ITMI20130637A1 - Metodo per la preparazione di sospensioni di nanoparticelle di oro colloidale coniugate ad anticorpi poli/monoclonali e/o oligonucleotidi utilizzabili per produzione di ivd (in-vitro diagnostici) a lettura cromatografica - Google Patents

Metodo per la preparazione di sospensioni di nanoparticelle di oro colloidale coniugate ad anticorpi poli/monoclonali e/o oligonucleotidi utilizzabili per produzione di ivd (in-vitro diagnostici) a lettura cromatografica

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ITMI20130637A1
ITMI20130637A1 IT000637A ITMI20130637A ITMI20130637A1 IT MI20130637 A1 ITMI20130637 A1 IT MI20130637A1 IT 000637 A IT000637 A IT 000637A IT MI20130637 A ITMI20130637 A IT MI20130637A IT MI20130637 A1 ITMI20130637 A1 IT MI20130637A1
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R A P I D Biotech S A S Di Claudi O Emilio Loren
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Description

“METODO PER LA PREPARAZIONE DI SOSPENSIONI DI NANOPARTICELLE DI ORO COLLOIDALE CONIUGATE AD ANTICORPI POLI/MONOCLONALI E/O OLIGONUCLEOTIDI UTILIZZABILI PER PRODUZIONE DI IVD (IN-VITRO DIAGNOSTICI) A LETTURA CROMATOGRAFICAâ€
Campo dell’invenzione
L’invenzione riguarda un metodo per la preparazione di sospensioni di nanoparticelle di oro colloidale coniugate ad anticorpi poli/monoclonali e/o oligonucleotidi utilizzabili per produzione di IVD (in-vitro diagnostici) a lettura cromatografica.
Sfondo dell’invenzione
I saggi diagnostici rapidi immunocromatografici a flusso laterale (lateral flow tests) sono di facile esecuzione e non necessitano di alcuna strumentazione aggiuntiva. Sono definiti POCT (point of care test) perché consentono una semplice e immediata valutazione diagnostica dell’analita (target) e possono essere applicati in numerosi settori quale quello medico, agrario, ambientale, alimentare.
Nella preparazione di IVD immunocromatografici nanoparticelle di oro colloidale coniugate ad anticorpi o oligonucleotidi specifici sono impiegate per la rilevazione della risposta diagnostica.
Di norma per tali preparazioni le nanoparticelle in sospensione reagiscono spontaneamente con la soluzione di anticorpo. Infatti, le proteine per mezzo di interazioni elettrostatiche vengono adsorbite sulla superficie delle nanoparticelle. Questo metodo presenta degli inconvenienti: gli anticorpi si dispongono sulla superficie delle nanoparticelle in modo casuale, non esponendo sempre in modo ottimale gli epitopi specifici per l’attacco con l’antigene. Questo comporta la necessità di utilizzare un’elevata quantità di anticorpo da miscelare con le nanoparticelle e determina una ridotta sensibilità del sistema coniugato nanoparticelle-anticorpo / antigene rispetto a quella potenziale. Inoltre, nel caso di anticorpi con percentuali elevate di cisteina, i gruppi -SH dell’aminoacido reagiscono con le nanoparticelle fornendo risultati falsamente positivi.
Nel caso degli oligonucleotidi, di norma, si fa ricorso alla loro modificazione mediante l’aggiunta di uno o più gruppi tiolici che interagiscono direttamente con le nanoparticelle d’oro. Tale metodo richiede l’utilizzo di quantità molto elevate di oligonucleotidi modificati per stabilizzare le nanoparticelle che altrimenti non potrebbero essere utilizzate nella reazione a catena di amplificazione tramite polimerasi (PCR) in quanto le temperature elevate (90-95°C) e la concentrazione di ioni nella miscela di reazione farebbero precipitare le nanoparticelle.
WO01/94947 (Roche Diagnostics) descrive particelle metalliche rivestite con destrano o amminodestrano (core-shell particles) le quali recano gruppi tiolici che possono essere utilizzati per legare molecole biologiche, ad esempio anticorpi o acidi nucleici. La domanda descrive la funzionalizzazione dei gruppi amminici dell’amminodestrano mediante reazione di quest’ultimo con acidi carbossilici attivati contenenti residui tiolici protetti, seguita da deprotezione. La miscelazione di particelle di oro colloidale con l’amminodestrano così funzionalizzato porta alla formazione di core-shell particles che possono essere accoppiate con molecole biologiche quali anticorpi o acidi nucleici. L’accoppiamento avviene tramite i gruppi SH che non sono stati coinvolti nella formazione di un legame con le particelle di oro. Per l’accoppiamento le biomolecole sono attivate mediante l’introduzione di spaziatori contenenti gruppi reattivi, ad esempio gruppi maleimmidici.
US5552086 (Coulter Corporation) descrive particelle colloidali comprendenti:
a) un substrato di dimensioni colloidali, preferibilmente un polimero; b) un rivestimento di amminodestrano sulla superficie periferica di detto substrato;
c) uno strato uniforme di un solido metallico di dimensioni colloidali, preferibilmente oro e argento, che ricopre lo strato di amminodestrano.
Non viene descritta la funzionalizzazione dell’amminodestrano con residui tiolici o la coniugazione con anticorpi.
WO99/19731 (Coulter International) descrive la funzionalizzazione delle particelle colloidali di US5552086 con proteine, in particolare anticorpi. Vengono descritte particelle colloidali che comprendono:
a) microparticelle di un substrato (ad esempio polistirene) di dimensioni colloidali rivestite nella superficie periferica con amminodestrano;
b) uno strato di oro colloidale sovrastante il suddetto rivestimento di amminodestrano;
c) uno spaziatore a struttura amminotritiolica avente un gruppo amminico libero, che si lega covalentemente alle particelle di oro tramite i gruppi tiolici;
d) un anticorpo legato al gruppo amminico dello spaziatore, preferibilmente tramite un agente di crosslinking bifunzionale.
WO99/19731 non descrive la funzionalizzazione dell’amminodestrano con residui contenenti gruppi tiolici.
Descrizione dell’invenzione
Oggetto della presente invenzione à ̈ un metodo per la preparazione di sospensioni di nanoparticelle di oro colloidale legate, tramite l’atomo di zolfo di spaziatori bifunzionali contenenti un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità, a un amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con detti spaziatori bifunzionali tramite detti gruppi ammino-reattivi e coniugato ad uno o più anticorpi e/o oligonucleotidi.
I gruppi amminici dell’amminodestrano sono utilizzati per due reazioni di bioconiugazione: 1) con spaziatori bifunzionali in grado di introdurre residui contenenti precursori di gruppi tiolici liberi che garantiscono l’attacco alle nanoparticelle d’oro e 2) con la molecola o le molecole di interesse: anticorpi e/o oligonucleotidi.
La coniugazione dell’amminodestrano all’anticorpo avviene tramite la formazione di legami ammidici tra gruppi amminici dell’amminodestrano e gruppi carbossilici degli anticorpi, mentre la coniugazione dell’amminodestrano all’oligonucleotide avviene tramite la formazione di legami fosfammidici tra gruppi amminici dell’amminodestrano e gruppi fosfato nella posizione 5’ dell’oligonucleotide.
Un ulteriore oggetto dell’invenzione sono nanoparticelle di oro colloidale come sopra definite e il loro uso come marcatori o agenti di rilevazione in procedure di test immunologici o per la preparazione di in-vitro diagnostici (IVD) a lettura immunocromatografica.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
Oggetto della presente invenzione à ̈ un metodo per la preparazione di sospensioni di nanoparticelle di oro colloidale legate, tramite l’atomo di zolfo di spaziatori bifunzionali contenenti un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità, a un amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con detti spaziatori bifunzionali tramite detti gruppi ammino-reattivi e coniugato ad uno o più anticorpi e/o oligonucleotidi.
Il metodo comprende una combinazione dei seguenti passaggi:
a) funzionalizzazione parziale dei gruppi amminici dell’amminodestrano con spaziatori bifunzionali contenenti un precursore di un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità, seguita dalla liberazione del gruppo tiolico a dare un amminodestrano funzionalizzato con detti spaziatori bifunzionali e contenente gruppi tiolici liberi e gruppi amminici liberi;
b) reazione parziale dei gruppi amminici dell’amminodestrano con il gruppo 5’-fosfato di uno o più oligonucleotidi, per dare un amminodestrano contenente gruppi amminici liberi e coniugato con uno o più oligonucleotidi tramite un legame fosfammidico;
c) funzionalizzazione, opzionalmente parziale, dei gruppi amminici liberi del prodotto ottenuto nel passaggio b) con spaziatori bifunzionali contenenti un precursore di un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità, seguita dalla liberazione del gruppo tiolico, per dare un amminodestrano funzionalizzato con detti spaziatori bifunzionali, contenente gruppi tiolici liberi e, opzionalmente, gruppi amminici liberi, e coniugato a uno o più oligonucleotidi tramite un legame fosfammidico;
d) formazione di legami ammidici tra i gruppi amminici liberi del prodotto ottenuto nel passaggio a) o c) e i gruppi carbossilici di anticorpi, per dare un amminodestrano contenente gruppi amminici funzionalizzati con detti spaziatori bifunzionali, contenente gruppi tiolici liberi e gruppi amminici legati ad anticorpi mediante legami ammidici, o per dare un amminodestrano contenente gruppi amminici funzionalizzati con detti spaziatori bifunzionali, contenente gruppi tiolici liberi e coniugato a uno o più oligonucleotidi tramite legami fosfammidici e a uno o più anticorpi mediante legami ammidici;
e) reazione del prodotto ottenuto nel passaggio c) o d) con nanoparticelle di oro colloidale.
In una realizzazione dell’invenzione, l’amminodestrano à ̈ coniugato unicamente con uno o più anticorpi ed il metodo comprende i soli passaggi a), d) ed e).
In questa realizzazione, l’invenzione si riferisce pertanto a un metodo per la preparazione di sospensioni di nanoparticelle di oro colloidale legate, tramite l’atomo di zolfo di spaziatori bifunzionali contenenti un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità, a un amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con detti spaziatori bifunzionali tramite detti gruppi ammino-reattivi e coniugato ad uno o più anticorpi, comprendente i seguenti passaggi:
a) funzionalizzazione parziale dei gruppi amminici dell’amminodestrano con spaziatori bifunzionali contenenti un precursore di un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità, seguita dalla liberazione del gruppo tiolico, a dare un amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con detti spaziatori bifunzionali tramite detti gruppi ammino-reattivi e contenente gruppi tiolici liberi e gruppi amminici liberi;
d') formazione di legami ammidici tra i gruppi amminici liberi del prodotto ottenuto nel passaggio a) e i gruppi carbossilici di anticorpi, per dare un amminodestrano contenente gruppi amminici funzionalizzati con detti spaziatori bifunzionali tramite detti gruppi ammino-reattivi, contenente gruppi tiolici liberi e gruppi amminici legati ad anticorpi mediante legami ammidici;
e') reazione del prodotto ottenuto nel passaggio d’) con nanoparticelle di oro colloidale.
In un’altra realizzazione dell’invenzione l’amminodestrano à ̈ coniugato unicamente a uno o più oligonucleotidi ed il metodo comprende i soli passaggi b), c) ed e).
In questa realizzazione, l’invenzione si riferisce pertanto a un metodo per la preparazione di sospensioni di nanoparticelle di oro colloidale legate, tramite l’atomo di zolfo di spaziatori bifunzionali contenenti un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità, a un amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con detti spaziatori bifunzionali tramite detti gruppi ammino-reattivi e coniugato ad uno o più oligonucleotidi, comprendente i seguenti passaggi:
b) reazione parziale dei gruppi amminici dell’amminodestrano con il gruppo 5’-fosfato di uno o più oligonucleotidi, per dare un amminodestrano contenente gruppi amminici liberi e coniugato con uno o più oligonucleotidi tramite un legame fosfammidico;
c') funzionalizzazione dei gruppi amminici liberi del prodotto ottenuto nel passaggio b) con spaziatori bifunzionali contenenti un precursore di un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità, seguita dalla liberazione del gruppo tiolico, per dare un amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con detti spaziatori bifunzionali tramite detti gruppi ammino-reattivi, contenente gruppi tiolici liberi e coniugato a uno o più oligonucleotidi tramite un legame fosfammidico;
e") reazione del prodotto ottenuto nel passaggio c’) con nanoparticelle di oro colloidale.
In un’altra realizzazione dell’invenzione l’amminodestrano à ̈ coniugato contemporaneamente a uno o più anticorpi e a uno o più oligonucleotidi ed il metodo comprende i soli passaggi b), c), d) ed e). In questa realizzazione dell’invenzione nel passaggio c) sopra descritto la funzionalizzazione, con spaziatori bifunzionali contenenti un precursore di un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità, dei gruppi amminici dell’amminodestrano coniugato con uno o più oligonucleotidi à ̈ parziale, per consentire la successiva coniugazione con anticorpi del prodotto così ottenuto.
In questa realizzazione, l’invenzione si riferisce pertanto a un metodo per la preparazione di sospensioni di nanoparticelle di oro colloidale legate, tramite l’atomo di zolfo di spaziatori bifunzionali contenenti un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità, a un amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con detti spaziatori bifunzionali tramite detti gruppi ammino-reattivi e coniugato ad uno o più anticorpi e a uno o più oligonucleotidi, comprendente i seguenti passaggi: b) reazione parziale dei gruppi amminici dell’amminodestrano con il gruppo 5’-fosfato di uno o più oligonucleotidi, per dare un amminodestrano contenente gruppi amminici liberi e coniugato con uno o più oligonucleotidi tramite un legame fosfammidico;
c") funzionalizzazione parziale dei gruppi amminici liberi del prodotto ottenuto nel passaggio b) con spaziatori bifunzionali contenenti un precursore di un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità, seguita dalla liberazione del gruppo tiolico, per dare un amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con detti spaziatori bifunzionali tramite detti gruppi ammino-reattivi, contenente gruppi tiolici liberi, gruppi amminici liberi e coniugato a uno o più oligonucleotidi tramite un legame fosfammidico;
d") formazione di legami ammidici tra i gruppi amminici liberi del prodotto ottenuto nel passaggio c†) e i gruppi carbossilici di anticorpi, per dare un amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con detti spaziatori bifunzionali tramite detti gruppi ammino-reattivi, contenente gruppi tiolici liberi e coniugato a uno o più oligonucleotidi tramite legami fosfammidici e a uno o più anticorpi mediante legami ammidici;
e''') reazione del prodotto ottenuto nel passaggio d†) con nanoparticelle di oro colloidale.
Il metodo oggetto dell’invenzione utilizza un amminodestrano avente peso molecolare superiore o uguale a 70 kDa, preferibilmente un amminodestrano avente peso molecolare di 70 kDa (AD70), il quale contiene circa 16-20 gruppi amminici per catena oligosaccaridica.
Per gli scopi della presente invenzione può essere utilizzato qualunque anticorpo o frammento di anticorpo. L’anticorpo può essere sia monoclonale che policlonale. Preferibilmente l’anticorpo à ̈ un’immunoglobulina IgC, IgY o IgG, più preferibilmente un’immunoglobulina IgG.
Gli oligonucleotidi adatti agli scopi della presente invenzione contengono preferibilmente non più di 100 coppie di basi. Questa lunghezza consente una agevole eliminazione della porzione di oligonucleotide che non ha reagito con l’amminodestrano. L’oligonucleotide deve necessariamente essere fosforilato in 5’ e può presentare una coda di poli-timina in 5’ per distanziare la porzione funzionale dalle nanoparticelle.
Nel passaggio a) la funzionalizzazione dei gruppi amminici dell’amminodestrano con spaziatori bifunzionali avviene preferibilmente mediante reazione dell’amminodestrano con uno spaziatore bifunzionale in cui il gruppo ammino-reattivo à ̈ un estere attivato, ad esempio un N-idrossisuccinimmido estere, ed il precursore del gruppo tiolico à ̈ un gruppo disolfuro, seguita dalla riduzione del disolfuro a tiolo.
In una realizzazione dell’invenzione si utilizzano N-succinimmidil C2-C6-alchilcarbossilati recanti sulla catena alchilica un gruppo disolfuro, ad esempio il composto succinimmidil 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) di formula 1.
O
O S
N SN
O
O 1
Altri esempi di spaziatori bifunzionali utilizzabili per gli scopi della presente invenzione sono: succinimmidil 6-[3-(2-piridilditio)propionammido]esanoato (LC-SPDP) di formula 2;
O O
O S N
N N S
H
O
O 2
4-succinimmidilossicarbonil-alfa-metil-alfa-[2-piridilditio]toluene (SMPT) di formula 3;
O
O
N
O
O
S
N S3
agenti bifunzionali analoghi di SPDP contenenti unità di polietilenglicol (PEG), quali ad esempio i composti PEG (n)-SPDP in cui n = 4 o n = 12 di formula 4.
O
OSN O O
NNS
H
O n
O 4
I suddetti esteri attivati sono commercialmente disponibili.
I rapporti molari tra i suddetti esteri attivati e l’amminodestrano sono tipicamente compresi tra 2:1 e 10:1 In queste condizioni una frazione dei gruppi amminici dell’amminodestrano non viene funzionalizzata ed à ̈ pertanto disponibile per la successiva coniugazione con uno o più anticorpi. Tale frazione tipicamente va dal 15% al 90% dei gruppi amminici dell’amminodestrano.
Quando il precursore di un gruppo tiolico e un gruppo disolfuro, la riduzione del gruppo disolfuro a tiolo avviene utilizzando metodi noti. Preferibilmente si utilizza un eccesso molare di ditiotreitolo operando a temperatura ambiente.
In una realizzazione dell’invenzione nel passaggio a) la funzionalizzazione dei gruppi amminici dell’amminodestrano avviene mediante la loro reazione con l’N-succinimmidil 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) a temperatura ambiente, seguita da riduzione con ditiotreitolo del prodotto ottenuto. In un'altra realizzazione dell’invenzione si impiega AD70 e l’SPDP à ̈ preferibilmente impiegato in un rapporto molare compreso tra 5:1 e 10:1 rispetto ad AD70.
Nel passaggio b) la formazione di legami fosfammidici tra gruppi amminici dell’amminodestrano ed il gruppo 5’-fosfato di uno o più oligonucleotidi viene condotta con metodi noti che prevedono l’attivazione del gruppo fosfato dell’oligonucleotide. In una realizzazione dell’invenzione il gruppo fosfato viene attivato impiegando una carbodiimmide, preferibilmente la etil dimetilamminopropil carbodiimmide (EDC). In una realizzazione dell’invenzione l’amminodestrano à ̈ AD70 e la carbodiimmide viene impiegata in un rapporto molare rispetto all’oligonucleotide superiore a 40:1. Si opera in presenza di una base organica, ad esempio imidazolo, ad un pH compreso tra 5 e 6, preferibilmente a pH 6, ad una temperatura di 18-25°C, preferibilmente a temperatura ambiente e per un tempo di 4-12 ore, preferibilmente per una notte. I tempi di reazione possono essere ridotti mantenendo la miscela di reazione in agitazione. In una realizzazione dell’invenzione l’amminodestrano à ̈ AD70 e il rapporto molare tra oligonucleotide, AD70 e imidazolo à ̈ preferibilmente compreso tra 2:1:200 e 6:1.200.
Nei passaggi c), c’) e c†) la funzionalizzazione con spaziatori bifunzionali dei gruppi amminici dell’amminodestrano coniugato a uno o più oligonucleotidi avviene impiegando reagenti e condizioni simili a quelle impiegate nel passaggio a). In una realizzazione dell’invenzione in cui l’amminodestrano à ̈ AD70 nel passaggio c’) il rapporto molare SPDP:AD70 à ̈ 16:1. In un’altra realizzazione dell’invenzione in cui l’amminodestrano à ̈ AD70 nel passaggio c’’) il rapporto molare SPDP:AD70 à ̈ compreso tra 5:1 e 10:1. In un’altra realizzazione dell’invenzione il rapporto molare (oligonucleotide SPDP):AD70 à ̈ 10:1 e il rapporto molare SPDP:AD70 à ̈ almeno 4.
Nei passaggio d), d’) e d†) la formazione dei legami ammidici tra i gruppi amminici liberi dell’amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con i spaziatori bifunzionali, contenente gruppi tiolici liberi e opzionalmente coniugato con uno o più oligonucleotidi, e i gruppi carbossilici degli anticorpi avviene utilizzando metodiche note nell’arte, ad esempio operando in presenza di un’opportuna N-idrossisuccinimmide e di un’opportuna carbodiimmide. Si opera preferibilmente a pH 6.
In una realizzazione dell’invenzione si impiegano la N-idrossisulfosuccinimmide e la etil dimetilamminopropil carbodiimmide (EDC). La reazione viene condotta a temperatura ambiente ed à ̈ completa in una notte.
In una realizzazione dell’invenzione in cui si utilizza AD70 come materiale di partenza, nel passaggio d’) l’anticorpo viene utilizzato in un quantitativo di 1-20 nmoli, preferibilmente 5-20 nmoli, più preferibilmente 5 nmoli, per 1 nmole di AD70 inizialmente messo a reagire.
In una realizzazione dell’invenzione in cui si utilizza AD70 come materiale di partenza, nel passaggio d’’) l’anticorpo à ̈ usato in un quantitativo di 1-20 nmoli, preferibilmente 5-20 nmoli, più preferibilmente 5 nmoli, per 1 nmole di amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con i spaziatori bifunzionali e coniugato ad uno o più oligonucleotidi.
Nei passaggi e), e’), e’’) ed e’’’) la reazione tra le nanoparticelle di oro colloidale e l’amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con gli spaziatori bifunzionali, contenente gruppi tiolici liberi e coniugato con uno o più anticorpi e/o oligonucleotidi, viene generalmente condotta impiegando una sospensione di oro colloidale, ottenuta con metodi noti, nella quale le dimensioni medie delle nanoparticelle sono tipicamente comprese tra 10 e 30 nm, preferibilmente 20 nm. La concentrazione della sospensione à ̈ tipicamente compresa tra 0,8-1,2 nM.
Nei passaggi e’) ed e’’’) la concentrazione delle nanoparticelle di oro colloidale à ̈ preferibilmente 1nM. La concentrazione dell’amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con gli spaziatori bifunzionali, contenente gruppi tiolici liberi e coniugato con uno o più anticorpi, o con uno o più anticorpi e uno o più oligonucleotidi viene determinata empiricamente valutando la stabilità delle nanoparticelle di oro colloidale e la qualità del segnale sul filtro.
Per esempio, la stabilità delle nanoparticelle si può testare valutando il quantitativo minimo di amminodestrano coniugato necessario a mantenere stabile la sospensione di nanoparticelle di oro colloidale (GNP) in condizioni di elevata forza ionica. Si eseguono delle diluizioni variando la quantità di amminodestrano coniugato da aggiungere alle GNP. Dopo 10’, tempo in cui l’amminodestrano coniugato si lega alle GNP, si aggiunge un pari volume di NaCl 10%. Quando si ha precipitazione la sospensione vira immediatamente dal rosso rubino al blu-violetto.
Il segnale sul filtro può essere valutato empiricamente mediante filtri di nitrocellulosa, analoghi a quelli utilizzati per realizzare i dispositivi lateral flow, su cui sia stato depositato un opportuno anticorpo. Utilizzando coniugati GNP quantità scalari crescenti di amminodestrano coniugato, partendo da una quantità minima che può essere quella determinata nella prova di stabilità delle nanoparticelle, si determina la concentrazione che restituisce il miglior risultato in termini qualità del segnale (qualità dello spot rosso che si forma nella zona di deposizione dell’anticorpo, il segnale deve essere intenso ma pulito.
Poiché l’amminodestrano coniugato à ̈ in grado di stabilizzare le GNP anche a concentrazioni molto basse, la valutazione della qualità del segnale sul filtro rappresenta il passaggio più importante per definire la concentrazione di amminodestrano coniugato da utilizzare.
Nei passaggi e’) ed e’’’) si opera in un intervallo di pH compreso tra 7,5 e 8, preferibilmente a pH 8. La reazione viene condotta a una temperatura tra 18-25°C per almeno 1 ora. Preferibilmente la reazione viene condotta a temperatura ambiente per 1 ora.
Nel passaggio e’’) la concentrazione delle nanoparticelle à ̈ preferibilmente 1 nM. La concentrazione dell’ amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con i spaziatori bifunzionali, contenente gruppi tiolici liberi e coniugato a uno o più oligonucleotidi tramite un legame fosfammidico, dipende dall’utilizzo finale della sospensione di nanoparticelle di oro colloidale legate all’amminodestrano funzionalizzato. Nel caso di impieghi in una reazione di amplificazione PCR o LAMP si opera in modo di avere almeno 0,5 – 2 pmoli di oligonucleotide per µl di coniugato in sospensione, determinando empiricamente la risposta del coniugato con prove di amplificazione (PCR). Si opera in un intervallo di pH compreso tra 7,5 e 8. La reazione viene condotta a una temperatura tra 18-25°C per almeno 1 ora. Preferibilmente la reazione viene condotta a temperatura ambiente per 1 ora.
Nel passaggio e’’’) si opera in condizioni simili a quelle impiegate nei passaggi e), e’) ed e†). La concentrazione dell’amminodestrano funzionalizzato contemporaneamente con anticorpi e oligonucleotidi viene determinata in funzione della peculiare applicazione.
Il metodo oggetto della presente invenzione consente la formazione di un complesso estremamente stabile anche alle elevate temperature proprie della reazione a catena della polimerasi (PCR) e in condizioni di elevata concentrazione elettrolitica e forza ionica.
Un ulteriore oggetto dell’invenzione sono nanoparticelle di oro colloidale come sopra definite, le quali sono particolarmente utili come marcatori o agenti di rilevazione in procedure di test immunologici e per la preparazione di in-vitro diagnostici a lettura immunocromatografica.
Le nanoparticelle dell’invenzione contenenti amminodestrano coniugato con oligonucleotidi sono utili in reazioni di amplificazione PCR o LAMP.
Le nanoparticelle dell’invenzione contenenti amminodestrano funzionalizzato contemporaneamente con anticorpi ed oligonucleotidi trovano impiego nella veicolazione mirata di oligonucleotidi.
L’invenzione viene ora illustrata in maniera dettagliata dai seguenti esempi.
Nei protocolli di seguito descritti à ̈ stata verificata la funzionalità delle molecole sopra citate e la loro concentrazione ottimale. I volumi e le quantità possono essere aumentate o diminuite in modo scalare in base alle necessità.
Esempio 1 -Coniugazione con anticorpi IgG
La metodica può essere schematizzata in tre fasi:
A) Modificazione di amminodestrano avente peso molecolare 70 kDa (AD70) mediante aggiunta di gruppi tiolici. Questa fase prevede la reazione, non a saturazione, dei gruppi amminici dell’AD70 con SPDP (N-succinimmidil 3-(2-piridilditio)propionato) e successiva riduzione dei legami S-S a gruppo tiolico per mezzo di DTT (ditiotreitolo).
B) Attacco dei carbossili delle immunoglobuline IgG ai gruppi amminici dell’AD70 per mezzo del composto N-idrossisulfosuccinimmide, in presenza di carbodiimmide specificatamente EDC (etil(dimetilamminopropil) carbodiimmide). Il risultato complessivo della fase A e B à ̈ una molecola di amminodestrano legata in modo covalente agli anticorpi e con gruppi tiolici liberi.
C) Coniugazione del composto alle nanoparticelle di oro colloidale. PROTOCOLLO
1) In 20 µl di PBS 10 mM, aggiungere 10 nmoli di SPDP e 1 nmole di AD70. Incubare 2 ore a temperatura ambiente (TA).
2) Alla miscela aggiungere 30µl di DTT 150 mM e incubare per 30’ a TA. Filtrare l’intero volume con un filtro centrifugo 50k MWCO a 580 rcf a 4°C fino al passaggio del 75% della soluzione.
3) Risospendere in 100 µl di PBS 10 mM pH 7,4.
4) Portare l’anticorpo ad una concentrazione di 1mg/ml in tampone MES 0,1M 0,5M NaCl, pH 6.
5) Aggiungere 0,8 µmoli di EDC e 5 µmoli di Sulfo-NHS (N-idrossisulfosuccinimmide) a 0,4 mg di anticorpo (circa 2,7 nmoli di anticorpo) in un volume totale di 400 µl.
6) Lasciar reagire 15’ a TA.
7) Aggiungere i 100µl di soluzione SPDP+AD70 (vedi punto 3) alla soluzione di anticorpo ottenuta al punto 5/6 e incubare a TA per una notte.
8) Filtrare l’intero volume (500 µl) con un filtro centrifugo 50k MWCO a 580 rcf a 4°C fino al passaggio del 75% della soluzione. Risospendere in 500 µl di HEPES.
Coniugazione alle nanoparticelle di oro colloidale
1) A 10 ml di una sospensione di oro colloidale (OD520= 0,98, dimensioni medie stimate delle nanoparticelle = 20 nm, concentrazione 1 nM) aggiungere 1 ml di Tampone Borato 20 mM pH 8 e un quantitativo titolato di anticorpo funzionalizzato con AD 70.
2) Incubare per 1 h a temperatura ambiente in agitazione.
3) Bloccare con 1 ml di Tampone borato 20 mM pH 8 contenente BSA 1% e centrifugare a 2000 rcf per 15 minuti a 4°C.
4) Scartare il sovranatante e risospendere il pellet in 10 ml di tampone borato 20 mM pH 8 con 1% BSA. Centrifugare a 2000 rcf per 15 minuti a 4°C. 5) Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di tampone borato 2 mM pH 8 con 0,1% BSA. Centrifugare a 2000 rcf per 15 minuti a 4°C.
6) Risospendere il pellet in 3 ml di Stabilcoat<®>con saccarosio 2%.
7) Portare la sospensione ad una OD finale tra 2,5 e 3 digit in corrispondenza del picco di assorbimento tra 525 e 530 nm.
Esempio 2 - Coniugazione con oligonucleotidi
La metodica può essere schematizzata in tre fasi:
A) Attacco di uno o più oligonucleotidi con un gruppo fosfato in 5’ ai gruppi amminici presenti nella catena dell’AD70 (Amminodestrano 70kDa) in modo da lasciare gruppi amminici liberi per la fase B.
B) Modificazione del coniugato AD70-oligo mediante aggiunta di gruppi tiolici. I gruppi amminici rimasti liberi dell’AD70 sono fatti reagire con SPDP (N-succinimmidil 3-(2-piridilditio)propionato). I legami S-S sono successivamente ridotti a gruppo tiolico per mezzo di DTT (ditiotreitolo).
C) Coniugazione del composto alle nanoparticelle di oro colloidale. PROTOCOLLO
Si utilizza una quantità nota di Oligo 5’-P liofilizzato.
Imidazolo 0,1M pH 6 (0,68g di imidazolo per 10ml di soluzione; per il pH usare HCl 37%)
Soluzione di imidazolo 0,1M AD70 0,025M (molarità dei gruppi NH2): 175mg AD70 2ml Imidazolo 0,1M
1- Il gruppo fosfato dell’oligo viene attivato risospendendo l’oligonucleotide liofilizzato in una soluzione di EDC 0,1M avendo cura di mantenere il rapporto molare tra EDC e oligo al di sopra di 40:1; aggiustare il volume di EDC in base a questo rapporto.
2- Unire rapidamente ad una soluzione di Imidazolo 0,1M pH 6 contenente AD70 in modo da avere i seguenti rapporti molari oligo:AD70:imidazolo = 2:1:100.
3- Miscelare e centrifugare. Aggiungere nuovamente Imidazolo 0,1M (rapporto finale oligo:imidazolo 1:200). Incubare a TA per una notte. Il giorno successivo centrifugare con filtro centrifugo 50k a 2000 rcf a 14°C. Recuperare. Portare a 100 µl con PBS 10 mM.
4- Aggiungere SPDP 20 mM in modo da avere un rapporto molare SPDP:AD70 16:1, incubare per 2 ore a TA.
5- Attivazione dei gruppi tiolici: aggiungere un pari volume di DTT 150 mM, incubare per 30’ a RT. Spinnare, e purificare con filtro centrifugo 50k. Risospendere in 500 µl di acqua o in tampone Tris-HCl pH 7,5-8,0 senza EDTA.
Coniugazione con nanoparticelle di oro colloidale (GNP)
1- Unire a 5ml di GNP: 1ml tampone borato 2mM e 50µl di coniugato Oligo-AD70 prediluito in 950µl di acqua o di tampone Tris-HCl pH 7,5-8,0 senza EDTA.
2- Incubare 50’ a TA in agitazione.
3- Aggiungere 15µl Triton 3%
4- Centrifugare a 2000 rcf giri per 30’
5- Risospendere in 7 ml di acqua con 2µl Triton 15%
6- Centrifugare a 2000 rcf per 20’
7- Concentrare il pellet in 1,4 ml di acqua.
Esempio 3 - Coniugazione con anticorpi e oligonucleotidi
La metodica può essere schematizzata in tre fasi:
A) Attacco di uno o più oligonucleotidi con un gruppo fosfato in 5’ ai gruppi amminici presenti nella catena dell’AD70 (Amminodestrano 70kDa) in modo da lasciare gruppi amminici liberi per la fase B.
B) Modificazione del coniugato Oligo-AD70 ottenuto nella fase A) mediante aggiunta di gruppi tiolici. Reazione, non a saturazione, dei gruppi amminici dell’AD70 con SPDP (N-succinimmidil 3-(2-piridilditio)propionato) e successiva riduzione dei legami S-S a gruppo tiolico per mezzo di DTT (ditiotreitolo).
C) Attacco dei carbossili delle immunoglobuline IgG ai gruppi amminici del coniugato Oligo-AD70 ottenuto nella fase B) per mezzo del composto N-idrossisulfosuccinimmide, in presenza di una carbodiimmide specificatamente EDC (etil(dimetilamminopropil) carbodiimmide). Il risultato complessivo della fase A, B e C Ã ̈ una molecola di polidestrano legata in modo covalente agli anticorpi, agli oligonucleotidi e con gruppi tiolici liberi.
D) Coniugazione del composto alle nanoparticelle di oro colloidale. PROTOCOLLO
Si utilizza una quantità nota di Oligo 5’-P liofilizzato.
Imidazolo 0,1M pH 6 (0,68g di imidazolo per 10ml di soluzione; per il pH usare HCl 37%)
Soluzione di imidazolo 0,1M+ AD70 0,025M (molarità dei gruppi NH2): 175mg AD70 2ml Imidazolo 0,1M
1- Il gruppo fosfato dell’oligo viene attivato risospendendo l’oligo liofilizzato in una soluzione di EDC 0,1M avendo cura di mantenere il rapporto molare tra EDC e Oligo al di sopra di 40:1; aggiustare il volume di EDC in base a questo rapporto.
2- Unire rapidamente ad una soluzione di Imidazolo 0,1M pH 6 contenente AD70 in modo da avere i seguenti rapporti molari oligo:AD70:imidazolo = 2:1:100.
3- Miscelare e centrifugare. Aggiungere di nuovo Imidazolo 0,1M (rapporto finale oligo:imidazolo 1:200). Incubare a TA per una notte. Il giorno successivo centrifugare con filtro centrifugo 50k 2000 rcf a 4°C. Recuperare. Portare a 100 µl con PBS 10 mM.
4- Aggiungere SPDP 20mM in modo da avere un rapporto molare SPDP:AD70 5:1 incubare per 2 ore a TA.
5- Alla miscela aggiungere un pari volume di DTT 150 mM e incubare per 30’ a TA. Filtrare l’intero volume con un filtro centrifugo 50k. Risospendere in 100 µl di PBS 10 mM pH 7,4.
6- Portare l’anticorpo ad una concentrazione di 1mg/ml in tampone MES 0,1M 0,5M NaCl, pH 6.
7- Aggiungere 0,8 µmoli di EDC e 5 µmoli di Sulfo-NHS a 0,4 mg di anticorpo (circa 2,7 nmoli di anticorpo) in un volume totale di 400 µl. Lasciar reagire 15’ TA.
8- Aggiungere la soluzione Oligo+SPDP+AD70 (vedi punto 5) alla soluzione di anticorpo ottenuta al punto 6/7 in modo tale che il rapporto molare tra anticorpo e AD70 sia ≥ 5:1 e incubare a TA per una notte.
9- Filtrare l’intero volume con un filtro centrifugo 50k MWCO a 580rcf a 4°C fino al passaggio del 75% della soluzione. Risospendere in 500 µl di HEPES.
La coniugazione con le nanoparticelle di oro colloidale viene eseguita in accordo alla procedura descritta nell’Esempio 1.

Claims (14)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la preparazione di sospensioni di nanoparticelle di oro colloidale legate, tramite l’atomo di zolfo di spaziatori bifunzionali contenenti un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità, a un amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con detti spaziatori bifunzionali tramite detti gruppi ammino-reattivi e coniugato ad uno o più anticorpi e/o oligonucleotidi, in cui: - la coniugazione dell’amminodestrano all’anticorpo avviene tramite la formazione di legami ammidici tra gruppi amminici dell’amminodestrano e gruppi carbossilici degli anticorpi; - la coniugazione dell’amminodestrano all’oligonucleotide avviene tramite la formazione di legami fosfammidici tra gruppi amminici dell’amminodestrano e gruppi fosfato nella posizione 5’ dell’oligonucleotide; comprendente una combinazione dei seguenti passaggi: a) funzionalizzazione parziale dei gruppi amminici dell’amminodestrano con spaziatori bifunzionali contenenti un precursore di un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità, seguita dalla liberazione del gruppo tiolico, a dare un amminodestrano funzionalizzato con detti spaziatori bifunzionali e contenente gruppi tiolici liberi e gruppi amminici liberi; b) reazione parziale dei gruppi amminici dell’amminodestrano con il gruppo 5’-fosfato di uno o più oligonucleotidi, per dare un amminodestrano contenente gruppi amminici liberi e coniugato con uno o più oligonucleotidi tramite un legame fosfammidico; c) funzionalizzazione, opzionalmente parziale, dei gruppi amminici liberi del prodotto ottenuto nel passaggio b) con spaziatori bifunzionali contenenti un precursore di un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità, seguita dalla liberazione del gruppo tiolico, per dare un amminodestrano funzionalizzato con detti spaziatori bifunzionali, contenente gruppi tiolici liberi e, opzionalmente, gruppi amminici liberi, e coniugato a uno o più oligonucleotidi tramite un legame fosfammidico; d) formazione di legami ammidici tra i gruppi amminici liberi del prodotto ottenuto nel passaggio a) o c) e i gruppi carbossilici di anticorpi, per dare un amminodestrano contenente gruppi amminici funzionalizzati con detti spaziatori bifunzionali, contenente gruppi tiolici liberi e gruppi amminici legati ad anticorpi mediante legami ammidici, o per dare un amminodestrano contenente gruppi amminici funzionalizzati con detti spaziatori bifunzionali, contenente gruppi tiolici liberi e coniugato a uno o più oligonucleotidi tramite legami fosfammidici e a uno o più anticorpi mediante legami ammidici; e) reazione del prodotto ottenuto nel passaggio c) o d) con nanoparticelle di oro colloidale.
  2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 per la preparazione di sospensioni di nanoparticelle di oro colloidale legate, tramite l’atomo di zolfo di spaziatori bifunzionali contenenti un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità, a un amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con detti spaziatori bifunzionali tramite detti gruppi amminoreattivi e coniugato ad uno o più anticorpi, comprendente i seguenti passaggi: a) funzionalizzazione parziale dei gruppi amminici dell’amminodestrano con spaziatori bifunzionali contenenti un precursore di un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità, seguita dalla liberazione del gruppo tiolico, a dare un amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con detti spaziatori bifunzionali tramite detti gruppi ammino-reattivi e contenente gruppi tiolici liberi e gruppi amminici liberi; d') formazione di legami ammidici tra i gruppi amminici liberi del prodotto ottenuto nel passaggio a) e i gruppi carbossilici di anticorpi, per dare un amminodestrano contenente gruppi amminici funzionalizzati con detti spaziatori bifunzionali tramite detti gruppi ammino-reattivi, contenente gruppi tiolici liberi e gruppi amminici legati ad anticorpi mediante legami ammidici; e') reazione del prodotto ottenuto nel passaggio d’) con nanoparticelle di oro colloidale.
  3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 per la preparazione di sospensioni di nanoparticelle di oro colloidale legate, tramite l’atomo di zolfo di spaziatori bifunzionali contenenti un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità, a un amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con detti spaziatori bifunzionali tramite detti gruppi amminoreattivi e coniugato ad uno o più oligonucleotidi, comprendente i seguenti passaggi: b) reazione parziale dei gruppi amminici dell’amminodestrano con il gruppo 5’-fosfato di uno o più oligonucleotidi, per dare un amminodestrano contenente gruppi amminici liberi e coniugato con uno o più oligonucleotidi tramite un legame fosfammidico; c') funzionalizzazione dei gruppi amminici liberi del prodotto ottenuto nel passaggio b) con spaziatori bifunzionali contenenti un precursore di un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità, seguita dalla liberazione del gruppo tiolico, per dare un amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con detti spaziatori bifunzionali tramite detti gruppi ammino-reattivi, contenente gruppi tiolici liberi e coniugato a uno o più oligonucleotidi tramite un legame fosfammidico; e") reazione del prodotto ottenuto nel passaggio c’) con nanoparticelle di oro colloidale.
  4. 4. Metodo secondo la rivendicazione 1 per la preparazione di sospensioni di nanoparticelle di oro colloidale legate, tramite l’atomo di zolfo di spaziatori bifunzionali contenenti un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità, a un amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con detti spaziatori bifunzionali tramite detti gruppi amminoreattivi e coniugato ad uno o più anticorpi e a uno o più oligonucleotidi, comprendente i seguenti passaggi: b) reazione parziale dei gruppi amminici dell’amminodestrano con il gruppo 5’-fosfato di uno o più oligonucleotidi, per dare un amminodestrano contenente gruppi amminici liberi e coniugato con uno o più oligonucleotidi tramite un legame fosfammidico; c") funzionalizzazione parziale dei gruppi amminici liberi del prodotto ottenuto nel passaggio b) con spaziatori bifunzionali contenenti un precursore di un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità, seguita dalla liberazione del gruppo tiolico, per dare un amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con detti spaziatori bifunzionali tramite detti gruppi ammino-reattivi, contenente gruppi tiolici liberi, gruppi amminici liberi e coniugato a uno o più oligonucleotidi tramite un legame fosfammidico; d") formazione di legami ammidici tra i gruppi amminici liberi del prodotto ottenuto nel passaggio c†) e i gruppi carbossilici di anticorpi, per dare un amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con detti spaziatori bifunzionali tramite detti gruppi ammino-reattivi, contenente gruppi tiolici liberi e coniugato a uno o più oligonucleotidi tramite legami fosfammidici e a uno o più anticorpi mediante legami ammidici; e''') reazione del prodotto ottenuto nel passaggio d†) con nanoparticelle di oro colloidale.
  5. 5. Il metodo delle rivendicazioni 1-4 in cui l’amminodestrano ha un peso molecolare maggiore o uguale a 70 kDa.
  6. 6. Il metodo della rivendicazione 1 in cui nei passaggi a) e c) la funzionalizzazione dei gruppi amminici dell’amminodestrano con spaziatori bifunzionali contenenti un precursore di un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità comprende la reazione dell’amminodestrano con esteri attivati di acidi C2-C6-alchilcarbossilici recanti sulla catena alchilica un gruppo disolfuro, seguita dalla riduzione del gruppo disolfuro a gruppo tiolico.
  7. 7. Il metodo della rivendicazione 6 in cui la funzionalizzazione dei gruppi amminici dell’amminodestrano comprende la reazione dell’amminodestrano con N-succinimmidil C2-C6-alchilcarbossilati recanti sulla catena alchilica un gruppo disolfuro, preferibilmente con N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato, seguita da riduzione del gruppo disolfuro con ditiotreitolo.
  8. 8. Il metodo delle rivendicazioni 1, 2 e 4 in cui l’anticorpo à ̈ una immunoglobulina monoclonale o policlonale, preferibilmente IgC, IgY o IgG, più preferibilmente IgG.
  9. 9. Il metodo delle rivendicazioni 1, 3 e 4 in cui l’oligonucleotide contiene non più di 100 coppie di basi e, opzionalmente, una coda di poli-T.
  10. 10. Nanoparticelle di oro colloidale legate, tramite l’atomo di zolfo di spaziatori bifunzionali contenenti un gruppo tiolico ad una estremità e un gruppo ammino-reattivo all’altra estremità, a un amminodestrano funzionalizzato ai gruppi amminici con detti spaziatori bifunzionali tramite detti gruppi ammino-reattivi e coniugato a uno o più anticorpi e/o oligonucleotidi, ed in cui: - il legame tra l’amminodestrano e l’anticorpo avviene tramite legami ammidici tra gruppi amminici dell’amminodestrano e gruppi carbossilici dell’anticorpo; - il legame tra l’amminodestrano e l’oligonucleotide avviene tramite la formazione di legami fosfammidici tra i gruppi amminici dell’amminodestrano ed il gruppo fosfato nella posizione 5’ dell’oligonucleotide.
  11. 11. Nanoparticelle secondo la rivendicazione 10 in cui l’anticorpo à ̈ una immunoglobulina monoclonale o policlonale, preferibilmente IgC, IgY o IgG, più preferibilmente IgG.
  12. 12. Nanoparticelle secondo la rivendicazione 10 in cui l’oligonucleotide contiene non più di 100 coppie di basi e, opzionalmente, una coda di poli-T.
  13. 13. Uso delle nanoparticelle secondo le rivendicazioni 10-12 come marcatori o agenti di rilevazione in procedure di test immunologici.
  14. 14. Uso delle nanoparticelle secondo le rivendicazioni 10-12 per la preparazione di in-vitro diagnostici a lettura immunocromatografica. Milano, 17 aprile 2013
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