TW201831679A - 體幹細胞用於增加自體吞噬的用途 - Google Patents

Abstract

一種在一個體中增加自體吞噬之方法，包含：辨識出有其需要之個體；以及投予一組成物至該個體，該組成物含有多個尺寸大於2微米且小於6微米之小細胞； 其中該等小細胞包括體幹細胞，其為(i)多潛能性的或全能性的；以及(ii) CD349(+)、CD9(+)、Oct4(+)、Nanog(+)、Lgr5(+)、CD66e(+)、CD133(+)、或CD34(+)。

Description

體幹細胞用於增加自體吞噬的用途

相關申請案之交互參照 本申請案申明於2017年2月6日提申之美國臨時申請案號62/454,979之優先權，在此併入本案以作為參考資料。

本發明係有關於體幹細胞用於增加自體吞噬的用途。

自體吞噬為細胞組成的細胞內降解過程。有三種類型之自體吞噬：巨自體吞噬、微自體吞噬、以及伴護蛋白(chaperone)-介導之自體吞噬。在巨自體吞噬中，細胞質成分在名為自噬體的雙層膜囊泡內被傳送至溶酶體，於該處細胞質成分會被降解並回收。在微自體吞噬中，細胞質成分直接被溶酶體吞噬。在伴護蛋白-介導的自體吞噬中，細胞質成分會與伴護蛋白複合，而轉位橫越溶酶體膜。

自體吞噬在對飢餓的適應性反應中扮演重要角色。亦顯示自體吞噬對神經退化具有保護作用。自體吞噬對其他生物過程如體內恆定和腫瘤發生也很重要。

在一觀點中，於此描述一種在一個體中增加自體吞噬之方法。此方法包括辨識出有其需要之個體；以及投予一組成物至該個體，該組成物含有多個尺寸大於2微米且小於6微米之小細胞；其中該等小細胞包括體幹細胞，其為(i)多功能性的(pluripotent)或全能性的(totipotent)；以及(ii) CD349(+)、CD9(+)、Oct4(+)、Nanog(+)、Lgr5(+)、CD66e(+)、CD133(+)、或CD34(+)。

在某些實施例中，該辨識步驟包括偵測得自該個體之生物樣本中的自體吞噬生物標記物之位準。該生物標記物選自於由LC3、Beclin-1、Atg5、 Atg12、Atg16L1、Atg7、Atg3、Atg10、p62、NBR1、NDP52、以及Nix組成之群組。在一些實施例中，該偵測到的生物標記物位準低於對照組之位準。辨識出之個體有與自體吞噬功能不良相關之症狀。例如，該個體可有癌症、神經退化疾病、感染性疾病或代謝性疾病。

投予至該個體之組成物中的該等小細胞可更包括血小板。例如，75%至85%的該等小細胞為血小板，以及20%至25%的該等小細胞為體幹細胞。在一些實施例中，該組成物含有1千萬至5億個體幹細胞。.

在一些實施例中，該組成物係以包括下列之方法製備：提供含有得自該個體或供應者個體之血液樣本與二價陽離子螯合劑之混合物；於溫度2°C 至12°C 之間儲存該混合物3至72小時，藉以將該混合物分離為上層與下層，其中該上層含有小細胞群；以及收集該上層藉以製備該組成物。每毫米血液樣本1.5至2.0 mg之二價陽離子螯合劑可與血液樣本混合，以獲得該混合物。較佳為，該二價陽離子螯合劑為EDTA。

任擇地，在獲得該血液樣本之前，於該個體或供應者個體中進行增加幹細胞數量之動作。該動作係投予一有效量之褐藻醣膠 (fucoidan)或顆粒細胞-群落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor)。

該製備組成物之方法可進一步包括在收集該上層之後，加入醫藥上可接受之賦形劑至該收集之上層中。此外，該方法更包括在收集上層之後，離心該上層以獲得細胞沉澱物。該沉澱物可進一步清洗，並懸浮於醫藥上可接受之賦形劑中。該醫藥上可接受之賦形劑可為不含二價離子者。在一實施例中，該醫藥上可接受之賦形劑為食鹽水溶液。

在一些實施例中，該方法更包含在投藥步驟之後，偵測得自該個體之生物樣本中的自體吞噬生物標記物之位準。

在另一觀點中，於此係描述一種在一個體中增加自體吞噬之組成物。該組成物包含多個尺寸大於2微米且小於6微米之小細胞，其中該等小細胞包括體幹細胞，其為(i) 多功能性的(pluripotent)或全能性的(totipotent)；以及(ii) CD349(+)、CD9(+)、Oct4(+)、Nanog(+)、Lgr5(+)、CD66e(+)、CD133(+)、或CD34(+)。

在以下描述中闡述了一或多個實施例的細節。 藉由說明書和附圖以及申請專利範圍，實施例的其他特徵、目的和優點將更臻清楚。

令人意外地發現，含有小體幹細胞(如Lgr5(+)或CD349(+)細胞)之組成物，可增加個體中LC3(一種自體吞噬生物標記物)之位準。因此，於此描述在一個體中增加自體吞噬之方法與組成物，並用於治療與自體吞噬缺失相關之疾病。體幹細胞

有各種類型的體幹細胞，包括全能幹細胞(totipotent)、多功能(pluripotent)幹細胞、多潛能(multipotent)幹細胞和前驅(progenitor)幹細胞(也稱為單潛能(unipotent)幹細胞)。分裂球樣幹細胞(BLSCs)為全能或多功能(pluripotent)體幹細胞。非常小胚胎樣幹細胞(VSEL)為多功能(pluripotent)體幹細胞。SB細胞為多功能(pluripotent)幹細胞或多潛能(multipotent)體幹細胞。間充質幹細胞(MSCs)和造血幹細胞(HSC)為多潛能(multipotent)體幹細胞。

細胞，如幹細胞之尺寸(Z)，如此述可為 (1) 細胞生物學領域或幹細胞領域中，細胞大小或代表性長度的常規定義，(2) 細胞直徑，尤其是當細胞為實質上球形時，(3)細胞主軸長度，尤其是當細胞為實質上橢圓形時 ，(4)細胞的寬度，當細胞形狀接近正方形時，(5) 細胞的長度，當細胞形狀接近長方形時，(6)細胞的最大橫截面或橫向尺寸。尺寸(Z)，不論是直徑、長度、寬度，或最大橫截面或橫向尺寸，可使用如由光學顯微鏡或電子顯微鏡(例如，掃描式電子顯微鏡(SEM))獲得的細胞圖像，或使用由流式細胞儀獲得的細胞數據(例如，二維點、輪廓或密度圖)，測定或測量。從光學顯微鏡或電子顯微鏡獲得的細胞圖像可為細胞的二維(2D)橫截面或三維(3D)結構。作為一範例，細胞尺寸(Z)可經由測量由光學顯微鏡或電子顯微鏡(例如SEM)獲得的2D橫截面圖像中的細胞最大橫截面或橫向尺寸而得。

術語“小細胞” (如小體幹細胞) 係指具有小於6微米(如介於2.0至6.0微米)尺寸之細胞。術語“大細胞”係指具尺寸大於6微米之細胞。

CD349(+) SB細胞或多功能(pluripotent)或多潛能(multipotent)體幹細胞。 CD349(+) SB細胞亦可為CD9(+)、Oct4(+)與Nanog(+)，以及CD133(−)、CD90(−)、CD34(−)與Sox2(−)。CD349(+) SB細胞每一者皆具有尺寸等於或小於4、5或6微米，如介於0.1至6.0微米、介於0.5至6.0微米、介於1.0至6.0微米、介於2.0至6.0微米、介於0.1至5.0微米、介於0.5至5.0微米、介於1.0至5.0微米、介於0.1至4.0微米、介於0.5至4.0微米，或介於1.0至4.0微米。較佳為，該尺寸大於2微米並小於6微米。

Lgr5(+) SB細胞亦為多功能(pluripotent)或多潛能(multipotent)體幹細胞。它們亦可為Oct4(+) 與Nanog(+)，以及CD133(−)、CD66e(−)、CD4(−)、CD8(−)、CD9(−)、CD10(−)、CD11(−)、CD16(−)、CD17(−)、CD18(−)、CD19(−)、CD20(−)、CD21(−)、CD31(−)、CD42(−)、CD63(−)、CD34(−)、Lin(−)、CD38(−)、CD90(−)、CD45(−)、CD349(−)，以及Sox2(−)。Lgr5(+) SB細胞之尺寸等於或小於4、5或6微米，如介於0.1至6.0微米、介於0.5至6.0微米、介於1.0至6.0微米、介於2.0至6.0微米、介於0.1至5.0微米、介於0.5至5.0微米、介於1.0至5.0微米、介於0.1至4.0微米、介於0.5至4.0微米，或介於1.0至4.0微米。較佳為，Lgr5(+) SB 細胞大於2微米並小於6微米。

分裂球樣幹細胞(BLSCs)為CD66e(+) 全能或多功能(pluripotent)體幹細胞。它們可具有尺寸等於或小於4、5或6微米，如介於0.1至6.0微米、介於0.5至6.0微米、介於1.0至6.0微米、介於2.0至6.0微米、介於0.1至5.0微米、介於0.5至5.0微米、介於1.0至5.0微米、介於0.1至4.0微米、介於0.5至4.0微米，或介於1.0至4.0微米。例如，BLSC細胞可具有大於2微米且小於6微米之尺寸。

非常小胚胎樣幹細胞(VSEL)為多功能(pluripotent)體幹細胞，其可為CD133(+) 或CD34(+)。VSEL亦可為CD45(−)與Lin(−)。例如，VSEL可為CD133(+)、CD45(−)與Lin(−)，或CD34(+)、CD45(−)與Lin(−)。VSEL之尺寸可等於或小於4、5或6微米，如介於0.1至6.0微米、介於0.5至6.0微米、介於1.0至6.0微米、介於2.0至6.0微米、介於0.1至5.0微米、介於0.5至5.0微米、介於1.0至5.0微米、介於0.1至4.0微米、介於0.5至4.0微米，或介於1.0至4.0微米。VSEL可具有大於2微米且小於6微米之尺寸。

間充質幹細胞(MSCs)為多潛能(multipotent)體幹細胞。MSC可表現一或多種細胞表面標記物CD13、CD29、CD44、CD73、CD90與CD105。MSCs 組成非常不均一族群。MSCs的某些類型可等於或小於4、5或6微米，如介於0.1至6.0微米、介於0.5至6.0微米、介於1.0至6.0微米、介於0.1至5.0微米、介於0.5至5.0微米、介於1.0至5.0微米、介於0.1至4.0微米、介於0.5至4.0微米，或介於1.0至4.0微米。MSCs的其他類型尺寸可大於6、7 或10微米。

造血幹細胞(HSC)為多潛能(multipotent)體幹細胞。它們可為CD34(+)、cKit(−)、CD38(−)、Lin(−)細胞或CD150(+)、CD244(−)，以及CD48(−)細胞。 HSCs可等於或小於4、5或6微米，如介於0.1至6.0微米、介於0.5至6.0微米、介於1.0至6.0微米、介於0.1至5.0微米、介於0.5至5.0微米、介於1.0至5.0微米、介於0.1至4.0微米、介於0.5至4.0微米，或介於1.0至4.0微米。增加幹細胞的動作

動作(X)使用於此係指例如在人類個體或非人類個體內，可有效增加一或多種類型幹細胞數量的動作。動作(X)可包括： 1. 服用藥物，如合成藥物或衍生自天然物的化合物； 2. 服用草藥或中草藥，如冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)、人參、枸杞子(Lycium Chinense Mill)，靈芝(Ganoderma lucidum)、牛樟芝(Taiwanofungus camphoratus)，及/或巴西蘑菇； 3. 服用營養素或膳食補充劑，如營養片或粉劑，包括以下材料或元素：維生素 (維生素 A、B、B錯合物、B₁₂ 、D、D₃ 、E等)、大量及/或微量礦物質(如鈣、鈉、鉀、氟、溴、鉻、碘、矽、硒、鈹、鋰、鈷、釩，及/或鎳)、多醣體、高分子量含海藻糖之醣蛋白、海藻(包括綠藻、藍藻、褐藻等)、海藻糖、褐藻醣膠(fucoidan)(褐藻的主要成分)、寡褐藻醣膠、藻類、含褐藻糖膠的褐藻(例如在日本沖繩生長和生產的褐藻)、日本水雲(Japanese Mozuku)、綠藻、藍綠藻(或藍藻 )、褐藻(包括海藻、海帶、裙帶菜(undaria)、鹿尾菜(sargassum fusiforme)、裙帶菜(pinnatifida)等)、植物性化學物質(如異黃酮或植物雌激素)、番茄紅素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、綠茶精華、葡萄糖營養素(例如木醣醇、半乳醣、葡萄糖、甘露糖N-乙醯葡萄醣胺、N-乙醯葡萄醣胺或N-乙醯神經胺酸)、魚油、中國香椿(toona sinensis)，及/或由植物、葉片、水果、蔬菜、魚類、海藻或藻類提取的營養物； 4. 實行素食飲食； 5. 攝食或食用健康食品或有機食品； 6. 服用替代(非傳統)藥物； 7. 接受替代療法或治療，如格森療法(Gerson therapy)或布氏癌治療 (Breuss cancer cure)； 8. 接受針灸； 9. 接受按摩如足部按摩； 10. 運動，如散步、慢跑、跳舞、體操、瑜伽、有氧運動，及/或太極拳(Chinese shadow exercise)； 11. 睡覺(用於測量睡眠質量目的)； 12. 沉思； 13. 實行由個人、健康專業人員或醫生設計的健康改善計劃或疾病治療計劃； 14. 服用某些營養素來增進身體某一器官的健康，例如服用番茄紅素來增進前列腺的健康； 15. 採取復健計劃來治癒受傷處，或治癒手術造成的傷口，或治癒疾病； 16. 將一種中藥或多種中藥浸泡在液體或酒中一段時間製成的藥用液(或稱為藥酒、藥用液或藥用酒)，如將人參浸泡在高酒精濃度的米酒中一個月而製成的人參酒； 17. 服用一種或多種由政府部門或主管部門，例如美國食品和藥物管理局(U.S. FDA)批准的藥物，用於治療特定疾病(例如，一種癌症、皮膚病、腎病，及/或其他疾病)； 18. 採取或進行一種或多種由政府部門或主管部門，例如美國食品和藥物管理局(U.S. FDA)批准的療法，用於治療特定疾病(例如，一種癌症、皮膚病、或腎病)； 19. 實行宗教活動，如祈求和平或崇拜上帝； 20. 直接或間接地暴露在陽光或光線下(早晨在日出前10分鐘和日出後50分鐘之間(含有大量紅外(IR)光)；或在中午左右，例如上午11:30到下午12:30之間(含有大量的紫外線)；或者在下午，例如在日落前50分鐘和日落後10分鐘之間(含有大量紅外(IR)光))； 21. 暴露於燈光或發光二極體(LED)光下，其可包括可見光、IR光、紅光、綠光、藍光或UV光的完整光譜)，或一或多種上述光線之結合； 22. 鍛煉或接受用於增進身體自癒力的程序、療法、方法、設備，及/或系統，例如，在受傷或手術後進行的增進自癒力的方法或療法(例如高壓氧療法)； 23. 飲用咖啡如黑咖啡； 24. 飲用茶如綠茶、紅茶或茉莉花茶； 25. 飲用紅酒； 26. 服用褪黑激素； 27. 聆聽音樂，如莫札特或貝多芬的交響樂； 28. 注射含褐藻醣膠(fucoidan)或寡褐藻醣膠的物質(如營養品或補充品)； 29. 服用賀爾蒙補充劑或接受賀爾蒙注射； 30. 注射顆粒細胞-群落刺激因子(G-CSF或GCSF)，其為一種醣蛋白； 31. 進行GCSF注射流程；以及 32. 服用營養成分、營養品、營養流體、營養飲料、營養液或營養食品，其含有(1) 各種胺基酸 (如精胺酸、組胺酸、離胺酸、天門冬胺酸、穀胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺、谷胺醯胺、半胱胺酸、纈胺酸、脯胺酸、甘胺酸、硒代半胱胺酸、丙胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、酪胺酸或色胺酸)、(2) 經平衡胺基酸，或 (3) 人體9 種必需胺基酸(即組胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色胺酸與纈胺酸)。例如：(a) 從紅、綠、黑豆發酵生產或萃取的產品；(b) 由水果或水果組合物，如甜菜、蘋果、番石榴、奇異果、葡萄、鳳梨、紅火龍果(火龍果)、青木瓜、番茄，及/或酪梨等，發酵產生的液體、流體或飲料；(c) 藥用液(或稱為藥酒、藥用液或藥用酒)，例如將一種中藥或多種中藥浸泡在液體或酒中一段時間製成，如將人參浸泡在高酒精濃度的米酒中一個月而製成的人參酒。含幹細胞之組成物

含幹細胞之組成物 (如含幹細胞之溶液) 可使用下述示範方法製備。

可對個體執行上述動作(X)之一的動作(X)。例如，該個體可為人類(例如兒童、青少年、成年人或老年人)或非人類動物。 非人類動物的範例包括靈長類(例如猴或大猩猩)、狗、囓齒動物(例如小鼠或天竺鼠)、貓、馬、乳牛、黃牛、綿羊、豬、雞、鴨、鵝，和大象。

例如，該個體可攝入幹細胞移動劑，如含褐藻醣膠(fucoidan)之化合物。含褐藻醣膠(fucoidan)之化合物可為褐藻補充劑。一錠褐藻補充劑包含80%之水雲(mozuku)粉、15%之結晶纖維素、3%之蔗糖脂肪酸酯，以及2%之微或微細氧化矽(含二氧化矽)。水雲粉末可萃取自生長於日本沖繩附近海域的水雲褐藻(一種海藻) 。水雲粉末之後與結晶纖維素、蔗醣脂肪酸酯和微或微細氧化矽(含二氧化矽)混合，以形成褐藻補充劑，其含有0.1克褐藻醣膠(fucoidan) 。個體可攝取20種或更多種褐藻糖補充劑(例如至少30錠)或2克或更多(例如至少3克)褐藻糖膠 (fucoidan) 。在另一範例中，個體可注射顆粒細胞-群落刺激因子(GCSF)，即移動劑，或可進行GCSF注射流程。

在執行動作(X)之後，個體等待一段時間(例如，預定的期間)，如15分鐘至60分鐘之間、20分鐘至100分鐘之間、30分鐘至4小時之間、60分鐘至90分鐘之間、0.5小時至3小時之間、1小時至6小時之間、1小時至12小時之間、12小時至36小時之間或36小時至50小時之間。執行動作(X)並等待一段時間，可允許一或多種特定類型的體幹細胞(例如SB細胞(即CD349(+)與Lgr5(+) SB細胞)，自如個體的骨髓移動至個體的周邊血液中。個體的周邊血液因此變得富含一或多種特定類型的體幹細胞。 例如，該一或多種特定類型的體幹細胞可以是或可包括一或多種上述的體幹細胞。 例如，該一或多種特定類型的體幹細胞可以是或可包括尺寸小於6微米，更佳大於2微米的體幹細胞，如CD349(+)體幹細胞，及/或 Lgr5(+)體幹細胞。

執行操作(X)並等待一段時間為任擇性步驟。 換言之，為了製備含有幹細胞的組成物，可以由個體取得血液樣品，而毋需先對個體者執行任何動作(X)。

緊接著上述等待步驟之後(若進行動作(X)與等待步驟的話)，血液樣本係得自個體周邊血液，並置於一或多個含有二價陽離子螯合劑之容器中(例如袋子、一或多個注射器或一個或多個試管)。血液樣本係與容器中的二價陽離子螯合劑混合以形成混合物。二價陽離子螯合劑，如抗凝血劑，可為乙二胺四乙酸(EDTA)，如K2 EDTA抗凝血劑或K3 EDTA抗凝血劑，其具重量例如大於70 mg，例如90至900 mg、120 至450 mg，或150至400 mg之間。此外，該二價陽離子螯合劑可為檸檬酸鹽，具重量大於70 mg，例如90至900 mg、120 至450 mg，或150至400 mg之間。該血液樣本包含複數個細胞，包括尺寸小於6微米的小細胞，以及尺寸大於6微米的大細胞。 例如，該小細胞包含血小板和尺寸小於6微米的小體幹細胞。例如，該小體幹細胞含有一或多種特定類型的體幹細胞(例如SB細胞)、BLSCs(即CD66e(+)體幹細胞)和VSEL(例如CD133(+)體幹細胞和CD34(+)體幹細胞)。例如，該大細胞包含尺寸大於6微米的大體幹細胞與譜系(lineage)細胞，如紅血球和白血球。血液樣本的體積可大於或等於45毫升，例如60至500毫升、80至250毫升，或100至200毫升。在一範例中，血液樣本可與1.5 mg或更多，例如1.6至2.0 mg每毫升血液樣本的二價陽離子螯合劑(例如K2 EDTA、K3EDTA或檸檬酸鹽)混合，以形成容器中的混合物。

接者，處理混合物以形成含有幹細胞的溶液。 該過程可包括幹細胞的活化和純化/分離的步驟。 於此使用之術語“純化”或“分離”是指自大細胞中(例如尺寸大於6微米的細胞)實質上分離出小細胞(例如尺寸大於2微米且小於6微米的細胞)。

該混合物可儲存於攝氏2度(°C) 至12°C之間，更佳2°C至7°C之間，或4°C之適當設備中(例如，冰箱或其他維持物體冷度之裝置)一段預定期間。該期間可為3小時至72小時，更佳為3小時至6小時之間、6小時至72小時之間、6小時至48小時之間、16小時至72小時之間、16小時至48小時之間、36 小時至60小時之間、48小時至72小時之間，或大約48小時。該混合物可儲存一段預定期間，混合物中的一或多種特定類型之體幹細胞 (如SB細胞) 可經二價陽離子螯合物(如K2 EDTA、K3 EDTA或檸檬酸鹽)活化，即該一或多種特定類型體幹細胞的細胞週期從G0活化為G1。該活化可相關於該二價陽離子螯合劑抑制p53功能之能力(推測是經由螯合Zn²⁺ 而達成)，因而允許該一或多種特定類型的體幹細胞(如SB細胞)，從G0靜止期脫離而前進至細胞週期的G1階段。由於p53蛋白需要Zn²⁺ 適當地折疊並形成功能蛋白，因此二價陽離子螯合劑螯合Zn²⁺ 可能是活化該一或多種特定類型體幹細胞(如SB細胞)的關鍵步驟。該二價陽離子螯合劑可螯合其它二價離子(如Ca²⁺ )，因而活化該一或多種特定類型的體幹細胞，並促使它們增殖並擴展。

當混合物儲存時，會由於重力而分成包括上層和下層的分離層。上層或上清液可具有20至250毫升、40至125毫升或50至100毫升的體積。上層包含血小板、血清和一或多種特定類型的小體幹細胞(即，例如SB細胞)、BLSC(即CD66e(+)體幹細胞)和VSEL(如CD133(+)體幹細胞和CD34(+)體幹細胞)。大部分含有譜系細胞的大體細胞，以及血液樣本之大體幹細胞，如大於血液樣本中大細胞的95%、98%或99%，係處於下層。 例如，上清液體積與血液樣品體積之比例可為三分之一到二分之一的範圍內。

之後，實質上所有的上層可被收集或轉移到液體容器中如袋子、注射器或玻璃瓶中，以產生含幹細胞的溶液或幹細胞混合物。上層例如含有幹細胞的溶液，含有小細胞，其包括血小板和小體幹細胞。含幹細胞溶液中的小體幹細胞數量可大於或等於1千萬個(例如，大於或等於3千萬、大於或等於5千萬、1千萬至5億之間、2千5百萬至3億，或者3千萬到5億)。該含幹細胞的溶液亦可含有二價陽離子螯合劑(例如EDTA)，及/或生長因子。

此外，含有幹細胞的溶液幾乎不包含或實質上排除大細胞(如大體幹細胞和譜系細胞)。 例如，大細胞可構成含幹細胞溶液中細胞總數的5%以下(例如，少於1%、0.5%或0.01%)。例如，含幹細胞溶液(例如收集的上層)中的紅血球數量可小於每毫升10⁵ 或10⁴ 個。 較佳地，每毫升含有幹細胞的溶液中，紅血球數量少於10³ 個。每毫升含幹細胞溶液中，白血球的數量可少於10⁴ 個(例如少於10³ 個)。 較佳地，每毫升含有幹細胞的溶液中，白血球數量少於10² 個。

含幹細胞溶液中的所有細胞之95%以上 (如99%或99.99%)可為小細胞。該小細胞可包括血小板、Lgr5(+)細胞、CD349(+)細胞、CD133(+) 細胞、CD34(+)與CD66e(+)細胞。血小板可構成75%至85%之含幹細胞溶液中的小細胞。所有小細胞的4%以上 (如大於5%，或 4.5%至10%)可為Lgr5+ 體幹細胞。CD349(+)體幹細胞可構成含幹細胞溶液中所有小細胞的4%以上 (如大於5%，或4.5%至10%)。小於2% (如小於1%或0.5%) 之小細胞可為CD133(+)細胞與CD34(+)細胞組合。小於6%(如小於5%或4.5%) 之小細胞可為CD66e(+)細胞。

亦可使用流式細胞術或其他常規技術(例如抗體-基礎技術，如結合抗體之微珠)，由收集的上層進一步分離或移除任何特定的小細胞。

收集的上層可以含幹細胞溶液的形式使用(例如投予個體或儲存)，或進一步加工。 例如，可進一步純化(例如過濾)或與一或多種額外成分混合。可於收集的上層中添加適當的不含Ca²⁺ 細胞培養基或溶液，其具體積如大於400毫升，如介於500至900毫升之間，以製備含幹細胞的溶液。該適當的不含Ca²⁺ 細胞培養基或溶液，如含NaCl溶液，可進一步不含任何二價離子，包括Mg²⁺ 。含NaCl溶液，例如，可為一般生理食鹽水(如0.90% w/v之NaCl，約300 mOsm/L或9.0 克每升)。

含幹細胞溶液可儲存於冷凍儲存溫度下，例如等於或低於-70°C 或 -80°C(例如-75°C至 -85°C之間)一段延長的時間(例如，超過一周、一個月或一年)。當準備使用時，可將含冷凍幹細胞的溶液快速解凍，並任選地與上述適當的不含Ca²⁺ 培養基或溶液混合(如0.9% NaCl)。治療方法

經由上述程序產生的含幹細胞組成物，可用於增強個體的自體吞噬。 例如，可用於治療與自體吞噬缺陷相關的症狀，或可以自體吞噬-調節劑治療的症狀。

自體吞噬已被證明在飢餓和其他形式的壓力、體內恆定、細胞分化與發育的適應性反應中扮演關鍵角色。 此外，已顯示自體吞噬的調節失常與各種疾病，如癌症、神經退化疾病、感染性疾病和代謝疾病之間存在關聯。

可以含幹細胞組成物治療的自體吞噬-相關症狀包括阿茲海默症(Alzheimer's disease)、帕金森氏症(Parkinson’s disease)、罕丁頓氏症(Huntington's disease)、肌萎縮側索硬化症、溶酶體貯積症(如 Niemann-Pick類型C)、癌症(如乳癌、卵巢癌或前列腺癌)，以及發炎性病症(如發炎性腸病)。

在將含幹細胞組成物投予至個體之前，可確認個體是否具有自體吞噬缺陷或需要增強自體吞噬。此外或額外地，在投予組成物之後，可測定個體之自體吞噬情況，以監測療效，並做出治療決定。例如，可測定由個體獲得的生物樣本，例如血液樣本、骨髓樣本、尿液樣本或固體組織樣本中的自體吞噬生物標記物的位準。生物標記物位準可為蛋白質位準、mRNA位準、cDNA位準或功能位準。自體吞噬生物標記物包括微管-結合輕鏈3(LC3)、Beclin-1、Atg5、Atg12、Atg16L1、Atg7、Atg3、Atg10、p62、NBR1、NDP52與Nix。例如，與對照組位準相較，偵測到生物樣本中生物標記物之一的位準較低，表明該個體有增加自體吞噬的需求。對照組位準是在沒有自體吞噬缺陷的健康個體或個體中發現的位準。 任擇地，可評估在投予之前及/或之後，該個體的疾病參數或症狀。

此述的含幹細胞組成物可經由任何投藥途徑，例如靜脈內、關節內、結膜、顱內、腹膜內、胸膜內、肌肉內、鞘內或皮下路徑，投予至有需要的個體中。該組成物可以含有1千萬至5億個小體幹細胞。可使用自體或同種異體之體幹細胞。該組成物可在治療期間(例如1至36個月，或2至10年)內，於如每1至14天、每2至4週、每1至6個月，或每2至12個月，或任何有需要時，投予至個體中。.

“個體”是指人類或非人類動物。 “治療(treating)”或“治療(treatment)”是指將化合物或組成物投予至患有病症的個體中，目的是治癒、減輕、緩和、補救、延遲疾病的發作或改善病症、該病症之一症狀 、繼發於該病症的疾病狀態，或者朝向該病症發展的傾向。“有效量”是指能夠在治療的個體中產生醫學上期望結果的化合物或組成物之量。 治療方法可單獨或與其他藥物或治療聯合進行。

下面的範例僅限於說明，而不以任何方式限制本公開的其餘部分。不需進一步闡述，相信本領域技術人員可基於本文的描述而進行完整利用。範例

100至150 ml的周邊血液樣本由個體中取得。含有血液樣本的EDTA塗覆管係於4℃儲存6至48小時，直至血液藉由重力分為二單獨層。收集含有SB細胞的上層，並經由靜脈內注射自體輸送回每一患者中。

在治療之前和之後，收集患者的血液樣本。測量樣本中LC3的表現位準。 在處理24小時及/或1週後，觀察到LC3的表現增加165.8%。其他實施例

本說明書中公開的所有特徵可以任何組合結合。 本說明書中公開的每一特徵可由用於相同、等同或類似目的之替代特徵替代。因此，除非另有明確說明，否則所公開的每一特徵僅為一系列等同或類似特徵的一個範例。

從以上描述中，本領域技術人員可容易地確定所描述實施例的基本特徵，並在不脫離其精神和範圍的情況下，可對實施例進行各種改變和修飾，以使其適應各種用途和條件。 因此，其他實施例亦落於申請專利範圍內。

Claims (20)

1. 一種在一個體中增加自體吞噬之方法，包含： 辨識出有其需要之個體；以及 投予一組成物至該個體，該組成物含有多個尺寸大於2微米且小於6微米之小細胞； 其中該等小細胞包括體幹細胞，其為(i)多功能性的(pluripotent)或全能性的(totipotent)；以及(ii) CD349(+)、CD9(+)、Oct4(+)、Nanog(+)、Lgr5(+)、CD66e(+)、CD133(+)、或CD34(+)。
2. 如請求項1之方法，其中該辨識步驟包括偵測得自該個體之生物樣本中的自體吞噬生物標記物之位準。
3. 如請求項2之方法，其中該生物標記物選自於由LC3、Beclin-1、Atg5、Atg12、Atg16L1、Atg7、Atg3、Atg10、p62、NBR1、NDP52、以及Nix組成之群組。
4. 如請求項1之方法，其中該個體有與自體吞噬功能不良相關之症狀。
5. 如請求項4之方法，其中該個體有癌症、神經退化疾病、感染性疾病或代謝性疾病。
6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該等小細胞更包括血小板。
7. 如請求項6之方法，其中75%至85%的該等小細胞為血小板，以及20%至25%的該等小細胞為體幹細胞。
8. 如請求項7之方法，其中該組成物含有1千萬至5億個體幹細胞。
9. 如請求項8之方法，其中該組成物係以包括下列之方法製備： 提供一混合物，其含有得自該個體或供應者個體之血液樣本與二價陽離子螯合劑； 於溫度2°C 至12°C 之間儲存該混合物3至72小時，藉以將該混合物分離為上層與下層，其中該上層含有小細胞群；以及 收集該上層藉以製備該組成物。
10. 如請求項9之方法，其中該二價陽離子螯合劑為EDTA。
11. 如請求項10之方法，其中每毫米血液樣本1.5至2.0 mg之二價陽離子螯合劑係與該血液樣本混合以獲得該混合物。
12. 如請求項10之方法，其中在獲得該血液樣本之前，於該個體或供應者個體中進行增加幹細胞數量之動作。
13. 如請求項12之方法，其中該動作為投予一有效量之褐藻醣膠(fucoidan)或顆粒細胞-群落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor)。
14. 如請求項10之方法，其中該製備該組成物之方法更包括在收集該上層之後，加入醫藥上可接受之賦形劑至該收集之上層中。
15. 如請求項10之方法，其中該製備該組成物之方法更包括在收集該上層之後，離心該上層以獲得細胞沉澱物。
16. 如請求項15之方法，其中該製備該組成物之方法更包括清洗該沉澱物，並將該沉澱物懸浮於醫藥上可接受之賦形劑中。
17. 如請求項15或16之方法，其中該醫藥上可接受之賦形劑不含二價離子。
18. 如請求項17之方法，其中該醫藥上可接受之賦形劑為食鹽水溶液。
19. 如請求項1至18中任一項之方法，其中該組成物係經靜脈內投予。
20. 如請求項1至19中任一項之方法，更包含在投予步驟之後，偵測得自經該投予步驟後之個體之生物樣本中的自體吞噬生物標記物之位準。