ITMI20091425A1 - Nuovi peptidi antipatogeni - Google Patents

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ITMI20091425A1
ITMI20091425A1 IT001425A ITMI20091425A ITMI20091425A1 IT MI20091425 A1 ITMI20091425 A1 IT MI20091425A1 IT 001425 A IT001425 A IT 001425A IT MI20091425 A ITMI20091425 A IT MI20091425A IT MI20091425 A1 ITMI20091425 A1 IT MI20091425A1
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amino acid
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acid residue
atoms
peptide
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IT001425A
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Davide Gibellini
Andrea Giuliani
Giorgio Gribaudo
Santo Landolfo
David Lembo
Giovanna Pirri
Lorena Pizzuto
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Spider Biotech S R L
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Description

"Nuovi peptidi antipatogenici"
Descrizione
La presente invenzione concerne composti peptidici monomerici e multimerici che presentano un'attività antipatogenica, in particolare un'attività antivirale o/e antibatterica. In un aspetto preferito, i composti peptidici dell'invenzione presentano un'attività nei confronti di un'ampia pluralità di virus, sia virus a DNA sia a RNA, provvisti o sprovvisti di pericapside. Inoltre, la presente invenzione si riferisce a composizioni comprendenti detti composti per uso medico, ossia per il trattamento o/e la prevenzione di infezioni patogeniche, in particolare di infezioni virali o/e batteriche .
Le infezioni batteriche e virali negli uomini e negli animali domestici hanno un costo di miliardi di dollari ogni anno. La scienza medica à ̈ alla costante ricerca di nuovi e più potenti agenti per prevenire e curare le infezioni batteriche e virali. Nonostante sia disponibile un'ampia scelta di farmaci contro le infezioni batteriche per il trattamento di malattie causate da batteri, il trattamento di malattie virali à ̈ spesso difficoltoso e pochi di essi sono realmente
efficaci. Infatti, i virus entrano nelle cellule dei
mammiferi dove svolgono la maggior parte delle loro
funzioni come la trascrizione e la traduzione delle
proteine virali e la replicazione del genoma virale.
In questo modo i virus sono in grado di evadere sia
il sistema immunitario dell'ospite, sia l'azione
diretta dei farmaci somministrati all'ospite. Risulta
pertanto esserci una necessità urgente di sviluppare
nuovi e più efficaci agenti antivirali.
Tabella 1
Virus Ospite Malattia
gengivostomatite, herpes labiale, herpes HSV 1 Humans
genitale, cheratite da herpes.
herpes labiale, herpes genitale, lesioni HSV2 Humans
genitali, encefalite.
retinite, mononucleosi, epatite, polmonite, HCMV Humans colite, danni cerebrali e perdita di udito nelle infezioni congenite.
sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS), malattie associate ad infezioni opportunistiche, tumori,
HIV Humans immunodeficienza, anemia, trombocitopenia, polmonite, encefalopatia, gastroenteropatia, nefropatia, cachessia, sindromi reumatologiche.
HPV Humans displasia cervicale, verruche ano-genitali.
Il virus dell'Herpes simplex di tipo 1 (HSV-1) à ̈ un patogeno prevalentemente umano che causa dolorose vesciche attorno alla bocca (herpes labialis) e una proporzione crescente di infezioni genitali ricorrenti (herpes genitales). L'Herpes simplex di tipo 2 (HSV-2) à ̈ generalmente associato all'herpes genitale. L'herpes genitale à ̈ una delle più diffuse infezioni sessulamente trasmissibili (STD) ed à ̈ un rilevante problema sanitario nella popolazione giovanile. L'HSV interagisce con le cellule epiteliali dove si riproduce. In seguito, l'HSV viene trasportato tramite gli assoni delle terminazioni nervose sensoriali dal sito di infezione ai gangli periferici, dove il virus instaura un'infezione latente (Garner 2003). I trattamenti topici attualmente disponibili per 1'herpes sono ampiamente inefficaci mentre le terapie orali (sistemiche), pongono seri problemi di insorgenza di organismi farmaco-resistenti, particolarmente nei soggetti immunodepressi dove le infezioni da herpes genitale sono ricorrenti.
Il Citomegalovirus umano (HCMV) à ̈ un membro della sottofamiglia beta degli Herpesvirus; l'HCMV à ̈ designato come Herpes virus umano di tipo 5 (HHV5). L'HCMV à ̈ un virus ubiquitario con una distribuzione mondiale e con una seroprevalenza del 30% in alcune aree del Nord America e del Nord Europa, fino a un massimo del 100% nei bambini e negli adulti provenienti da regioni sottosviluppate di Africa, Asia e Sud America. Le infezioni da HCMV in soggetti sani immunocompetenti sono generalmente subcliniche, tuttavia, possono causare severe malattie in assenza di un'efficiente immunorisposta come per esempio in soggetti immunologicamente immaturi e immunocompromessi . L'HCMV viene associato a malattie che si suddividono in tre gruppi di soggetti immunodepressi : 1) feti immunologicamente immaturi, 2) allotrapiantati sottoposti a terapia immunosoppressiva antirigetto, 3) pazienti infettati da HIV con perdita di linfociti CD4+ e di risposta immunitaria adattiva. Gli organi che sono maggiormente colpiti sono: il sistema nervoso centrale (SNC), i polmoni, e il tratto gastrointestinale. La retinite, che può indurre a cecità, à ̈ la più frequente infezione a carico del SNC direttamente attribuibile alla replicazione del HCMV. Le terapie attuali includono Ganciclovir (Cytovene), foscarnet (Foscavir) e HPMPC (Cidofovir), tuttavia sono tutte caratterizzate da tossicità legata alla dose e dallo sviluppo di resistenze (Landolfo et al.
2003) .
I virus del papilloma umano (HPV) sono virus a DNA membri della famiglia dei Papillomaviridae . Più di 100 tipi differenti di HPV sono stati identificati sino ad ora, oltre 30 dei quali sono in grado di infettare le aree genitali (Lowy and Howley, 2001). Le infezioni genitali da HPV sono stimate essere le più comuni forme di infezioni sessualmente trasmesse. Sebbene la maggioranza di esse non causi sintomi e risulti essere auto- limitante, l'HPV genitale à ̈ diventato un'emergenza sanitaria pubblica poiché le infezioni persistenti con alcuni tipi possono causare il cancro alla cervice che uccide ca. 250.000 donne nel mondo ogni anno (Bosch and de Sanjose, 2003). I trattamenti attuali sono a carattere ablativo e diretti contro le cellule anormali associate all'HPV piuttosto che al virus stesso; nessun trattamento diretto contro il virus à ̈ disponibile. La prevenzione dell 'HPV vaginale à ̈ essenziale per ridurre l'insorgenza di verruche genitali e PAP test positivi, così come il cancro alla cervice. Poiché i profilattici maschili si sono dimostrati solo parzialmente efficaci nel contrastare la diffusione da HPV, non possono essere raccomandati come primaria strategia di prevenzione (Manhart and Koutschil, 2002).
Recentemente, un vaccino molto efficace à ̈ stato approvato per la prevenzione di infezioni dovute a quattro tipi di HPV che insieme sono responsabili globalmente del 70% dei tumori alla cervice (HPV 16 e HPV-18) e del 90% delle verruche genitali (HPV-6 e HPV-11) (Garland et al. 2007). Tuttavia, le donne possono rimanere esposte al rischio di essere infettate da HPV appartenente ai genotipi virali ad alto rischio (HPV-31, 33, 45 ecc.) che possono causare il cancro alla cervice ma non sono trattabili con nessun vaccino. Inoltre, il vaccino à ̈ relativamente costoso e potrebbe non essere accessibile a tutte le donne, in particolar modo alle donne nei paesi in via di sviluppo. In questo scenario, un microbicida topico, un composto in grado di bloccare tutti i tipi di infezione da HPV nelle fasi iniziali dell'ingresso del virus nella cellula ospite, potrebbe essere un utile complemento alla terapia vaccinica.
Il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) à ̈ un membro della famiglia dello Retroviridae in grado di infettare prevalentemente i linfociti T CD4+ e i macrofagi. L'HIV induce un'infezione persistente che, se non trattata, evolve in una sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) fino alla morte del paziente infetto (Quinn, 2008). Negli ultimi 25 anni, sono stati conseguiti significativi passi avanti nello sviluppo di agenti antiretrovirali. In particolare, l'avvento della terapia denominata highly active antiretroviral therapy (HAART), basata sul trattamento di pazienti HIV con una combinazione di farmaci antiretrovirali, si à ̈ dimostrata efficace nel sopprimere la replicazione virale e nel prevenire la progressione della malattia in AIDS, sebbene senza giungere alla completa eradicazione dell'infezione (Marsden and Zack, 2009). Gli svantaggi maggiori della terapia antiretroviralesono l'insorgenza di resistenze antiretrovirali che possono insorgere durante un lungo trattamento dei soggetti HIV e la conseguente perdita di efficacia della terapia nel tempo (Wilson and Gallant, 2009). Risulta pertanto fondamentale individuare nuovi composti antiretrovirali per incrementare l'arsenale di farmaci "magic bullet" diretti contro le differenti fasi del ciclo replicativo virale in modo da aumentare la complessità e la flessibilità della terapia antiretrovirale.
I peptidi antimicrobici naturali (antimicrobial peptides, AMPs), rappresentano una classe di molecole con un'ampia varietà di attività di interesse biologico che includono: attività antibatterica, antifungina, antiparassitaria, antitumorale, e antivirale (Giuliani et al., 2007). Si ritiene che essi abbiano target multipli, che includono la membrana citoplasmatica e i processi di divisione cellulare e sintesi di macromolecole (Ref 3). In considerazione del loro ruolo di mediatori tra il sistema di difesa innato e adattivo di numerosi organismi, si può affermare che l'importanza degli AMPs si estende ben oltre la loro attività prettamente antimicrobica (Yang et al., 2002).
L'effetto antivirale di peptidi policationci sull'herpes simplex virus di tipo 1 (HSV), così come su numerosi altri virus tra cui, virus del mosaico del tabacco, virus della parotite, virus della malattia di Newcastle, virus dell'influenza, sono stati ampiamente documentati (Langeland et al., 1988). In un altro studio, la classe di peptidi delle magainine, potenti peptidi cationici antimicrobici originariamente isolati dalla pelle e secrezioni granulari della rana Africana, Xenopus laevis, e in particolare quei derivati ricchi in lisine contenenti gruppi octanoile, si sono rivelati in grado di esercitare un'azione antivirale diretta contro HSV.
WO 2006/018431 descrive una sequenza peptidica derivata dalla catena beta di emoglobina umana, corrispondente alla regione della sequenza 112-147 della β-emoglobina umana, efficace contro HSV-2 in vivo.
In anni recenti, molecole dendrimeriche, o dendrimeri, hanno trovate applicazione in ambito biotecnologico o farmaceutico. Un dendrimero viene definito come una macromolecola altamente ramificata sintetizzata a partire da una struttura polifunzionale. Sino ad oggi, sono state sintetizzate molecole dendrimeriche recanti, sulla superficie più esterna, gruppi funzionali in grado di formare complessi con recettori cellulari o virali, interferendo nell'interazione normale vius-cellula compreso l'iniziale legame del virus alla cellula (Bourne et al., 2000).
Una particolare sottoclasse di dendrimeri à ̈ rappresentata da peptidi dendrimerici o macromolecole cuneiformi ramificate che consistono di una struttura peptidica ramificata e/o gruppi funzionali superficiali legati covalentemente (Niederhafner et al., 2005).
WO 02/079299 descrive una nuova classe di molecole polivalenti altamente ramificate caratterizzate da uno strato superficiale formato da gruppi polianionici in grado di esplicare una significativa attività antivirale, in particolare verso un ampio spettro di patogeni virali e microbici coinvolti in malattie sessualmente trasmissibili. Questi composti sono sintetizzati a partire da unità funzionali monomeriche con molteplici ramificazioni o strutture a forma d'albero. La superficie più esterna reca un numero di gruppi funzionali sufficiente al riconoscimento di un recettore biologico.
I dendrimeri hanno un alto potenziale terapeutico per la loro dimensione (nanomolare), la loro facilità di sintesi e funzionalizzazione, e per la loro capacità di mettere a disposizione molteplici gruppi funzionali per processi biologici di riconoscimento (multivalenza), in particolare in applicazioni antivirali .
La presente invenzione riguarda metodi per l'utilizzo e la produzione di nuovi composti peptidici antipatogeni per il trattamento e/o la prevenzione di infezioni virali e/o batteriche.
Oggetto della presente invenzione à ̈ un composto peptidico avente una lunghezza fino a 35 residui aminoacidici , comprendente una sequenza aminoacidica rappresentata dalla formula generale (I):
R-V-R-I-K-[K]n-[Q]m
in cui
R Ã ̈ un residuo aminoacidico con una catena laterale di arginina o una catena laterale di guanidina N-alchil sostuita, in particolare L-arginina,
V ed I sono residui aminoacidici indipendentemente selezionati tra:
(i) un residuo aminoacidico con una catena laterale di vaiina, in particolare L-valina; (ii) un residuo aminoacidico con una catena laterale di isoleucina, in particolare L-isoleucina;
(iii) un residuo aminoacidico con una catena lineare satura o insatura con almeno tre atomi di carbonio, preferibilmente con 3-10 atomi di C, in particolare norleucina, acido 2-aminopentanoico, acido 2-aminoottanoico, acido 2-aminodecanoico o acido 2-aminododecanoico;
(iv) un residuo aminoacidico con una catena laterale ramificata satura o insatura con almeno 3 atomi di carbonio, preferibilmente 3-10 atomi di C, particolarmente tertleucina, 5-metil norleucina o omoisoleucina (4-metil norleucina);
(v) un residuo aminoacidico con una catena laterale ciclica satura o insatura con almeno 3 atomi di carbonio, preferibilmente con 3-10 atomi di C, che à ̈ selezionata preferibilmente da residui ciclici con 3-6 atomi anulari, opzionalmente comprendenti un doppio legame C=C, come per esempio<’>ciclopropil, ciclobutil, ciclobutenil, ciclopentil, ciclopentenil, cicloesil, cicloesenil, opzionalmente sostituti in qualunque posizione dell'anello con gruppi alifatici, preferibilmente gruppi alifatici aventi 1-10 atomi di carbonio, più preferibilmente 1-8 atomi di C, e ancor più preferibilmente 1-6 atomi di C e in particolare preferibilmente metil, etil, isopropil, n-propil, n-butil, isobutil, per esempio come norfuranomicina, carbafuranomicina, ciclopentilglicina, ciclopentenilglicina o cicloesenilglicina. K à ̈ un residuo aminoacidico con una catena laterale di lisina, in particolare L-lisina o un altro residuo aminoacidico con una catena laterale carica positivamente, in particolare ornitina o acido 2,4 diamminobutirrico.
Q Ã ̈ un residuo aminoacidico con una catena laterale di glutammina, in particolare L-glutammina, ed m ed n sono indipendentemente 0 o 1.
Preferibilmente, il residuo aminoacidico V della formula (I) Ã ̈ un residuo aminoacidico con una catena laterale di vaiina, in particolare L-valina, e il residuo aminoacidico I della formula (I) Ã ̈ un residuo aminoacidico con una catena laterale di isoleucina, in particolare L-isoleucina.
Il composto peptidico può comprendere residui aminoacidici in configurazione L e/o D.
Le sequenze dei composti peptidici dell'invenzione sono scritte a partire dall'estremità N-terminale a sinistra fino all'estremità C-terminale alla destra.
In un'ulteriore forma di realizzazione preferita, la presente invenzione fa riferimento ad un composto peptidico avente lunghezza fino a 35 residui aminoacidici comprendente una sequenza aminoacidica rappresentata dalla formula generale (II):
A-S-L-R-V-R-I-K- [K]n-[Q]m in cui R, K, Q, V, I, n ed m sono definiti come sopra, e
in cui A Ã ̈ un residuo aminoacidico con una catena laterale di alanina, in particolare L-alanina.
S Ã ̈ un residuo aminoacidico con una catena laterale alifatica o aromatica idrossi-sostituita in particolare un residuo aminoacidico con una catena laterale di serina, in particolare L-serina.
L Ã ̈ un residuo aminoacidico selezionato tra:
(i) un residuo aminoacidico con una catena laterale di leucina, in particolare L-leucina;
(ii) un residuo aminoacidico con una catena laterale di isoleucina, in particolare L-isoleucina;
(iii) un residuo aminoacidico con una catena lineare satura o insatura con almeno tre atomi di carbonio, preferibilmente con 3-10 atomi di C, in particolare norleucina, acido 2-aminopentanoico, 2-aminoottanoico, acido 2-aminodecanoico o acido 2-aminododecanoico; (iv) un residuo aminoacidico con una catena laterale ramificata satura o insatura con almeno 3 atomi di carbonio, preferibilmente con 3-10 atomi di C, in particolare tertleucina, 5-metil norleucina o omoisoleucina (4-metil norleucina);
(v) un residuo aminoacidico con una catena laterale ciclica satura o insatura con almeno 3 atomi di carbonio, preferibilmente con 3-10 atomi di C, che à ̈ selezionato preferibilmente da residui ciclici con 3-6 atomi anulari, opzionalmente comprendenti un doppio legame C=C, come per esempio ciclopropil, ciclobutil, ciclobutenil, ciclopentil, ciclopentenil , cicloesil, cicloesenil, opzionalmente sostituti in qualuque posizione dell'anello con gruppi alifatici, preferibilmente gruppi alifatici recanti 1-10 atomi di carbonio, più preferibilmente 1-8 atomi di C, e ancor più preferibilmente 1-6 atomi di C, in particolare preferibilmente metil, etil, isopropil, n-propil, n-butil, isobutil, per esempio come norfuranomicina, carbafuranomicina, ciclopetilglicina, ciclopentenilglicina o cicloesenilglicina . In un'ulteriore forma di realizzazione ancora più preferita, i composti peptidici della presente invenzione comprendono una sequenza aminoacidica slezionata tra:
A-S-L-R-V-R-I-K-K (H a) e
A-S-L-R-V-R-I-K-K-Q (iib)
dove R, K, Q, V, I, A, L ed S sono definiti come sopra, in particolare dove:
R Ã ̈ un residuo aminoacidico con una catena laterale di arginina o una catena laterale di guanidina N-alchil sostuita, in particolare L-arginina,
V Ã ̈ un residuo aminoacidico con una catena laterale di vaiina, in particolare L-valina,
I Ã ̈ un residuo aminoacidico con una catena laterale di isoleucina, in particolare L-isoleucina, e
L Ã ̈ un residuo aminoacidico con una catena laterale di leucina, in particolare L-leucina.
In una forma d'attuazione molto preferita delle formule Ila e Ilb, A Ã ̈ alanina, S Ã ̈ serina, L Ã ̈ leucina, R Ã ̈ arginina, V Ã ̈ vaiina, I Ã ̈ isoleucina, K Ã ̈ lisina, e Q Ã ̈ glutammina (SEQ ID NO: le SEQ ID NO: 2).
In una forma preferita di realizzazione dell'invenzione, i composti peptidici antipoatogenici, e in particolare antivirali e/o antibatterici dell'invenzione, hanno una struttura antipatica.
In un' ulteriore forma preferita di realizzazione, la presente invenzione fa riferimento a composti multimerici che comprendono una pluralità di unità peptidiche definite come sopra, dove i singoli composti peptidici sono covalentemente legati, p.e. tramite unità multifunzionali, p.e. unità di- o trifunzionali, come per esempio aminoacidi di- o trifunzionali.
La presente invenzione riguarda composti peptidici. Il termini "composto peptidico" comprende composti che, almeno in parte, comprendono unità funzionali aminoacidiche o analoghi di esse, che sono legate attraverso legami covalenti, preferibilmente legami carbossammidici. Tali unità funzionali vengono preferibilmente selezionate tra acidi amminocarbossilici , ad esempio acidi α-ammino carbossilici o altri tipi di acidi carbossilici, ad esempio acidi β- o anche ω-amminocarbossilici . Inoltre, tali unità funzionali aminoacidiche possono essere selezionate tra acidi L-α-amminocarbossilici codificati geneticamente e/o tra i loro D-enantiomeri e/o tra unità funzionali aminoacidiche non naturali.
L'oggetto della presente invenzione consiste anche in varianti di composti peptidici, dove le singole unità aminoacidiche sono modificate. In particolare, dette modificazioni delle unità comprendono la sostituzione di singoli aminoacidi, in particolare mediante sostituzione conservativa, in cui un aminoacido à ̈ sostituito da un altro aminoacido con struttura chimica simile senza alterare la funzionalità dei peptidi. Inoltre, conformemente all'invenzione, anche singole modificazioni aminoacidiche possono comprendere la sostituzione di singoli aminoacidi con degli aminoacidi mimetici.
Le unità funzionali aminoacidiche possono essere anche selezionate tra i (gli) aminoacidi mimetici. I mimetici aminoacidici si riferiscono a composti chimici aventi una struttura differente dalla struttura chimica generale di un aminoacido ma che agiscono in maniera analoga ad un aminoacido naturale. Questi residui non naturali sono ampiamente descritti nella letteratura scientifica e brevettuale: alcuni residui non naturali esemplicativi utilizzabili come mimetici di residui aminoacidici naturali saranno descritti di seguito. Mimetici di aminoacidi aromatici sono, per esempio, D- o L-naftilalanina; D- o L-fenilglicina; D- o L-2 tienilalanina; D- o L-, 2,3-, o 4-pirenilalanina; D-o L-3 tienilalanina; D- o L-(2-piridinil)- alanina; D- o L-(3-piridinil)-alanina; D- o L-(2-pirazinil)alanina; D- o L-(4-isopropil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilglicina; D- (trifluorometil)-fenilalanina; D-p- fluoro-fenilalanina; D- o L-pbifenilfenilalanina; D- o L-p-metossibifenilfenilalanina; D- o L-2-indolo(alchil)alanina; e D- o L-alchilalanine . In questo contesto, il termine "alchile" significa un metile, etile, propile, esile, butile, pentile, isopropile, isobutile, sec-isobutile o iso-pentile sostituito o non sostituito. Gli anelli aromatici di un aminoacido non naturale includono, ad esempio, cicli aromatici di tiazoli, tiofenili, pirazolili, benzimidazoli, naftili, furanili, pirroli e piridili.
I composti peptidi della presente invenzione, come appena definiti, includono tutte le forme "mimetiche" e "peptidomimetiche" . I termini "mimetico" e "peptidomimetico" si riferiscono ad un composto chimico di sintesi che possiede sostanzialmente la stessa struttura e/o le stesse caratteristiche funzionali proprie del composto peptidico dell'invenzione. Il mimetico può essere sia interamente composto da analoghi aminoacidici sintetici non naturali, sia essere una molecola chimerica composta in parte da aminoacidi naturali, in parte da analoghi degli aminoacidi non naturali.
Il mimetico può anche contenere una qualsiasi quantità di sostituzioni conservative di aminoacidi naturali fino a che tali sostituzioni non ne alterino sostanzialmente la struttura e/o l'attività del mimetico.
Le singole unità funzionali dei composti peptidici sono legate attraverso un legame ammidico naturale ("legame peptidico") o mediante altri legami covalenti, ad esempio, un legame carbossamide carbammato, estere, tioestere, etere, tioetere, tetrazolo, tiazolo, retroamide, e tioamide. I composti peptidici della presente invenzione possono essere lineari o ciclici. I composti peptidici monomerici hanno una lunghezza fino a 35 residui aminoacidici e preferibilmente una lunghezza di almeno 8 residui, più preferibilmente di almeno 9 o 10 e fino a 15 residui aminoacidici.
In una forma di realizzazione preferita, l'invenzione si riferisce ad un composto multimerico che comprende una pluralità di composti peptidici come descritto in precedenza. Per esempio, un composto multimerico dell'invenzione può comprendere 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 copie o più dei composti peptidici. Il composto multimerico può comprendere i composti peptidici multimerizzati su una matrice, ad esempio una matrice costituita da polipeptide, un mono-, oligo- o polisaccaride o un polimero di natura organica, preferibilmente un polimero lineare di natura organica. Per esempio, la matrice può essere selezionata tra poli (N-alchil (metil)acrilamide) , poli (Π,Π-dialchil (metil)acrilamide) , polimelammina, destrano, ciclodestrina, polietileneglicole e/o polivinilpirrolidone . Il legame del composto peptidico alla matrice può avvenire preferibilmente via l'estremità N- e/o C-terminale del composto peptidico, per esempio usando linker omo- e/o eterobifunzionali che consentono il legame con i gruppi reattivi, p.e. gruppi idrossi -gruppi , animino-gruppi, tiol -gruppi o carbossil- gruppi presenti sulla matrice .
In una forma di realizzazione preferita, il composto multimerico ha struttura ramificata, in particolare dendrimerica.
In un'ulteriore forma di realizzazione preferita, il composto multimerico à ̈ selezionato tra:
(i) R-(Y1 - R)m- Y1 - (R)m<1>(Illa)
in cui R à ̈ un composto peptidico come definito sopra o in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, Y1 à ̈ un legame covalente o un linker bifunzionale, per esempio un dialcole come per esempio propilene glicole, un acido dicarbossilico come per esempio l'acido succinico, una diammina come per esempio l'etilen diammina, un aminoacido, un acido idrossi carbossilico, per esempio un acido idrossi alcanoico, o un diisocianato, ed m à ̈ 0 o un numero intero positivo, in particolare 1,2,3,4, 5 o 6, e m' à ̈ 0 o 1,
(ii) [[(R)ni Y1<1>]n2] Y2 (IH b)
in cui R Ã ̈ un composto peptidico come definito sopra o in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5;
Y1<1>à ̈ in ogni caso indipendentemente un linker con una funzionalità di almeno 3, per esempio un aminoacido trifunzionale come per esempio la lisina, l'ornitina, l'acido 2,4-diaminobutirrico, la norlisina, 1'amminoalanina , l'acido aspartico o l'acido glutammico, e
Y2 à ̈ un linker con una funzionalità di almeno 2, ed ni e n2 in ciascun caso indipendentemente sono un numero intero con un valore di almeno 2, preferibilmente 2, 3 o 4, più preferibilmente 2,
(iii) {[t(R)nlYl']n2] Y2' }n3Y3 (IIIc) in cui R à ̈ un composto peptidico come definito sopra o in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, Y1<1>e Y2' sono in ogni caso linkers indipendenti con una funzionalità di almeno 3, per esempio un aminoacido trifunzionale come per esempio la lisina, l'ornitina, l'acido 2,4 diaminobutirrico, la norlisina, amminoalanina, acido aspartico o glutammico,
Y3 à ̈ un linker con una funzionalità di almeno 2 e ni, n2 e n3, sono in ogni caso indipendentemente, numeri interi con un valore di almeno 2, preferibilmente 2, 3 o 4, più preferibilmente di 2.
Il composto multimerico (Illa) à ̈ un composto multimerico lineare, in cui una pluralità di composti peptidici sono connessi mediante legami covalenti e/o linkers Y1 omo- o etero-bifunzionali. Preferibilmente il composto multimerico comprende fino ad 8, più preferibilmente fino a 4, unità dei composti peptidici (I) o (II).
I composti multimerici (Illb) e (IIIc) sono composti ramificati, in cui ogni singola unità peptidica R à ̈ connessa mediante linkers aventi una funzionalità di almeno 3. In una forma preferita di attuazione, il composto multimerico (Illb) comprende 4 unità peptidiche ed ha la seguente struttura:
In un'ulteriore forma preferita d'attuazione, il composto multimerico (IIIc) comprende unità peptidiche e ha la seguente struttura:
Il linker Y2 del composto multimerico (Illb) e il linker Y3 del composto multimerico (IIIc) possono essere preferibilmente dei linker aventi funzionalità 3, preferibilmente un linker aminoacidico trifunzionale, più preferibilmente una lisina. In una ulteriore forma preferita, i linker Y2 e Y3 sono legati ad ulteriori residui aminoacidici , preferibilmente a l, 2, 3 o 4 residui aminoacidici, selezionati tra α-, β-, o anche ω- residui aminoacidici. In una forma di realizzazione particolarmente preferita, l'ulteriore residuo aminoacidico legato ai linker Y2 e/o Y3 à ̈ un residuo β-aminoacido, più preferibilmente un residuo di βalanina .
In un'ulteriore forma di realizzazione preferita dell'invenzione, il composto multimerico (Illb) ha la struttura :
[[(R)2Lys] 2]Lys^ -Ala
Esempi specifici di composti peptidici multimerici secondo la presente invenzione comprendono unità monomeriche di composti peptidici come sopra descritto, preferibilmente una sequenza aminoacidica come definita in SEQ ID N0:1 o 2 e sono rappresentati dalle seguenti strutture:
(ASLRVRIKKQ)4-Lys2-Lys^ -Ala (IV)
(ASLRVRIKK)4-Lys2-Lys- β-Ala (V)
in cui β-Ala rappresenta un aminoacido β-alanina di origine naturale, in cui il gruppo amminico à ̈ in posizione β rispetto al gruppo carbossilico e in cui i peptidi suddetti sono opzionalmente amidati all'estremità C-terminale.
In una ulteriore forma preferita d'attuazione della presente invezione, i composti peptidici e multimerici comprendono almeno una modificazione, in particolar modo selezionata tra un' unità lipidica, un ammide, un estere, un acile e/o un gruppo alchilico ad essi legati, per esempio, legati ad un gruppo N-terminale, un gruppo C-terminale e/o un gruppo laterale della catena aminoacidica . Preferibilmente esse sono modificazioni all'estremità N-terminale e C-terminale.
Pertanto, la presente invenzione si riferisce anche a derivati dei composti peptidici monomerici e multimerici ottenuti mediante almeno una modificazione, in particolare derivati peptidici ottenuti mediante: amidazione, acetilazione, solfatazione, lipidazione, fosf orilazione, glicosilazione, ossidazione, aggiunta di polietilenglicole .
Preferibilmente , la modificazione consiste nell'attacco di almeno un unità lipidica, costituita da almeno un acido amino carbossilico che comprende un gruppo idrocarburo lineare o ciclico, saturo, e mono- o poli-insaturo aventi dai 3 ai 25, e preferibilmente dai 5 ai 25 atomi di C, per esempio acido 5-aminovalerico (5-Ava) , acido 5-aminopentanoico, acido 8-aminoottanoico (8-Ada) o acido 2-aminodecanoico (2-Ada). Preferibilmente, l'unità lipidica à ̈ legata all'estremità N- terminale e/o C-terminale del composto. Le unità lipidiche possono essere per esempio legate sia alle estremità libera N-terminale o C-terminale dei composti peptidici e/o dei composti multimerici. Le unità lipidiche, comunque, possono essere anche legate a linkers presenti all'estremità N-terminale e/o C-terminale come per esempio descritto per i composti (Illa), (Illb) e (IIIc) . In una forma preferita d'attuazione dei composti (Illb) e (IIIc), i linkers C-terminali Y2 e Y3 sono linkers trifunzionali ai quali 1' unità lipidica può essere legata. L' unità lipidica può essere legata al peptide attraverso un legame amidico.
Un ulteriore aspetto preferito riguarda l'attacco dei gruppi acile, per esempio gruppi acetile, all'estremità N- e/o C-terminale e/o l'amidazione dell'estremità C-terminale libera.
I composti dell'invenzione possono avere attività antipatogenica, in particolare attività antivirale e/o antibatterica.
In particolare, i composti peptidici dell'invenzione, esibiscono una significativa attività antivirale contro un ampio spettro di virus selezionati all'interno delle famiglie di virus a DNA e virus a RNA. In particolare, i composti peptidici antivirali dell'invenzione possono inattivare i virus prima del loro ingresso nella cellula, prevenendo l'attaccamento e/o l'adsorbimento
del virus alla cellula bersaglio.
Esempi di virus a DNA sono la famiglia delle Parvoviridae, che include in particolare gli Eritrovirus, la famiglia degli Adenovirus, la famiglia dei Paporvaviridae, che include in particolare i Papillomavirus e il Poliovirus, la famiglia degli Herpesvirus, che include in particolare 1'Herpes simplex virus, il Citomegalovirus e il virus di Epstein-Bar, la famiglia dei Poxviridae, che include in particolare il virus Variola e la famiglia degli Hepadnaviridae, che include in particolare l'Hepatits B virus.
Esempi di virus a RNA sono la famiglia dei Picornavirus, che include in particolare gli Enterovirus (p.e. Poliovirus, Coxsackievirus B ed A) e gli Hepatovirus (p.e. Hepatitis A virus), la famiglia dei Caliciviridae che include, in particolare 1'Hepatitis E virus, le famiglie dei Togaviridae e dei Flaviviridae (Arbovirus), che includono in particolare Alphavirus, Flavivirus e Rubella virus, la famiglia dei Flaviviridae, che include in particolare Hepatitis C, la famiglia dei Coronaviridae, che include in particolare il Coronavirus umano, la famiglia dei Paramoxiviridae, che include in particolare il virus della parainfluenza, il virus della parotite, del morbillo e il virus respiratorio sinciziale, la famiglia dei Rhadoviridae, che include in particolare il virus della stomatite vescicolare e della rabbia, la famiglia dei Filoviridae, che include in particolare il virus Marburg ed Ebola, la famiglia degli Ortomixovirus, le famiglie degli Arenaviridae, che include in particolare il virus della coriomeningite linfocitica e il Lassa virus, la famiglia dei Buniaviridae, che include in particolare il virus della febbre della Rift Valley e l'Hantaan virus, la famiglia dei Reoviridae, che include in particolare i Reovirus mammiferi, il virus della febbre del Colorado e i Rotavirus, la famiglia delle Retroviridae, in particolare l'HIV, HTLV-1 e HTLV 2. Ulteriori virus possono essere l'Hepatitis D virus (Deltavirus) . Inoltre, i composti peptidici possono risultare attivi contro le particelle infettive di natura proteica (prioni).
Preferibilmente, i composti rivendicati nell'invenzione hanno attività antivirale contro la famiglia degli herpes viridae, preferibilmente Herpes simplex, in particolare HSV-1 e HSV-2, Citomegalovirus umano (HCMV), la famiglia dei Papovaviridae, preferibilmente il Papillomavirus umano (HPV) e la famiglia dei Retroviridae, preferibilmente il virus dell'immunodeficienza umana ( HIV).
In un ulteriore aspetto, i composti dell'invenzione hanno attività antibatterica. In particolare i composti peptidici sono attivi contro i batteri quali per esempio Chlamydia trachomatis e/o Neisseria Gonorrhoeae.
Dunque, i composti peptidici dell'invenzione sono ottimi utilizzati nella prevenzione e nel trattamento di infezioni patogeniche, in particolare di infezioni virali o/e batteriche. In una forma di realizzazione particolarmente preferita, i composti dell'invenzione sono ottimi contro infezioni sessuali dove la malattia à ̈ un'infezione trasmessa per via vaginale, rettale o orale a causa di uno o più dei seguenti virus: Herpes simplex (p.e. HSV-1 e HSV-2), Citomegalovirus (HCMV), Papilloma virus umano (HPV) e virus dell'immunodeficienza umana (HIV), Chlamydia trachomatis e/o Neisseria Gonorrhoeae.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ una composizione per uso medico che comprende almeno uno dei composti come definiti sopra, per esempio un composto peptidico o multimerico come definito sopra, unitamente a veicolanti, diluenti e/o adiuvanti farmaceuticamente accettabili. Per l'uso in medicina umana o veterinaria, la composizione à ̈ preferibilmente presente in forma di dosaggio farmaceutico in forma di solidi, liquidi o gel e loro combinazioni, come per esempio un collirio, collutorio, unguente, aerosol o prodotti topici. Le forme di dosaggio farmaceutico comprendono una quantità del principio attivo che à ̈ efficace per il trattamento e/o la prevenzione dei disordini causati da, associati con o accompagnati dalla presenza di organismi patogeni. Il quantitativo effettivo del principio attivo può variare a seconda della via di somministrazione e del tipo e della gravità del disordine trattato.
Al fine di raggiungere l'effetto (o gli effetti) desiderato/i, il composto peptidico monomerico o multimerico può essere somministrato in singola o multipla dose, per esempio in un intervallo che va da almeno circa 0,01 mg/kg a circa 200 fino a 550 mg/kg, da almeno circa 0,01 mg/kg a circa 100 fino 300<m>£i/kg, da almeno circa 0,1 mg/kg a circa 50 fino 100 mg/kg o da almeno circa 1 mg/kg a circa fino 10 fino 50 mg/kg di peso corporeo o da almeno circa lmg/kg a circa 20 mg/kg di peso corporeo, sebbene altri dosaggi possano essere utilizzati.
Per preparare una composizione farmaceutica, i peptidi dell'invenzione vengono sintetizzati od ottenuti mediante altri sistemi, purificati ove necessario o desiderato, e poi preferibilmente liofilizzati e stabilizzati. I peptidi possono essere utilizzati alla concentrazione desiderata ed opzionalmente combinati con altri agenti farmaceutici accettabili .
Pertanto, possono essere utilizzati uno o più dosaggi farmaceutici comprendenti i peptidi terapeutici rivendicati dall'invenzione tramite una varietà di vie di somministrazione comprendenti la via orale, topica, parenterale (che include la via subcutanea, intravenosa, intramuscolare e intraperitoneale), vaginale, rettale, dermale, transdermale, intratoracica, intrapolmonare e intranasale (via respiratoria).
Per la somministrazione topica, gli ingredienti attivi possono essere formulati come noto nell "arte a seconda della tipologia dell'applicazione, p.e. su unghie e pelle. Le forme utilizzate per la formulazione topica comprendono per esempio smalti, creme, latti detergenti, gel, polveri, dispersioni e microemulsioni, lozioni più o meno addensate, cerotti impregnati, unguenti e stick, aerosol (p.e. spray e schiume), saponi, detergenti, e lozioni. Altre frome convenzionali adatte allo stesso impiego comprendono bendaggi per ferite, fasciature, o altri rivestimenti di natura polimerica, unguenti, creme e lozioni.
In un'ulteriore forma di realizzazione preferita, i composti monomerici e multimerici o la composizione della presente invenzione possono essere usati in medicina veterinaria.
In un ulteriore aspetto, la composizione della presente invenzione comprende almeno un ulteriore agente antipatogenico, in particolare un agente antivirale e/o antibatterico, dove l'agente suddetto à ̈ un inibitore delle proteasi, un inibitore della polimerasi, un inibitore dell'integrasi , un inibitore dell'ingresso, un inibitore dell' assemblaggio/secrezione, un inibitore della traduzione, un immunostimolante o una loro combinazione .
Inoltre, la presente invenzione verrà spiegata in maggior dettaglio mediante le figure e gli esempi seguenti :
Nell'ambito delle seguenti figure es esempi, i composti peptidici multimerici particolarmente preferiti della presente invenzione, formule (VI) e (VII) sono qui riferiti come SB105 e SB105A10, rispettivamente. Come controllo negativo, viene utilizzato il composto peptidico multimerico qui riferito come SB104. Le strutture di detti composti peptidici sono mostrate in tabella 2, dove A Ã ̈ aminoacido alanina, S Ã ̈ serina, L Ã ̈ leucina, R Ã ̈ arginina, V Ã ̈ vaiina, I Ã ̈ isoleucina, K Ã ̈ lisina, Q Ã ̈ glutammina, ed N Ã ̈ asparagina.
Tabella 2
Nome del Sequenza peptidica (da N- a -Formula
composto C)
VI SB105 (H-ASLRVRIKKQ) 4-Lys2-Lys-£-Ala VII SB105-A10 (H-ASLRVRIKK) 4- Lys2-Lys-g-Ala Vili SB104 (H-NKKIRVRL) 4-Lys2-Lys-p-Ala
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1 A e B. Attività antivirale dei peptidi dendrimerici SB105 (VI) e SB105-A10 (VII) nei confronti di HSV-1 e HSV-2. Colture di cellule Vero, pretrattate e trattate un'ora prima e poi durante l'infezione con concentrazioni crescenti dei peptidi SB105 o SB105-A10, sono state infettate con HSV-1 (pannello A) o con HSV-2 (pannello B) ad una M.O.I. di 0,1 PFU/cellula, fino a quando un esteso effetto citopatico à ̈ stato osservato nei controlli non trattati. La resa virale di HSV-1 e HSV-2 à ̈ stata poi valutata titolando 1'infettività dei sovranatanti dei lisati di cellule Vero mediante un saggio standard delle placche di lisi. Le placche di lisi sono state contate al microscopio e la media delle placche per ogni concentrazione di peptide à ̈ stata espressa come percentuale della media delle placche dei controlli non trattati. Il numero delle placche à ̈ poi stato interpolato con la concentrazione dei composti in esame e la concentrazione in grado di ridurre del 50% la formazione delle placche (IC50) à ̈ stata determinata. I risultati raffigurati rappresentano i valori medi ± la deviazione standard (SD) di tre esperimenti indipendenti.
Figura 2. L'esposizione ai peptidi dendrimerici SB105 e SB105-A10 dopo l'adsorbimento virale non influenza l'entrata di HSV-1 e HSV-2 nelle cellule Vero. Colture di cellule Vero in monostrato e preraffreddate a 4° C, sono state infettate con 200 PFU di HSV-1 o HSV-2 per 3 ore a 4°C, lavate e poi incubate con differenti concentrazioni di SB105, SB105-A10, SB104 o eparina a 37°C per 2 ore prima dell'inattivazione dei virus extracellulari. Le colture sono poi state ricoperte con terreno di coltura contenente 1,2% metilcellulosa, e incubate a 37°C. Dopo 48 ore, le placche di lisi virale sono state contate e le medie del numero delle placche per ogni concentrazione di composto sono state espresse come percentuale dei valori medi dei controlli non trattati. I risultati mostrati rappresentano i valori medi ± la deviazione standard (SD) di tre esperimenti indipendenti .
Figura 3. I peptidi dendrimerici SB105 e SB105-A10 inibiscono l'assorbimento di HSV-1 e HSV-2 alle cellule Vero. Colture pre-raffreddate di cellule Vero sono state incubate a 4°C con differenti concentrazioni di SB105, SB105-A10, SB104 o eparina e con 200 PFU di HSV-1 o di HSV-2. Dopo l'assorbimento virale (3 ore a 4°C), le cellule sono state lavate tre volte con PBS freddo per rimuovere i composti e l'inoculo virale non assorbito, ricoperte con terreno di coltura contenente 1,2% metilcellulosa e incubate a 37°C per 48 h. Le placche di lisi virale sono state poi colorate e contate, e i valori medi del numero di placche per ciascuna concentrazione di peptidi sono stati espressi come percentuale delle medie dei controlli non trattati. I risultati mostrati rappresentano i valori medi ± la deviazione standard (SD) di tre esperimenti indipendenti.
Figure 4 A e B. I peptidi dendrimerici SB105 e SB105-A10 inibiscono la replicazione di HCMV. Colture di cellule HELF sono state infettate con il ceppo di laboratorio HCMV AD169 (Figura 4 A) o con l'isolato clinico HCMV ALI (Figura 4 B) ad una M.O.I. di 1 PFU/cellula, e, dove indicato, le cellule sono state pre-trattate e trattate con concentrazioni crescenti dei diversi peptidi un'ora prima e durante l'infezione, fino a quando un esteso effetto citopatico non à ̈ stato osservato nelle colture di controllo non trattate.
Le colture di cellule HUVEC sono state infettate con il ceppo endoteliotropico e isolato clinico HCMV VR1814 (Figura 4 B) ad una M.O.I di 1. La replicazione di AD169 o di ALI à ̈ stata poi valutata titolando nelle cellule HELF 1'infettività del sovranatante delle sospensioni HELF con il metodo standard delle placche di lisi virale. La replicazione di VR1814 à ̈ stata invece misurata titolando nelle cellule HELF 1'infettività dei sovranatanti di sospensioni cellulari mediante immunoperossidasi di colorazione HUVEC mediante una procedura indiretta con l'impiego di un anticorpo monoclonale (mAb) che riconosce le proteine IE di HCMV. Le placche virali sono state contate al microscopio, e i valori medi del numero di placche per ciascuna concentrazione di peptide sono stati espressi come percentuale delle medie del numero di placche dei controlli. Il numero di placche à ̈ poi stato interpolato con la concentrazione dei peptidi per determinare la concentrazione che produce una riduzione del 50% (IC50) nella formazione delle placche. I risultati riportati rappresentano i valori medi ± la deviazione standard (SD) di tre esperimenti indipendenti .
Figura 5. I peptidi dendrimerici SB105 e SB105-A10 non inibiscono l'entrata di HCMV nelle cellule HELF se aggiunti dopo l'assorbimento virale. Colture monostrati di cellule HELF pre-raffreddate sono state infettate con 200 PFU di HCMV AD169 per 3 ore a 4°C, lavate e incubate con differenti concentrazioni di SB105, SB105-A10, SB104 o eparina a 37°C per 2 ore prima dell'inattivazione dei virus extracellulari. Le colture sono poi state ricoperte con terreno contenente 1,2% metilcellulosa e incubate a 37°C per 6 giorni. Successivamente, le placche di lisi virale sono state contate e i valori medi del numero di placche per ciascuna concentrazione di peptide sono stati espressi come percentuale della media delle placche dei controlli non trattati. I risultati riportati sono relativi ai valori medi ± deviazione standard (SD) di tre esperimenti indipendenti.
Figura 6. I peptidi dendrimerici SB105 e SB105-A10 inibiscono l'assorbimento di HCMV alle cellule bersaglio. Colture pre-raffreddate di cellule HELF sono state incubate a 4°C con differenti concentrazioni di SB105, SB105-A10, SB104 o eparina e con 200 PFU di HCMV AD169. Dopo l'assorbimento virale (3 ore a 4°C), le cellule sono state lavate tre volte con PBS freddo per rimuovere il composto e l'inoculo virale non assorbito, ricoperte con terreno di coltura contenente 1,2% metilcellulosa e incubate a 37°C per 6 giorni. Le placche di lisi virale sono poi state colorate e contate e i valori medi del numero di placche per ciascuna concentrazione di peptide sono stati espressi come percentuale delle medie dei controlli. I risultati raffigurati rappresentano i valori medi ± deviazione standard (SD) di tre esperimenti indipendenti.
Figura 7. Caratterizzazione di HPV-16-SEAP PsV purificati. (A) Un'aliquota di preparazione di PsV Ã ̈ stata purificata mediante SDS-PAGE con colorante Comassie Brillinat Blue (corsia 1) o immunoblotting (corsia 2) con un anticorpo anti L-l (B0580 Dako Corporation, Carpinteria, CA, USA). (B) Microfotografia elettronica di una preparazione di PV purificata .
Figura 8. Analisi, mediante reai time RT-PCR quantitativa, del carico di HIV-1 ENA nei sovranatanti di colture cellulari di C8166 infettate con HIV-1, dopo 7 giorni di infezione. I dati dei campioni trattati con SB105-A10 o SB104 sono espressi come percentuali del controllo (100%) rappresentato da campioni infetti non trattati. I dati sono riportati come medie SD di tre esperimenti indipendenti eseguiti in duplicato.
Figura 9. Analisi e lisa della proteina HIV-1 p24 in sovranatanti di colture cellulari di C8166 infettate con HIV-1 dopo 7 giorni di infezione. I dati dei campioni trattati con SB105-A10 o SB104 sono espressi come percentuali del controllo (100%) rappresentato da campioni infetti non trattati. I dati sono riportati come medie SD di tre esperimenti indipendenti eseguiti in duplicato.
Figura 10. Determinazione della vitalità di cellule C8116 mediante la tecnica di esclusione del Trypan blue. C8166 non infettate sono state trattate o non trattate con concentrazioni scalari SB105-A10 o SB104 e l'analisi à ̈ stata condotta mediante la tecnica di esclusione di Trypan Blue dopo 7 giorni di trattamento. I dati dei campioni trattati con SB105-A10 o SB104 sono espressi come percentuali del controllo (100%) rappresentato da campioni non trattati. I dati sono riportati come medie SD di tre esperimenti indipendenti eseguiti in duplicato.
ESEMPI
Materiali
I solventi, tutti HPLC grade, sono stati ottenuti da Sigma Aldrich (St. Louis, MO, US) e utilizzati senza ulteriore purificazione. N,N-diisopropiletilamina (DIEA), piperidina, acido trifluoroacetico e triisopropilsilano sono stati acquistati da Aldrich e Fluka (St. Louis, MO, US). Fmoc-aminoacidi, HOBT, HBTU e le resine sono state fornite da Chem-Impex International (Wooddale, 111.) e Merck (Darmstadt, Germany).
Sintesi peptidica
Tutti i peptidi sono sintetizzati mediante sintesi su fase solida con un sintetizzatore MultiSynTech Syro (Witten, Germany) , utilizzando la chimica Fmoc/tBu. L'attivazione della reazione di coupling à ̈ stata eseguita mediante una soluzione di HOBt/ DIRA./ HBTU (l/2/0,9) in dimetilformammide (DMF) mentre la protezione Fmoc- sull'ammina à ̈ stata rimossa utilizzando una soluzione del 40% di piperidina in N-metil pirrolidone (NMP). I gruppi protettori delle catene laterali degli aminoacidi sono: tritile per la glutammina e 1 'asparagina; 2 ,2,4,6,7-pentamet il-diidro-benzof uran- 5-sulf onil (Pbf) per l'arginina; tert-butil etere per la serina tert-butilossicarbonil (Boc) per la lisina, prolina e triptofano. Fmoc-Lisina (Fmoc)-OH à ̈ l'aminoacido utilizzato per sintetizzare peptidi dimerici e tetramerici. Peptidi tetramerici, dimerici e lineari sono stati preparati su resine Rink amide 4-benzidrilamine (MBHA), valutando per via spettrofotmetrica il loading finale dei gruppi amminici liberi, mentre i peptidi acidi sono stati preparati mediante resina 2-clorotritil cloruro.
Tutti i peptidi sono stati staccati dalla resina e deprotetti mediante trattamento con acido trifluoroacetico, acqua e triisopropilsilano (95:2,5:2,5). I peptidi grezzi, ottenuti per precipitazione in etere dietilico, sono stati purificati mediante HPLC-UV Waters (Milford, MA) in colonne C12 Phenomenex e caratterizzati mediante spettrometria MALDI-TOF Bruker (Billerica, Massachusetts) .
ESEMPIO I
Sintesi dei peptidi tetramerici : Formula (VI) (SB105), (VII) (SB105-A10) e (Vili) (SB104)
La procedura generale della sintesi peptidica à ̈ stata precedentemente riportata. Al termine della sintesi, i peptidi vengono purificati mediante HPLC-UV e caratterizzati mediante MALDI-TOF. Il grado di purezza determinato mediante HPLC à ̈ >90%.
In particolare, i valori delle masse ottenuti sono: Formula (VI) calcolato 5194.5 (M), ottenuto 5195,5 (M+H); (Formula VII) calcolato 4681,9 (M), trovato 4682,9 (M+H); Formula (Vili) calcolato 4506,0 (M), trovato 4507,1 (M+H).
ESEMPIO II
Attività antivirale dei peptidi SB105 e SB105-A10 nei confronti di HSV-1 e
HSV-2
L'attività dei peptidi dendrimerici SB105 e SB105-A10 nei confronti della replicazione in vitro di HSV-1 e HSV-2 à ̈ stata analizzata mediante un saggio di riduzione della resa virale. A questo scopo, fibroblasti di scimmia verde africana (Vero) sono stati seminati alla densità di 5 x 10<4>/pozzetto in piastre da 24 pozzetti e poi incubati in duplicato a 37°C con terreno di coltura o con differenti concentrazioni dei peptidi SB105 (Formula (VI)) o SB105-A10 (Formula (VII)) in terreno di coltura o lasciate non trattate. Dopo 1 ora, le cellule sono state infettate con HSV-1 o HSV-2 ad una M.O.I. di 0,1 PFU/cellula. Dopo l'adsorbimento dei virus (2 ore a 37°C), le colture sono state incubate in terreno contenente il peptide corrispondente (trattamento pre- e post-), e poi mantenute fino a quando le colture di controllo non trattate presentavano un esteso effetto citopatico (48 ore p.i.). Le cellule e i sovranatanti del saggio antivirale sono stati poi raccolti, combinati e le cellule residuali distrutte mediante sonicazione. La resa virale à ̈ stata valutata titolando 1'infettività di sovranatanti da lisati cellulari in duplicato mediante un saggio standard delle placche di lisi su cellule Vero.
Per determinare la vitalità cellulare, colture di cellule Vero sono state esposte a concentrazioni crescenti dei peptidi e dopo 6 giorni di incubazione, il numero di cellule vitali à ̈ stato valutato mediante l'impiego del metodo basato sul bromuro di 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2 ,5-difenil tetrazolio (MTT), come descritto precedentemente (Pauwels et al., 1988).
Gli effetti inibitori dei peptidi SB105 e SB105-A10 sulla replicazione di HSV-1 e HSV-2 sono riportati rispettivamente nelle Figure 1A elB. Le concentrazioni di SB105 in grado di inibire al 50% la replicazione di HSV-1 e HSV-2 (IC50) erano rispettivamente di 1,76 e 7,6 Î1⁄4g/ml, mentre le IC50 di SB105-A10 per HSV-1 e HSV-2 erano rispettivamente di 5,1 e 4,2 Î1⁄4g/ml.
Inoltre, i peptidi analizzati non hanno mostrato una significativa capacità di ridurre la vitalità delle cellule Vero quando saggiati nella gamma delle concentrazioni efficaci nell'attività antivirale. Infatti, più del 90% delle cellule erano vitali dopo 6 giorni di esposizione a concentrazioni fino a 50 Î1⁄4g/ml (Figura 1A). Questo risultato conferma che l'attività antivirale dei peptidi non era dovuta ad effetti citotossici sulle cellule bersaglio.
Per verificare gli effetti dei peptidi SB105 and SB105-A10 sull'entrata di HSV-1 e HSV-2 nelle cellule bersaglio, saggi di entrata virale sono stati eseguiti essenzialmente come descritto da MacLean (1988) e con le modificazioni introdotte da Shogan et al. (2006). A questo scopo, cellule Vero seminate alla densità di 5 x 104/pozzetto in piastre da 24 pozzetti, sono state raffreddate a 4°C e poi infettate con 200 PFU di HSV-1 o HSV-2 per 3 ore a 4°C per permettere l'assorbimento virale. Successivamente, le colture infettate sono state lavate per tre volte con tampone fosfato (PBS) freddo per rimuovere l'inoculo virale non assorbito. In seguito, per verificare gli effetti dei peptidi dendrimerici sull'entrata virale, concentrazioni differenti di SB105, SB105-A10, SB104 (come controllo negativo per l'inibizione della replicazione virale) o eparina (come controllo positivo per l'inibizione dell'assorbimento virale) sono state aggiunte alle cellule, e la temperatura di incubazione à ̈ stata innalzata a 37°C per 2 ore prima dell'inattivazione dei virus extracellulari. Per inattivare i virus extracellulari e rimuovere dal saggio di entrata ogni composto in esame, le cellule infettate e trattate sono state incubate con 1 mi di una soluzione 100 mM glicina-140 mM NaCl, pH 3,0 per 60 secondi a temperatura ambiente. Le colture sono poi state lavate tre volte con PBS per neutralizzare il pH, ricoperte con terreno di coltura contenente 1,2% metilcellulosa e incubate a 37°C. Dopo ulteriori 48 ore, le piastre sono state fissate e colorate con cristalvioletto e le placche di lisi virale sono state contate. In parallelo, la stessa quantità di virus à ̈ stata assorbita alle cellule per 3 ore 4°C come descritto sopra e in seguito le cellule infettate sono state ricoperte con terreno di coltura contenente metilcellulosa. Il numero di placche di lisi prodotte da questi monostrati di cellule non trattate à ̈ stato definito come 100%.
La Figura 2 mostra come l'incubazione dei peptidi dopo l'assorbimento virale non influenza l'entrata dei virus nelle cellule bersaglio.
Per verificare se i peptidi SB105 and SB105-A10 agissero invece nella fase di assorbimento dei virus (MacLean, 1988; Shogan et al., 2006), cellule Vero seminate alla densità di 5 x 10<4>/pozzetto in piastre da 24 pozzetti, sono state raffreddate a 4°C e poi incubate in duplicato a 4°C con differenti concentrazioni di SB105, SB105-A10, SB104 (come controllo negativo per 1'inibizione della replicazione virale) o eparina (come controllo positivo per l'inibizione dell'assorbimento virale) e con 200 PFU di HSV-1 o HSV-2. Dopo l'assorbimento dei virus per 3 ore a 4°C, in condizioni in cui viene permesso esclusivamente l'assorbimento virale, le cellule sono state lavate tre volte con PBS freddo per rimuovere i composti e i virus non assorbiti, ricoperte con terreno di coltura contenente 1,2% metilcellulosa e incubate a 37°C. Dopo ulteriori 48 ore, le piastre sono state fissate e colorate con crystal violetto e le placche di lisi virale sono state contate. Come mostrato nella Figura 3, i peptidi SB105 and SB105-A10 inibivano l'assorbimento di HSV-1 e HSV-2 alle cellule Vero in modo concentrazione-dipendente . Inoltre, come atteso, il trattamento con eparina à ̈ sufficiente a prevenire completamente l'assorbimento virale. Al contrario, il peptide SB104 non ha ridotto significativamente il legame di virioini HSV-1 e HSV-2 alle cellule Vero. Nel loro insieme questi risultati indicano che SB105 and SB105-A10 inibiscono l'assorbimento di HSV-1 e HSV-2 alle cellule bersaglio.
ESEMPIO III
Attività antivirale dei peptidi SB105 and SB105-A10 contro HCMV
Per verificare l'effetto inibitorio dei peptidi dendrimerici SB105 e SB105-A10 sulla replicazione in vitro di HCMV à ̈ stato utilizzato un saggio di riduzione della resa virale (Luganini et al., 2008). A questo scopo, fibroblasti embrionali umani di polmone (HELF) a basso numero di passaggi seminati alla densità di 5 x 10<4>/pozzetto in piastre da 24 pozzetti sono stati incubati in duplicato a 37°C con differenti concentrazioni di peptidi SB105 o SB105-A10 disciolti in terreno di coltura o lasciati non trattati. Dopo 1 ora, le colture sono state infettate con HCMV AD169 o con HCMV ALI ad una M.O.I. di 1 PFU/cellula. Dopo l'assorbimento virale (2 ore a 37°C), le colture sono state mantenute in terreno contenente il corrispondente peptide e incubate fino a quando le colture di controllo manifestavano un esteso effetto citopatico (6 giorni p.i.). Le cellule e i sovranatanti del saggio antivirale sono stati poi combinati e le cellule residuali distrutte mediante sonicazione. La resa virale à ̈ stata poi misurata mediante la titolazione dell 'infettività dei sovranatanti dei lisati cellulari con il metodo standard delle placche di lisi su cellule HELF.
Per valutare gli effetti dei peptidi dendrimerici SB105 e SB105-A10 sulla replicazione in vitro del ceppo endoteliotropico HCMV VR1814, cellule endoteliali umane dalla vena ombelicale (HUVEC) a basso numero di passaggi (da 2 a 6) e ottenute mediante trattamento con tripsina della vena del cordone ombelicale sono state seminate alla densità di 5 x 10<4>/pozzetto in piastre da 24 pozzetti. Dopo 24 ore, le cellule sono state incubate in duplicato a 37°C, con differenti concentrazioni dei peptidi SB105 o SB105-A10, disciolti in terreno di coltura o lasciti non trattati. Dopo un'ora, le colture sono state infettate con HCMV VR1814 ad una M.O.I. di 1 PFU/cellula. In seguito all'assorbimento virale (2 ore a 37°C), le colture sono state mantenute in terreno contenente il corrispondente peptide e incubate fino a quando le colture di controllo non presentavano un esteso effetto citopatico (6 giorni p.i.). Le cellule e i sovranatanti del saggio antivirale sono stati poi combinati e distrutti mediante sonicazione. La resa di replicazione virale à ̈ stata misurata titolando su cellule HELF 1'infettività dei sovranatanti dei lisati cellulari mediante una procedura di colorazione indiretta con immunoperossidasi su HUVEC usando un anticorpo monoclonale (mAb) che riconosce le proteine IE1 e IE2 di HCMV (clone E13; Argene Biosoft) (Revello et al., 2001).
Per determinare la vitalità cellulare, cellule HELF o HUVEC sono state esposte a concentrazioni crescenti dei peptidi. Dopo 6 giorni di incubazione, il numero di cellule vitali à ̈ stato misurato con il metodo che impiega il 3-(4,5-dimethylthiazol-2-il)-2,5-diphenyltetrazolium bromuro (MTT), come descritto in precedenza da Pauwels et al., 1988.
Come mostrato in Figura 4A, il pre-trattamento delle cellule HELF con i peptidi SB105 e SB105-A10 un'ora prima dell'infezione determina un significativo effetto inibitorio concentrazionedipendente sulla replicazione in vitro del ceppo di laboratorio HCMV AD169 a 6 giorni p.i. Le concentrazioni dei peptidi SB105 e SB105-A10 in grado di ridurre del 50% la replicazione di HCMV AD169 (IC50) erano rispettivamente di 1,17 e 1,36 Î1⁄4Ï‚/τηΠ. Gli effetti inibitori di SB105 e SB105-A10 non erano ceppo virale- o cellula-specifici in quanto, come riportato in Figura 4B, sono stati osservati in cellule HELF infettate con l'isolato clinico di ALI (isolato da un lavaggio bronchioalveolare di un trapiantato di polmone) (IC50di 1,2 ^g/ml per SB105 e SB105-A10) o in cellule HUVEC infettate con il ceppo endoteliotropico VR1814 (un isolato clinico da un prelievo cervicale di una donna gravida e adattato alla crescita in cellule endoteliali) (Revello et al., 2001) (IC50 di 1,1 e di 1,3 Mg/ml rispettivamente per SB105 e per SB105-A10) .
Nessuno dei peptidi analizzati ha dimostrato un effetto inibitorio sulla vitalità delle cellule HELF o HUVEC quando impiegati nella gamma delle concentrazioni antivirali efficaci, in quanto più del 90% delle cellule erano vitali dopo 6 giorni di esposizione a concentrazioni di peptidi fino a 50 Î1⁄4g/ml (Figura 4A) . Questo risultato dimostra che l'attività antivirale contro HCMV non era quindi dovuta ad effetti citotossici sulle cellule bersaglio .
Per esaminare gli effetti di SB105 e SB105-A10 sull'entrata di HCMV nelle cellule bersaglio, cellule HELF seminate alla densità di 5 x 10<4>/pozzetto in piastre da 24 pozzetti, sono state pre-raffreddate a 4°C e infettate con 200 PFU di HCMV AD169 per 3 ore a 4°C per permettere l'assorbimento del virus e poi lavate tre volte con tampone fosfato (PBS) freddo per rimuovere l'inoculo virale non assorbito. Successivamente, per analizzare l'effetto dei peptidi dendrimerici sull'entrata virale, differenti concentrazioni di SB105, SB105-A10 , SB104 (come controllo negativo per l'inibizione della replicazione virale) o eparina (come controllo positivo per l'inibizione dell'assorbimento virale) sono state aggiunte alle cellule e la temperatura à ̈ stata elevata a 37°C per 2 ore prima dell'inattivazione dei virus extracellulari. Per inattivare i virus extracellulari (e rimuovere ogni composto in esame dal saggio di entrata virale), le cellule sono state incubate in 1 mi di una soluzione di 100 mM glicina-140 mM NaCl, pH 3,0 per 60 secondi a temperatura ambiente. Le cellule sono state poi lavate tre volte con PBS per neutralizzare il pH, ricoperte con terreno di coltura contenente 1,2% metilcellulosa, e incubate a 37°C. Dopo 6 giorni, le colture sono state fissate e colorate con cristalvioletto e le placche di lisi virale contate. In parallelo, la stessa quantità di HCMV à ̈ stata adsorbita alle cellule per 3 ore 4°C come descritto sopra e in seguito le cellule infetatte sono state ricoperte con terreno di coltura contenente metilcellulosa. Il numero di placche di lisi prodotte da queste colture non trattate à ̈ stato definito come 100%.
La Figura 5 mostra come l'incubazione dei peptidi dopo l'assorbimento virale non alteri la fase di entrata del virus nelle cellule bersaglio.
Per esaminare la capacità dei peptidi SB105 e SB105-A10 di interferire con la fase di assorbimento di HCMV alle cellule bersaglio, le cellule HELF sono state seminate alla densità di 5 x 10<4>/pozzetto in piastre da 24 pozzetti. Dopo 24 ore le colture sono state pre-raffreddate a 4°C e incubate in duplicato a 4°C con differenti concentrazioni di SB105, SB105-A10, SB104 (come controllo negativo per l'inibizione della replicazione virale) o di eparina (come controllo positivo per l'inibizione dell'assorbimento virale) e con 200 PFU di HCMV AD169. Dopo 1'asssorbimento per 3 ore a 4°C, in condizioni in cui viene assicurato esclusivamente 1'assorbimento del virus, le colture sono state lavate con PBS freddo per tre volte per rimuovere i composti in esame e il virus non assorbito, ricoperte con terreno di coltura contenente 1,2% metilcellulosa e infine incubate a 37°C per 6 giorni. In seguito, le piastre sono state fissate, colorate con cristalvioletto e le placche di lisi virale contate. Come riportato in Figura 6, i peptidi SB105 e SB105-A10 inibiscono potentemente l'attacco di HCMV alle cellule HELF in modo concentrazione-dipendente . Come atteso, il trattamento con eparina à ̈ in grado di prevenire l'assorbimento del virus, mentre il peptide SB104 non riduce in modo significativo l'attacco dei virioni di HCMV alle cellule HELF. Nel loro insieme questi risultati dimostrano che SB105 and SB105-A10 inibiscono la replicazione di HCMV impedendo l'assorbimento del virus alle cellule bersaglio.
ESEMPIO IV
Attività nei confronti dei papillomavirus umani. Colture cellulari
La linea cellulare 293TT, che deriva da cellule embrionali di rene umano trasformate dall'antigene T grande di SV40, Ã ̈ stata coltivata in terreno EAGLE modificato da Dulbecco (DMEM) (Gibco/BRL, Gaithesburg, MD, USA) supplementato con il 10% di siero di vitello (FBS) (Gibco/BRL, Gaithesburg, MD, USA), e 1% Glutamax-I (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e amminoacidi non essenziali.
Questa linea cellulare permette elevati livelli di espressione proteica se si utilizzano vettori che contengono l'origine di replicazione di SV40 a seguito della iper-replicazione del plasmide di espressione (Buck et al., 2004).
Produzione degli pseudovirioni.
Gli pseudovirioni (PsV) di HPV-16 sono stati prodotti seguendo il metodo descritto in letteratura (Buck et al., 2004). Brevemente, le cellule 293TT sono state trasfettate con il plasmide pl6sheLL, esprimente le proteine capsidi che maggiori e minori deel papilloma virus (LI e L2) insieme con un plasmide indicatore esprimente la fosfatasi alcalina secreta (SEAP) o la proteina fluorescente verde (GFP), chiamati pYSEAP o pfwB rispettivamente. I capsidi sono stati lasciati a maturare tutta la notte nel cellulare. Il surnatante chiarificato à ̈ stato caricato su di un gradiente di densità Optiprep al 27-33-39% temperatura ambiente per 4 ore. Il materiale à ̈ stato centrifugato a 234.000 x g per 3,30 ore a 16°C in un rotore SW50.1 (Beckman Coulter, Ine. Fullerton, CA, USA) e poi raccolto pungendo il fondo del tubo. Le frazioni sono state controllate per la purezza mediante gel su 105 tris-glicina, titolate su cellule 293TT per verificarne 1'infettività mediante determinazione di SEAP o GFP, e infine riunite e surgelate a -80°C fino a quando richiesto. La concentrazione di proteina LI presente nelle frazioni di PsV à ̈ stata determinata comparandola a concentrazioni note di siero albumina bovina in gel SDS-PAGE colorati con blu di Coomassie.
Saggi di inibizione.
Per i saggi basati sulla SEAP, le cellule 293TT sono state piastrate 3-4 ore prima in piastre a fondo piatto a 96 pozzetti trattate con coltura di tessuto ad una densità di 30.000 cellule/pozzetto in 100 Î1⁄4Î di tampone di neutralizzazione(DMEM senza rosso fenolo, 10% in FBS inattivata al calore, 1% glutammato, 1% aminoacidi non essenziali, 1% penicillina streptomicina, e 10 mM HEPES) . Per generare delle curve dose-risposta aliquote opportunamente diluite di PsV (80 Î1⁄4Î /pozzetto) sono state poste in piastre a 96 pozzetti di polistirene non trattate sterili (Nalge-Nunc, Roskilde, Denmark), combinate con 20 Î1⁄4Î di peptidi diluiti serialmente e poste in ghiaccio per 1 ora. La miscela di composti PSV 100-Î1⁄41 à ̈ stata poi addizionata alle cellule piastrate e incubata per 68-72 ore. La concentrazione finale di PsV era di circa lng/ml di LI. Dopo l'incubazione, sono stati raccolti 50 Î1⁄4Î di surnatante e chiarificati 1.500 x g per 5 min. Il contenuto di SEAP nel surnatante chiarificato à ̈ stato misurato utilizzando il kit di chemiluminescenza Great ESCAPE (BD Clontech, Mountain View, CA, USA) seguendo le istruzioni del produttore. Dieci minuti dopo l'aggiunta del substrato i campioni sono stati letti utilizzando un luminometro Lumino (Stratec Biomedicai System, Birkenfeld, Germany). I valori della concentrazione inibente al 50% (IC50) sono stati calcolati mediante il programma Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
I saggi basati sulla GFP sono stati eseguiti come descritto sopra. Le cellule positive alla GFP sono state contate mediante l'osservazione con un microscopio a fluorescenza e la percentuale di infezione à ̈ stata calcolata comparando i valori delle cellule trattate con quelli delle cellule non trattate .
Saggi di vitalità cellulare
Le cellule sono state seminate ad una densità di 5 x 10<4>/pozzetto in piastre a 24 pozzetti; il giorno successivo sono state trattate con diluizioni seriali dei peptidi per generare curve dose-risposta. 48 o 72 ore dopo il trattamento la vitalità cellulare à ̈ stata valutata mediante il saggio MTT. La concentrazione citotossica al 50% (CC50) à ̈ stata calcolata mediante il programma Prism.
Microscopia elettronica
Prima dell'analisi un'aliquota di preparazioni diluite HPV-PsV à ̈ stata posta su di una griglia e fatta seccare all'aria. La microscopia à ̈ stata condotta utilizzando il microscopio elettronico a trasmissione Philips CM10;le microfotografie sono state prese su sezioni a caso a differenti ingrandimenti.
Caratterizzazione degli pseudovirioni.
HPV-16 à ̈ stato scelto come modello perché à ̈ il tipo più oncogenico tra gli HPV genitali. Per verificare la qualità della preparazione di HPV-16-SEAP PsV che à ̈ stata utilizzata nei saggi successivi, un'aliquota à ̈ stata analizzata mediante SDS-PAGE. Come mostrato nella figura 7A una banda principale che migra a 55kD à ̈ stata rilevata mediante colorazione con blu di Coomassie (corsia 1). Mediante Western Blotting si à ̈ confermato che tale banda à ̈ la proteina capsidica LI (corsia 2). L'assenza di prodotti di degradazione proteolitica reattivi a LI à ̈ stata osservata al di sotto del peso di 55 kD indicando la buona qualità della preparazione. La figura 7B mostra una micrografia elettronica della stessa frazione .di PsV. Gli PsV mostrano consistentemente un diametro medio di 50-60 nm, che à ̈ simile a quello di un autentico capside HPV e appaiono particelle ben definite e poco aggregate.
Effetto inibitorio dei peptidi sintetici nei confronti dell'infezione da HPV PsV.
Gli eventi iniziali della infezione da PsV sono simili a quelli della infezione naturale da HPV poiché il PsV consiste di un plasmide indicatore allocato in un capside costituito dalle due proteine capsidiche (LI e L2) come il capside autentico di un HPV. Dopo il legame degli PsV alla superficie cellulare e il successivo ingresso nella cellula, il plasmide indicatore viene trasportato nel nucleo ove il gene indicatore viene espresso (Buck et al., 2004) . Noi abbiamo utilizzato un saggio basato sugli PsV per saggiare una collezione di peptidi sintetici come antagonisti dell'infezione da HPV-16. Per generare delle curve dose-risposta, diluizioni seriali di peptidi sono state pre-incubate con aliquote di HPV-16-SEAP PsV e poi addizionate alle cellule 293TT. L'inibizione dell'infezione del rilascio mediato da PsV del plasmide indicatore della SEAP 72 ore dopo l'infezione à ̈ stato valutato mediante la misurazione dei livelli di chemioluminescenza nei surnatanti cellulari. Come mostrato in Tabella 3, il peptide sintetico SB105-A10 ha inibito fortemente l'infezione da HPV-16-SEAP-PsV a IC50 di 2,8 pg/ml. Poiché il valore di CC50 era >100 pg/ml per ogni composto analizzato, l'attività inibitoria non à ̈ ascrivibile ad un effetto cictotossico . Risultati simili si ottengono con il saggio basato sulla GFP.
Tabella 3. Attività inibitoria dei peptidi sintetici nei confronti di HPV-16 PsV
Formula Peptide IC50* CC50*
VI SB105 11,6 >100
VII SB105-A10 2,8 >100
* valori espressi in Î1⁄4g/ml
ESEMPIO V
Attività contro HIV.
Attività antivirale del peptide SB105-A10 nei confronti di HIV.
Per valutare l'attività antivirale del peptide SB105-A10 nei confronti di HIV-1, abbiamo determinato quantitativamente il carico virale di RNA genomico (RNA virai load) e la proteina HIV-1 gag p24 in sovranatanti di cellule T linfoblastoidi C8166 infettate con il ceppo T tropico HIV-lIIIb. Il ceppo HIV-lIIIb alla concentrazione di 300pg di p24/ml à ̈ stato pre- incubato per 60 minuti a 37°C con concentrazioni scalari (0,1, 1, 5, 10, 20 pg/ml) di SB-105A10 o di SB104 e successivamente posto a contatto con cellule C8166 alla densità finale di lxlO<6>cellule/ml per 120 minuti a 37°C. Dopo quattro lavaggi in PBS, le cellule alla concentrazione di 5x10<s>cellule/ml sono state poste in terreno RPMI 1640 (Gibco, Paisley, UK) addizionato con il 10% FCS (Gibco) e in presenza delle concentrazioni scalari di SB105-A10 o di SB104. Dopo quattro giorni di coltura, metà del terreno di coltura à ̈ stato sostituito da terreno di coltura senza SB105-A10 o di SB104. La determinazione quantitativa del RNA virai load e della proteina HIV-1 gag p24 à ̈ stata eseguita 7 giorni dopo l'infezione nei sopranatanti delle colture cellulari in tre esperimenti separati in duplicato. HIV-1 RNA à ̈ stato estratto con il Roche high pure virai nucleic acid kit (Roche, Mannheim, Germania) da 200 pi di sopranatante di coltura. L'RNA virale à ̈ stato quindi quantificato mediante una reai time RT-PCR quantitativa come descritto precedentemente (Gibellini et al. 2004). In parallelo, à ̈ stata quantificata anche la proteina HIV-1 gag p24 mediante l'ELISA HIV-1 p24 antigen kit (Biomerieux, Marcy L'Etoile, Francia). Il trattamento con SB105-A10 riduce in modo significativo sia 1'HIV-1 RNA virai load sia la proteina HIV-1 p24 mentre SB104 non mostra una significativa inibizione della replicazione virale come indicato nelle Figure 8 e 9. La concentrazione di SB105-A10, che causa l'inibizione del 50% della replicazione virale HIV-1 IIIB(IC50), à ̈ di 2,5 Î1⁄49/πι1. Siccome l'attività antiretrovirale potrebbe essere dovuta alla possibile tossicità cellulare dei composti testati, abbiamo analizzato la vitalità cellulare con la tecnica di esclusione del Trypan blue dimostrando che SB105-Ai0non influenza significativamente la sopravvivenza cellulare come mostrato nella Figura 10. Nell'insieme questi risultati dimostrano che, nelle condizioni sperimentali sopracitate, la replicazione del ceppo HlV-lmbà ̈ significativamente inibita dal trattamento con SB105-Aio e che quindi questa molecola potrebbe essere considerata come un nuovo composto ad azione antiretrovirale .
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Claims (23)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Un composto peptidico avente una lunghezza fino a 35 residui aminoacidici comprendente una sequenza aminoacidica rappresentata dalla formula generale (I): R-V-R-I-K-[K]n-[Q]m in cui R à ̈ un residuo aminoacidico con una catena laterale di arginina o una catena laterale di guanidina N-alchil sostuita, in particolare L-arginina, V ed I sono residui aminoacidi indipendenemente selezionati tra: (i) un residuo aminoacidico con una catena laterale di vaiina, in particolare L-valina; (ii) un residuo aminoacidico con una catena laterale di isoleucina, in particolare L-isoleucina; (iii) un residuo aminoacidico con una catena lineare satura o insatura con almeno tre atomi di carbonio, preferibilmente con 3-10 atomi di C, in particolare norleucina, acido 2-aminopentanoico, 2-aminoottanoico, acido 2 aminodecanoico o acido 2-aminododecanoico; (iv) un residuo aminoacidico con una catena laterale ramificata satura o insatura con almeno 3 atomi di carbonio, preferibilmente con 3-10 atomi di C, in particolare tertleucina, 5-metil norleucina o omoisoleucina (4-metil norleucina); (v) un residuo aminoacidico con una catena laterale ciclica satura o insatura con almeno 3 atomi di carbonio, preferibilmente con 3-10 atomi di C, che à ̈ selezionata preferibilmente da residui ciclici con 3-6 atomi anulari, opzionalmente comprendenti un doppio legame C=C, come per esempio ciclopropil, ciclobutil, ciclobutenil, ciclopentil, ciclopentenil, cicloesil, cicloesenil, opzionalmente sostituti in qualuque posizione dell'anello con gruppi alifatici, preferibilmente gruppi alifatici aventi 1-10 atomi di carbonio, più preferibilmente 1-8 atomi di C, e ancor più preferibilmente 1-6 atomi di C, in particolare preferibilmente metil, etil, isopropil, n-propil, n-butil, isobutil, per esempio come norfuranomicina, carbafuranomicina, ciclopentilglicina , ciclopentenilglicina o cicloesenilglicina. K à ̈ un residuo aminoacidico con una catena laterale di lisina, in particolare L-lisina o un altro residuo aminoacidico con una catena laterale carica positivamente, in particolare ornitina o acido 2,4 diamminobutirrico; Q à ̈ un residuo aminoacidico con una catena laterale di glutammina, in particolare L-glutammina, ed m ed n sono indipendentemente 0 o 1, e in cui il composto peptidico può comprendere residui aminoacidici in conformazione L e/o D.
  2. 2. Un composto peptidico secondo la rivendicazione 1 avente una lunghezza fino a 35 residui aminoacidici comprendente una sequenza aminoacidica rappresentata dalla formula generale (II): A-S-L-R-V-R-I-K-[K]n-[Q]min cui R, K, Q, V, I, n ed m sono definiti come nella rivendicazione 1, e in cui A à ̈ un residuo aminoacidico con una catena laterale di alania, in particolare L-alanina. S à ̈ un residuo aminoacidico con una catena laterale alifatica o aromatica idrossi-sostituita, in particolare un residuo aminoacidico con una catena laterale di serina, in particolare L-serina. L à ̈ un residuo aminoacidico selezionato tra: (i) un residuo aminoacidico con una catena laterale di leucina, in particolare L-leucina; (ii) un residuo aminoacidico con una catena laterale di isoleucina, in particolare L-isoleucina; (iii) un residuo aminoacidico con una catena lineare satura o insatura con almeno tre atomi di carbonio, preferibilmente con 3-10 atomi di C, in particolare norleucina, acido 2-aminopentanoico, 2-aminoottanoico, acido 2-aminodecanoico o acido 2-aminododecanoico; (iv) un residuo aminoacidico con una catena laterale ramificata satura o insatura con almeno 3 atomi di carbonio, preferibilmente con 3-10 atomi di C, in particolare tertleucina, 5-metil norleucina o omoisoleucina (4-metil norleucina); (v) un residuo aminoacidico con una catena laterale ciclica satura o insatura con almeno 3 atomi di carbonio, preferibilmente con 3-10 atomi di C, che à ̈ selezionata preferibilmente da residui ciclici con 3-6 atomi anulari, opzionalmente comprendenti un doppio legame C=C, come per esempio ciclopropil, ciclobutil, ciclobutenil, ciclopentil, ciclopentenil, cicloesil, cicloesenil, opzionalmente sostituti in qualuque posizione dell'anello con gruppi alifatici, preferibilmente gruppi alifatici aventi 1-10 atomi di carbonio, più preferibilmente 1-8 atomi di C, e ancor più preferibilmente 1-6 atomi di C e in particolare preferibilmente metil, etil, isopropil, n-propil, n-butil, isobutil, per esempio come norfuranomicina, carbafuranomicina, ciclopetilglicina, ciclopentenilglicina o cicloesenilglicina.
  3. 3. Un composto peptidico secondo una delle rivendicazioni 1-2 che comprende una sequenza aminoacidica selezionata tra: A-S-L-R-V-R-I-K-K (H a) A-S-L-R-V-R-I-K-K-Q (Ilb) dove R, K, Q, V, I, A, L ed S sono definiti come nelle rivendicazioni 1 o 2.
  4. 4. Un composto peptidico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3 avente una lunghezza fino a 30 residui aminoacidici, preferibilmente fino a 15 residui aminoacidici.
  5. 5. Un composto peptidico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4 in forma lineare o ciclica.
  6. 6. Un composto multimerico comprendente una pluralità di composti peptidici come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5.
  7. 7. Il composto multimerico secondo la rivendicazione 6 multimerizzato su una matrice, in particolare una matrice selezionata tra: poli (N-alchil (metil)acrilamide), poli (N,N-dialchill (metil)acrilamide), polimelammina, destrano, ciclodestrina, polietilenglicole e/o polivinilpirrolidone .
  8. 8. Il composto multimerico secondo la rivendicazione 6 avente una struttura ramificata, in particolare una struttura dendrimerica.
  9. 9. Un composto multimerico secondo le rivendicazioni 6 o 8, selezionato tra: (i) R- (Y1 - R)m- Y1 - (R)m' (Illa) in cui R à ̈ un composto peptidico come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, Y1 à ̈ un legame covalente o un linker bifunzionale, per esempio un dialcole come per esempio propilenglicole, un acido dicarbossilico come per esempio l'acido succinico, una diammina come per esempio 1'etilendiammina, un aminoacido, un acido idrossi carbonilico, o un diisocianato, ed m à ̈ 0 o un numero intero positivo, preferibilmente 1, 2, 3, 4, 5 06, ed m' à ̈ O o l, (ii) [[(R)ni Yl’]n2] Y2 (IH b) in cui R à ̈ un composto peptidico come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, Y1<1>à ̈ in ogni caso indipendentemente un linker con una funzionalità di almeno 3, per esempio un aminoacido trifunzionale come per esempio la lisina, l'ornitina, l'acido 2 ,4-diamminobutirrico, la norlisina, 1'amminoalanina, l'acido aspartico o l'acido glutammico, e Y2 à ̈ un linker con una funzionalità di almeno 2, ed ni and n2 in ciascun caso indipendentemente sono un numero intero con un valore di almeno 2 preferibilmente 2, 3 o 4, più preferibilmente 2, (iii) {[[(R)m Yl']n2] Y2<1>}n3Y3 (IIIc) in cui R à ̈ un composto peptidico come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, Y1<1>e Y2<1>sono in ogni caso linkers indipendenti con una funzionalità di almeno 3, per esempio un aminoacido trifunzionale come per esempio lisina, ornitina, acido 2,4 diaminobutirrico, norlisina, amminoalanina, acido aspartico o acido glutammico, Y3 à ̈ un linker con una funzionalità di almeno 2 e ni, n2 e n3, in ognuno dei casi indipendentemente, sono numeri interi con un valore di almeno 2, preferibilmente 2, 3 o 4, più preferibilmente 2.
  10. 10. Il composto multimerico secondo la rivendicazione 9, in cui il composto multimerico (Illb) comprende 4 unità peptidiche ed ha la struttura:
  11. 11. Il composto multimerico secondo la rivendicazione 10, in cui il composto multimerico (Illb) ha la struttura: [[(R)2Lys]2]Lys-p-Ala
  12. 12. Il composto multimerico secondo le rivendicazioni 9-11, in cui R Ã ̈ un composto peptidico di formula (Ila) o (Ilb) come definito nella rivendicazione 3, in particolare un composto multimerico selezionato tra: (ASLRVRIKKQ)4-Lys2-Lys-p-Ala (IV) e (ASLRVRIKK)4-Lys2-Lys-p-Ala (V)
  13. 13. Il composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-12 che comprende almeno una modificazione, in particolare selezionata tra l'attacco di una porzione di lipide, amide, estere, acile e/o alchile.
  14. 14. Il composto secondo la rivendicazione 13, comprendente almeno un'unità lipidica, che à ̈ almeno un acido aminocarbossilico comprendente un gruppo idrocarburo lineare o ciclico, saturo, mono- o poliinsaturo, avente da 3 a 25 atomi di carbonio, p.e. acido 5-amino valerico, acido 5-amino-pentanoico, acido 8-amino-ottanoico o acido 2-aminodecanoico, e preferibilmente legato al all'estremità N- o C-terminale del composto.
  15. 15. Il composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-14 avente attività antipatogenica, in particolare attività antivirale contro virus a DNA e/o RNA, in particolare contro Herpes simplex, Citomegalovirus , Papilloma virus e il virus dell'immunodeficienza umana.
  16. 16. Il composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-15 per la prevenzione e il trattamento di infezioni da patogeni, in particolare infezioni da virus e/o da batteri.
  17. 17. Un composto secondo la rivendicazione 16 per la prevenzione e il trattamento di un'infezione sessulamente trasmissibile per via vaginale, rettale, orale, selezionate tra uno o più del gruppo di herpes simplex, Citomegalovirus, Papilloma virus umano, virus dell'immunodeficienza umana, Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae.
  18. 18. Una composizione per uso medico comprendente almeno un composto come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-13 insieme a veicolanti, diluenti e/o adiuvanti farmaceuticamente accettabili .
  19. 19. Una composizione secondo la rivendicazione 18 per uso in medicina umana.
  20. 20. La composizione secondo la rivendicazione 18 per uso in medicina veterinaria.
  21. 21. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8-20 in forma di dosaggio farmaceutico selezionata tra un solido, liquido o gel e loro combinazioni, per esempio un collirio, collutorio, unguento, aerosol o prodotto topico.
  22. 22. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 18-21, ulteriormente comprendente almeno un agente antipatogenico aggiuntivo, in particolare un agente antivirale e/o antibatterico
  23. 23. La composizione secondo la rivendicazione 22, in cui l'agente antivirale aggiuntivo à ̈ un inibitore delle proteasi, un inibitore della polimerasi, un inibitore dell'integrasi, un inibitore dell'ingresso, un inibitore dell'assemblaggio/della secrezione, un inibitore della traduzione, un immunostimolante o qualunque loro combinazione.
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