ITMI20002349A1 - Metodo e dispositivo per la rilevazione della carica batterica in fluidi biologici - Google Patents

Description

Descrizione di un brevetto d'invenzione

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda la rilevazione di batteri nei fluidi biologici e, preferibilmente, nelle urine e nel sangue. Più specificatamente, l'oggetto di questa invenzione consiste in un metodo e un dispositivo particolarmente adatto per la selezione di campioni di fluido biologico, in particolare urina o sangue, da sottoporre ad ulteriore accertamenti analitici per la determinazione di infezioni batteriche.

In particolare, l'invenzione si riferisce ad un metodo per la rilevazione delle infezioni batteriche, mediante un sistema completo di contenitori per il prelievo e l'esame del campione di fluido biologico.

Il metodo e il dispositivo di questa invenzione sono particolarmente adatti per l'esecuzione in un sistema completamente automatizzato.

Il suddetto metodo comprende le seguenti operazioni: (a) introdurre in un primo contenitore del tipo usualmente impiegato per la campionatura ed analisi di fluidi biologici (che d'ora in poi verrà identificato come provetta A, indipendentemente dalla sua forma specifica e dimensioni) una quantità di detto fluido biologico, in particolare urina o sangue, sufficiente per la determinazione analitica della carica batterica in esso presente, detto contenitore essendo assemblato con un secondo contenitore sostanzialmente del medesimo tipo, tale secondo contenitore (che d'ora in poi verrà identificato come provetta B, indipendentemente dalla sua forma e dimensioni) contenendo un mezzo di coltura in quantità sufficiente per promuovere la crescita della carica batterica contenuta nel campione di fluido biologico introdotto nel primo contenitore; (b) sottoporre il sistema assemblato delle provette A e B ad azione centrifuga in modo da incrementare in maniera sostanziale la concentrazione della carica batterica nel fondo della provetta A inserita nella provetta B; (c) esercitare una pressione sul liquido sovrastante e determinare il trasferimento di tale carica batterica concentrata nella provetta B mediante la perforazione del fondo della provetta A che separa detta carica batterica concentrata dalla provetta B; (d) produrre nella provetta B le condizioni adatte per far crescere in un tempo sufficientemente breve la carica batterica concentrata ivi trasferita; (e) determinare con metodi per se noti la carica batterica originale del campione prelevato attraverso, l'osservazione della crescita nel tempo della carica batterica trasferita nella provetta B. Il metodo permette di rilevare se la carica batterica iniziale del campione assume valori clinicamente significanti, secondo ì criteri usualmente applicati nelle tecniche diagnostiche, tali da rendere necessaria o, comunque, consigliabile la sua ulteriore valutazione microbiologica e dì selezionare a tal fine i campioni rispondenti ai suddetti criteri.

Un aspetto particolare del metodo di questa invenzione è costituito dal fatto che il trasferimento della carica batterica definito nel passaggio (c) è determinato dalla perforazione meccanica del fondo della provetta A per opera di una appendice che si protende all'interno della provetta B a seguito di un movimento di translazione assiale di una provetta rispetto all'altra e all'esercizio di una pressione sul fluido biologico contenuto nella provetta A.

L'obbiettivo principale delle indagini batteriologiche è la rilevazione di batteri in un campione clinico nel tempo più breve possibile per una rapida diagnosi e di conseguenza una rapida e corretta terapia.

Inoltre la diminuzione dei tempi di analisi riduce anche i costi dell'analisi stessa.

Per ottenere questi obbiettivi devono essere utilizzati terreni colturali idonei, temperature e condizioni di incubazione appropriate alla crescita batterica.

Oggi sono sempre più richieste, da parte degli operatori di laboratorio, condizioni di lavoro di elevata sicurezza, come ad esempio, l'utilizzazione di materiale usa e getta ("disposable").

Le infezioni del tratto urinario sono seconde in frequenza, solo alle infezioni del tratto respiratorio e, comunque, più frequenti delle infezioni del sangue.

Pertanto, a titolo esemplificativo dell'invenzione, viene qui di seguito descritta con maggior dettaglio l'applicazione della medesima nella rilevazione della carica batterica delle urine, pur confermando la sua completa funzionalità nel rilevamento delle infezioni batteriche negli altri fluidi biologici, come per esempio, il sangue.

Una infezione urinaria viene normalmente associata ad una concentrazione batterica maggiore o uguale a IO<5 >unità formanti colonia/mL (CFU/mL), significativa di batteriuria (Pezzlo M.T., et al, rif. 1).

In certi pazienti, ad esempio, quelli immunodepressi, anche una concentrazione di 10<4 >CFU/mL può essere una condizione significativa di batteriuria.

La rapida rilevazione di concentrazioni batteriche di questo ordine di grandezza con un metodo affidabile faciliterebbe enormemente una precoce e specifica diagnosi.

E' quindi evidente la necessità di poter disporre di un rapido e semplice test per la determinazione di batteriuria.

Nel caso specifico delle urine, inoltre, generalmente solo il 20-30% dei campioni valutati risulta positivo, per cui sono evidenti l'utilità ed i vantaggi di uno screening che permetta di eliminare a priori campioni che non meritano una valutazione finale della carica batterica e di una sensibilità specifica dei germi ai vari antibiotici.

I metodi attuali tradizionali di analisi microbiologica delle urine includono tecniche microscopiche con colorazioni varie e condizioni culturali specifiche come, ad esempio, il metodo dell'ansa calibrata: per mezzo di un bastoncino di plastica con all'estremità un'occhiello di dimensioni calibrate {da 1 a 10 microlitri), si raccoglie il campione e si pone su una piastra batteriologica contenente un idoneo terreno colturale. La piastra viene quindi incubata in un termostato a 37° per almeno 24 .ore. Allo scadere del tempo vengono contate le colonie batteriche che si sono sviluppate e rapportate a 1 mL. Se la carica è superiore o uguale a IO<4 >o IO<5 >l'esame prosegue con l'identificazione della specie batterica e l'esame dell'antibiogramma.

Un esempio di sistemi manuali per l'identificazione è API SYSTEM/BIOMERIEUX, mentre esempi di sistemi automatici sono VITEK/BIOMERIEUX e MICROSCAN/DADE-BEHRING (Stager C.E. et al., rif.

8; Funke G. et al., rif. 9).

L'antibiogramma può essere ottenuto manualmente con il metodo Kirby Bauer o con sistemi automatizzati ad esempio con ATB/BIOMERIEUX.

Tuttavia, in questo modo vengono esaminati, indistintamente, tutti i campioni.

Esistono anche metodi automatici per lo screening urinario che utilizzano una lettura con raggio laser per la rilevazione di presenza batterica. (Richet H., et al., rif. 2).

Questo metodo presenta, però, alcuni svantaggi, tra cui la eccessiva e pericolosa manipolazione del campione urinario da parte dell'operatore (l'urina deve essere prelevata manualmente e deposta, sempre manualmente, nella provetta in vetro contenente il terreno di coltura) e scarsa sensibilità.

Infatti, urine con alta ematuria oppure molto torbide per un'alta concentrazione di sali, possono esprimere risultati falsamente negativi.

Sono noti anche altri sistemi diagnostici per lo screening delle urine basati su principi e tempi di rilevazione diversi (Hubbard W.A., et al., rif.

3; Murray P.R., et al., rif. 4; Wallis C. et al., rif. 5; Hale DeVon C., et al., rif. 6).

Ad esempio, un metodo colorimetrico si basa sulla filtrazione del campione: sul filtro rimangono adesi i batteri che, per mezzo di un colorante, si colorano ad intensità proporzionale alla carica batterica. Talvolta, però i batteri si aggregano tra di loro rendendo difficile la colorazione e di conseguenza l'interpretazione dei risultati.

Un altro sistema utilizza il principio della bioluminescenza rivelando l'ATP (Adenosintrifosfato) batterico. Il metodo è veloce, ma molto costoso.

Un lìmite di altri sistemi è la scarsa sensibilità nella rilevazione di IO<4 >CFU/mL con la necessità di prolungare l'esame anche fino a 5 ore.

Essenzialmente, quindi, i problemi da risolvere per lo screening delle urine sono tre:

1) sicurezza e minima manualità per il tecnico di laboratorio;

2) rapida rilevazione di una presenza numericamente significativa di batteri nelle urine;

3) accuratezza nell'analisi tenendo conto anche della presenza di possibili elementi interferenti nel campione (ad esempio sangue, cellule di sfaldamento o sostanze minerali che possono intorbidare le urine).

Il dispositivo particolarmente adatto per la realizzazione del metodo per l'analisi colturale nei fluidi biologici, in particolare, delle urine e del sangue consiste in un sistema di provette A e B che si possono assemblare inserendole a tenuta una nell'altra.

Più specificatamente un dispositivo particolarmente adatto alla realizzazione del metodo di questa invenzione consiste in un primo contenitore del tipo impiegato per la campionatura ed analisi dei fluidi biologici, in particolare sangue o urine, (provetta A) e di un secondo contenitore, sostanzialmente del medesimo tipo (provetta B), tali provette A e B essendo di forme e dimensioni tali che la porzione inferiore della provetta A possa essere inserita a tenuta nella porzione superiore della provetta B per formare un sistema assemblato, il fondo della provetta .A essendo perforabile meccanicamente e la provetta B essendo dotata di appendice (D) che si protende in direzione assiale all' interno della provetta B, atta a perforare il fondo della provetta A quando il sistema assemblato delle provette A e B viene sottoposto ad un primo movimento di translazione assiale di una provetta verso l'altra e a otturare il foro ivi praticato quando il suddetto sistema assemblato viene sottoposto ad un ulteriore movimento di translazione assiale di una provetta verso l'altra.

Nel dispositivo assemblato la provetta superiore A è inserita nella provetta inferiore B e vi rimane bloccata. La Figura 1 mostra il sistema delle provette A e B in forma assemblata.

La provetta A è costituita da un contenitore, preferibilmente di forma cilindrica. Il fondo della provetta A è perforabile meccanicamente. Esso è preferibilmente costituito da un setto C dello stesso materiale di cui è costituita la provetta ma di spessore inferiore, tale da risultare facilmente perforabile da parte di un'appendice che si protende in direzione assiale all'interno della provetta B a seguito di un movimento di translazione assiale di una provetta rispetto all'altra .

La porzione inferiore della provetta A che si inserisce nella provetta B ed entra in contatto con le pareti interne di quest'ultima può essere opportunamente sagomata e presentare dimensioni trasversali (diametro, se di forma cilindrica) leggermente inferiori a quelle della porzione superiore .

La provetta A è inoltre munita di un tappo a tenuta F di materiale perforabile mediante ago o altro strumento appuntito.

In una forma preferita di realizzazione dell'invenzione la parte terminale della provetta cilindrica A che si inserisce nella provetta B ha una forma tronco-conica che ha lo scopo di favorire la raccolta del concentrato batterico sul fondo della provetta stessa nella zona corrispondente al setto perforabile C.

La provetta B è costituita da un secondo contenitore la cui forma nella porzione superiore deve corrispondere a quella della porzione inferiore della provetta A affinché le due provette possano essere inserite una nell'altra.

Secondo un modo preferito di realizzazione dell'invenzione, la porzione superiore della provetta B è di forma cilindrica. La sezione della porzione superiore della provetta B è tale che la provetta B possa essere assemblata con la provetta A tramite inserzione a tenuta della parte inferiore della provetta A nella parte superiore della provetta B.

La provetta B è munita di un appendice interna D di forma preferibilmente cilindrica che si protende in direzione assiale all'interno della provetta stessa verso la sua imboccatura di lunghezza tale che, quando le due provette sono assemblate, la parte terminale dell'appendice possa penetrare nel fondo della provetta A, a seguito di una translazione di una provetta verso l'altra.

La parte terminale della suddetta appendice ha forma e dimensioni tali da permettere il deflusso del liquido sovrastante dalla provetta A alla provetta B, quando l'appendice D penetra nella provetta A dopo rottura del setto C.

Detta parte terminale ha, preferibilmente, una forma leggermente assottigliata e, preferibilmente, è dotata di un orifizio, p.e. una scanalatura, E che favorisce il deflusso del concentrato batterico dalla provetta A alla provetta B durante la fase di trasferimento. La forma e le dimensioni della parte terminale dell'appendice D e della eventuale scanalatura E sono comunque tali che, successivamente alla rottura del setto C, l'effettuazione di una ulteriore translazione assiale di una provetta verso l'altra provochi la completa chiusura del foro praticato sul fondo della provetta A e la cessazione del deflusso del liquido dalla provetta A alla provetta B.

Secondo un esempio specifico ma non limitante della realizzazione dell'invenzione in cui sia la forma, sia le dimensioni dei contenitori, sia il materiale con cui questi sono fabbricati hanno un valore puramente dimostrativo, la provetta A, di forma cilindrica, è costituita di materiale plastico, p.e. polimetacririlato di metile (Plexiglas®, Perpex®, Lucite®) ed ha una lunghezza totale di 101 mm .

La porzione inferiore della provetta A avente un diametro esterno leggermente ridotto ha una lunghezza di 27 mm.

Il diametro esterno della porzione superiore della provetta A è di 17 mm mentre il diametro esterno della porzione inferiore che penetra nella provetta B, al di sopra della svasatura troncocronica, è di 13,8 mm. Il diametro esterno del fondo della provetta al termine della svasatura è di 7,5 mm.

Il diametro interno della parte superiore della provetta A è di 13 mm, mentre il diametro interno del fondo della provetta al termine della svasatura tronco-conica è di 6,3 mm. Il setto di spessore inferiore (0,4 mm) rispetto alle altre pareti della provetta e perforabile meccanicamente ha un diametro di 4 mm.

Sempre secondo il suddetto esempio dimostrativo, ma non limitante, di realizzazione dell'invenzione, la provetta B, di forma cilindrica nella sua porzione superiore, è costruita di materiale plastico avente adeguate caratteristiche di resistenza meccanica e trasparenza, p.e. K-resina, ed ha una lunghezza di 50,5 mm.

L'imboccatura della provetta B è munita di flangia ed all'imboccatura ha un diametro interno di 14 mm che, ad una distanza di 5 mm dall'imboccatura, si riduce a 13,6 mm.

La parte inferiore della provetta B può venire sagomata, p.e. riducendone il diametro o modificandone la forma geometrica, in modo da poter essere inserita in un mezzo di supporto e da questo trattenuta e/o facilitare la rilevazione della concentrazione batterica mediante un sistema ottico (per esempio, presentando due pareti piane parallele) .

Dal fondo della provetta si estende verticalmente verso l'imboccatura l'appendice D di forma cilindrica.

La lunghezza della porzione inferiore dell'appendice D è di 24 mm e il suo diametro costante è leggermente superiore a 4 mm in modo da poter chiudere completamente il foro praticato sul fondo della provetta A attraverso il setto perforabile C.

La parte terminale dell'appendice si estende per altri 5 mm e si assottiglia alla sua sommità presentando un diametro di 3,5 mm. Quest'ultima porzione, destinata a penetrare nella provetta A, contiene un orifizio costituito da una scanalatura verticale di 2 mm di larghezza e 3 mm di profondità .

Nell'attuazione pratica di questa invenzione la provetta A (con il setto C integro) viene fornita assemblata con la provetta B che contiene un terreno colturale liquido eugonico (che permette la crescita anche di germi "difficili"), in quantità variabile da 2 a 6 mL.

L'assemblaggio può essere effettuato, ad esempio, forzando la provetta superiore A dentro quella inferiore B.

Inoltre, ognuna delle due provette contiene un'ancoretta di materiale magnetizzato con dimensioni e forme diverse particolarmente adatte alle condizioni di agitazione specificamente richieste.

Nell'esempio dimostrativo e non limitante di cui sopra l'ancoretta all'interno della provetta A ha forma quadrata, con dimensioni di 2 mm X 2 mm e spessore di 1 mm mentre quella all'interno della provetta B ha forma di triangolo isoscele, con dimensioni 3 mm X 3 mm X 5 mm e spessore di 1 mm.

Ambedue sono particolarmente adatte per effettuare funzioni specifiche, la prima di agitazione magnetica lenta, la seconda di agitazione magnetica vigorosa.

Infatti, nella provetta A, lo scopo è quello di ottenere una leggera dispersione del concentrato, dopo centrifugazione, nella porzione di liquido terminale della stessa provetta, ad un volume minimo sufficiente (per esempio da 0,2 a 0,5 mL) affinché tutto il concentrato defluisca, dopo la rottura del setto, nella provetta B, senza intasamenti del setto stesso causati dall'impaccamento e senza perdite della carica batterica.

Nella provetta B, invece, lo scopo è ottenere un'agitazione vigorosa nel terreno eugonico di coltura, facilitando così lo sviluppo batterico. L'ancoretta triangolare con le suddette dimensioni si è rivelata la più adatta nelle condizioni applicate nell'esempio dimostrativo di cui sopra.

Il campione viene raccolto nella provetta A, sterile, sottovuoto calibrato, munita di tappo (F) di gomma, o di altro materiale naturale o sintetico, a tenuta; la raccolta può essere effettuata da qualsiasi contenitore e avviene tramite un "holder", sterile nel modo seguente:

i) si inserisce la cannula dell' "holder" nel contenitore che raccoglie il campione di fluido biologico da esaminare;

ii) la provetta A viene inserita nel cappuccio dell' "holder" e spinta fino a che l'ago non attraversa il tappo della provetta stessa;

iii) una quantità predeterminata di liquido defluisce all'interno della provetta A nella quale è stata praticata una riduzione della pressione (in generale, in una provetta A avente le dimensioni, sopra descritte, vengono introdotti 5-10 mL di liquido in funzione della depressione praticata all'interno della stessa).

A questo punto il sistema prevede una serie di fasi operative che possono essere eseguite automaticamente mediante un'apposita strumentazione.

Le suddette fasi operative possono essere identificate come segue:

a) Centrifugazione : il campione viene centrifugato affinché i batteri eventualmente presenti vengano sedimentati sul fondo della provetta. In questo modo la carica batterica viene concentrata notevolmente (almeno 40 volte) e la sensibilità nella rilevazione è aumentata nella stessa proporzione.

Ad esempio, centrifugando il campione a 3000 rpm (giri per minuto) per 30 minuti in una centrifuga con bracci oscillanti, tutti i batteri presenti nel campione sedimentano molto bene sul fondo della provetta.

b) Risospensione del sedimento: il sedimento viene risospeso molto delicatamente dall'ancoretta della provetta A, tramite un agitatore magnetico posto sotto la provetta.

In questo modo le cellule batteriche compatte vengono leggermente risospese cosicché nella fase successiva di deflusso del liquido dalla provetta A alla provetta B viene facilitato il trasporto dell'intera carica batterica.

Agitando il sedimento, ad esempio con un agitatore magnetico, a 60 rpm per un minuto si ottiene la risospensione del sedimento stesso a circa 0,2-0,5 mL di volume (in una provetta A avente le dimensioni sopra descritte).

c) Trasferimento del sedimento batterico nella provetta B: il trasferimento viene effettuato mediante le seguenti operazioni:

- il tappo di gomma viene spinto, p.e. tramite pistone, all'interno della provetta tanto quanto necessario per ottenere una precisa, predeterminata pressione sul liquido e il conseguente deflusso della porzione di esso che contiene la sospensione batterica concentrata quando viene praticata la rottura del setto C. Nel caso specifico dell'esempio prima riportato la translazione del pistone viene tarata in modo da ottenere un deflusso di 0,2-0,5 mL di liquido nella provetta B contenente il terreno eugonico di cultura;

- un movimento di translazione della provetta A verso la provetta B provoca la rottura del setto C ad opera dell'appendice D, la penetrazione della parte terminale dell'appendice stessa nella provetta A e il deflussso della sospensione batterica concentrata nella provetta B;

- la provetta B viene ulteriormente sospinta verso l'alto in modo che venga bloccato un ulteriore deflusso di liquido.

d) Agitazione e crescita della coltura: nel caso specifico sopra menzionato l'agitazione viene effettuata tramite un sistema di magneti che agita periodicamente la coltura accelerando così lo sviluppo batterico.

e) Rivelazione dello sviluppo batterico: un sistema ottico legge, ad intervalli predeterminati dì tempo, l'aumento di torbidità dovuto alla crescita batterica.

La crescita di una popolazione batterica può essere misurata quantitativamente prendendo come indice l'aumento di massa totale.

Il metodo generalmente usato per seguire l'aumento di massa si basa sull'intorbidamento del terreno di coltura dovuto alla riproduzione cellulare.

La torbidità può essere determinata e quantizzata sfruttando il principio che un raggio di luce che attraversa una sospensione viene disperso dalle particelle in modo proporzionale alla loro concentrazione e alla loro massa.

La riduzione della intensità di luce trasmessa dà in questo la misura della densità della popolazione batterica.

Un dato germe, inoculato in un idoneo terreno colturale e incubato a temperatura ottimale (37°C è la temperatura idonea per tutti i patogeni dell'uomo), si divide secondo una definita e costante curva di crescita, per cui, seguendo le variazioni di torbidità a intervalli regolari di tempo ed estrapolando in termini logaritmici i valori rilevati, si può risalire, sia pure in misura approssimata, alla concentrazione batterica presente inizialmente nel campione.

Sistemi automatici che utilizzano questo principio sono noti e già citati in questa domanda di brevetto (rif. 1, 3). Il principio basilare è sempre comunque quello che, in una coltura batterica, ogni microorganismo in crescita diventa progressivamente più grande fino ad una "taglia" critica per cui si divide in due microorganismi cellulari identici. (in: Topley and Wilson' s: Principles of bacteriology, virology, and immunity, rif. 7).

La rilevazione di concentrazioni dell'ordine di 10<4>/10<5 >cellule/mL in un campione di urina prelevata da un paziente e seminata in un terreno eugonico può essere critica per un sistema ottico, nel senso che il sistema stesso non ha sufficiente sensibilità di rilevazione di queste concentrazioni, anche dopo 3-4 ore di incubazione appropriata. Secondo il metodo di questa invenzione, la concentrazione della carica batterica realizzata mediante la centrifugazione del campione, aumenta la sensibilità di rilevazione, diminuendo nello stesso tempo, il tempo di analisi.

Le Figure 2, 3 e 4 mostrano il sistema delle provette A e B nelle sue tre diverse fasi di utilizzazione secondo il metodo di questa invenzione .

La Figura 2 rappresenta il sistema suddetto che mediante lo spostamento esercitato sul tappo F provoca la pressione sul liquido contenuto nella provetta A che determina il successivo trasferimento nella provetta B della quantità prestabilita di liquido contenente la carica batterica concentrata.

La Figura 3 rappresenta il sistema assemblato delle provette A e B dopo che la translazione della provetta B verso la provetta A ha provocato la rottura del setto C ed il conseguente trasferimento della carica batterica concentrata, facilitato dalla presenza della scanalatura E.

La Figura 4 rappresenta il sistema suddetto dopo che una ulteriore translazione della provetta B verso la provetta A ha determinato una perfetta chiusura del foro sul fondo della provetta e la cessazione del flusso di liquido attraverso la scanalatura E.

Operando nelle condizioni e con il sistema sopra descritti, entro tre ore dall'inizio dell'incubazione del campione sotto agitazione, si possono rilevare cariche iniziali di 104 cellule/mL, anche di germi caratterizzati da una crescita lenta, ad esempio Pseudomonas aeruginosa.

Con questi tempi di esecuzione il tecnico di laboratorio entro la mattina di lavoro riesce a discriminare i campioni negativi dai positivi con un sistema di screening preliminare; nel caso di campioni urinari, ad esempio, circa il 70-80% (percentualmente media di negativi sul totale di campioni) dei campioni può essere eliminato.

Quindi rimarrà solo, in termini percentuali, il 20-30% di campioni sul totale su cui eseguire la conta batterica, l'isolamento e le fasi di identificazione e determinazione della sensibilità antibiotica del germe.

Queste ulteriori valutazioni potranno essere eseguite secondo le tecniche comunemente note nel ramo, p.e. quelle già citate in questa domanda di brevetto {vedasi rif. 8 e 9).

Nell'esecuzione pratica del metodo di questa invenzione possono venir utilmente impiegate sostanze che provocano la lisi delle cellule siano esse del sangue o di altra origine (p.e., basse e alte vie urinarie). Questi tipi di cellule possono essere infatti presenti nelle urine e provocare un intorbidamento delle stesse e quindi determinare delle alterazioni nei sistemi ottici di lettura.

Tali sostanze appartengono al gruppo delle saponine e dei detergenti non ionici del tipo poliossietilene alchil fenoli come, p.e., il Triton X-100.

L'aggiunta di una miscela di queste sostanze al campione di fluido da esaminare permette una rapida ed efficace lisi sia dei globuli rossi, sia dei globuli bianchi, liberando i germi patogeni eventualmente inglobati e aumentando ulteriormente in questo modo la sensibilità della rilevazione. Queste sostanze, a certe concentrazioni, non sono tossiche per i germi.

Quindi il loro impiego, in caso di torbidità del campione urinario dovuta proprio alla presenza di globuli rossi e/o bianchi, diminuisce la torbidità stessa, aumentando così la sensibilità nella lettura.

Infatti campioni troppo torbidi possono rendere "cieco" il sistema di lettura, nel senso che, in caso di crescita batterica e quindi di aumento della torbidità, le variazioni possono non venire significativamente apprezzate.

Nella pratica, la miscela di saponina purificata e il detergente in rapporto che varia da 1:1 a 1:50 (in peso) sono introdotti nella provetta Δ, prima del suo impiego, in quantità tale da dare luogo ad una concentrazione che varia da 0,01 per cento a 0,5 per cento (in volume) rispetto al totale del campione da analizzare.

In tale modo il metodo di questa invenzione risulta efficace, oltre che con il sangue, anche con campioni urinari più difficili. Con la lisi di componenti cellulari del sangue, concentrando la carica batterica e facendo sviluppare i batteri in condizioni ottimali, possono essere infatti rivelati, entro 3 ore dall'inizio dell'analisi, i campioni positivi, limitando così solo a questi le indagini da parte del microbiologo per quanto riguarda le fasi successive di isolamento, identificazione e di sensibilità agli antibiotici.

Claims (17)

1. RIVENDICAZIONI 1) Metodo per la rilevazione della carica batterica in un fluido biologico comprendente le seguenti operazioni: {a) introdurre in un primo contenitore del tipo usualmente impiegato per la campionatura ed analisi di fluidi biologici (provetta A) una quantità di detto fluido biologico, sufficiente per la determinazione analitica della carica batterica in esso presente, detto contenitore essendo assemblato con un secondo contenitore sostanzialmente del medesimo tipo, tale secondo contenitore (provetta B) contenendo un mezzo di coltura in quantità sufficiente per promuovere la crescita della carica batterica contenuta nel campione di fluido biologico introdotto nel primo contenitore; (b) sottoporre il sistema assemblato delle provette A e B ad azione centrifuga in modo da incrementare in maniera sostanziale la concentrazione della carica batterica nel fondo della provetta A inserita nella provetta B; (c) esercitare una pressione sul liquido sovrastante e determinare il trasferimento di tale carica batterica concentrata nella provetta B mediante la perforazione del fondo della provetta A che separa detta carica batterica concentrata dalla provetta B; (d) produrre nella provetta B le condizioni adatte per far crescere in un tempo sufficientemente breve la carica batterica concentrata ivi trasferita; (e) determinare con metodi per se noti la carica batterica originale del campione prelevato attraverso l'osservazione della crescita nel tempo della carica batterica concentrata trasferita nella provetta B.
2. 2) Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui il trasferimento della carica batterica nella provetta B definito nel passaggio (c) è determinato dalla perforazione meccanica del fondo della provetta A per opera di una appendice che si protende all'interno della provetta B a seguito di un movimento di translazione di una provetta rispetto all'altra e all'esercizio di una pressione sul fluido biologico contenuto nella provetta A.
3. 3) Metodo secondo una delle rivendicazioni 1 e 2 dove il fluido biologico è urina o sangue.
4. 4) Metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 3 dove la concentrazione della carica batterica sul fondo della provetta A a seguito della centrifugazione viene incrementata di almeno 40 volte.
5. 5) Metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 4 dove la determinazione della carica batterica concentrata nella provetta B viene effettuata mediante un sistema ottico che legge, ad intervalli predeterminati di tempo, l'aumento di torbidità dovuta alla carica batteria e le variazioni dei valori di torbidità rilevate estrapolate in termini logaritmi, permettono di risalire alla concentrazione batterica presente originariamente nel campione prelevato.
6. 6) Metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 5 in cui al campione di fluido da esaminare vengono aggiunte sostanze che provocano la lisi delle cellule rosse e bianche eventualmente presenti nel campione.
7. 7) Metodo secondo la rivendicazione 6 in cui le sostanze aggiunte al campione da esaminare appartengono al gruppo delle saponine e dei detergenti non ionici.
8. 8) Metodo secondo la rivendicazione 7 in cui le sostanze aggiunte sono costituite da una miscela di saponina purificata e detergente non ionico del tipo dei poliossietilene alchil fenoli.
9. 9) Metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 8 dove la carica batterica sedimentata sul fondo della provetta A a seguito della centrifugazione viene leggermente risospesa mediante agitazione magnetica prima del trasferimento nella provetta B.
10. 10) Metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 9 dove i campioni che risultano contenere una carica batterica originale clinicamente significante vengono ulteriormente sottoposti a valutazione microbiologica per l'identificazione della specie batterica e l'esame dell'antibiogramma .
11. 11) Dispositivo atto alla realizzazione del metodo di una delle rivendicazioni da 1 a 10 consistente in un primo contenitore del tipo impiegato per la campionatura ed analisi di fluidi biologici (provetta A) e di un secondo contenitore sostanzialmente del medesimo tipo (provetta B), tale provette A e B essendo di forma e di dimensioni tali che la porzione inferiore della provetta A possa essere inserita a tenuta nella porzione superiore della provetta B per formare un sistema assemblato, il fondo della provetta A essendo perforabile meccanicamente e la provetta B, essendo dotata di un appendice (D) che si protende in direzione assiale all'interno della provetta B atta a perforare il fondo della provetta A quando il sistema assemblato delle provette A e B viene sottoposto ad un primo movimento di translazione assiale di una provetta verso l'altra e ad otturare il foro ivi praticato quando il suddetto sistema assemblato viene sottoposto ad un ulteriore movimento di translazione assiale di una provetta verso l'altra.
12. 12) Dispositivo secondo la rivendicazione 11 caratterizzato dal fatto che il fondo perforabile della provetta A comprende un setto (C) del medesimo materiale di cui è costituito il fondo di detta provetta ma di spessore inferiore a quello della residua zona circostante.
13. 13) Dispositivo secondo la rivendicazione 12 caratterizzato dal fatto che la parte terminale della provetta A che si inserisce nella provetta B ha una forma tronco-cronica atta a favorire la raccolta del concentrato batterico sul fondo della provetta A nella zona corrispondente al setto perforabile C.
14. 14 ) Dispositivo secondo una delle rivendicazioni 12 e 13 caratterizzato dal fatto che la parte terminale, dell'appendice (D) che si protende all'interno della provetta B ha dimensioni e forma leggermente assottigliati tali che la parte terminale della suddetta appendice, a seguito di una prima translazione assiale di una provetta verso l'altra, penetri nel fondo della provetta A e permetta il deflusso del liquido sovrastante dalla provetta A nella provetta B e, a seguito di un ulteriore movimento di translazione assiale di una provetta verso l'altra, provochi la completa chiusura del foro praticato sul fondo della provetta A e la cessazione del deflusso del liquido dalla provetta A alla provetta B.
15. 15) Dispositivo secondo la rivendicazione 14 caratterizzato dal fatto che la parte terminale dell'appendice D è dotata di un orifizio (E) che favorisce il deflusso del concentrato batterico dalla provetta A alla provetta B durante la fase di trasferimento.
16. 16) Dispositivo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 15 caratterizzato dal fatto che la parte inferiore della provetta B è sagomata in modo da poter essere inserita in un mezzo di supporto e/o facilitare la rilevazione della concentrazione batterica mediante un sistema ottico.
17. 17 ) Dispositivo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 16 caratterizzato dal fatto che ognuna delle due provette contiene un'ancoretta di materiale magnetizzato di dimensioni e forme adatte per effettuare rispettivamente un'agitazione magnetica lenta nella provetta A e un'agitazione magnetica vigorosa nella provetta B.