ITMI20001985A1 - Varianti dell'allergene maggiore par j 2 di parietaria judaica - Google Patents

Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:

“VARIANTI DELL’ALLERGENE MAGGIORE Par j 2 di Parietaria judaica "

La presente invenzione riguarda nuove varianti di un allergene del polline di piante della specie Parietaria judaica.

Più in particolare, la presente invenzione fornisce le sequenze amminoacidiche di varianti ipoallergeniche dell’allergene Par j 2, ottenute per mutagenesi sito-specifica della sequenza nucleotidica codificante per detto allergene. Le varianti ipoallergeniche possono essere utilizzate nell’ immunoterapia specifica di patologie allergiche causate dal polline di Parietaria judaica.

BACKGROUND DELL’INVENZIONE

Le allergie sono determinate da una anomalia del sistema immunitario che reagisce producendo anticorpi della classe IgE a proteine, di per sé del tutto innocue, contenute principalmente in pollini, acari, epiteli ed alcuni alimenti.

Stime recenti indicano che più del 10% della popolazione nei paesi industrializzati è affetta da questa patologia, che persistendo nel tempo può determinare un peggioramento dei sintomi (p. es. comparsa di asma) ed una sensibilizzazione ad altri allergeni, complicando così la scelta della terapia più idonea.

L’immunoterapia specifica iposensibilizzante (ITS), a differenza della terapia farmacologica, è l’unica forma di trattamento eziologico delle patologie allergiche in grado di modificare positivamente alcuni parametri immunologici che sono alla base della malattia.

L’ITS consiste nella somministrazione a dosi crescenti di estratti standardizzati (vaccini), ottenuti a partire dalla stessa sostanza causa della malattia.

In questo modo si aumenta progressivamente nel paziente una sorta di “tolleranza immunologica” nei confronti di tale sostanza che si accompagna ad una scomparsa dei sintomi allergici.

Il rischio di suscitare effetti collaterali anche gravi (1), per quanto notevolmente ridotto con Γ impiego di vaccini a lento rilascio o somministrati per vie alternative a quella iniettiva, ha limitato l’impiego dell’ITS nella terapia delle malattie allergiche.

Negli ultimi anni molta attenzione si è concentrata sullo sviluppo di vaccini efficaci e con un maggior grado di sicurezza. In particolare, un obiettivo importante è rappresentato dallo sviluppo di vaccini costituiti da proteine ricombinanti mutagenizzate, cioè di varianti ipoallergeniche in grado di incidere positivamente sul decorso naturale della malattia senza causare effetti secondari indesiderati (2).

Il polline di Parietaria rappresenta una delle più importanti cause di allergia nell’area mediterranea. I due principali allergeni del polline, Par j 1 (la cui sequenza nucleotidica è identificata nella banca dati GenBank dal codice AC X77414) e Par j 2 (AC X95865), sono proteine di circa 12 kD di peso molecolare con parziale omologia di sequenza e funzionale (3, 4, 5).

DESCRIZIONE DETTAGLIATA

Si è ora trovato che è possibile ridurre l’effetto allergenico di Par j 2 (GenBank, AC X95865) modificando la sua sequenza amminoacidica in almeno una delle posizioni n° 19, 23, 27, 35, 41, 46, 73 e 78, nelle quali è presente un residuo di Lys. Per “modifica” si intende la sostituzione di uno o più residui nelle posizioni specificate, preferibilmente con amminoacidi neutri o polari, o la delezione di uno o più residui Lys presenti nella forma naturale, o la contemporanea sostituzione e delezione di due o più residui.

Le seguenti mutazioni per sostituzione, riportate in SEQ ID N. 2 in grassetto, risultano preferite: GIn19, Ala23, Ala27, Gly35, Ala41, Ala46, G ly73 e Ser78, dove il numero in pedice indica la posizione del residuo amminoacidico nella sequenza. Maggiormente preferita è la variante in cui sono contemporaneamente presenti le otto sostituzioni indicate in SEQ ID N. 2 o, in alternativa, le 5 sostituzioni Gln19 Ala23, Ala27, Ala41 e Ala46 L’invenzione comprende inoltre un peptide immunologicamente attivo derivato dalla sequenza amminoacidica di Par j 2 e contenente almeno una delle sostituzioni/delezioni sopra descritte.

In un altro aspetto, l’invenzione è diretta ad una molecola di acido nucleico che codifica per una variante proteica di Par j 2 o per un peptide da essa derivata.

Le varianti di sequenza secondo l’invenzione possono essere facilmente preparate a partire dal cDNA della forma matura dell’allergene Par j 2, che non comprende la regione codificante il peptide segnale, opportunamente mutagenizzato nelle posizioni d’interesse.

In SEQ ID N. 1 è riportata la sequenza del cDNA (basi mutagenizzate in grassetto) codificante la variante preferita con le 8 sostituzioni corrispondenti a SEQ ID N. 2.

Il cDNA di SEQ ID N. 1 è stato espresso in cellule di Escherichia coli. La proteina ricombinante prodotta presenta una ridotta reattività alle IgE del siero di soggetti allergici al polline di Parietaria judaica. In particolare, esperimenti di Western blotting hanno dimostrato che circa il 75% (10/13) dei sieri che immunoreagiscono con l’allergene normale presenta una reattività ridotta con la variante mutagenizzata corrispondente a SEQ ID N. 2 [Fig. 1]. Questa reattività risulta mediamente diminuita di oltre F80%, come determinato con saggio ELISA [Fig. 2, mut 8]. La variante ottenuta con l' introduzione dei residui Gln19 Ala23, Ala27, Ala41 e Ala46 ha invece dimostrato un’allergenicità ridotta con la metà dei sieri analizzati [Fig. 1] e mediamente tale riduzione è del 50% [Fig. 2, mut 5]. Infine la variante dell’allergene Par j 2 con le 3 sostituzioni Gln19 Ala23 e Ala27 presenta una riduzione del legame alle IgE di circa il 20% [Fig. 2, mut 3].

L’invenzione si riferisce inoltre a un vettore di espressione comprendente una molecola di acido nucleico codificante per una qualsiasi delle varianti ipoallergeniche sopra definite.

Tale vettore può essere un plasmide, cosmide, virus, batteriofago o qualsiasi altro vettore comunemente utilizzato nell’ingegneria genetica, e può comprendere, in aggiunta alla molecola di acido nucleico dell’invenzione, elementi di controllo dell’espressione eucarioti o procarioti, quali sequenze regolatone per l’inizio e la terminazione della trascrizione, intensificatori (“enhancers”), promotori, sequenze segnale o altro.

L’invenzione comprende inoltre una cellula ospite procariota o eucariota trasformata o trasfettata con il vettore dell’invenzione. Generalmente per il clonaggio del vettore e l’espressione del cDNA verranno utilizzate cellule procariote quali Escherichia coli o Bacillus subtilis, o eucariote quali Saccharomyces cerevisiae.

Le varianti proteiche secondo l’invenzione possono essere prodotte come tali o come proteine di fusione.

Data la ridotta reattività alle IgE, tali varianti potranno essere utilizzate a scopo terapeutico nella preparazione di vaccini da impiegare nell’ immunoterapia della allergie al polline di Parietaria judaica.

Un altro aspetto dell’invenzione riguarda pertanto una composizione farmaceutica comprendente una quantità efficace di variante ipoallergenica dell’invenzione, eventualmente in combinazione con altri allergeni anche modificati di Parietaria judaica, insieme ad eccipienti farmaceuticamente accettabili. In una realizzazione preferita, tale composizione farmaceutica è un vaccino per uso nel trattamento profilattico o terapeutico di malattie allergiche, quali asma bronchiale, rinite allergica, dermatite allergica, congiuntivite allergica. I principi e la pratica della vaccinazione sono ben noti all’esperto del settore e sono descritti, per esempio, in (7) e (8).

Gli esempi che seguono illustrano l’invenzione in maggior dettaglio. ESEMPI

I metodi utilizzati nei seguenti esempi, se non altrimenti specificato, sono quelli descritti da Sambrook, Fritsch ET Maniatis “Molecular cloning. A laboratory manual” II ed. voi. 1-2-3 CSH Lab Press 1989.

ESEMPIO 1 - Mutagenesi sito-specifica del cDNA codificante per l’allergene Par i 2

La mutagenesi sito-specifica del cDNA codificante per l’allergene Par j 2 è condotta per amplificazione con PCR (Polymerase Chain Reaction) dello stesso cDNA clonato in un vettore procariota (pBluescript). Gli oligonucleotidi impiegati come primer per l’innesco della reazione della PCR presentano le opportune sostituzioni di basi. Per ogni mutagenesi è utilizzata una coppia complementare di tali oligonucleotidi, che si legano a regioni corrispondenti dei due filamenti della molecola di DNA. Dopo amplificazione, il templato originale non modificato è selettivamente degradato con digestione enzimatica catalizzata daH’enzima di restrizione Dpn 1. Cellule di Escherìchia coli sono quindi trasformate con le molecole mutagenizzate. I cloni ottenuti da singole colonie batteriche sono sequenziari con il metodo di Sanger per verificare la corretta modificazione delle basi e l’assenza di mutazioni aspecifiche del cDNA.

ESEMPIO 2 - Produzione della proteina Par i 2 e delle sue varianti Il cDNA normale di Par j 2 e quelli mutagenizzati, dopo clonaggio in un vettore di espressione (pCALn - Stratagene) sono espressi in cellule di Escherìchia coli secondo protocolli standard. Le cellule sono raccolte per centrifugazione e risospese in tampone PBS. La proteine ricombinanti sono isolate dopo lisi delle cellule batteriche per sonicazione ed eliminazione dei particolati cellulari con centrifugazione. Dal surnatante le proteine sono purificate per cromatografia di affinità, utilizzando colonne con legata alla matrice la proteina calmodulina che interagisce con la porzione di CBP (Calmodulin Binding Protein) fusa all’allergene.

ESEMPIO 3 - Analisi mediante Western blotting della allergenicità delle varianti di Par j 2

Uguali quantità dell’allergene ricombinante e della variante mutagenizzata sono analizzate mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide e successivo trasferimento su membrana di nitrocellulosa mediante elettroblotting, secondo la tecnica descritta da Towbin (6).

La membrana è incubata per un’ora in TBS contenente 5% di latte in polvere (tampone di saturazione) e quindi per una notte con singoli sieri di pazienti allergici alla Parietaria (RAST 3+ e 4+). Dopo tre lavaggi con TBS contenente Tween-20 allo 0,05%, gli anticorpi IgE legati alla membrana sono rivelati incubando per un’ora con antisiero anti-IgE umane coniugato a perossidasi e, dopo ulteriori lavaggi, con il sistema di rivelazione basato sull’utilizzo di una soluzione di DAB (Diamino benzidina) contenente H2O2 quale substrato delle perossidasi.

ESEMPIO 4 - Analisi con saggio ELISA della reattività alle IgE delle varianti di Par j 2

Uguali quantità (0,2 μg) di allergene normale e delle sue varianti mutagenizzate, in tampone carbonato/bicarbonato 50 mM pH 9,6, sono adsorbiti sui pozzetti di piastre di polistirene per saggi ELISA mediante incubazione a 4°C per 16 ore. Gli antigeni sono quindi lavati con soluzione di lavaggio (tampone fosfato 60 mM pH 6,5 contenente Tween-20 allo 0,05%) e i siti liberi sono saturati con soluzione diluente (25% siero di cavallo, EDTA 1 mM, Tween 20 0,05%, Thiomersal 0,01% in tampone fosfato 150 mM pH 7,4). Di un pool di sieri umani con reattività RAST 4+ sono prodotte diluizioni seriali in rapporto 1:2 in tampone diluente. Uguali aliquote (100 μΐ) delle varie diluizioni di siero sono aggiunte a ciascun campione e fatte incubare a 25°C per 2 ore. Dopo tre lavaggi è aggiunto Γ antisiero anti-IgE umane biotinilato diluito 1:1500 in tampone diluente, che è incubato a 25°C per 1,5 ore. Dopo tre lavaggi, lo sviluppo della reazione colorimetrica si ottiene aggiungendo 100 μl di reagente Ultra Blu (Intergen, Milford, MA) e incubando 15 minuti a 25°C. La reazione è bloccata con l’aggiunta di 100 μl di HC1 1 N e valutata con lettura a 450 nm allo spettrofotometro.

LISTA DELLE SEQUENZE

Claims (12)

1. RIVENDICAZIONI 1. Variante della forma naturale della proteina Par j 2 in cui almeno uno dei residui Lys presenti nelle posizioni 19, 23, 27, 35, 41, 46, 73 e 78 è sostituito e/o deleto.
2. 2. Variante secondo la rivendicazione 1, in cui detti residui sono sostituiti con amminoacidi neutri o polari.
3. 3. Variante secondo le rivendicazioni 1-2, in cui le sostituzioni sono scelte tra Gln19, Ala23, Ala27, Gly35, Ala41, Ala46, Gly73 e Ser78.
4. 4. Variante secondo le rivendicazioni 1-3, avente sequenza SEQ ID N. 2.
5. 5. Variante secondo le rivendicazioni 1-3, che presenta le sostituzioni Glnl9, Ala23, Ala27, Ala41 e Ala46.
6. 6. Peptide comprendente una parte immunologicamente attiva di una variante delle rivendicazioni 1-5, in cui sia presente almeno una sostituzione/delezione secondo la rivendicazione 1.
7. 7. Molecola di acido nucleico codificante per una variante proteica secondo le rivendicazioni 1-5 o per un peptide secondo la rivendicazione 6.
8. 8. Molecola di acido nucleico secondo la rivendicazione 7, di sequenza SEQ ID N. 1.
9. 9. Vettore comprendente la molecola di acido nucleico delle rivendicazioni 7-8.
10. 10. Cellula ospite trasdotta con il vettore della rivendicazione 9.
11. 11. Composizione farmaceutica comprendente una quantità efficace di una variante proteica secondo le rivendicazioni 1-5 o di un peptide secondo la rivendicazione 6 insieme ad eccipienti farmaceuticamente accettabili.
12. 12. Composizione secondo la rivendicazione 11, in forma di vaccino.