ITMI20111488A1 - Formulazioni comprendenti saccharomyces boulardii e superossido dismutasi (sod) per controllare l'obesita' - Google Patents

Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:

“FORMULAZIONI COMPRENDENTI SACCHAROMYCES BOULARDII E SUPEROSSIDO DISMUTASI (SOD) PER CONTROLLARE L’OBESITÀâ€

La presente invenzione riguarda formulazioni utili come supplemento alla dieta contenenti il lievito probiotico Saccharomyces boulardii e l’enzima antiossidante superossido-dismutasi. Le formulazioni dell’invenzione sono utili per ridurre il rischio di sviluppare la sindrome metabolica correlata all’obesità.

Stato dell’arte

L’obesità à ̈ definita come una condizione di eccesso di grasso corporeo ed à ̈ associata ad un elevato numero di disfunzioni, tra cui malattie cardiovascolari (CVD) e diabete mellito non insulino-dipendente (NIDDM).

La prevalenza di obesità e sovrappeso negli adulti, bambini e adolescenti à ̈ cresciuto rapidamente negli ultimi 30 anni e continua ad aumentare, portando ad elevati costi sociali.

L’obesità à ̈ generalmente vista come il risultato di una combinazione di un eccessivo apporto energetico e di uno stile di vita sedentario ma, pur essendo questi fattori naturalmente importanti, più recentemente, à ̈ stato suggerito che esiste un’influenza di una flora intestinale sub-ottimale (Tennyson CA, Friedman G. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 2008 Oct;15(5):422-7), mentre le complicanze metaboliche sistemiche sono ricondotte alla infiammazione sistemica di basso grado che si instaura negli obesi (Fantuzzi G., J Allergy Clin. Immunol. 2005;115:911-919, Bàckhed F, Ding H, Wang T, PNAS 2004;101:15718-15723).

Inoltre, à ̈ stato descritto che alcune specie di batteri, come i batteri produttori di acido lattico come le specie L. gasseri, L. casei o L. acidophilus sono capaci di ridurre l’aumento di peso nei ratti nutriti con una dieta ricca di carboidrati (Kang JH, Yun SI, Park HO, J Microbiol. 2010 Oct;48(5):712-4. Epub 2010 Nov 3).

A supporto di questi studi, sono stati descritti prodotti contenenti batteri probiotici appartenenti ai generi Lactobacillus e Bifidobacterium, capaci di prevenire o curare disfunzioni metaboliche derivanti dall’obesità (WO 2010146568; WO 2010091992; US 2008267933).

Ad oggi, oltre alle ben descritte proprietà dei batteri probiotici, ci sono molti articoli di letteratura scientifica che descrivono alcuni effetti benefici sulla salute dovuti alla somministrazione di un lievito probiotico: ad esempio à ̈ descritta l’inattivazione della tossina A del Clostridium difficile da parte del lievito Saccharomyces boulardii (Castagliuolo I, Riegler MF, Valenick L, LaMont JT, Pothoulakis C.-Infect Immun. 1999 Jan;67(1):302-7) oppure l’efficacia del Saccharomyces boulardii nel prevenire la diarrea causata da terapia antibiotica oppure provocata da infezioni di patogeni intestinali (Surawicz CM, Elmer GW, Speelman P, McFarland LV, Chinn J, van Belle G.-Gastroenterology. 1989 Apr;96(4):981-8; McFarland LV- World J Gastroenterol. 2010 May 14;16(18):2202-22).

L’enzima superossido dismutasi (SOD) somministrato per via parenterale si à ̈ dimostrato efficace in diverse patologie a carattere infiammatorio (Carroll IM, et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2007 Oct;293(4):G729-38; Oku T, et al. Inflamm Bowel Dis. 2006 Jul;12(7):630-40) riducendo la formazione di radicali liberi ed il danno tissutale.

Nonostante la numerosità e l’approfondimento degli studi, non à ̈ mai stato studiata né proposta una composizione a base di lieviti probiotici, capaci di prevenire o contrastare l’obesità e le patologie ad essa correlate.

Descrizione dell’invenzione

La presente invenzione riguarda una composizione contenente un lievito probiotico e un antiossidante, utile per ridurre il rischio di sviluppare l’obesità e la sindrome metabolica ad essa correlata.

Il lievito probiotico presente nella composizione, in grado di ridurre il rischio di sviluppare la sindrome metabolica correlata con l’obesità, appartiene al genere Saccharomyces e più preferibilmente à ̈ alla specie Saccharomyces cerevisiae var. boulardii (di seguito denominato Sb).

La sostanza antiossidante, usata in combinazione con il lievito probiotico Sb, appartiene alla classe di enzimi antiossidanti e più preferibilmente à ̈ l’enzima superossido-dismutasi (di seguito denominato SOD).

Preferibilmente, la SOD à ̈ in forma gastroprotetta per mezzo di tecniche ed eccipienti convenzionali. La dose efficace di lievito probiotico à ̈ compresa tra 10<6>e 10<9>unità formanti colonia (UFC) per somministrazione giornaliera, preferibilmente circa 10<7>UFC mentre la dose efficace di SOD à ̈ compresa fra 1 e 100 mg, preferibilmente fra 2 e 50 mg, più preferibilmente fra 5 e 20 mg al giorno. È particolarmente preferita una dose di circa 10 mg al giorno.

Il lievito e la SOD potranno anche essere somministrati simultaneamente, separatamente o sequenzialmente: in tal caso, i due ingredienti attivi potranno non essere associati in una singola unità di dosaggio e potranno eventualmente rientrare in un prodotto in forma di kit comprendente forma di dosaggio separata per i due ingredienti attivi.

L’efficacia del supplemento alla dieta fornito nella presente invenzione à ̈ stata valutata seguendo delle proprietà fisiche come il peso, l’accumulo di grasso addominale e l’assunzione di cibo e misurando alcuni parametri biochimici quali la glicemia e il livello di citochine pro-infiammatorie.

L’efficacia della composizione dell’invenzione come supplemento alla dieta à ̈ stata sperimentata su un modello murino di obesità non genetica ottenuto in topi maschi della linea C57BL/6, che hanno ricevuto dall’età di 4 settimane una dieta normale o ipercalorica supplementata giornalmente da Sb e SOD o con il solo veicolo.

Nel corso delle 9 settimane di somministrazione del supplemento alla dieta sono stati valutati ogni settimana il peso corporeo e la quantità di cibo assunto.

Al termine del periodo di somministrazione, gli animali sono stati sottoposti al test di tolleranza al glucosio a seguito di un digiuno notturno; altri animali sono stati sacrificati per la raccolta del sangue periferico necessario alla determinazione quantitativa delle citochine circolanti e per misurare il grasso addominale accumulato.

L’invenzione à ̈ descritta in maggior dettaglio nei seguenti esempi.

Esempio 1: Peso corporeo, assunzione di cibo e regolazione del grasso corporeo.

Al fine di valutare l’efficacia del supplemento alla dieta costituito dalla composizione di Sb e SOD nella regolazione delle proprietà fisiche influenzate dall’obesità, topi maschi C57BL/6 (15,2 0,3 g) di 4 settimane sono stati suddivisi in gruppi randomizzati a cui à ̈ stata somministrata una dieta normo-calorica (77% carboidrati, 19% proteine, grassi 4%) o iper-calorica (VHF, 21% carboidrati, 19% proteine, grassi 60%), in presenza o assenza di un supplemento giornaliero costituito da 10<7>UFC di Sb (somministrato mediante sonda gastrica) e/o 10 mg di SOD estratta da lievito, purificata e resa gastro-resistente mediante microincapsulazione fino ad un’attività specifica di 180000 U/g e integrata nel cibo. È comunque evidente che altri metodi di gastro-protezione quali ad esempio il supporto film di gliadina, o altre tecniche equivalenti, produrrebbero lo stesso effetto e sono quindi da considerare equivalenti ai fini della presente invenzione.

Dieta e supplementi alimentari sono stati somministrati continuativamente per un totale di 9 settimane.

L’assunzione di cibo degli animali (Tabella) e il peso corporeo sono stati monitorati settimanalmente, mentre l’accumulo di grasso viscerale à ̈ stato quantificato dopo 9 settimane di integrazione della dieta.

Al termine del periodo sperimentale, gli animali sono stati sacrificati, il grasso addominale accuratamente raccolto, pesato e poi fissato in formalina per il successivo esame istologico (Figura 2a).

La supplementazione dietetica con Sb SOD, ma non con Sb da solo, riduce in maniera significativa l’incremento ponderale legato all’assunzione della dieta ipercalorica (Figura 1). Inoltre, risulta significativamente ridotto l’accumulo di tessuto adiposo a livello addominale sia negli animali che hanno ricevuto solo Sb sia in quelli che hanno ricevuto Sb in associazione con SOD (Figura 2 e 2a).

Tabella

Dieta Supplemento<Cibo ingerito al>Calorie ingerite algiorno per topo (g)giorno per topo (kcal) Normo-caloricano 3,20 10,89 Ipercalorica no 4,76 28,71 Ipercalorica Sb 2,00 12,08 Ipercalorica Sb SOD 2,00 12,05

Esempio 2: Regolazione dei parametri biochimici nell’obesità.

Al fine di valutare l’efficacia del supplemento alla dieta costituito dalla

composizione di Sb e SOD nelle complicanze metaboliche associate

all’obesità trascorse le 9 settimane di esperimento dell’esempio 1, i topi sono

stati sottoposti sia ad un test di carico orale di glucosio che allo studio della

cascata dei segnali indotti dall’insulina in un organo bersaglio (fegato).

Per eseguire il test orale di tolleranza al glucosio, dopo 18 ore di

digiuno à ̈ stata determinata la glicemia prima della somministrazione di un

carico orale di glucosio (2 mg / g di peso corporeo).

Successivamente, Ã ̈ stata misurata la glicemia ogni 30 minuti fino a

120 minuti ed à ̈ stata calcolata la tolleranza al glucosio come l’area sotto la

curva (AUC) (Figura 3a e Figura 3b).

Per valutare lo stato funzionale della cascata dei segnali

indotti dall’insulina, à ̈ stato somministrato ai topi un carico di insulina per

via intraperitoneale (10U/Kg peso). In questo caso gli animali sono

stati sacrificati 5 minuti più tardi e campioni di fegato sono stati raccolti e

congelati.

Dai campioni di fegato sono state estratte le proteine totali e sottoposte

ad analisi di immunoblotting per valutare il livello di fosforilazione della proteina IRS1 (Insulin Receptor Substrate 1) (Figura 4).

In condizioni normali il legame dell’insulina al suo recettore causa la fosforilazione della proteina IRS1 sul residuo Tyr941 mentre in caso di sindrome metabolica associata all’obesità tale segnale à ̈ ridotto.

La supplementazione con Sb o Sb SOD utilizzando le stesse preparazioni e le stesse dosi dell’Esempio 1 ha ridotto l’entità dell’iperglicemia post-carico di glucosio che si associa alla obesità (Figura 3a e 3b). La co-somministrazione di Sb e SOD ha causato una riduzione più marcata della iperglicemia post-carico. La supplementazione dietetica nei topi obesi con Sb e SOD ripristina la fosforilazione di IRS1 sul residuo Tyr941 in risposta ad un carico glicemico, correggendo pertanto la insensibilità dei tessuti bersaglio all’insulina (Figura 4).

Esempio 3: Infiammazione sistemica causata dall’obesità.

Al fine di valutare l’efficacia del supplemento alla dieta costituito dalla composizione di Sb e SOD sull’infiammazione sistemica, una condizione comune nei soggetti obesi, a seguito della supplementazione alimentare durata 9 settimane, à ̈ stato prelevato un campione di sangue circolante utilizzato per misurare i livelli circolanti della citochina proinfiammatoria (TNFα) e di un’adipochina (leptina). Il dosaggio à ̈ stato eseguito sul siero mediante saggio ELISA (Figura 5 e Figura 6).

Nel caso di animali obesi si osserva un aumento dei livelli circolanti di TNFα e di leptina che contribuiscono allo sviluppo delle complicanze sistemiche. La supplementazione dietetica con Sb o con Sb SOD utilizzando le stesse preparazioni e le stesse dosi dell’Esempio 1 riduce in maniera significativa i livelli circolanti di TNFα e di leptina (Figura 5 e Figura 6).

Esempio 4: Stato infiammatorio della mucosa intestinale nell’obesità. Al fine di valutare l’efficacia del supplemento alla dieta costituito dalla composizione di Sb e SOD sulla condizione infiammatoria della mucosa associata ad obesità dopo 9 settimane di supplementazione alimentare, gli animali sono stati sacrificati per la raccolta di un segmento di ileo. I segmenti intestinali sono stati omogenati in tampone fosfato addizionato di un cocktail di inibitori delle proteasi per l’estrazione delle proteine totali. L’omogenato à ̈ stato centrifugato a 13000x g per 10 min a 4°C ed il surnatante chiarificato à ̈ stato utilizzato per quantificare le citochine pro-infiammatorie IL1-β e TNF-α mediante saggio ELISA. I livelli di citochine sono stati normalizzati ai livelli di proteine totali determinati con saggio Bradford.

Nel caso di soggetti obesi si osserva un aumento dei livelli di IL1-β e TNFα nella mucosa intestinale, che contribuiscono allo sviluppo delle complicanze sistemiche. La supplementazione dietetica con Sb o la co-somministrazione di Sb e SOD utilizzando le stesse preparazioni e le stesse dosi dell’Esempio 1 induce una riduzione significativa di entrambe le citochine (Fig. 7 ed 8). Appare evidente dalle figure 7 ed 8 che solo la cosomministrazione di Sb e SOD riporta IL1-β e TNFα nella mucosa intestinale a valori paragonabili ai topi controllo.

Claims (6)

1. RIVENDICAZIONI 1. Una composizione contenente Saccharomyces cerevisiae var boulardii e l’enzima superossido dismutasi.
2. 2. Una composizione secondo la rivendicazione 1 in cui la superossidodismutasi à ̈ in forma gastroprotetta.
3. 3. Una composizione secondo la rivendicazione 1 o 2 in forma di kit adatta per la somministrazione simultanea, separata o sequenziale.
4. 4. La composizione della rivendicazione 1, 2 o 3 per l’uso come supplemento alimentare.
5. 5. La composizione delle rivendicazioni 1 o 2 per l’uso nella prevenzione o riduzione del rischio di sviluppare disfunzioni metaboliche correlate all’obesità.
6. 6. La composizione delle rivendicazioni 1 o 2 per l’uso nella riduzione dell’incremento di peso, per la riduzione dell’assunzione di cibo, per la riduzione dell’accumulo di grasso corporeo, per il miglioramento della condizione di infiammazione sistemica associata all’obesità. Milano, 3 agosto 2011