ITFI20110034A1 - Uso della oleuropeina aglicone per il trattamento del morbo di alzheimer. - Google Patents

Description

USO DELLA OLEUROPEINA AGLICONE PER IL TRATTAMENTO DEL MORBO DI ALZHEIMER

CAMPO DELL’INVENZIONE

L’invenzione si riferisce all’ambito delle sostanze per uso medico; in particolare si riferisce all’oleuropeina aglicone per l’uso nel trattamento terapeutico e/o profilattico del Morbo di Alzheimer (AD).

STATO DELL’ARTE

Il Morbo di Alzheimer (AD) è la più comune malattia neurodegenerativa legata all’invecchiamento, che conduce ad una disabilità progressiva e grave e, infine, alla morte. Si stima che, con l’invecchiamento della popolazione mondiale, il numero di persone affette da AD crescerà dalla cifra stimata attualmente di 26,6 milioni a 106,8 milioni nel 2050. Dal punto di vista neuropatologico, la malattia è caratterizzata dalla presenza sia nel parenchima cerebrale che nei neuroni presenti nelle regioni interessate di depositi amiloidi, costituiti soprattutto dal peptide Αβ(1-42) e suoi derivati e dalla proteina tau iperfosforilata. Molti dati suggeriscono che l’aggregazione amiloide, ed in particolare la prima fase di oligomerizzazione, sia la causa principale della malattia. E’ quindi ovvio che la ricerca di possibili farmaci attivi contro l’AD si focalizzi su molecole capaci di inibire la formazione di specie tossiche all’inizio del processo di aggregazione amiloide. Questo è lo scopo della presente invenzione.

L’oleuropeina, nella sua forma glicata, è il secoiridoide caratteristico della famiglia delle Oleaceae, e particolarmente di Olea Europaea, l’olivo. I secoiridoidi derivano dagli iridoidi (che contengono un anello ciclopentanico fuso con un anello eterociclico a sei atomi ossigenato) in seguito all’apertura dell’anello ciclopentanico successiva all’ossidazione e alla rottura di un legame carboniocarbonio. L’oleuropeina (metil ((4S,5E,6S)-4-[2-[2-(3,4-diidrossifenil)etossi]-2-ossoetil]-5-etilidene-6-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-triidrossi-6-(idrossimetil)ossan-2-il]ossi-4H-piran-3-carbossilato) è una specie chimica idrosolubile di peso molecolare 540,51 , e formula molecolare C25H32O13· In seguito all’idrolisi da parte di una glicosidasi presente nelle olive durante la maturazione e l’estrazione dell’olio extra vergine, la porzione glicosidica viene rilasciata e così l’oleuropeina aglicone, divenuta altamente idrofoba, si ritrova nell’olio.

L’oleuropeina aglicone è un composto di formula (I) con peso molecolare = 378, 18 e formula molecolare C19H22O8

L’Oleuropeina aglicone può essere preparata dall’oleuropeina mediante deglicosilazione in vitro ad opera della β-glicosidasi (EC 3.2.1.21) (Rigacci, S., Guidotti, V., Bucciantini, M., Parri, M., Nediani, C., Cerbai, E., Stefani, M., and Berti, A. “Oleuropein aglycon prevents cytotoxic amyloid aggregation of human amylin” (2010) J. Nutr. Biochem. 21 , 726-735). Rigacci et al. hanno dimostrato che l’oleuropeina aglicone è capace di interferire con l’aggregazione deN’amilina umana (hIAPP) portando ad una notevole riduzione della tossicità di hIAPP nei confronti di una linea cellulare pancreatica umana. L’oleuropeina aglicone è stata quindi proposta per la terapia del diabete mellito di tipo II.

Scopo della presente invenzione è quello di fornire una sostanza capace di inibire l’aggregazione del peptide Αβ(1-42), e quindi utile nel trattamento del morbo di Alzheimer.

SOMMARIO DELL’INVENZIONE

Sorprendentemente, è stato trovato che l’oleuropeina aglicone possiede una forte attività contro l’aggregazione amiloide tossica del peptide Αβ(1-42), ostacolando in modo specifico la formazione di oligomeri tossici. Inoltre è stato trovato che l’oleuropeina aglicone, una volta aggiunta ad aggregati fibrillari preesistenti di Αβ(1 -42), non favorisce il rilascio di oligomeri tossici e neutralizza la tossicità residua associata a queste specie molecolari.

Quindi oggetto della presente invenzione è l’oleuropeina aglicone per uso nel trattamento profilattico e/o terapeutico di AD.

Oggetto della presente invenzione sono anche composizioni farmaceutiche per il trattamento di AD, tali composizioni comprendenti l’oleuropeina aglicone ed almeno un altro ingrediente accettabile in ambito farmaceutico.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

La presente invenzione verrà meglio illustrata dai seguenti dettagli sperimentali. SEZIONE SPERIMENTALE

In accordo col sistema sperimentale descritto in Rigacci, S., et al.; “Oleuropein aglycon prevents cytotoxic amyloid aggregation of human amylin” (2010) J. Nutr. Biochem. 21 , 726-735, la deglicosilazione dell’oleuropeina viene eseguita incubando 5,5 μιτιοΐί di oleuropeina (Extrasynthese) in un tampone 0,1 M fosfato di sodio pH 7,0 (concentrazione finale di oleuropeina: 10 mM) con 7,55 U.l. di βglicosidasi (EC 3.2.1.21) tutta la notte a temperatura ambiente. In seguito alla deglicosilazione, l’oleuropeina aglicone diviene insolubile nel tampone acquoso e può essere precipitata mediante centrifugazione a 18.000 rpm per 10 min. Il supernatante viene recuperato e su di esso si determina la concentrazione di glucosio mediante un test enzimatico che usa la 3-D-glucosio:NAD ossidoreduttasi (EC 1.1.1.47) e l’aldoso-l-epimerasi (EC 5.13.3). La quantità di oleuropeina aglicone ottenuta viene stimata da quella del glucosio libero, essendo questi equimolari. Per mezzo della Gas Cromatografia-Spettrometria di Massa (GC-MS) abbiamo confermato che l’oleuropeina non è presente nel precipitato, mentre l’oleuropeina aglicone è completamente assente nel supernatante. L’oleuropeina aglicone è stata disciolta completamente alla concentrazione 100 mM in DMSO e conservata al buio.

Una soluzione alcalina monomerica 500 μΜ del peptide Αβ(1-42) (Bachem) viene ottenuta riprendendolo in una miscela di CH3CN / Na2C03(300 pM)/NaOH (250 mM) (48.3/48.3/3.4, v/v/v) e sonicandolo per 5 min. Dopo una diluizione intermedia a 100 μΜ con H20/Na2C03(300 pM)/NaOH (250 mM) (48.3/48.3/3.4, v/v/v), la soluzione d’uso di Αβ(1-42) (10 μΜ) è ottenuta diluendo in tampone fosfato 10mM pH 7,7 contenente 11 mM NaCI. La miscela è quindi incubata a 25 °C per periodi di tempo crescenti, in presenza o in assenza di diverse concentrazioni di oleuropeina aglicone ottenuta come descritto sopra. Il test della Tioflavina-T (ThT) è stato effettuato diluendo 10 μΙ_ delle varie miscele di aggregazione di Αβ(1-42) 10 μΜ (con o senza oleuropeina aglicone) 40 volte in un tampone 0.1 M Gly/NaOH, pH 8,5, contenente 20 μΜ ThT. L’intensità della fluorescenza emessa a 485 nM, in seguito all’eccitazione a 440 nm, aumenta in presenza di polimeri del peptide ricchi in struttura amiloide. La soluzione 100mM di oleuropeina aglicone in DMSO viene diluita nel tampone di aggregazione prima dell’uso così da essere 100x rispetto alla concentrazione finale. Le analisi di dose-dipendenza vengono eseguite saggiando i campioni di Αβ(1-42) incubati con una concentrazione molare 1x, 3x, 9x di oleuropeina aglicone. Per ogni tempo viene valutata la fluorescenza del bianco (Fb) che viene utilizzata per normalizzare quella del campione (Fs), secondo la formula “F = (Fs-Fb)/Fb”. Le analisi statistiche mostrano che l’oleuropeina aglicone inibisce in maniera dose-dipendente la comparsa di specie amiloidi di Αβ(1-42), con una soppressione quasi completa quando il rapporto molare tra oleuropeina aglicone e Αβ(1 -42) è 9.

Abbiamo eseguito analisi di dicroismo circolare per indagare le modificazioni strutturali indotte da oleuropeina aglicone durante l’aggregazione di Αβ(1-42). Αβ(1 -42) viene diluito a 20 μΜ in presenza o in assenza di 100 μΜ oleuropeina aglicone (rapporto molare 5x). Gli spettri delle miscele vengono registrati a 25 Ό (acquisizione dei dati ogni 1.0 nm, velocità di acquisizione 50 nm/min, tempo di risposta 1.0 s), effettuando 10 accumuli. Lo spettro del bianco viene acquisito e quindi sottratto allo spettro di ogni campione. Dopo 24 h di incubazione, lo spettro di Αβ(1 -42) mostra una chiara transizione verso la struttura beta (con un minimo a 218 nm), che è invece completamente assente nel campione che contiene oleuropeina aglicone; tale inibizione persiste anche dopo 48 h di incubazione. Si può concludere che l’oleuropeina aglicone impedisca le modificazioni strutturali precoci che conducono all’aggregazione amiloide di Αβ(1-42).

La conclusione è confermata dal test dell’ANS (acido anilino-naftalen-sulfonico), basato sulla capacità dell’ANS di legare raggruppamenti idrofobici esposti (una caratteristica tipica del misfolding proteico e dell’aggregazione amiloide) con un aumento dell’intensità dello spettro di emissione in fluorescenza nell'intervallo 420-620 nm, ed uno spostamento del suo massimo da 510 nm a 480 nm. 20 μί. di Αβ(1 -42) 10 μΜ, aggregata in assenza o in presenza di oleuropeina aglicone 9x, sono stati mescolati a diversi intervalli di tempo con 380 μΙ_ di ANS 25 μΜ in tampone fosfato 10 mM, pH 7,7 contenente NaCI 11mm. Dopo 72-96h di incubazione, in presenza di oleuropeina aglicone non abbiamo osservato alcun aumento nell’intensità, né alcuno spostamento nel massimo di emissione, dello spettro dell’ANS.

Dopo avere ottenuto informazioni sulle prime fasi dell’aggregazione amiloide in presenza o in assenza di oleuropeina aglicone, abbiamo analizzato le strutture più tardive mediante Microscopia Elettronica a Trasmissione (TEM) e Microscopia a Forza Atomica (AFM). Una soluzione di Αβ(1-42) invecchiata per 24h mostra la presenza di corte protofibrille e piccoli oligomeri che infine crescono dando abbondanti fibrille dopo 72h di invecchiamento. In presenza di oleuropeina aglicone dopo 24h prevale del materiale amorfo e dopo 72h è presente soltanto una scarsa popolazione di protofibrille. L’analisi di AFM dei campioni di Αβ(1-42) invecchiati per 7 giorni mostra tipiche fibrille amiloidi mature per Αβ(1-42) mentre in presenza di oleuropeina aglicone si ritrovano delle protofibrille curve “a perle”. Collettivamente, questi risultati indicano che l’oleuropeina aglicone interferisce pesantemente con l’intero processo di aggregazione di Αβ(1-42) portando alla formazione di specie morfologicamente diverse in ogni fase del processo.

La completa inibizione della formazione di oligomeri tossici del peptide Αβ(1-42) da parte dell’oleuropeina aglicone dopo 1-7 giorni di incubazione è confermata da esperimenti di dot blot eseguiti con anticorpi A11 specifici per gli oligomeri tossici pre-fibrillari.

L’effetto della oleuropeina aglicone sulla tossicità di Αβ(1 -42) viene saggiato usando la linea cellulare di neuroblastoma umano SH-SY5Y. Αβ(1 -42) 10 μΜ viene incubato in presenza o in assenza di oleuropeina aglicone 9x per 1 -7 giorni, quindi diluito nel terreno di coltura (500 nM) e somministrato alle cellule per 48 h. Al termine del trattamento, sulle cellule vengono eseguiti due test: quello dell’MTT, basato sulla riduzione dell’MTT in cellule metabolicamente attive da parte delle deidrogenasi mitocondriali e associate alla membrana, e il test della captazione del colorante Rosso Neutro (NRU), che misura la capacità della cellula di trattenere il colorante all’interno dei lisosomi. Per il test dell’MTT le cellule vengono incubate per 2 h in una soluzione 0,5 mg/ml di MTT, quindi lisate in 20% (w/v) SDS, 50% (v/v) A/,A/-dimetilformammide, e l’assorbanza del formazano blu viene misurata a 570 nm. Per il test del NRU, le cellule vengono incubate per 3 h a 37 °C con 0.066 mg/ml di NR, quindi lisate con 100 pL/pozzetto di una soluzione acquosa contenente 1,0% acido acetico e 50% etanolo, e si misura poi l’assorbanza a 550 nm. L’analisi statistica dei risultati ottenuti da entrambi i test indica che la presenza di oleuropeina aglicone durante l’aggregazione di Αβ(1-42) provoca la formazione di specie non tossiche. L’oleuropeina aglicone non risulta tossica per le cellule almeno fino alla concentrazione 200 μΜ.

Uno dei rischi associati all’uso di inibitori dell’aggregazione amiloide è la possibile disaggregazione di fibrille amiloidi preesistenti con il rilascio di oligomeri tossici. Quando l’oleuropeina aglicone viene aggiunta a fibrille di Αβ(1-42) ottenute incubando il peptide per 7 giorni, l’analisi al TEM mostra che dopo 24 h le fibrille sono più corte, raggruppate e meno abbondanti rispetto al campione mantenuto nelle medesime condizioni ma senza l'aggiunta di oleuropeina aglicone. Per appurare se in queste condizioni vengano rilasciate specie oligomeriche tossiche dalle fibrille di Αβ(1-42), abbiamo eseguito un test dell’MTT e un’analisi in dot blot. La tossicità residua associate agli aggregati fibrillari viene eliminata dalla successiva incubazione con oleuropeina aglicone. Questo risultato è in accordo con l’analisi al dot blot, che conferma che l’incubazione con oleuropeina aglicone determina la scomparsa di specie oligomeriche tossiche, ancora presenti assieme agli aggregati fibrillari di Αβ(1-42). Si può concludere che l’oleuropeina aglicone non induce il rilascio di oligomeri tossici dalle fibrille preformate, piuttosto, essa neutralizza qualsiasi tossicità residua che derivi dalla presenza, nel campione, di oligomeri solubili e di altri aggregati tossici.

Claims (4)

1. RIVENDICAZIONI 1. Oleuropeina aglicone per l’uso come inibitore della formazione di specie oligomeriche tossiche di Αβ(1-42).
2. 2. Oleuropeina aglicone per uso nel trattamento o nella prevenzione del Morbo di Alzheimer.
3. 3. Uso della oleuropeina aglicone per la preparazione di composizioni farmaceutiche per il trattamento o la prevenzione del Morbo di Alzheimer.
4. 4. Una composizione farmaceutica per il trattamento del Morbo di Alzheimer, tale composizione comprendente l’oleuropeina aglicone ed almeno un altro ingrediente farmaceuticamente accettabile.