ITMI20112444A1 - Composizioni per la riparazione tissutale comprendenti citochine, fattori di crescita e rna - Google Patents
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Description
“COMPOSIZIONI PER LA RIPARAZIONE TISSUTALE COMPRENDENTI CITOCHINE, FATTORI DI CRESCITA E RNAâ€
L’invenzione si riferisce a composizioni comprendenti citochine, fattori di crescita e RNA isolati dai tessuti e dai liquidi biologici di mammiferi, in particolare da siero, placenta e colostro, per la riparazione tissutale, in particolare per la terapia di lesioni della cute, della cartilagine, dell’osso, dei tendini, dei muscoli (lisci e striati), dei legamenti, del tessuto connettivo, rene, pancreas, cornea e del tessuto nervoso.
Le composizioni dell’invenzione costituiscono un’alternativa vantaggiosa alla terapia con cellule staminali, nel cui sovranatante si ritrovano, in quantità dell’ordine dei picogrammi, sostanzialmente gli stessi fattori di crescita, citochine e RNA presenti nel siero, nella placenta e nel colostro dei mammiferi.
Descrizione dell’invenzione
Secondo la corrente letteratura scientifica, l’azione terapeutica delle cellule staminali può essere riconducibile a due meccanismi: differenziazione delle cellule staminali in cellule residenti e rilascio di fattori trofici rigenerativi da parte delle cellule staminali. I rispettivi contributi di questi due meccanismi rimangono da chiarire, anche se à ̈ stato ipotizzato che non siano le cellule staminali a trasformarsi in cellule mature del tessuto leso, ma che esse trasmettano dei fattori vitali a questo tessuto, che può così tornare a proliferare e a differenziarsi, rigenerandosi (Fig. 1, tratta da A.I. Caplan and J.E. Denni. Mesenchymal Stem Cells as Trophic Mediators. J. Cell Bioch 98:1076–1084; 2006).
La terapia con cellule staminali presenta molti problemi legati non solo ai costi e a complicazioni tecniche ed applicative, ma anche a scrupoli etici e religiosi.
La terapia con cellule staminali à ̈ attuabile solo per via iniettiva o, in alcuni casi, topica, e non per via orale Il sovranatante delle cellule staminali in coltura contiene fattori di crescita, citochine, fattori chemiotattici ecc. che si ritiene siano responsabili dell’effetto benefico della terapia staminale sulla crescita e/o riparazione dei tessuti.
L’eventuale utilizzo dei fattori vitali isolabili dal sovranatante delle cellule staminali presenta, tuttavia, non solo gli stessi problemi etici dell’uso delle cellule staminali stesse ma anche costi molto elevati.
Si à ̈ sorprendentemente scoperto che nei liquidi biologici e in alcuni tessuti dei mammiferi sono presenti gli stessi fattori attivi rilasciati dalle cellule staminali e pertanto presenti nel sovranatante delle colture delle cellule staminali stesse. Le migliori sorgenti di questi fattori sono il siero, la placenta e il colostro dei mammiferi.
La Tabella riporta il confronto quali-quantitativo fra i fattori presenti nel sovranatante delle colture di cellule staminali e i fattori isolati da queste nuove sorgenti da noi denominati POOL OF MATERNAL FACTORS (P.M.F.).
Tabella
P.M.F. Mesenchymal NAME (pg/ml ) stem cells (pg/ml) IL 1 r a IL-1 receptor antagonist 29.05 0.0
IL-1I 0.09 0.0
IL-2 Interleukin-2 32.05 0.0
IL-4 Interleukin-4 0.17 21.12
IL - 6 Interleukin- 6 1.26 293.01 IL - 8 Interleukin- 8 0.71 359.56 IL - 9 Interleukin- 9 3.66 0.78
IL- 10 Interleukin- 10 2.83 0.99
IL - 12 Interleukin- 12 1.73 0.0
IL-15 Interleukin- 15 4.33 0.5
IL- 17 Interleukin-17 21.95 0.32 Eotaxin Eotaxin 5.01 0.0
INF-γ Gamma- 11.14 MCP-1 Monocyte chemotactic factor-1 4.12 11.23
PDGF Platelet derived growth factor 11<.>^5 3.08 TNF Tumor necrosis factor 40.00 12.30
Vasculen d growth 41.00 208.04 VEGF factor
HGF Hepatocyte growth factor 52.3 100.74 FGF Fibroblast growth factor 180.15 18.21 TGF- 64.00 51.32 beta1 transforming growth factor
IGF-1 - growth factor 1.60 0.0
GM- Granulocyte/monocyte-colony 183.85 0.0
C SF stimulating factor
LIF leukemia inhibitory factor 15.20 27.32 SCF stem cell factor 10.55 4.54 SDF-1 stromal derived factor- 1 41.75 28.8 NGF Nerve growth factor 8.33 0.0 BMP-2 Bone protein 25.01 2.65
RNA 189 ng/ml 48 pg/ml
Presenza di fattori di crescita/citochine in P.M.F. (pg/ml ) e nei
di Cellule Staminali Mesenchimali (1 milione di cellule).
E’ evidente la maggior concentrazione di quasi tutti i fattori presenti
nel P.M.F. rispetto a quella presente nel sovranatante delle cellule staminali.
E’ inoltre evidente la possibilità di utilizzare concentrazioni
terapeutiche anche molto alte di P.M.F., ad esempio dosi da 0,5/1 g. per via topica o iniettiva e dosi fino a 20/30 g. per via orale, rispetto alle massime concentrazioni terapeutiche utilizzate di cellule staminali che corrispondono a 1/2 milioni/Kg e pertanto a un massimo di 140 milioni per terapia e, dunque, a valori di fattori sempre dell’ordine dei picogrammi.
L’oggetto dell’invenzione à ̈ quindi una composizione (P.M.F.) contenente in altissima concentrazione tutti i fattori attivi presenti nel sovranatante delle cellule staminali ma isolati, con semplici metodiche estrattive, da fonti naturali molto economiche, di facile reperibilità e senza problemi etici.
Inoltre le composizioni dell’invenzione contengono anche fattori antibatterici (transferrina, lisozima, lactoperossidasi, lactoferrina) e anticorpi delle classi IgG e IgA. (P.M.F. Ab).
L’assenza di anticorpi e di antibatterici del sovranatante delle cellule staminali à ̈ un’ulteriore ragione per l’utilizzo di P.M.F. Ab in molti usi terapeutici, topici e per via orale.
Il siero presenta il massimo picco dei fattori negli ultimi giorni prima del parto, il colostro nelle prime ore dopo il parto e non oltre la 6° ora.
Già dopo 12 ore dal parto i fattori diminuiscono notevolmente, a 24 h molti di loro non sono più dosabili.
Questi fattori sono geneticamente molto conservati nelle varie specie e pertanto à ̈ possibile usare sull’uomo fattori isolati da altre specie di mammiferi come i bovini, gli equini, i cammelli, i mammiferi marini ecc.
I fattori sono controllati con metodiche ELISA specifiche per la specie, anche se la cross reazione interspecie à ̈ altissima in quanto i fattori sono filogeneticamente molto conservati e sono pertanto misurabili solo qualitativamente anche con ELISA utilizzati per specie diverse (es: uomo-bovino e viceversa).
Una prima fonte dei fattori dell’invenzione à ̈ il siero di mammiferi che, negli ultimi giorni (5-15) prima del parto, à ̈ molto ricco dei fattori attivi oggetto dell’invenzione rispetto a mammiferi non gravidi o ai primi mesi di gravidanza. Si descrive di seguito, a titolo di esempio, una metodica di estrazione da siero.
Si preleva 1 litro di sangue in 4 giorni per 4 prelievi complessivi per non danneggiare l’animale, preferibilmente bovino o equino.
Il sangue viene sierato a temperatura ambiente per 24 h e quindi centrifugato per spremere il coagulo.
Si recupera il siero (circa il 30/40% del volume totale) a cui si aggiungono, come agenti antisettici, fenossietanolo al 2,5% e diazolidinil-urea all’1%. Il siero così trattato viene quindi frazionato con i seguenti passaggi.
Ultrafiltrazione 300'000 Da
Il campione di siero (congelato a -20°C) ottenuto per coagulazione e centrifugazione da sangue di mammifero viene scongelato a temperatura ambiente e diluito con 2 volumi di acqua demineralizzata. La soluzione ottenuta viene ultrafiltrata su membrana piana a flusso tangenziale Millipore Pellicon Biomax in polyethersulfone da 300'000 Da ad una Pi di 0,5÷1 bar, in camera fredda a 4°C.
Il retentato e una frazione corrispondente a circa 1:10 del permeato vengono trasferiti in un tubi da dialisi Spectrum Spectrapor in cellulosa rigenerata da 1'000 Da e dializzati contro acqua demineralizzata.
Ultrafiltrazione 5'000 Da
Il restante permeato viene ultrafiltrato su membrana da 5'000 Da. Il permeato dell’ultrafiltrazione da 300'000 Da viene concentrato su membrana piana a flusso tangenziale Millipore Pellicon Biomax in polyethersulfone da 5'000 ad una Pi di 0,5 ÷1 bar, in camera fredda a 4°C. Il retentato viene trasferito in un tubo da dialisi Spectrum Spectrapor in cellulosa rigenerata da 1'000 Da e dializzato contro acqua demineralizzata (con questa dialisi si eliminano anche i conservanti). Il composto à ̈ quindi immediatamente liofilizzato.
Una seconda fonte dei fattori dell’invenzione à ̈ la placenta. Si descrive di seguito, a titolo di esempio, una metodica di estrazione.
Vengono utilizzate preferibilmente placente bovine o equine.
Omogeneizzazione
La placenta (congelata a -20°C) viene scongelata a temperatura ambiente, tagliata in piccoli pezzi, lavata con abbondante soluzione fisiologica (NaCl 0,9%) fredda (4°C) e omogeneizzata tramite cutter Siramm in un buffer di lisi così composto: Tris/HCl 50 mM, EDTA 25mM, triton X-100 0,001% a pH 7,4. Alla sospensione ottenuta viene aggiunto NaCl fino ad una concentrazione dello 0,9%, e i conservanti (fenossietanolo al 2,5% e diazolidinil-urea all’1%). La sospensione viene posta sotto agitazione (agitatore magnetico) per 2 ore e mantenuta statica over night in camera fredda a 4°C.
Centrifugazione
La sospensione viene centrifugata a 13’000 rpm con centrifuga Sorvall RC6 e rotore SLA 15000 per 45 minuti a 4°C. Il surnatante della centrifugazione viene recuperato, prefiltrato sotto vuoto su Dicalite e su filtri in cellulosa rigenerata da 0,45 µm e 0,22 µm.
Ultrafiltrazione 300'000 Da
Il prodotto filtrato viene ultrafiltrato su membrana piana a flusso tangenziale Millipore Pellicon Biomax in polyethersulfone da 300'000 Da ad una Pi di 0,5÷1 bar, in camera fredda a 4°C.
Ultrafiltrazione 5'000 Da
Il permeato dell’ultrafiltrazione da 300000 Da viene concentrato su membrana piana a flusso tangenziale Millipore Pellicon Biomax in polyethersulfone da 5000 ad una Pi di 0,5÷1 bar, in camera fredda a 4°C. Il retentato viene trasferito in un tubo da dialisi Spectrum Spectrapor in cellulosa rigenerata da 1'000 Da e dializzato contro acqua demineralizzata (si eliminano pertanto anche i conservanti) e quindi immediatamente liofilizzato.
Una ulteriore fonte dei fattori dell’invenzione à ̈ il colostro. Si usa preferibilmente colostro bovino per la facilità di approvvigionamento e le quantità disponibili. E’ particolarmente preferito il colostro da mucche di razza Holstein (Frisona) e Guernsey. E’ stato provato che tali mucche producono colostro con la maggior concentrazione di fattori attivi. Le mucche sono preferibilmente al secondo o terzo parto. Il colostro à ̈ preferibilmente raccolto fra la 1° e la 6° ora dal parto in quanto, in questo periodo, si assiste alla maggior concentrazione di attivi. Nel colostro a partire dalla sesta ora dal parto i fattori attivi diminuiscono rapidamente (dopo 24 ore ne sono presenti solo il 15%). Il colostro raccolto à ̈ sottoposto a test per tubercolosi, citotossicità su culture cellulari, controllo di micoplasmi, prioni e di virus umani e bovini.
Il colostro nella cisterna mammaria à ̈ praticamente sterile, ma una volta munto, nonostante ogni precauzione, per l’alta concentrazione di fattori di crescita, la sua carica batterica sale molto rapidamente durante la gelatura e la sgelatura, processi piuttosto lenti data l’alta densità del colostro nelle prime ore.
L’utilizzo di raggi γ permette di ottenere un colostro sterile solo se si utilizzano radiazioni superiori a 10 Kgy che tuttavia distruggono gran parte dei fattori attivi, e d’altronde questo metodo non impedisce la formazione di pirogeni il cui utilizzo à ̈ sconsigliabile per via topica e proibito per via parenterale.
E’ stata pertanto messa a punto una filiera di raccolta innovativa, per ottenere un composto anallergico sterile, senza conservanti e senza pirogeni.
Al colostro raccolto in taniche sterili (sterilizzate a vuoto a 25 Kgy) si aggiungono agenti antisettici in quantità tali da garantire la sterilità e l’assenza di pirogeni. Si impiegano preferibilmente fenossietanolo alla concentrazione del 2,5% e diazolidinil-urea a una concentrazione dell’1%.
Il colostro così trattato può, per brevi periodi (max 30 gg) non essere conservato congelato prima dei processi di estrazione dei fattori attivi, con evidente risparmio dei costi industriali.
I fattori attivi possono essere estratti con i seguenti passaggi:
Centrifugazione
Il colostro bovino viene diluito 1:10 con acqua demineralizzata, si aggiunge NaCl fino ad ottenere una concentrazione dello 0,9%.
La sospensione viene centrifugata in continuo a 8'000 rpm a temperatura di 20-25°C con una centrifuga Alfa Laval scartando il pellet corrispondente alla parte lipidica.
Ultrafiltrazione ceramica da 300'000 Da
Il prodotto ottenuto dalla centrifugazione viene ultrafiltrato su membrana ceramica con cut-off 300'000 Da ad una temperatura di 20-25°C recuperando il permeato.
Ultrafiltrazione su 5000 Da
Il permeato dell’ultrafiltrazione 300'000 Da viene concentrato su membrana a spirale avvolta da 5'000 Da in polyethersulfone ad una temperatura di 20-25°C e dializzato contro acqua demineralizzata fino ad una conducibilità del retentato di circa 600 µs/cm<2>(con questa dialisi si eliminano anche i conservanti).
Liofilizzazione
Il retentato dell’ultrafiltrazione da 5'000 Da viene filtrato sotto vuoto su filtri Millipore in cellulosa rigenerata da 0,2 µm, congelato a -20°C e liofilizzato.
Purificazione di P.M.F. Ab dagli anticorpi
Una soluzione di ammonio solfato satura viene aggiunta ad una soluzione di fattori attivi isolati sia da siero, placenta o colostro sotto agitazione e ad un rapporto finale 1:1 (v/v). La miscela à ̈ mantenuta per due ore a temperatura ambiente o a 4°C per 12 ore, in ambiente sterile e successivamente centrifugata a 18.000 rpm. Il surnatante à ̈ quindi sottoposto a dialisi a 4°C contro acqua, utilizzando membrane con cut-off di 100 kDA. La frazione esterna alle membrane di dialisi, priva della componente immunoglobulinica, viene quindi liofilizzata e conservata a -20°C. La deplezione della componente immunoglobulinica viene verificata mediante analisi SDS-PAGE in condizioni riducenti e non, utilizzando blue coomassie come colorante.
In alternativa o di seguito al precedente, la purificazione prevede l’utilizzo di colonne di affinità funzionalizzate con proteina G. La soluzione dei fattori attivi o la frazione preventivamente precipitata con ammonio solfato viene fatta eluire mediante pompa peristaltica ad un flusso di 1 ml/min attraverso una colonna funzionalizzata con proteina G in ambiente sterile. Dopo 20 minuti di perfusione, la soluzione à ̈ dializzata per ultrafiltrazione ad alta pressione per eliminare totalmente i conservanti e quindi liofilizzata. Si ottiene una polvere sterile, priva di pirogeni, priva di immunoglobuline animali, libera da conservanti, anallergica (caseina e lattoalbumina sono i responsabili di oltre il 95% delle allergie verso queste componenti animali) di altissima solubilità e con la massima concentrazione possibile di fattori attivi.
Qualunque sia la sorgente utilizzata si riscontra la presenza degli stessi fattori attivi misurati con l’ELISA.
Di seguito sono riportati i fattori attivi presenti in PMF e le loro attività principali.
FATTORI DI CRESCITA
Basic FGF (fibroblast growth factor): Regola la crescita ed il differenziamento di cellule di origine mesenchimale.
TGF-beta1 (transforming growth factor): Regola crescita, differenziamento, adesione, migrazione ed altre funzioni cellulari.
IGF-1 (insulin-like growth factor): Regola crescita e sviluppo cellulare.
NGF (nerve growth factor): Stimola la crescita e regola funzionalmente strutture del sistema nervoso e di organi sensoriali.
PDGF (platelet-derived growth factor): Regola la crescita ed il differenziamento di cellule di origine mesodermica.
VEGF (vascular endothelial growth factor): Regola la crescita di cellule endoteliali e l’angiogenesi.
FATTORI DI STIMOLAZIONE STAMINALE GM-CSF (human granulocyte colony-stimulating factor). Stimolo e dismissione periferica di progenitori immuni dal midollo osseo.
LIF (leukemia inhibitory factor). Induzione del differenziamento delle staminali ematopoietiche, regolazione di differenziamento neuronale, della transizione epitelio-mesenchimale e di tolleranza materno-fetale.
SCF (stem cell factor). Fattore pleiotropico che agisce su cellule staminali ematopoietiche nell’adulto.
SDF-1 (stromal derived factor-1). Fattore chemotattico per progenitori staminali esprimenti il CXCR4 ligando.
CITOCHINE CON ATTIVITA’ IMMUNOSTIMOLANTE
IL-2: (interleukin-2). Proliferazione clonale dei linfociti T.
IL-6: Maturazione dei linfociti B e stimolazione del sistema infiammatorio.
IL-9: Stimolazione della proliferazione cellulare e blocco dell’apoptosi.
IL-12: Stimolazione di linfociti T e cellule natural killer.
IL-15: Stimolazione di linfociti T e cellule natural killer. Molte attività sono in comune con L’IL-2.
IL-17: Regolazione di NF-kappaB e mitogen-activated protein kinases per stimolare espressione di IL-6, prostaglandine e produzione di ossido nitrico.
INF-gamma (gamma interferon): Citochina con attività antivirale, immunoregolatoria e anti-tumorale, potente attivatore dei macrofagi.
TNF (tumor necrosis factor): Citochina con multiple funzioni.
Coinvolta in proliferazione, differenziazione, apoptosi, metabolismo lipidico e coagulazione.
CITOCHINE ANTIINFIAMMATORIE IL1-ra (IL-1 receptor antagonist): Inibizione dell’attività proinfiammatoria di IL-1.
IL10. Regolazione di cellule T regolatorie, inibizione dell’attività dei linfociti T helper, stimolo dei linfociti B.
FATTORI CHEMOTATTICI
Eotaxina: Reclutamento di eosinofili.
IP-10: Reclutamento di cellule infiammatorie.
MCP-1 (Monocyte chemotactic factor-1): Reclutamento di cellule infiammatorie, in particolare monociti.
RNA: modula le cellule bersaglio inducendo una riprogrammazione a livello genetico.
P.M.F. potrà essere vantaggiosamente formulato in composizioni adatte alla somministrazione orale, topica o parenterale, a seconda dell’applicazione desiderata e dello specifico danno d’organo da trattare. Tali formulazioni conterranno P.M.F. in dosaggi unitari compresi tra 1 g e 30 g.
L’invenzione à ̈ descritta in maggior dettaglio nella seguente parte sperimentale, data a titolo di esempio.
Prove in vitro
P.M.F. ha dimostrato di aumentare notevolmente la capacità proliferativa delle cellule staminali mesenchimali derivate da tessuto adiposo umano (hASCs) rispetto al controllo (10% FBS). P.M.F. utilizzato a due diverse concentrazioni (5mg/ml e 1mg/ml), nel mezzo di cultura, ha dimostrato che l’effetto à ̈ dose dipendente e tempo di incubazione dipendente (Fig. 2).
P.M.F. ha dimostrato una forte capacità proliferativa sulle cellule murine mesenchimali D1 rispetto al controllo (10% FBS). L’effetto à ̈ dose e tempo di incubazione dipendente (Fig. 3).
P.M.F. ha dimostrato una forte capacità proliferativa sugli osteoblasti umani rispetto al controllo (10% FBS). L’effetto à ̈ dose e tempo di incubazione dipendente (Fig. 4).
Prove in vivo
Il Matrigel à ̈ una miscela in forma di gel costituita da proteine secrete dalle cellule del sarcoma di topo Engelbreth-Holm-Swan (EHS). Questa miscela mima il complesso ambiente extracellulare di molti tessuti e viene solitamente utilizzata come substrato per le colture cellulari.
Osso
Il matrigel iniettato nel muscolo di topo resta inerte e non viene colonizzato dalle cellule dell’animale. Se si inietta matrigel contenente 100 γ di P.M.F., in venti giorni si assiste alla totale colonizzazione cellulare del matrigel (Fig. 5). In presenza di idrossiapatite e matrigel P.M.F. si assiste dopo 60 giorni alla comparsa di collagene e delle cellule a capo del metabolismo osseo: osteoclasti e osteoblasti (Fig. 6).
Muscolo cardiaco
Se, dopo aver lesionato con un ago il muscolo cardiaco del topo, ritirando l’ago, si rilascia matrigel P.M.F. si assiste prima alla colonizzazione della lesione da parte di cellule muscolari (Fig. 7A) e poi alla sua totale riparazione (Fig. 7B).
UTILIZZO DI P.M.F. NELLA TERAPIA DEL DOLORE NEUROPATICO PER VIA ORALE
Come modello sperimentale à ̈ stato usato la costrizione cronica (CCI) universalmente riconosciuta come il migliore modello sperimentale del dolore neuropatico. La neuropatia à ̈ stata indotta in ratti maschi Sprague Dawley di 150-175 gr.
I parametri del dolore sono stati valutati sulle zampe posteriori ipsolaterali e controlaterali alla lesione (Dynamic Plantar Aesthesiomether con filamento di von Frey) 3, 7, 14, 21,30, 45 giorni dopo l’intervento. I parametri biochimici sono stati valutati come proteine (ELISA) e RNA (real time PCR) il Nerve Growth Factor (NGF), le interleuchine 1-6-10 e il Tumor Necrosis Factor α (TNFα). I trattamenti con P.M.F. per via orale (2-4-8 g/kg) sono stati fatti al settimo giorno dopo la lesione (patologia già in atto), in singole somministrazioni e a dosi ripetute ogni 14 giorni. I dati ottenuti dimostrano una significativa diminuzione della allodinia e iperalgesia già con il trattamento singolo e una durata dell’effetto pieno fino al ventunesimo giorno, cui segue una lenta flessione. Il trattamento ripetuto quando diminuisce l’effetto della dose singola, ripristina l’effetto analgesico e permette di mantenere l’effetto per tutto il periodo delle somministrazioni. I parametri biochimici sono modificati significativamente dal trattamento nella direzione di una diminuita infiammazione, fino alla normalizzazione.
UTILIZZO DI P.M.F. NELLA PROFILASSI DELLA ENCEFALOMIELITE ALLERGICA (EAE) IN TOPI SJL PER VIA ORALE
Sono stati utilizzati topi SJL/J femmine di 6-7 settimane immunizzate con 75µg di PLP (139-151) emulsionato in adiuvante completo di Freund (CFA). I topi sono stati osservati giornalmente mediante la misura del peso e la valutazione dello score clinico dei segni di malattia fino alla fine del trattamento. Tale valutazione clinica à ̈ stata effettuata da un osservatore ignaro del trattamento in accordo al seguente punteggio: 0=no malattia, 1= coda flaccida, 2= paraparesi moderata, 3= paraparesi severa, 4=tetraparesi, 5= morte.
Gli animali sono stati trattati a partire dal giorno 0 per via orale rispettivamente con P.M.F. alla dose di 2-4-8 g/kg e con il suo veicolo (acqua). Dopo 21 giorni, il trattamento con S.C.F. ha protetto dai segni clinici di malattia mentre i topi, trattati con il solo veicolo, hanno raggiunto il 50% di incidenza.
UTILIZZO DI P.M.F. NELLA PROFILASSI DEL DIABETE DI TIPO I IN TOPI C57/BL6 PER VIA ORALE
Sono stati utilizzati topi C57 BL6 maschi di 6-7 settimane trattati con veicolo o streptozotocina 40 mg/kg ogni giorno per 5 giorni. La streptozotocina à ̈ un tossico per le cellule beta pancreatiche e le porta a degenerazione, provocando quindi diabete. La glicemia à ̈ stata valutata una volta alla settimana fino al giorno 35 dall’ultima somministrazione di streptozotocina.
Gli animali sono stati trattati con diluente (acqua) o P.M.F. per via orale alla dose di 2-4-8 g/kg per 15 giorni a partire dall’ultima dose di streptozotocina. Gli animali trattati con diluente sviluppavano diabete con aumento della glicemia a partire dal giorno 14 dopo l’ultimo trattamento con streptozotocina, mentre gli animali trattati con P.M.F. rimanevano liberi da malattia.
Tutti i modelli sopra riportati sono stati studiati per le cellule staminali: essi dimostrano che P.M.F. ricco degli stessi fattori secreti dalle staminali, si assimila alla loro attività nel ruolo di modulatore dell’attività delle cellule residenti e nel favorire l’eventuale riparazione anche dei danni anatomici.
LESIONE MECCANICA ALLA CODA DEL SUINO: TERAPIA INTRADERMICA
La legatura della coda del suino produce una necrosi a valle della coda stessa. Il modello sperimentale prevede l’iniezione a monte di: 1) Fisiologica, 2) fisiologica P.M.F.,3) matrigel P.M.F.
Dopo iniezione di fisiologica, a monte della lesione, le code cadono in 24/48 ore. Dopo 15 giorni dall’iniezione, a monte della lesione, di fisiologica P.M.F., le code non cadono, cominciano a crescere ma non in condizioni ottimali, soprattutto nei tratti distali alla lesione si notano lesioni necrotiche, non si ha crescita delle setole. Dopo 15 giorni dall’iniezione, a monte della lesione, di Matrigel P.M.F. le code sono ritornate perfettamente normali.
L’esame istologico dimostra che negli animali trattati non si osservano alterazioni dei fasci nervosi e la muscolatura, il derma e la vascolarizzazione appaiono conservati Le sezioni di coda degli animali non trattati, oltre ad avere un diametro circa la metà di quello degli animali trattati, mostra un’estesa sclerosi, con totale atrofia della componente muscolare. Si nota inoltre che le arterie sono completamente ostruite da placche intimali.
Claims (5)
- RIVENDICAZIONI 1. Composizioni comprendenti citochine, fattori di crescita e RNA isolati da siero, placenta e colostro, per la riparazione tissutale, in particolare per la terapia di lesioni della cute, della cartilagine, dell’osso, dei tendini, dei muscoli (lisci e striati), dei legamenti, del tessuto connettivo, rene, pancreas, cornea e del tessuto nervoso.
- 2. Composizioni secondo la rivendicazione 1 comprendenti Basic FGF (fibroblast growth factor), TGF-beta1 (transforming growth factor): IGF-1 (insulin-like growth factor), NGF (nerve growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), VEGF (vascular endothelial growth factor), GM-CSF (human granulocyte colony-stimulating factor), LIF SCF (stem cell factor), SDF-1 (stromal derived factor-1), IL-2, IL-6, IL-9, IL-12, IL-15, IL-17, INF-gamma (gamma interferon), TNF (tumor necrosis factor), IL1-ra, IL10, Eotaxina, IP-10, MCP-1, RNA.
- 3. Composizioni secondo la rivendicazione 1 o 2 ottenute da siero di mammiferi.
- 4. Composizioni secondo la rivendicazione 1 o 2 ottenute da placenta.
- 5. Composizioni secondo la rivendicazione 1 o 2 ottenute da colostro.
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