proteine aventi un peso di circa 10 kDa descritte nella letteratura di cui sopra.
Si è ora trovato che peptidi costituiti da 25 amminoacidi con sequenza corrispondente a o con grado di omologia pari ad almeno il 25% con il frammento 1-25 della HSP da Mycobacterium tuberculosis, sono dotati di attività antiinfiammatoria.
L'invenzione riguarda pertanto un peptide di 25AA avente un'omologia > 25% per la seguente sequenza airminoacidica I:
NH2-Ala Lys Val Asn Ile Lys Pro Leu Giu Asp Lys ile Leu Val Gin Ala Asn Giu Ala Giu Thr Thr Thr Ala Ser-OH
dove la porzione N-terrainale è facoltativamente acilata.
E' particolarmente preferito un peptide 1-25 avente la sequenza I. Detti peptidi risultano utili nel trattamento di stati infiammatori, ed in particolare nel trattamento dell'artrite reumatoide.
I peptidi oggetto della presente invenzione sono preparati per via chimica usando metodiche convenzionali di sintesi peptidica. Una metodica è quella in fase solida sviluppata originalmente da Marrifield, R.B. (Biochemistry 1964, 3, pag. 1385; The Peptides 1979, 2, pagg.
1-284, E. Gross e J. Meienhofer editori). In alternativa la sintesi può essere condotta, sempre in "fase solida", usando il metodo a flusso ed utilizzando gli Fmoc-anminoacidi eventualmente protetti, nelle catene laterali, con gruppi acido-labili [Atherton E. e Sheppard R.c. in "Solid Phase Peptide Synthesis - a practical approach" IRL PRESS, Oxford, 1989]. In questo caso si userà un sintetizzatore automatico o semiautomatico fra quelli disponibili in commercio (per esempio il MilligenR 9050) ed il supporto solido potrà essere una delle resine conpatibili con questo metodo di sintesi (per esempio le resine NovaSyn^ della Novabiochem o PepSynR della Milligen KA). Generalmente queste resine contengono dei residui di norleucina (come amminoacido di riferimento interno) ai quali viene poi legato l'agente di ancoraggio reversibile per il peptide da sintetizzare. L'agente di ancoraggio può essere, ad esempio, l'acido p-idrossimetil-fenossiacetico; in questo caso si possono scegliere, fra le resine in commercio, quelle che contengono già il derivato protetto del primo amminoacido legato con legame estereo alla resina.
La sintesi del peptide verrà comunque condotta generalmente attraverso una serie di cicli di deprotezione con 20% piperidina in dimetilformammide (DMF), ripetuti brevi lavaggi con DMF, acilazione ed ancora ripetuti lavaggi con IMF, secondo le procedure standard fom ite dal costruttore del sintetizzatore o loro modifiche ovvie per l'esperto del reuno, che vengono eseguite automaticamente dallo strumento. I singoli amminoacidi protetti vengono usati nell'assemblaggio del peptide sotto forma di esteri attivati, preformati e reperibili commercialmente, o preparati in situ senza isolamento, ad esempio come esteri fenolici, oppure come esteri dell'l-idrossi-benzotriazolo o della 3-idrossi-4-osso-3,4-diidro-l,2,3-benzotriazina e analoghi. In pratica si fa reagire l'amminoacido opportunamente protetto con un agente di condensazione quale, ad esempio, una di-cicloalchil-carbodiimnide, una dialchilcarbodiimmide o esafluorofosfato di 1-benzotriazolil-ossi-tris-(dimeti laminino)-fosfonio (BOP) e analoghi, in presenza del prescelto derivato fenolico, quale ad esempio il pentafluorofenolo, o dell’lidrossi-1 ,2,3-benzotriazolo (HOBT) o della 3-idrossi-4-osso-3,4-diidro-1,2,3-benzotriazina (HODhbt). Per ogni condensazione si è usato un eccesso 4 volte molare rispetto ai gruppi amminici. Al termine della sintesi il peptide potrà essere rimosso dalla resina mediante uno dei protocolli noti all'esperto del ramo. Ad esempio 0,5 g di resina peptide, sospesi in circa 10 mi di una miscela costituita da 90% acido trifluoroacetioo (TPA), 5% tioanisolo, 3% etanditiolo, 2% anisolo, vengono mantenuti a temperatura ambiente, sotto leggera agitazione, in atmosfera di azoto per 4 ore. La miscela viene quindi filtrata direttamente in un volume 10-20 volte maggiore di etere etilico raffreddato in bagno a ghiaccio. Il precipitato da etere viene filtrato o centrifugato; quindi seccato sotto vuoto per una notte. Il peptide viene sciolto in un tampone adatto e liofilizzato. Un altro metodo consiste nel sospendere 0,5 g di resina peptide in circa 25 ml di una miscela costituita da 1M Me3SiBr trimetil-silil-bromuro, 1M tioanisolo, 0,25M etandiolo, in acido trifluoroaoetico, e mantenere il tutto a 0*0, sotto leggera agitazione in atmosfera di azoto per 1 ora. La resina viene quindi filtrata e lavata con un piccolo volume di TFA puro. Il solvente viene evaporato ed il residuo triturato con etere etilico viene filtrato o centrifugato, quindi seccato sotto vuoto per una notte. Il peptide viene sciolto in un tampone adatto e liofilizzato.
Il seguente esempio illustra l'invenzione in maggior dettaglio.
ESEMPIO
Sintesi del frammento 1-25 di HSP10 di Micobacterium tuberculosis Sequenza :
Il supporto solido, 1 g di Fmoc-Ser (tBu)-PepSyn KA (100) [sostituzione della resina 0,09 mmol/g], è stato caricato nella colonna di un sintetizzatore Milligen^ 9050 e sottoposto ad una serie di cicli standard di deprotezione ed acilazione. Ogni singolo residuo amminoacidico utilizzato aveva il gruppo a-anuiinico protetto con Fmoc, mentre i gruppi protettori sulle catene laterali erano tert-butil-ossicarbonile (Boc) per lisina; tert-butile (tBu) per acido aspartico, acido glutammico, serina e treonina. Gli amminoacidi così protetti erano tutti preattivati come esteri del pentafluorofenolo, tranne serina e treonina preattivate come esteri di HODhbt. Ogni singolo residuo è stato sequenzialmente assemblato (in eccesso 4 volte molare) partendo dall 'amminoacido C-terminale, attraverso cicli di singolo e/o doppio accoppiamento con un tempo medio di 60 minuti. Lo sblocco finale del peptide datila resina ed il distacco dei gruppi protettori dalle catene laterali sono stati eseguiti su una scala di 0,5 g di peptide-resina seguendo uno dei protocolli sopra descritti. Dopo liofilizzazione si sono ottenuti 100 mg di peptide grezzo (peso molecolare 2684; resa teorica 120 mg) resa 83%. 50 mg sono stati caricati su una colonna semipreparativa a fase inversa (Vydac C4, 25 x 1 cm) equilibrata con l'eluente A) TFA allo 0,085% in acqua ed eluiti con 1‘eluente B) TFA allo 0,085% in acetonitrile:acqua 80:20, applicando un gradiente di 0,27% B/minuto ad un flusso di 3,0 ml/minuto. Si sono così ottenuti 13 mg di prodotto con una resa finale sul grezzo del 26%. La purezza relativa del peptide è stata determinata per analisi HPLC su una colonna a fase inversa Vydac C4150 x 4,6 nan; usando come eluente A) 0,045% TFA in acqua acetonitrile (98:2 v/v) e come eluente B) 0,036% TFA in acetonitrile, con un gradiente di 2% B/minuto.
La composizione amminoacidica del peptide (Tab. 1) è stata determinata su di un analizzatore di amminoacidi BECKMAN System Gold 126AA, dopo idrolisi a 110’C per 22 ore in HCL 6N in presenza di 1% fenolo v/v, in fiale sigillate sotto vuoto: contenuto peptidico 88%. Il peso molecolare del peptide è stato determinato per spettrometria di massa (spettrometro BIOMASS, ionizzatore ELECTRO-SPRAY, quadripolo,
I peptidi della presente invenzione sono utili nel trattamento di stati infiammatori di varia natura ed origine, come è possibile dimostrare in prove farmacologiche (saggi di artrite da adiuvante) come di seguito riportato.
15 ratti Vistar (C. River) del peso di 130-140 g, anestetizzati con biossido di carbonio, sono stati trattati per via intradermica (iniezione alla base della coda) con 0,1 mi di una sospensione di 10 mg/ml di M. tuberculosis (Strain C, DT e FN) inattivato al calore (Central Vet. Labs - GB), in olio sterile di paraffina. I ratti sono stati divisi in tre gruppi di 5 animali ciascuno, ed al 4*, 5* e 6* giorno dal trattamento sopra detto, sono state somministrate, secondo le stesse modalità utilizzate per l'induzione dell'artrite, dosi da 50 μg/ratto del peptide I in 100 μΐ di PBS al primo grippo, il solo PBS al secondo gruppo, mentre il terzo gruppo non è stato trattato. Il decorso dell'artrite è stato monitorato secondo il seguente schema di punteggi clinici:
punteggio sintomatologia
0 assenza di infiammazione
1 leggero arrossamento e rigonfiamento delle zanpe 2 rigonfiamento delle zanpe tale per cui i tendini non sono più visibili
3 rigonfiamento esteso alle articolazioni delle caviglie
4 evidente infiammazione e deformazione delle articolazioni delle caviglie
i punteggi vanno da 0 a 4 per ogni zampa; inoltre si assegna 1 punto aggiuntivo se sono presenti noduli sulla coda, ed 1 punto aggiuntivo se sono coinvolte le orecchie, per cui il punteggio va da un minimo di 0 ad un massimo di 18.
I risultati sono illustrati nelle Tabelle 2 e 3.
Oggetto della presente invenzione è pertanto l'uso dei peptidi sopra descritti nel trattamento di stati infiammatori, ed in particolare dell'artrite reumatoide, con attinenza agli atti ed aspetti industrialmente applicabili di detto uso, inclusa la loro incorporazione in conposizioni farmaceutiche. Per i previsti inpieghi terapeutici, i peptidi dell'invenzione possono essere somministrati opportunamente formulati in conposizioni farmaceutiche adatte alla somministrazione parenterale, in particolare in formulazioni iniettabili per via intradermica, sottocutanea ed intra-articolare. Per quanto concerne le formulazioni iniettabili per via intra-dermica e sottocutanea, il principio attivo potrà venire sciolto in acqua bidistillata, facoltativamente in presenza di agenti isotonizzanti, quali destrosio o cloruro di sodio, antimicrobici, quali p-idrossibenzoati, e tamponi, ad esempio un tarpone fosfato quale PBS. Per quanto invece cera rne le formulazioni iniettabili per via intra-articolare, è necessaria la presenza di un agente isotonizzante, quale uno di quelli già sopra citati, insieme agli altri eccipienti già nominati. Il principio attivo può anche essere formulato come liofilizzato ricostituibile, contenente dal 4 al 6% di marmitelo o lattosio. La posologia dipenderà ovviamente da più fattori quali tipo e gravità delle patologie da trattare e
Claims (5)
- RIVENDICAZIONI 1. Peptidi costituiti da 25 amminoacidi aventi un'omologia di almeno il 25% per la seguente sequenza amninoacidica (I): essendo detta sequenza eventualmente acilata all'estremità N-terminale.
- 2. Peptide secondo la rivendicazione 1, avente la sequenza amminoacidica I.
- 3. Composizioni farmaceutiche contenenti cane principio attivo un peptide della rivendicazione 1 o 2 in miscela con un veicolo opportuno.
- 4. Uso di un peptide della rivendicazione 1 o 2 per la preparazione di un medicamento per il trattamento di stati infiammatori.
- 5. Uso di un peptide della rivendicazione 1 o 2 per la preparazione di un medicamento per il trattamento di artrite reumatoide.
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