ITMI20101054A1 - Composizioni e sistemi di sequestro ed immunodisattivazione di nichel e cobalto - Google Patents

Composizioni e sistemi di sequestro ed immunodisattivazione di nichel e cobalto Download PDF

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ITMI20101054A1
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Description

D E S C RI Z I O N E
Annessa a domanda di brevetto d’INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo:
COMPOSIZIONI E SISTEMI DI SEQUESTRO ED IMMUNODISATTIVAZIONE DI NICHEL E COBALTO
CAMPO DELL’INVENZIONE
L’invenzione si riferisce a composizioni ad uso locale per la prevenzione dei fenomeni di sensibilizzazione da metalli immunogenici come nichel e cobalto.
STATO DELL’ARTE
L’esposizione a nichel e cobalto, con i cromati, costituisce un’ importante fonte di allergia. Il fenomeno si manifesta come lichen planus orale nel caso di allergie stomatologiche, o di una dermatite eczematosa in caso di contatto cutaneo nel quale compare eritema, desquamazione, vescicole ripiene di liquido chiaro tendenti a formare crosticine. Spesso le persone affette da dermatite da contatto presentano altre malattie allergiche (es. asma o rinite allergica) o hanno storia familiare di allergia. Da un punto di vista clinico, la sintomatologia cutanea da allergia al nichel e al cobalto (dermatite da contatto o orticaria) si accentua durante la stagione estiva e nei climi caldo-umidi. In seguito all’aumentata sudorazione i metalli immunogenici vengono infatti liberati più facilmente dagli oggetti che contengono questi metalli, ad es. la bigiotteria. Nei soggetti allergici al nichel o al cobalto con dermatite, orticaria o lichen planus orale l’assunzione tramite alimenti e/o contatto con oggetti contenenti questi metalli possono aggravare le corrispondenti sintomatologie in atto.
Le ricerche di Rui e coll. (Contact Dennatitis. 2010;62(4):225-31 eseguite su quasi 15000 soggetti con dermatite da contatto evidenziano circa 25% dei pazienti reattivi al nichel solfato, 10% al cobalto cloruro, con un restante 8,7% al potassio dicromato. Diversi dermatologi, tra cui Schram e coll. (Int J Dermatol. 2010;49(2): 115-25) evidenziano come l’effetto allergenico di questi metalli sia preoccupante ed in fase di incremento.
Le cellule dendritiche primarie umane sono un modello in vitro di cellule di Langerhans, che ne costituiscono la variante tissutale specifica di cute e mucose sensibili ai metalli immunogenici. Il riconoscimento dell’antigene metallico da parte del TCR (T Celi Receptor) dei linfociti T (segnale 1) è funzionale alla maturazione di una risposta immune quando avviene a livello della membrana di una cellula presentante Γ antigene e fornisce un ulteriore segnale (segnale 2, o costimolo) fondamentale per la definizione del tipo di risposta (umorale, cellulare, ec). Sia B7.1 che B7. 2 (collettivamente: B7) sono glicoproteine di membrana presenti sulla superficie di cellule a presentazione antigenica (cellule dendritiche, cellule di Langerhans, monociti/macrofagi, cheratinociti) e agiscono come costimoli. Infatti, entrambe sono ligandi della glicoproteina denominata CD28 presente sulla membrana del linfocita T. L’innesco del sistema ligando/recettore CD28/B7 previene l’apoptosi delle cellule T e coopera nel sostenere la loro proliferazione e differenziazione.
Nelle prime fasi della risposta immune B7.2 è espresso costitutivamente e modula sia le risposte Thl che Th2. Con il progredire della risposta immune, anche B7.1 è sovra-regolata e incrementa l’intensità del segnale costimolatorio, con espansione delle cellule T e produzione di varie citochine. B7.1, inoltre, è sovra-regolato durante la fase acuta delle risposte autoimmuni ed è segno di attivazione di una risposta immunitaria.
Tra i rari esempi di sforzi rivolti alla risoluzione del problema nel settore della cosmesi è il brevetto EP1175896 di ICIM srl (Garbagnate, Italia) nel quale si rivendica l’uso di materiali a concentrazione quasi nulla di nichel tali da creare prodotti cosmetici ipoallergenici.
Un altro esempio è il brevetto EP1902755 di Cognis (D), che rivendica l’utilizzo di sostanze quali piperina, silibina, nortrachelogenina e rapontina per attenuare od eliminare il rilascio di GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) indotto dai sali di nichel. A titolo informativo si cita inoltre il brevetto FR2838055 che rivendica la modulazione dell’attività pro-infiammatoria e allergenica del nichel mediante estratti di Theobroma cacao. Rimane pertanto inevasa la necessità di sistemi utili alla prevenzione dei fenomeni allergici causati dal contatto con prodotti cosmetici contenenti questi metalli piuttosto che dal contatto con oggetti metallici (monili, monete, telefonini, ecc.) ed apparecchi protesici in grado di rilasciare nichel o cobalto al contatto con pelle e mucose.
SOMMARIO
Si è trovato che alcuni polimeri sono utilmente impiegabili in prodotti topici o di igiene orale per mascherare la presenza di metalli immunogenici, in particolare nichel e cobalto, sottraendoli dal contatto col sistema immunitario di soggetti sensibilizzati.
Un oggetto dell’invenzione è una composizione per la detossicazione di nichel e/o cobalto comprendente un polimero azotato veicolato da eccipienti fisiologicamente accettabili.
Un ulteriore oggetto dell’invenzione è un metodo di prevenzione dell’elicitazione allergica da metalli applicabile a formulazioni cosmetiche, di igiene orale o di dispositivo medico.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA
L’invenzione si riferisce in particolare a nichel(II) e cobalto(II), e tuttavia lo spettro di azione può essere allargato ad altri “metalli immunogenici”. Questa definizione indica le specie metalliche in grado di elicitare reazioni allergiche per attivazione di cellule di Langherans, T-linfociti e/o mediate da Ig-E come descritto in Allergy 2000;55:108-15 quali le comprendono, oltre aNi(II) e Co(II), anche le specie Cr(III), Cu(II), Pd(II) e Ru(III).
Il termine “polimeri” come utilizzato in questo contesto sta ad indicare sostanze ad alto peso molecolare in forma lineare oppure reticolata sia in forma di idrocolloidi che di particelle solide, queste ultime altresì note come “resine”.
Nelle formule a seguire il simbolo P sta indicare polimeri a peso molecolare > 5000 dalton al quale sono connessi i gruppi funzionali indicati nei prodotti esemplificativi.
Polimeri con funzionalità iminodi acetato
Sono composti di formula generale (I):
Esempi di tali polimeri includono: Amberlite™ IRC748 da Rohm&Haas-Dow; Diaion™ CRI 1 da Mitsubishi-Resindion; Lewatit™ TP 207 da Lanxess GmbH; QuadraPure™ IDA da Reaxa Ltd (Manchester, UK); Chelex 100 e Chelex 20 da Bio-Rad (Sigma- Aldrich cat. N. C7901); IDA-agarose (Sigma-Aldrich cat. N. 14758) e IDA-coupled Sepharose™ Fast Flow da GE Healthcare; Purolite™ S930 Plus da Purolite International (Baia Cynwyd, PA, USA); Dionex ProPac IMAC-10™ da Dionex Corp.
Altri polimeri iminodiacetati sono ottenuti per modificazione di polimeri, ad es. con linker glicidile come illustrato da Qaykara T e coll. (Mater Scien Engin. C, 2009; 29:20-4.
Polimeri con funzionalità tiourea
Sono composti di formula generale (II):
Esempi di tali polimeri includono: Lewatit™ MP 500 da Lanxess AG (Germania); Purolite™ S920 da Purolite Int.; QuadraPure™ TU da Reaxa Ltd.
Polimeri con funzionalità amino(m)etil fosfonato
Sono composti di formula generale (III):
Esempi di tali polimeri includono: QuadraPure™ AMPA da Reaxa; Purolite™ S940/950 da Purolite Int. Il corrispondete etil-omologo
Polimeri con funzionalità benzil ammina
Sono composti di formula generale (IV):
Esempi includono: QuadraPure™ BzA da Reaxa Ltd.
Polimeri con funzionalità amminica
Sono composti di formula generale (V):
Esempi di tali polimeri includono: QuadraPure™ EDA da Reaxa Ltd; Purolite™ S985 da Purolite Int; Dianion™ CR20 da Mitsubishi-Resindion.
Polimeri con funzionalità imidazolica
Sono composti di formula generale (VI):
Esempi di tali polimeri includono: QuadraPure™ BdZ da Reaxa Ltd.
Polimeri con funzionalità mercaptofenil ammina
Sono composti di formula generale (VII):
Esempi di tali polimeri includono: QuadraPure™ MPA da Reaxa Ltd.
Polimeri con funzionalità imidazol-l-il propilammina
Sono composti di formula generale (Vili):
Esempi di tali polimeri includono: QuadraPure™ IMIDAZ da Reaxa Ltd.
Polimeri con funzionalità bis(2-picolillammina
Sono composti di formula generale (Vili):
Esempi di tali polimeri includono: Dowex™ M4195 da Dow.
In un ambito preferito i polimeri utili secondo gli scopi dell’invenzione sono le resine utilizzate in diversi ambiti industriali per la captazione di metalli pesanti e di transizione. Polimeri con funzionalità idrossilammina
Sono composti di formula generale (X):
I poliidrossammati sono ottenibili per funzionalizzazione di polimeri naturali o sintetici.
Esempi di poliidrossammati da polimeri naturali sono gli idrossammati collageno-mimetici (Kinberger GA, Inorg Chem. 2006; 45(3):961-3), idrossammati pectinici (Yang SJ, Agric Food Chem. 2004, 30;52(13):4270-3), idrossammati (poli)N-acriloil-p-alanina (WO/1986/000891), ecc. e ibridi (Lutfor e coll. J Appi Polym Science. 2001, 79(7): 1256-64).
La funzionalizzazione può inoltre avvenire su polimeri naturali idrossilati come idrossammati chitosan succinato (Aiedeh K Eur J Pharm Sci 2001; 13(2): 159-68); idrossammati chitosan acido α-ketoglutarico (Ding PJ Hazard Mater. 2007; 146(1 -2):58-64); e glicina idrossammato guaran (Ahuja M, e coll. Carbohydrate Polym, 1997; 33(1), 57-62).
Altri idrossammati sono ottenibili per funzionalizzazione di polimeri con gruppi carbossilici o loro sintoni quali polimeri N-acrilosssuccinimidici, acriloil cloruro e (2-idrossietil)acrilato (Pradeep K. e coll.. Biomacromolecules, 2005, 6 (6):2946-53). Esempio sono la funzionalizzazione di polimeri quali poli(metilmetacrilato-co-acido metacrilico) (Skaija GA, Biomaterials. 2009, 30(10): 1890-7); n-butilmetacrilato e copolimero vinilico (Nakayama Y, Biomed Mater Res B Appi Biomater. 2007;80(l):260-7); polimero acrilonitriledivinilbenzene (Selvi e coll.. J Appi Polym Scien. 2004; 92(2) 847-55); poli(stirene-co-acido maleico) (Mendez R, e coll.. Eur Polym J. 1996; 32(4), 515-21); metilmetacrilatodivinilbenzene copolimero (A. Varadharaj, J Chem Tech Biotech. 1996, 67(2): 149-52); o i poliacrilati COO-attivati come in US 4,352,871 o Sangita P. J Macromol Scien. Pure Appi Chem. 2006, 43(4-5):735-47.
Altri polimeri azotati oltre a quelli citati sono utilmente impiegabili, ad esempio la resina fùnzionalizzata con gruppi amidoxima Purolite™ S910. Altri esempi sono i polimeri amminotiolici funzionalizzati con cisteine o acido tioglicolico o con reagenti eterobifunzionali come N-succinimdil-3-(piridilditio) propionato o con 2-iminotiolano (reagente di Traut’s).
Ulteriori metodi e relative forme polimeriche utili sono descritte nella review di Bilba e coll, in Croatica Chemica Acta 1998; 71(1), 155-78
Per l’utilizzo nell’ambito inventivo le resine in forma di beads devono essere micronizzate a ridurre le dimensioni iniziali a una polvere a dimensione controllata, preferibilmente < 50 μτη. La quantità del polimero nella composizione della presente invenzione varia tra 5% e 0,005% in peso, preferibilmente tra 1% e 0,01% in peso della composizione, ancor più preferibilmente intorno allo 0,1% in peso della composizione.
La composizione della presente invenzione comprendente i polimeri potrà essere assumere diverse forme cosmetiche, dermatologiche od ontologiche (odontostomatologiche) con eccipienti/ingredienti compatibili tali da garantire un profilo di beneficio/rischio accettabile. Le composizioni ad uso topico potranno assumere le varie forme applicative cosmetiche o medicinali topiche incluse pomate, creme, unguenti, gel, lipogel, tinture, latti, schiume, stick, ed emulsioni di vario tipo: A/O, O/A e multifasiche.
Le composizioni ad uso cosmetico o medicinale conterranno eccipienti fisiologicamente accettabili, es. gli ingredienti descritti INCI-CTFA dell’Annex 93/35/ECC e/o gli eccipienti delle Farmacopee intemazionali e possono essere formulate secondo numerose pratiche galeniche note, come ad es. quelle descritte in “Remington: The Science and Practice of Pharmacy” (20th ed.), ed. Gennaro AR, Lippincott Williams & Wilkins, 2000.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione è un metodo di prevenzione dell’elicitazione allergica da metalli, in particolare nichel e cobalto, applicabile a qualsiasi formulazione cosmetica o dispositivo medico per applicazione topica in commercio o in sviluppo.
Detto metodo consiste nell’ introdurre nella composizione un polimero scelto nel gruppo comprendente quelli a funzionalità iminodiacetato, tiourea, aminometil fosfonato, benzil ammina, amminica, imidazolica, mercaptofenil ammina, imidazol-l-il propilammina, bis(2-picolil)ammina e idrossilammina come descritti in precedenza in quantità preferibilmente compresa tra 1% e 0,01% in peso della composizione mediante tecniche note.
La composizione per uso odontologico potrà assumere la forma di coluttorio, dentifricio, dentifricio liquido, gel, film, gel su film, granuli, paste da denti, polvere dentale, pasta profilattica, e gomma da masticare nelle varie presentazioni di confetteria dentale.
Il termine “colluttorio” comprende composizioni orali non-ingeribili sostanzialmente liquide come soluzioni colluttorie idroalcoliche, spray ed altri prodotti da risciacquo.
Il termine “dentifricio” comprende composizioni concepite per la pulizia dentale come dentifrici mono- e multi-fase o liquido, polvere per denti, tavolette, creme e gel dentali.
Il termine “gomma da masticare” comprende tavolette masticabili, losanghe ed altre modalità generalmente classificate sotto la voce “chewing gum”.
Altre forme dei dispositivi come “gel”, “film”, “gel su film”, “granuli”, “pasta da denti”, “polvere dentale”, “pasta profilattica” comprendono preparati spalmabili e/o applicabili sui denti e/o sulla mucosa del cavo orale direttamente o tramite supporto esterno.
Le composizioni potranno contenere svariati ingredienti utilizzati nel settore dei preparati dentali ed ondontologici, che comprendono: agenti anti-carie, agenti desensibilizzanti, viscosizzanti ed agenti reologici, diluenti, tensioattivi ed emulsionanti, schiumogeni, tamponi, abrasivi, umettanti, modificatori di gusto, dolcificanti, aromi, coloranti, conservanti e loro combinazioni. Esempi di tali questi ingredienti sono illustrati in US 2006134020.
In un ulteriore ambito della presente invenzione le composizioni odontologiche potranno essere combinate con polimeri citati nelle concomitanti co-applicazioni IT2009MI02147 (04/12/2009) o IT2010MI00196 (10/02/2010) in modo da garantire la simultanea detossicazione dal cavo orale (oltre che del nichel e cobalto) del mercurio, oro, palladio ed altri metalli pesanti ad azione immunogenica.
Una vasta gamma di composizioni e realizzazioni secondo l’invenzione possono essere realizzati mediante metodi noti agli specialisti nel settore. Gli esempi seguenti illustrano difatti alcune modalità esecutive dell’invenzione, non essendo intesi a limitarne gli scopi.
ESEMPI
Esempio biologico 1 - Valutazione della capacità di soppressione immunogenica dei polimeri azotati sull’ atività allergizzante del nichel
Nel modello in vitro si valuta la capacità di attenuazione di attività pro-sensibilizzante mediante un modello di reattività immunologica con cellule dendritiche a presentazione di antigene esposte a contatto prolungato (48h) con nichel e con nichel in presenza di un polimero azotato scelto tra quelli indicati in precedenza.
Il test avviene su cellule dendritiche immature derivate da monociti di sangue periferico di donatore valutando la modulazione dell’espressione di due citochine CD80 (B7.1) e CD86 (B7.2) confrontando la risposta del nichel solfato da solo ed in presenza dei polimeri azotati. Dopo l’esposizione le cellule sono esaminate con colorazione di Tripan Blue e osservazione microscopica in camera conta-globuli per la vitalità, raccolte, lavate in un tampone isotonico (PBS) e marcate con un anticorpo fluoresceinato diretto contro B7.1 o B7.2. Dopo ulteriori lavaggi per asportare l’anticorpo in eccesso, le cellule sono immesse in un citofluorimetro di flusso (FACS, Fluorescence Activated Celi Sorter, Becton Dickinson, Mountain View, CA) per la valutazione della MFI, proporzionale al n. di molecole marcate per cellula e rappresentativo del livello di espressione delle molecole costimolatorie.
Si rilevano inoltre i parametri qualitativi morfologici (alterazione del volume cellulare, modificazioni delle granulazioni) legati a necrosi cellulare e apoptosi connessi al processo di elicitazione allergica.
Come controllo (fluorescenza di base) è stata valutata la MFI sia di cellule dendritiche non trattate (tranne i lavaggi in PBS) che di cellule dendritiche reagite con anticorpo monoclonale fluoresceinato (anti-B7.1 e anti-B7.2) ma di specificità irrilevante (isotype-matched control). La Tabella I illustra i risultati preliminari e tipicamente ottenibili con l’utilizzo di resine resina azotate del tipo sopra specificato.
MFI = Mean Fluorescence Intensità, media geometrica di intensità di fluorescenza delle
cellule colorate con anticorpo fluoresceinato, proporzionale al n. di molecole per cellula;<(2)>Diaion™ CR20 (Mitsubishi-Resindion) è resina poliamminica (1,30 meq/g) micronizzata;<(3)>Diaion™ CRI 1 (Mitsubishi-Resindion) è resina imidodiacetica (1,36 meq/g) micronizzata. La presenza di nichel è caratterizzata da incremento di entrambi i marcatori, con prevalenza di CD86; correlazione concentrazione-attività; effetto rilevabile anche a dosi basse. NB La dose di 4 pg/ml di nichel solfato corrisponde a 25 μΜ in vitro e 1 ppm di nichel in situ, valore soglia in soggetti sensibilizzati su cute irritata. Si evidenzia che l’utilizzo delle resine azotate determina un abbattimento della risposta immunitaria sotto la soglia allergizzante.
Esempio biologico 2 - Valutazione della citotossicità dei polimeri azotati
I campioni di resina micronizzata sono sospesi in etanolo e quindi diluiti nel medium di coltura delle cellule a diverse diluizioni e sottoposti a test preliminare di citotossicità su cellule dendritiche per valutarne la citotossicità. Come controllo negativo si considera il terreno di crescita cellulare lasciato nelle stesse condizioni sperimentali.
Si utilizza una linea umana primaria di cellule dendritiche derivate da monociti di sangue periferico di donatore sano coltivate in RPMI 1640 addizionato di FCS (10%) GM-CSF (50 ng/ml) e IL-4 (1000 IU/ml).
Il test MTT utilizza il 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide o MTT, colorato in giallo in soluzione acquosa. La deidrogenasi mitocondriale delle cellule vitali taglia l’anello tetrazolico portando alla formazione di cristalli di formazano viola porpora insolubili in acqua. I cristalli vengono sciolti in isopropanolo acidificato e la soluzione viola risultante è misurata allo spettrofotometro. L’aumento o diminuzione delle cellule vitali ha per risultato il cambiamento nella quantità di formazano prodottosi, quale indicatore del grado di citotossicità causato dall’esposizione alle sostanze testate.
Il terreno per MTT è preparato come descritto da Mossman (J. Immunol. Methods 1993, 65:55-63). Dopo il trattamento, le cellule vengono lavate con PBS e la soluzione MTT è aggiunta ad ogni pozzetto con successiva incubazione a 37°C. Alla termine il terreno-MTT viene rimosso e in ogni pozzetto viene aggiunta la soluzione solubilizzante MTT. La piastra è agitata in piastra per 20-30 minuti fino a solubilizzazione dei cristalli con formazione di una soluzione omogenea. Viene letta Tassorbanza e sottratto il fondo. Il risultato è espresso come: % di sopravvivenza cellulare = (OD cellulte trattate) / (OD cellulte trattate) x 100
Le resine azotate (Diaion™ CR20 e CR 11 da Mitsubishi-Resindion) impiegate a due diverse diluizioni sulle cellule dendritiche nel medium di coltura per 48 h a 37°C in C025% forniscono valori di ottima compatibilità cellulare, compresa tra 90% e 98%.
Esempio formulativo 2 - Crema protettiva ipoallergica
Una crema è preparata fondendo i lipidi della fase A a 85°C, poi solubilizzando i componenti B in acqua e riscaldando alla stessa temperatura, quindi versandovi la fase A sotto agitazione, infine incorporando la resina nella quantità indicata.
Esempio formulativo 3 - Gel buccale
Un gel è preparato sciogliendo e sospendendo in acqua gli ingredienti a seguire.
Esempio formulativo 4 - Gomma da masticare
Gli ingredienti sono setacciati e quindi addizionati alla gomma base, mescolati intimamente e quindi compressi in losanghe del peso di circa 1,2 g ciascuna. La ricetta base è come segue.
Le gomme da masticare ottenute presentano ima buona compattezza e non si attaccano (se non sporadicamente) al punzone, tuttavia tendono a sfaldarsi nella prime fase di masticazione. La gomma diviene accettabile e consistente dopo circa 1 minuto di masticazione.
Esempio formulativo 5 - Collutorio
Un collutorio è preparato per miscelazione progressiva degli ingredienti riportati.
Esempio formulativo 6 - Dentifricio
Si riporta la ricetta di un dentifricio ottenibile per incorporazione degli ingredienti riportati.

Claims (10)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Composizione farmaceutica per la somministrazione per via vaginale comprendente una dose efficace di un principio attivo appartenente al gruppo dell'acido 5-benzoil-2 ,3-diidro- lH-pirrolizin- l-carbossilico, in forma racemica o suoi enantiomeri otticamente attivi, e relativi sali in combinazione con eccipienti o diluenti di uso farmaceutico caratterizzata da livelli plasmatici di principio attivo nell'uomo inferiori a 0.5 mg/L.
  2. 2 . Composizione farmaceutica per somministrazione vaginale secondo la rivendicazione 1 avente attività analgesica ed antiinfiammatoria .
  3. 3. Composizione farmaceutica per somministrazione vaginale secondo la rivendicazione 1 comprendente da 0.5 a 40 mg/dose di principio attivo.
  4. 4. Composizione farmaceutica per somministrazione vaginale secondo la rivendicazione 1 in forma di compressa vaginale.
  5. 5. Composizione farmaceutica per somministrazione vaginale secondo la rivendicazione 1 in forma di una compressa vaginale effervescente.
  6. 6. Composizione farmaceutica per somministrazione vaginale secondo la rivendicazione 1 in forma di ovuli di gelatina molle o di trigliceridi .
  7. 7 . Composizione farmaceutica per somministrazione vaginale secondo la rivendicazione 1 in forma di crema .
  8. 8. Composizione farmaceutica per somministrazione vaginale secondo la rivendicazione 1 in forma di gel.
  9. 9. Composizione farmaceutica comprendente oltre al principio attivo secondo le rivendicazioni 1-8 eventualmente uno o più eccipienti o veicoli farmaceuticamente accettabili.
  10. 10. Uso di una composizione secondo una o più delle rivendicazioni da 1 a 9 per prevenire, trattare e ridurre malattie e/o situazioni dolorose ed infiammatorie dell'area urogenitale.
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