ITFI20100019A1 - Inibitori peptidomimetici di integrine basati sull'1,2,3-triazolo per la diagnosi e terapia dei tumori. - Google Patents

Inibitori peptidomimetici di integrine basati sull'1,2,3-triazolo per la diagnosi e terapia dei tumori. Download PDF

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IT000019A
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Anna Bottoncetti
Lido Calorini
Nicoletta Cini
Antonio Guarna
Gloria Menchi
Alberto Pupi
Silvia Raspanti
Andrea Trabocchi
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Univ Firenze
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Description

DOMANDA DI BREVETTO PER INVENZIONE INDUSTRIALE DAL TITOLO:
INIBITORI PEPTIDOMIMETICI DI INTEGRINE BASATI SULL’1,2,3-TRIAZOLO PER LA DIAGNOSI E TERAPIA DEI TUMORI
CAMPO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce al campo di composti chimici aventi un anello 1,2,3-triazolico, loro preparazione ed uso medico-diagnostico per le patologie in cui è alterata l’angiogenesi, ad esempio condizioni patologiche di origine tumorale, metastasi tumorali, osteoporosi, ed artrite reumatoide.
STATO DELL’ARTE
Le integrine sono una classe di recettori cellulari noti per legare le proteine della matrice extracellulare e di mediare gli eventi di adesione cellulare. Un importante sito di riconoscimento dei ligandi delle integrine αvβ3 e αvβ5 è la sequenza peptidica RGD, che è presente in tutti i ligandi peptidici identificati per le integrine che legano la vitronectina. Fra le integrine-RGD dipendenti, i recettori αvβ3 e αvβ5 hanno ricevuto un’attenzione crescente come target terapeutici poiché essi sono espressi in varie tipologie di cellule e sono coinvolti nei processi legati allo sviluppo e crescita di tumori, nonché nell’osteoporosi e nell’artrite reumatoide. Il sito di riconoscimento RGD può essere mimato da polipeptidi che contengono la sequenza tripeptidica RGD, e antagonisti di αvβ3, inclusi i peptidi contenenti la sequenza RGD, e questi sono stati applicati come inibitori dell’angiogenesi e della crescita tumorale. Negli ultimi anni, il peptide ciclico c[RGDfV] è stato riportato da Kessler e collab. come un ligando selettivo dell’integrina αvβ3. Sono stati sviluppati numerosi analoghi di tale struttura ciclica contenente la sequenza RGD, ed in particolare, il derivato N-metilato c[RGDf(Me)Val] (Cilengitide), che è in fase di sperimentazione clinica come inibitore dell’angiogenesi per il trattamento del glioblastoma. Tuttavia, è necessario disporre di farmaci alternativi che possano avere un profilo di azione diverso e quindi possano risolvere potenziali effetti collaterali evidenziati nella sperimentazione clinica attuale (Reynolds, A. R. e collab. Nat. Med. 2009, 15, 392). Negli anni sono stati riportati in letteratura svariati esempi di inibitori peptidomimetici delle integrine contenenti nuclei eterociclici (Cacciari, B.; Spalluto, G. Current Medicinal Chemistry, 2005, 12, 51-70), fra cui: benzodiazepinoni, piperazine, benzoazepinoni, nitroarili, isossazoline, indazoli, fenoli, e altri, esclusi i derivati triazolici.
L’unico sistema molecolare contenente il triazolo consiste in un analogo ciclico del peptide c[RGDfV], in cui l’anello triazolico sostituisce il dipeptide D-Phe-Val, che risolve solo in parte le problematiche relative alla stabilità chimica ed alla sua biodisponibilità (Kolb, H.; Chen, K.; Walsh, J. C.; Gangadharmath, U.; Kasi, D.; Wang,B.; Duclos, B.; Liang, Q.; Padgett, H. C.; Karimi, F. WO2008/033557). Allo stato dell’arte non è stato mai riportato alcun antagonista non peptidico lineare di integrine contenenti il nucleo dell’1,2,3-triazolo. La sintesi di molecole contenenti il nucleo del triazolo ha conosciuto un enorme progresso in seguito allo sviluppo da parte di Sharpless e collab. di un metodo catalitico impiegante Cu(I) come catalizzatore in presenza di ascorbato di sodio per la generazione a partire da un alchino ed un’azide in condizioni blande e altamente regioselettive di sistemi 1,2,3-triazolici aventi sostituenti in posizione 1,4 (Sharpless, B. K.; Fokin, V.; Rostovsev, V.; Green, L.; Himo, F. WO03/101972). C’è un grande interesse in campo medicodiagnostico nella possibilità di disporre di un ligando per le integrine αvβ3 e αvβ5 con alta affinità, che non abbia natura peptidica, che sia di semplice preparazione, e che mostri una attività antiangiogenica in seguito alla sua attività antagonistica verso le integrine. Risulta pertanto evidente la necessità di ottenere una molecola metabolicamente più stabile degli attuali ligandi basati sulla sequenza peptidica RGD, e di facile e conveniente preparazione a partire da precursori commerciali e con pochi passaggi sintetici.
Scopo della presente invenzione è quello di fornire un prodotto che abbia le suddette caratteristiche, ovvero che sia di facile sintesi a partire da precursori facilmente preparabili anche come composti enantiopuri, che sia di carattere generale per permettere la generazione di derivati con proprietà modulate, che abbia una significativa stabilità metabolica, ed una alta affinità verso le integrine a cui corrisponda un’attività antiangiogenica in vivo.
SOMMARIO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione riguarda composti peptidomimetici contenenti il nucleo 1,2,3-triazolico dotati di notevole affinità verso i recettori αvβ3 ed αvβ5 appartenenti alla famiglia delle integrine.
La presente invenzione si riferisce a composti di formula (I)
dove Q = N, O; m e r sono indipendentemente =1,2,3; p = 0,1,2; se Q = N allora R1 = H, alchile; se Q = O allora R1 è assente; R4 = H, alchile, arile opzionalmente sostituito; R5 = catena laterale di un amminoacido, oppure scelto nel gruppo
suddetti anelli opzionalmente sostituiti, dove R6, R7 ed R8 sono indipendentemente scelti nel gruppo H, alchile, cicloalchile;
W è un gruppo guanidinio oppure un suo isostere scelto nel gruppo
incluse tutte le possibili variazioni dei centri stereogenici, loro miscele e sali farmaceuticamente accettabili, e inclusa l’eventuale presenza di uno o più radioisotopi.
Sorprendentemente essi sono risultati essere potenti inibitori di integrine, in particolare di integrine che riconoscono la sequenza peptidica Arg-Gly-Asp (RGD), e nello specifico delle integrine αvβ3 e αvβ5, per cui sono adatti all’uso in medicina, in particolare per la preparazione di diagnostici e/o medicamenti per la diagnosi ed il trattamento di patologie in cui le suddette integrine sono coinvolte, in particolare connesse con angiogenesi e insorgenza-progressione di tumori, osteoporosi, ed artrite reumatoide.
Un aspetto della presente invenzione consiste in preparati farmaceutici contenenti almeno un composto di formula (I), e almeno un altro ingrediente, eccipiente o diluente farmaceuticamente accettabile.
DEFINIZIONI
In relazione alla presente invenzione nei composti di formula (I) come sopra definiti:
per gruppo protettore si intende un qualsiasi gruppo capace di impedire all’atomo a cui esso è legato di partecipare ad una reazione indesiderata o ad un legame, come prassi usuale nelle reazioni chimiche. I gruppi protettori preferiti sono quelli che impediscono la reazione od il legame di ossigeno, azoto, acidi carbossilici, tioli, alcoli, ammine, e simili. Tali gruppi, la loro preparazione ed il loro inserimento sono convenzionali nello stato dell’arte e includono, per esempio, per la funzione reattiva OH: benzil, tert-butil; acetali, esteri, trialchilsilileteri; per il gruppo COOH: metil, tert-butil, benzil, fenil, allil esteri; per il gruppo NH: t-Boc, Fmoc, Cbz, Alloc, Bn, Bz, Nosile.
Per catena laterale di un amminoacido si intende la diversa sostituzione come catena laterale attaccata ad un “amminoacido”. Il termine “amminoacido” include ognuno dei venti α-amminoacidi naturali della serie L o D avente come “catena laterale”: -H per glicina; -CH3 per alanina; -CH(CH3)2 per valina; -CH2CH(CH3)2 per leucina; -CH(CH3)CH2CH3 per isoleucina; -CH2OH per serina; -CH(OH)CH3 per treonina; -CH2SH per cisteina; -CH2CH2SCH3 per metionina; -CH2-(fenil) per fenilalanina; -CH2-(fenil)-OH per tirosina; -CH2-(indolo) per triptofano; -CH2 COOH per acido aspartico; -CH2C(O)(NH2) per asparagina; -CH2CH2COOH per acido glutammico; -CH2CH2C(O)NH2 per glutammina; -CH2CH2CH2-N(H)C(NH2)NH per arginina; -CH2-(imidazolo) per istidina; -CH2(CH2)3NH2 per lisina, comprendente le stesse catene laterali di amminoacidi portanti opportuni gruppi protettori. Inoltre, il termine “amminoacido” include gli amminoacidi non naturali, fra cui ornitina (Orn), norleucina (Nle), norvalina (NVa), β-alanina, L or Dα-fenilglicina (Phg), acido diamminopropionico, acido diamminobutirrico, e altri bennoti nell’arte della chimica dei peptidi.
Nei composti di formula (I), come sopra definiti, per alchile s’intendono i gruppi C1-
8alchil, C2-8alchenil e C2-8alchinil che appunto rappresentano radicali alchilici lineari o ramificati, come per esempio: metil, etil, propil, isopropil, butil, pentil, esil, eptil, ottil, etilene, propene, butene, isobutene, acetilene, propino, butino, ecc... Il termine cicloalchile rappresenta: ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, cicloesano, cicloeptano, ciclottano, norbornano, canfano, adamantano.
Il termine arile specifica i gruppi fenil, bifenil and naftil opzionalmente sostituiti. Il termine eterociclo rappresenta in particolare: eterocicli saturi o insaturi contenenti uno o più atomi di azoto, più in particolare: pirrolo, pirazolo, pirrolidina, imidazolo, indolo, piridina, pirimidina, pirazina, triazolo, piperidina opzionalmente sostituiti.
Per anelli (arili, ciclo alchili o etero cicli) opzionalmente sostituiti s’intendono sostituiti con uno o più, e preferibilmente uno o due specie scelte fra i gruppi consistenti in alogeni, ciano, nitro, C1-6alchil, OC1-6alchile, NH2, NHC1-6alchile, C1-
6alchil-Z, OC1-6alchile-Z, con Z = alogeno .
Il termine alogeno rappresenta fluoro, cloro, bromo, iodio.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1a. Curve di inibizione del composto 24 per αvβ3.
Figura 1b. Curve di inibizione del composto 24 per αvβ5.
Figura 2a. Curve di inibizione del composto 34 per αvβ3.
Figura 2b. Curve di inibizione del composto 34 per αvβ5.
Figura 3. Test di inibizione dell’adesione cellulare dei composti 24 e 34 sulla linea cellulare A375M di melanoma.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Composti preferiti sono quelli di formula (I) come sopra descritta in cui B = H e quindi preferibilmente i composti di formula (I) sono caratterizzati da una delle seguenti formule (Ia)-(Ib)
dove X, Y, V e W sono come sopra descritti.
Preferibilmente composti di formula (Ia) o (Ib) sono quelli in cui
W-X- è scelto nel gruppo W-(CH2)n-,
dove n=1,2,3;
V-Y- è scelto nel gruppo -CH2-CO-N(R4)-CH(R5)-CH2-V, -CH2-N(R1)-CH2-CO-N(R4)-CH(R5)-CH2-V, dove R1 = H, alchile; R4 = H, Me, Ph; R5 = H, Ph, opzionalmente sostituito;
W è un gruppo guanidinio oppure un gruppo
V è un gruppo COOH oppure CONHOH.
Composti particolarmente preferiti sono quelli di formula (Ia) in cui
W-X- è scelto nel gruppo W-(CH2)n-, dove n=1,2,3;
V-Y- è scelto nel gruppo -CH2-CO-N(R4)-CH(R5)-CH2-V, -CH2-N(R1)-CH2-CO-N(R4)-CH(R5)-CH2-V, dove R1 = H, alchile; R4 = H, Ph; R5 = H, Ph opzionalmente sostituito;
W è un gruppo guanidinio oppure un gruppo
V è un gruppo COOH.
Composti particolarmente preferiti sono quelli di formula (Ib) in cui
W-X- è scelto nel gruppo -(CH2)n-W, dove n=2;
V-Y- è scelto nel gruppo -CH2-N(R1)-CH2-CO-N(R4)-CH(R5)-CH2-V, dove R1 = Me; R4 = H; R5 = Ph, fluoro-Ph;
W è un gruppo guanidinio;
V è un gruppo COOH.
Composti di formula (I) come sopra descritti sono ottenibili a partire da precursori facilmente preparabili anche come composti enantiopuri, e specificamente dalla combinazione di due molecole che portano rispettivamente un’azide ed un triplo legame terminali attraverso la “click chemistry”, secondo lo Schema I.
Nello specifico, i composti di formula (I) sono ottenibili mediante un processo che comprende una cicloaddizione 1,3-dipolare di Huisgen tra un’azide J-N3 ed un alchino K-C≡CH, catalizzata da sali di rame e dell’acido ascorbico, o da catalizzatori a base di rutenio, in cui J e K sono rispettivamente precursori dei gruppi A e B o C.
Nel caso in cui la cicloaddizione è catalizzata da sali di rame e in presenza di acido ascorbico si ottengono addotti precursori di composti di formula (I) in cui B è H. In questo caso si ottengono composti di formula (Ia) o (Ib).
Nel caso in cui la cicloaddizione è catalizzata da catalizzatori a base di rutenio si ottengono addotti precursori di composti di formula (I) in cui C è H.
Il processo suddetto, per ottenere i prodotti finali di formula (I) come sopra descritti, prevede dopo la cicloaddizione, successive trasformazioni dei gruppi J e K per ottenere i gruppi A, B e C come sopra descritti, e quindi è seguita dall’eventuale inserimento del gruppo guanidinio o suo isostere, e deprotezione finale dei gruppi COOH e guanidinio o loro isosteri. Il processo è di carattere generale, e permette la generazione di un certo numero di derivati diversi sia per i gruppi funzionali che contengono, sia per la loro posizione reciproca, in funzione della scelta dei due componenti per la reazione di cicloaddizione 1,3-dipolare e del catalizzatore scelto. In particolare (Schema 1), usando il processo (i), catalizzato da sali di rame, ad esempio CuI, CuSO4, CuSO4 con polvere di rame, o Cu(OAc)2, ed in presenza di ascorbato di sodio, è possibile ottenere molecole 1,2,3-triazoliche di formula (Ia) come sopra descritte, a partire da un alchino K-C≡CH e un’azide J-N3, dove K è un precursore protetto del gruppo –X-W e J è un precursore protetto del gruppo –Y-V, oppure molecole 1,2,3-triazoliche di formula (Ib) come sopra descritte, a partire da un alchino K-C≡CH e un’azide J-N3, dove K è un precursore protetto del gruppo –Y-V e J è un precursore protetto del gruppo – X-W. Usando il processo (ii), catalizzato da complessi di Ru, ad esempio Cp*RuCl(PPh3)2, è possibile ottenere molecole 1,2,3-triazoliche di formula (I) dove C è H, a partire da un alchino K-C≡CH e un’azide J-N3, dove K e J sono precursori dei gruppi –X-W e –Y-V.
Il processo di preparazione dei composti di formula (I) prevede, dopo la cicloaddizione, due o tre passaggi sintetici in funzione del tipo di gruppo precursore di -X-W prescelto; in particolare, nel caso in cui J o K corrispondono al diretto derivato protetto di-X-W (ovvero il precursore J o K contiene già il gruppo guanidinio protetto), il processo consiste nella reazione di cicloaddizione 1,3-dipolare di Huisgen seguita da deprotezione dei gruppi protettori di V e W (vedi sintesi composti 19-35); nel caso invece in cui J o K corrispondono ad un indiretto precursore di-X-W (ovvero il precursore J o K non contiene già il gruppo guanidinio ma contiene un gruppo funzionale atto alla successiva introduzione del gruppo guanidinio protetto o meno), il processo consiste nella reazione di cicloaddizione 1,3-dipolare di Huisgen, seguita dall’introduzione dell’isostere protetto o no corrispondente a quanto definito per W, secondo le modalità note allo stato dell’arte, come ad esempio mediante reazione di guanidinilazione fra un precursore –J = -X-NH2 ed un gruppo guanidinio protetto o suo isostere (vedi sintesi composti 36-37 e Schema 6), o mediante reazione di Mitsunobu fra un precursore -J=-X-OH ed un gruppo guanidinio o suo isostere, e deprotezione dei gruppi protettori di V e W.
La sintesi delle molecole di formula (I) è notevolmente meno complessa di quella dei peptidomimetici ciclici noti allo stato dell’arte, ed è possibile ottenere, con processi relativamente semplici, anche grandi quantità di prodotto finale. Inoltre l’anello 1,2,3-triazolico è particolarmente stabile non essendo facilmente idrolizzato, ossidato o ridotto, e facendo così supporre una sua notevole stabilità in vivo. La preparazione degli alchini e delle azidi è realizzata secondo le procedure note allo stato dell’arte.
A titolo esemplificativo, sono riportati in Tabella 1 i componenti selezionati per la reazione di cicloaddizione 1,3-dipolare sopra descritta:
L’alchino 7 e l’azide 12 di Tabella 1 possono essere ottenuti a partire dal metilestere della β-(R)-p-F-fenilalanina secondo lo Schema 2, prodotto a sua volta ottenibile a partire dal corrispondente p-F-cinnamato di metile secondo procedure note allo stato dell’arte (Davies, S. G.; Ichihara, O. Tetrahedron: Asymmetry 1991, 2, 183). La reazione del metilestere della (R)-p-F-fenilalanina con bromoacetil bromuro in solvente anidro, preferibilmente diclorometano anidro, in presenza di una base, preferibilmente trietilammina, preferibilmente a temperatura ambiente per un tempo necessario al completamento della reazione, permette l’ottenimento del bromuro 15. Il successivo trattamento con NaN3 in solvente polare aprotico, preferibilmente DMF, alla temperatura di riflusso fino al completamento della reazione permette l’ottenimento dell’azide 12. La reazione del bromuro 15 con N-metil-propargilammina in solvente polare aprotico, preferibilmente DMF, ed in presenza di una base, preferibilmente trietilammina, a temperatura ambiente fino al completamento della reazione permette invece l’ottenimento dell’alchino 7. Analogamente, l’alchino 6 e l’azide 11 di Tabella 1 possono essere ottenuti a partire dal metilestere della β-(S)-p-F-fenilalanina corrispondente.
L’alchino 5 di Tabella 1 può essere ottenuto facilmente a partire dalla Bocpiperazina, composto commercialmente disponibile, per trattamento con un derivato del butinolo, preferibilmente mesilato di butinile, successiva rimozione del gruppo Boc, preferibilmente per trattamento con una miscela di TFA-diclorometano 1:1, e guanidinilazione, preferibilmente con triflato di Di-Bocguanidina, secondo lo Schema 3:
A titolo esemplificativo, sono riportati nello Schema 4 esempi di composti di formula (Ia) e (Ib) ottenuti mediante il processo sopra descritto comprendente la reazione di cicloaddizione 1,3-dipolare Cu-catalizzata fra un’azide ed un alchino di Tabella 1 e successiva idrolisi in ambiente acido.
Il processo sintetico della presente invenzione per la preparazione dei composti di formula (Ia) è esemplificata nello Schema 5 per la preparazione del composto 24 a partire dall’azide 9a e dall’alchino 3 di Tabella 1.
La reazione di cicloaddizione 1,3-dipolare di Huisgen fra l’azide e l’alchino selezionati è condotta in rapporto equimolare, in solvente protico, preferibilmente in acqua - t-butanolo (1:1) in presenza di sali di rame e dell’acido ascorbico, preferibilmente acetato di rame(II) e ascorbato di sodio, a temperatura ambiente e per un tempo necessario al completamento della reazione, fino ad un massimo di due giorni. Dopo trattamento della miscela di reazione con una soluzione basica, preferibilmente NaHCO3 al 5%, ed eventuale purificazione cromatografica, la successiva reazione di idrolisi e realizzata per trattamento del derivato protetto con un acido, preferibilmente HCl 3M, ottenendo dopo evaporazione del solvente il prodotto desiderato come cloridrato.
Nel caso dei composti 36 e 37 di formula (Ib) il processo sintetico è basato sull’introduzione del gruppo guanidinio successivamente alla reazione di “click chemistry”. A titolo esemplificativo, la preparazione del composto 36 di formula (I) consiste nella cicloaddizione 1,3-dipolare di Huisgen Cu-catalizzata usando i substrati 13 e 7 di Tabella 1, come riportato nello Schema 6. La successiva deprotezione dell’addotto 39, e guanidinilazione del composto deprotetto 40, permette di ottenere il prodotto finale 36 per idrolisi acida.
Gli studi di competizione in vitro eseguiti utilizzando recettori αvβ3 e αvβ5 purificati da placenta umana con tecnica di cromatografia di affinità, hanno evidenziato per il composto 24 un’alta affinità per entrambi i sistemi recettoriali, con IC50=16.4 nM per αvβ3 e IC50=1.02 μM per αvβ5 (Figura 1).
L’inserimento sull’anello aromatico di un atomo di fluoro in posizione para, analogamente ad un’eventuale marcatura con fluoro-18 (radioisotopo PET), corrispondente ai prodotti di formula (I) 34 e 35, ha messo in evidenza che l’aggiunta dell’atomo di fluoro mantiene l’affinità per il recettore, anche se ridotta di circa un ordine di grandezza (composto 34: IC50=215 nM per αvβ3, e IC50=9.90μM per αvβ5), come illustrato in Figura 2.
Una serie di esperimenti condotti con l’ausilio della tecnica della citometria a flusso e anticorpi monoclonali specifici, hanno consentito di disporre di particolari cellule di melanoma dell’uomo caratterizzate da una elevata espressione di recettori integrinici. Con l’uso di queste cellule, è stata valutata la capacità di alcune molecole di formula (I), utilizzate alla concentrazione 10, 1.0 e 0.1 μM, di inibire il legame tra queste cellule e substrati adeguati esprimenti siti RGD, come la vitronectina, la fibronectina, l’osteopontina (Figura 3). I risultati ottenuti indicano che la molecola 24 inibisce in modo significativo il legame delle cellule di melanoma sia alla vitronectina, sia alla osteopontina, mentre ha un minore effetto sull’adesione delle cellule alla fibronectina. La molecola 34 inibisce in modo significativo solo il legame delle cellule di melanoma alla vitronectina, mentre ha un minore effetto sull’adesione delle cellule alla osteopontina e alla fibronectina. Nel loro insieme, questi risultati dimostrano che queste molecole RGD-compatibili sono capaci di esercitare effetti biologici importanti anche su recettori integrinici associati alla plasma-membrana delle cellule tumorali, condizione indispensabile per il loro uso in vivo. Inoltre, questi risultati indicano che tra i due peptidomimetici selezionati, il composto 24 ha una maggiore affinità per il recettore integrinicoαvβ3, che riconosce i residui RGD esposti sia sulla vitronectina che sullaosteopontina.
Da questi risultati in vitro si deduce un potenziale impiego dei composti di formula (I) come sopra descritti come medicamenti e/o diagnostici per il trattamento di patologie in cui le integrine sono coinvolte. I composti della presente invenzione possono quindi essere utilizzati come antagonisti dei recettori integrinici, in particolare delle integrine che riconoscono la sequenza tripeptidica Arg-Gly-Asp (RGD), e nello specifico delle integrine αvβ3 e αvβ5, risultando così utili nel trattamento ad esempio di insorgenza o sviluppo di tumori (agendo come antiangiogenici), osteoporosi o artrite reumatoide.
Composti di formula (I) secondo la presente invenzione qualora contenenti uno o più radioisotopi possono essere utilizzati come diagnostici, oppure a partire dai composti di formula (I) come sopra descritti possono essere ottenuti composti coniugati con altre sonde o probe molecolari.
PARTE SPERIMENTALE
Procedura generale (A) per la sintesi degli alchini 1-3 di Tabella 1. Ad una soluzione di alchin-1-olo (1 eq) in THF anidro si aggiungono sotto atmosfera di azoto PPh3(1 eq) e N,N′-di-Boc-guanidina (1 eq). Successivamente, DIAD (1 eq) è aggiunto lentamente a 0 °C, quindi la miscela è lasciata a reagire in un sintetizzatore a microonde a 110°C per 30 min. Si evapora il solvente e il grezzo di reazione è purificato per cromatografia flash (AcOEt-et. petr. 1:2) ottenendo il prodotto puro.
N,Nƍ-Di-Boc-NƎ-(prop-2-inil)-guanidina (1). Il composto 1 è ottenuto secondo la procedura generale A come un solido bianco con una resa del 72%. Rf0.80 (EtOAc-et. petr.1:2).<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 8.46 (br, 1H), 4.22 (dd, J = 4.8,<2.6 Hz, 2H), 2.26 (t, J = 2.6 Hz, 1H), 1.49 (s, 18H) ppm; 13C NMR (CDCl3, 50 MHz)>δ 163.3 (s), 159.8 (s), 154.4 (s), 83.8 (s), 81.1 (s), 78.5 (s), 69.7 (d), 42.8 (t), 28.2(q), 27.9 (q), 18.5 (t) ppm.
N,Nƍ-Di-Boc-NƎ-(but-3-inil)-guanidina (2). Il composto 2 è ottenuto secondo la procedura generale A come un solido bianco per una resa del 72%. Rf0.80 (EtOAc-et. petr. 1:2).<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 9.20 (br, 1H), 4.08 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.52 (td, J = 7.0, 2.6 Hz, 2H), 1.95 (t, J = 2.6 Hz, 1H), 1.53 (s, 9H), 1.48 (s, 9H) ppm;<13>C NMR (CDCl3, 50 MHz) δ 163.3 (s), 159.8 (s), 154.4 (s), 83.8 (s), 81.1 (s), 78.5 (s), 69.7 (d), 42.8 (t), 28.2 (q), 27.9 (q), 18.5 (t) ppm.
N,Nƍ-Di-Boc-NƎ-(pent-4-inil)-guanidina (3). Il composto 3 è ottenuto secondo la procedura generale A come un solido bianco per una resa del 68%. Rf0.63 (EtOAc-et. petr. 1:2).<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 9.30 (br, 1H), 4.00 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.23 (td, J = 7.2, 2.2 Hz, 2H), 1.93 (t, J = 2.2 Hz, 1H), 1.83 (m, 2H), 1.52 (s, 9H), 1.48 (s, 9H) ppm;<13>C NMR (CDCl3, 50 MHz) δ 163.7 (s), 160.5 (s), 154.8 (s), 83.8 (s), 83.7 (s), 78.7 (s), 68.5 (d), 43.9 (t), 28.3 (q), 28.0 (q), 27.5 (t), 16.0 (t) ppm.
Acido [t-butossicarbonilimmino-(4-prop-2-inil-piperazin-1-il)-metil]-carbammico t-butilestere (4). Ad una soluzione di N,N’-di-Boc-N”-trifluorometansulfonilguanidina (1.72 g, 4.40 mmol) in CH2Cl2anidro ( 20 mL) sono aggiunti Et3N ( 674 μL, 4.84 mmol) e N-propargil piperazina (600 mg, 4.84 mmol). La miscela è lasciata a reagire a temperatura ambiente per 16 h, quindi il solvente è evaporato. Il residuo è ripreso in AcOEt e trattato con una soluzione satura di NaHCO3e brine. Il prodotto grezzo è purificato per cromatografia flash FCC (AcOEt-et. petr. 2:1, Rf0.37) ottenendo il prodotto 4 come un olio giallo (1.01 g, 2.77 mmol) con una resa del 63%.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 9.61 (br, 1H), 3.44 (m, 4H), 3.16 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 2.41 (m, 4H), 2.18 (m, 1H), 1.27 (s, 9H) ppm. Acido [t-butossicarbonilimmino-(4-but-3-inil-piperazin-1-il)-metil]-carbammico t-butilestere (5) (Schema 3). Ad una soluzione di 16 (1.02 g, 5.47 mmol) trietilammina (762 μL, 5.47 mmol) e NaI (23 mg, 0.153 mmol) in DMSO si aggiunge goccia a goccia il but-3-inil mesilato (810 mg, 5.47 mmol). La miscela di reazione è scaldata a 50 °C per la notte, quindi si aggiunge acqua. La fase acquosa è estratta con Et2O, e la fase organica è lavata con brine, anidrificata su solfato di sodio. Dopo evaporazione del solvente, si ottengono 1.10 g (4.62 mmol, 84%) di acido 4-but-3-inil-piperazina-1-carbossilico t-butil estere (17) come olio giallo.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 3.38 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 2.55 (m, 2H), 2.41-2.28 (m, 6H), 1.94 (t, J = 2.6 Hz, 1H), 1.40 (s, 9H) ppm;<13>C NMR (CDCl3, 50 MHz) δ 154.3 (s), 82.3 (s), 79.5 (s), 69.1 (d), 56.9 (t), 52.6 (t), 43.5 (t), 28.4 (q), 16.7 (t) ppm. Il composto 17 (1.10 g, 4.62 mmol) è lasciato a reagire per 16h con una miscela di CH2Cl2/TFA 1:1 (2 mL/mmol). Dopo evaporazione del solvente, il residuo è ripreso in MeOH, ed eluito su una colonna riempita con resina Amberlyst A-21, ottenendo 1-but-3-inil-piperazina (18) pura (606 mg, 4.39 mmol) con una resa del 95%.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 6.98 (br, 1H), 3.06-3.01 (m, 4H), 2.62-2.55 (m, 6H), 2.38-2.29 (m, 2H), 1.96 (t, J = 2.6 Hz, 1H) ppm;<13>C NMR (CDCl3, 50 MHz) δ 82.1 (s), 69.4 (d), 56.6 (t), 50.6 (t), 44.1 (t), 16.8 (t). MS m/z 138 (M<+>, 7), 99 (100), 70 (48), 56 (98) ppm. Ad una soluzione di N,N’-di-Boc-N”-trifluorometansulfonilguanidina (1.52 g, 3.88 mmol) in CH2Cl2anidro ( 18 mL) si aggiungono Et3N ( 595 μL, 4.27 mmol) e 18 (590 mg, 4.27 mmol). La miscela è lasciata a reagire per 16 h a temperatura ambiente, quindi il solvente è evaporato. Il residuo è ripreso in AcOEt e trattato con una soluzione satura di NaHCO3e brine. Il prodotto grezzo è purificato per cromatografia flash (CH2Cl2-MeOH 12:1, Rf0.50) ottenendo il prodotto 5 come un solido bianco (1.10 g, 2.25 mmol) con una resa del 58%.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 3.58 (m, 4H), 2.63-2.51 (m, 6H), 2.39-2.33 (m, 2H), 1.96 (t, J = 2.6 Hz, 1H) ppm;<13>C NMR (CDCl3, 50 MHz) δ 154.7 (s), 151.2 (s), 115.9 (s), 85.9 (s), 82.3 (s), 69.2 (d), 56.6 (t), 52.3 (t), 46.7 (t), 28.0 (q), 27.8 (q), 16.8 (t); MS m/z 380 (M<+>, 0.11), 160 (17), 121 (79), 57 (100) ppm.
Acido (3S)-(2-bromo-acetilammino)-3-(4-fluoro-fenil)-propionico metilestere [(S)-15] (Schema 2). Ad una soluzione del composto (S)-14 (1.0 g, 5.08 mmol), preparato come riportato (Davies, S. G.; Ichihara, O. Tetrahedron: Asymmetry 1991, 2, 183), e Et3N (0.71 mL, 5.08 mmol) in CH2Cl2anidro (5 mL) si aggiunge goccia a goccia a -10°C il bromoacetil bromuro (442 μL, 5.08 mmol). Dopo 15 min a -10°C, si lascia tornare a temperatura ambiente e si lascia a reagire per ulteriori 30 min. Quindi si aggiunge acqua e si separano le due fasi. La fase organica è lavata con 5% HCl e brine, ed è anidrificata su Na2SO4anidro. Dopo evaporazione a secco, il composto (S)-15 è ottenuto come un olio giallo (1.40 g, 4.42 mmol) con una resa dell’87%.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 7.74 (br, 1H), 7.30-7.23 (m, 2H), 7.07-6.98 (m, 2H), 5.36 (dt, J = 8.0, 5.6 Hz, 1H), 3.90 (s, 2H), 3.64 (s, 3H), 2.88 (dd, J1= 5.6, 3.8 Hz, 2H) ppm;<13>C NMR (CDCl3, 50 MHz) δ 171.3 (s), 164.8 (s), 162.1 (d, JCF= 245 Hz), 135.5 (s), 127.8 (d, JCF= 8.2 Hz), 115.6 (d, JCF= 20 Hz), 52.1 (q), 49.6 (d), 39.6 (t), 29.1 (t) ppm.
Acido (3R)-(2-bromo-acetilammino)-3-(4-fluoro-fenil)-propionico metilestere [(R)-15]. Il prodotto (R)-15 è preparato come descritto per (S)-15 a partire da (R)-14 (1.0 g, 5.08 mmol). Dopo evaporazione del solvente, (R)-15 è ottenuto come un olio giallo (1.35 g, 4.27 mmol) con una resa del 84% e dati NMR come riportati per (S)-15.
Acido (S)-3-(4-fluoro-fenil)-3-[2-(metil-prop-2-inil-ammino)-acetilammino]-propionico metilestere (6). Una soluzione di (S)-15 (654 mg, 2.18 mmol) in DMF (2 mL) è aggiunta a temperatura ambiente ad una soluzione di N-metil propargilammina (181 μL, 2.18 mmol) e Et3N (453 μL, 3.27 mmol) in DMF (5 mL). Dopo 1 h, la miscela è scaldata a 80 °C e lasciata a reagire per 16 h. Al termine, si aggiunge acqua alla soluzione, e la fase organica è estratta con etere dietilico. Il prodotto grezzo è purificato per cromatografia flash (AcOEt-et. petr. 3:2, Rf0.50) ottenendo il prodotto 11 come un olio giallo (0.990 g, 3.54 mmol) con una resa dell’80%.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 7.81 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.26-7.18 (m, 5H), 5.43-5.34 (m, 1H), 3.55 (s, 3H), 3.28 (d, J = 2.5 Hz, 2H), 3.05 (s, 2H), 2.81 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.30 (s, 3H), 2.19 (t, J = 1.2 Hz, 1H) ppm;<13>C NMR δ 170.9 (s), 169.2 (s), 140.4 (s), 128.5 (d), 127.4 (d), 126.1 (d), 73.5 (t), 59.3 (t), 51.6 (q), 49.0 (t), 46.2 (t), 42.2 (q), 40.2 (t) ppm.
Acido (R)-3-(4-fluoro-fenil)-3-[2-(metil-prop-2-inil-ammino)-acetilammino]-propionico metilestere (7) (schema 2). Il prodotto 7 è preparato come riportato per 6 a partire da (R)-15, con dati NMR analoghi al composto 6.
Acido [(2-azido-acetil)-fenil-ammino]-acetico t-butilestere (8). Ad una soluzione di N-fenil-glicina metilestere (1.65 g, 7.98 mmol) e Et3N (1.11 mL, 7.98 mmol) in CH2Cl2anidro (8 mL) a -10°C si aggiunge goccia a goccia il bromoacetil bromuro (695 μL, 7.98 mmol). Dopo 15min a -10°C, si lascia tornare a temperatura ambiente e la miscela è lasciata a reagire per 30 min. Quindi si aggiunge acqua e si separano le due fasi. La fase organica è lavata con 5% HCl e brine, ed è anidrificata su Na2SO4anidro. Dopo evaporazione a secco, si ottengono 2.10 g del bromoacetil-derivato corrispondente come un olio bruno (85%).<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 7.41 (m, 5H), 4.23 (s, 2H), 3.67 (s, 2H), 1.42 (s, 9H) ppm. Ad una soluzione di questo composto (2.10 g, 6.76 mmol) in DMF si aggiunge NaN3(1.32 g, 20.3 mmol) a temperatura ambiente. Dopo 5 min, la miscela è scaldata a 80 °C e lasciata a reagire per 16 h. Al termine, si aggiunge acqua alla soluzione, e la fase organica è estratta con etere dietilico. Il prodotto grezzo è purificato per cromatografia flash (AcOEt-et. petr.1:3, Rf0.57) ottenendo il prodotto 8 come un solido bianco (1.06 g, 3.65 mmol) con una resa del 54%.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 7.41-7.35 (m, 5H), 4.29 (s, 2H), 3.66 (s, 2H), 1.46 (s, 9H) ppm;<13>C NMR (CDCl3, 50 MHz) δ 167.4 (s), 167.3 (s), 140.9 (s), 129.9 (d), 128.8 (d), 127.7 (d), 82.1 (s), 52.2 (t), 50.6 (t), 28.1 (q) ppm; MS m/z 290 (M<+>, 0.2), 262 (0.7), 217 (11), 189 (1.8), 161 (7.3), 106 (30), 77 (18), 57 (100).
Acido (3S)-(2-azido-acetilammino)-3-fenil-propionico metilestere (9a) Il prodotto 9a è preparato come descritto per (S)-15 a partire da (S)-β-fenilalanina metilestere (1.0 g, 5.59 mmol), preparata come riportato (Davies, S. G.; Ichihara, O. Tetrahedron: Asymmetry 1991, 2, 183). Dopo evaporazione del solvente, il bromoacetil-derivato intermedio è ottenuto come un olio bruno (1.37 g, 4.97 mmol) con una resa dell’89%.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 7.72 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.37-7.24 (m, 5H), 5.38 (dt, J = 8.0, 5.8 Hz, 1H), 3.87 (s, 2H), 3.62 (s, 3H), 2.90 (t, J = 5.8 Hz, 2H) ppm;<13>C NMR (CDCl3, 50 MHz) δ 171.1 (s), 164.9 (s), 139.6 (s), 128.6 (d), 127.6 (d), 126.0 (d), 51.8 (q), 50.1 (d), 39.5 (t), 28.9 (t) ppm. Ad una soluzione di questo composto (1.37 g, 4.97 mmol) in DMF si aggiunge NaN3(969 mg, 14.9 mmol) a temperatura ambiente. Dopo 5 min, la miscela è scaldata a 80 °C e lasciata a reagire per 16 h. Al termine, si aggiunge acqua alla soluzione, e la fase organica è estratta con etere dietilico. Il prodotto grezzo è purificato per cromatografia flash (AcOEt-et. petr. 1:1, Rf0.40) ottenendo 9a come un solido bianco puro (1.01 g, 4.12 mmol) con una resa dell’83%. [α]<23>
D-25.9 (c 1.8, CHCl3).
<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 7.35-7.26 (m, 5H), 5.43 (dt, J = 8.0, 5.8 Hz, 1H), 4.03 (s, 2H), 3.64 (s, 3H), 2.90 (t, J = 5.8 Hz, 2H) ppm;<13>C NMR (CDCl3, 50 MHz) δ 171.2 (s), 165.9 (s), 139.7 (s), 128.7 (d), 127.4 (d), 126.1 (d), 52.5 (t), 51.9 (q), 49.5 (d), 39.6 (t) ppm.
Acido (3S)-(2-azido-acetilammino)-3-fenil-propionico t-butilestere (9b). Il prodotto 9b è preparato come riportato per 9a a partire da (S)-β-fenilalanina tbutilestere.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 7.47 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.32 (m, 5H), 5.39 (dt, J = 8.4, 5.8 Hz, 1H), 4.02 (s, 2H), 2.80 (pseudo t, J = 6.2 Hz, 2H), 1.34 (s, 9H) ppm. [α]<23>
D-18.9 (c 1.0, CHCl3).
Acido (3R)-(2-bromo-acetilammino)-3-fenil-propionico metilestere (10a). Il prodotto 10a è preparato come descritto per 9a a partire da (R)-β- fenilalanina metilestere (1.0 g, 5.59 mmol). Dopo evaporazione del solvente, il bromoacetilderivato intermedio corrispondente è ottenuto come un olio bruno con una resa dell’85%.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 7.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.37-7.24 (m, 5H), 5.38 (dt, J = 8.0, 5.8 Hz, 1H), 3.87 (s, 2H), 3.62 (s, 3H), 2.90 (t, J = 5.8 Hz, 2H) ppm;<13>C NMR (CDCl3, 50 MHz) δ 171.1 (s), 164.9 (s), 139.6 (s), 128.6 (d), 127.6 (d), 126.0 (d), 51.8 (q), 50.1 (d), 39.5 (t), 28.9 (t) ppm. Il prodotto 10a è quindi ottenuto da questo composto intermedio (1.31 g, 4.75 mmol) come riportato per 9a con una resa dell’80% e con dati NMR analoghi a 9a. [α]<23>
D+25.9 (c 0.5, CHCl3).
Acido (3R)-(2-azido-acetilammino)- 3-fenil-propionico t-butilestere (10b). Il prodotto 10b è preparato come riportato per 9a a partire da (R)-β-fenilalanina tbutilestere, con dati NMR simili a quanto riportato per 9b. [α]<23>
D+18.0 (c 1.0, CHCl3).
Acido (3S)-(2-azido-acetilammino)-3-(4-fluoro-fenil)-propionico metilestere (11). Ad una soluzione di (S)-15 (1.40 g, 4.42 mmol) in DMF è aggiunto NaN3(862 mg, 13.3 mmol) a temperatura ambiente. Dopo 5 min, la miscela è scaldata a 80 °C e lasciata a reagire per 16 h. Al termine, si aggiunge acqua alla soluzione, e la fase organica è estratta con etere dietilico. Il prodotto grezzo è purificato per cromatografia flash (AcOEt-et. petr. 3:2, Rf0.50) ottenendo il prodotto puro 11 come un olio giallo (0.990 g, 3.54 mmol) con una resa dell’80%.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 7.46 (d, J = 8.0 Hz 1H), 7.29-7.22 (m, 2H), 7.00 (td, JHF= 8.8 Hz, JHH= 1.4 Hz, 2H), 5.36 (dt, J = 8.0, 5.6 Hz, 1H), 3.97 (s, 2H), 3.62 (s, 3H), 2.88 (pseudo t, J = 5.6 Hz, 2H) ppm;<13>C NMR (CDCl3, 50 MHz) δ 170.9 (s), 165.7 (s), 161.9 (d, JCF= 245 Hz), 135.6 (s), 127.8 (d, JCF= 8.2 Hz), 115.5 (d, JCF= 20 Hz), 52.5 (t), 51.9 (q), 48.9 (d), 39.7 (t) ppm. [α]<23>
D-22.0 (c 0.6, CHCl3).
Acido (3R)-(2-azido-acetilammino)-3-(4-fluoro-fenil)-propionico metilestere (12) (Schema 2). Il prodotto 12 è preparato come descritto per 11 a partire da (R)-15 (1.35 g, 4.27 mmol). Il grezzo è purificato per cromatografia flash (AcOEt-et. petr. 3:2, Rf0.50) ottenendo 12 puro come un olio giallo (0.932 g, 3.33 mmol) con una resa del 78% e con dati NMR analoghi a quanto riportato per 11. [α]<23>
D+23.4 (c 0.5, CHCl3).
Acido (2-azido-etil)-carbammico t-butilestere (13). Una soluzione di etanolammina (300 μL, 4.9 mmol) in CH3CN (25 mL) è trattata con Boc2O (1.2 g, 5.5 mmol) e DMAP (120 mg, 0.98 mmol) a temperatura ambiente per 3 h. Al termine, la miscela è trattata con una soluzione di KHSO4al 5% e brine, e anidrificata su solfato di sodio. Dopo evaporazione del solvente, Bocetanolammina pura è ottenuta con una resa del 53%.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 5.27 (br, 1H), 3.67 (br, 1H), 3.53 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.17-3.09 (m, 2H), 1.35 (s, 9H) ppm. Questo prodotto è disciolto in CH2Cl2anidro e Et3N (1.1 mL, 7.9 mmol) è aggiunta sotto atmosfera di azoto. La miscela è raffreddata a 0 °C, MsCl (614 μL, 7.94 mmol) è aggiunto goccia a goccia, e la miscela è lasciata a reagire alla stessa temperatura per 20 min. Successivamente, si aggiunge NaOH 1M (10 mL) e la fase organica è separata. La miscela è trattata con una soluzione satura di NaHCO3e con brine, e anidrificato su solfato di sodio. Dopo evaporazione del solvente, si ottiene Boc-amminoetil mesilato puro (509 mg) con una resa del 64%.
<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 5.05 (br, 1H), 4.33-4.20 (m, 2H), 3.45-3.21 (m, 2H), 3.01 (s, 3H), 1.39 (s, 9H) ppm. Il risultante mesilato è disciolto in DMF (5 mL) e NaN3(413 mg, 6.36 mmol) è aggiunto a 0 °C. La miscela è quindi scaldata a 80 °C per 16 h, quindi diluita con acqua (50 mL). La fase organica è estratta con Et2O (25 mL x 5), ed anidrificata su solfato di sodio. Dopo evaporazione del solvente, il prodotto grezzo è purificato per cromatografia flash (AcOEt-et. petr.
1:3, Rf = 0.75), ottenendo 13 (224 mg) come un olio puro con una resa del 61%.
<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 4.92 (br, 1H), 3.40-3.35 (m, 2H), 3.30-3.22 (m, 2H), 1.41 (s, 9H) ppm.
Procedura generale (B) per la cicloaddizione Cu-catalizzata: ad una soluzione di alchino (1 eq.) e azide (1 eq.) in H2O/t-BuOH 1:1 (4 mL/mmol) si aggiunge sotto atmosfera di azoto una soluzione di ascorbato di sodio 0.9M (1 eq) ed una soluzione di Cu(OAc)20.3M (1 eq.). La miscela di reazione è lasciata in agitazione a temperatura ambiente per 2 gg. La fase organica è estratta con CH2Cl2, trattata con una soluzione al 5% di NaHCO3e brine, ed infine anidrificata su solfato di sodio. Dopo evaporazione del solvente, il prodotto grezzo è purificato per cromatografia flash.
Composto 19. Seguendo la procedura generale B, l’alchino 1 (195 mg, 0.66 mmol) e l’azide 10b (200 mg, 0.66 mmol) in H2O/t-BuOH 1:1 (2.6 mL) generano, dopo work-up e purificazione per cromatografia flash (AcOEt/et. Petr. 1:1, Rf= 0.25), addotto protetto (388 mg, 64%) precursore di 19 come un olio giallo.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 11.39 (br, 1H), 8.71 (br, 1H), 7.72 (s, 1H), 7.48 (br, 1H), 7.19 (m, 5H), 5.32 (m, 1H), 4.98 (s, 2H), 4.64 (s, 2H), 2.69 (m, 2H), 1.45 (s, 9H), 1.41 (s, 9H), 1.20 (s, 9H) ppm;<13>C NMR (CDCl3, 50 MHz) δ 169.8 (s), 164.1 (s), 163.1 (s), 155.8 (s), 152.8 (s), 144.3 (s), 139.7 (s), 128.5 (d), 127.6 (d), 126.1 (d), 123.8 (d), 83.1 (s), 81.4 (s), 79.3 (s), 52.8 (t), 50.2 (d), 41.0 (t), 36.3 (t), 28.2 (q), 27.9 (q), 27.8 (q) ppm. Il prodotto 19 è ottenuto per trattamento con HCl 3M (5 mL) per 16 h a temperatura ambiente, seguito da evaporazione del solvente. [α]<24>
D
+66.3 (c 0.2, H2O).<1>H NMR (D2O, 400 MHz) δ 8.00 (s, 1H), 7.46-7.37 (m, 5H), 5.35-5.23 (m, 3H), 4.56 (s, 2H), 2.79 (m, 2H) ppm.
Composto 20. Seguendo la procedura generale B, l’alchino 2 (200 mg, 0.64 mmol) e l’azide 10a (168 mg, 0.64 mmol) in H2O/t-BuOH 1:1 (2.6 mL) generano, dopo work-up e purificazione per cromatografia flash (AcOEt-et. petr. 4:1, Rf= 0.50), l’addotto protetto (177 mg, 48%), precursore di 20, come un olio giallo.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 9.24 (br, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.30-7.17 (m, 5H), 5.38 (m, 1H), 5.02 (s, 2H), 4.17 (m, 2H), 3.58 (s, 3H), 3.06 (m, 2H), 2.81 (m, 2H), 1.48 (s, 9H), 1.47 (s, 9H) ppm;<13>C NMR (CDCl3, 50 MHz) δ 170.7 (s), 164.3 (s), 163.5 (s), 160.0 (s), 154.5 (s), 145.6 (s), 139.5 (s), 128.6 (d), 127.7 (d), 125.9 (d), 123.3 (d), 84.0 (s), 78.7 (s), 52.9 (t), 51.9 (q), 50.1 (d), 44.2 (t), 39.7 (t), 28.5 (q), 28.0 (q), 25.4 (t) ppm. Il prodotto 20 è ottenuto per trattamento con HCl 3M (5mL) per 16 h a temperatura ambiente, seguito da evaporazione del solvente. [α]<24>
D+60.9 (c 0.3, H2O).<1>H NMR (D2O, 400 MHz) δ 7.87 (s, 1H), 7.49-7.40 (m, 5H), 5.34 (m, 1H), 5.28 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 3.53 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.05-3.00 (m, 4H) ppm.
Composto 21. Seguendo la procedura generale B, l’alchino 3 (153 mg, 0.47 mmol) e l’azide 10a (124 mg, 0.47 mmol) in H2O/t-BuOH 1:1 (2 mL) generano, dopo work-up e purificazione per cromatografia flash (AcOEt-et. petr. 4:1, Rf= 0.38), l’addotto protetto (153 mg, 55%), precursore di 21.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 9.34 (br, 1H), 7.28-7.20 (m, 6H), 5.38 (m, 1H), 5.05 (s, 2H), 3.90 (m, 2H), 3.55 (s, 3H), 2.79 (m, 4H), 1.98 (m, 2H), 1.49 (s, 9H), 1.46 (s, 9H) ppm;<13>C NMR (CDCl3, 50 MHz) δ 170.6 (s), 164.5 (s), 163.3 (s), 159.8 (s), 154.6 (s), 147.7 (s), 139.6 (s), 128.5 (d), 127.5 (d), 126.0 (d), 122.8 (d), 83.8 (s), 78.8 (s), 52.7 (t), 51.8 (q), 50.0 (d), 43.9 (t), 39.8 (t), 28.3 (q), 28.0 (q), 27.7 (t), 22.9 (t) ppm. Il prodotto 21 è ottenuto per trattamento con HCl 3M (5 mL) per 16 h a temperatura ambiente, seguito da evaporazione del solvente. [α]<24>
D+56.9 (c 0.4, H2O).<1>H NMR ( D2O, 400 MHz) δ 7.83 (s, 1H), 7.48-7.39 (m, 5H), 5.33 (pt, J = 7.2 Hz, 1H), 5.26 (d, J = 3.6 Hz, 2H), 3.21 (t, J = 6.8, 2H), 3.00 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 2.82 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.97 (m, 2H) ppm.
Composto 22. Seguendo la procedura generale B, l’alchino 1 (301 mg, 1.01 mmol) e l’azide 9b (308 mg, 1.01 mmol) in H2O/t-BuOH 1:1 (4 mL) generano, dopo work-up e purificazione per cromatografia flash (AcOEt-et. petr. 1:1, Rf= 0.25), l’addotto protetto (273 mg, 45%), precursore di 22, come un olio giallo con dati NMR analoghi a quanto riportato per 19 protetto. Il prodotto 22 è ottenuto per trattamento con HCl 3M (5 mL) per 16 h a temperatura ambiente, seguito da evaporazione del solvente, con dati NMR analoghi a quanto riportato per 19. [α]<24>
D
-73.2 (c 0.2, H2O).
Composto 23. Seguendo la procedura generale B, l’alchino 2 (140 mg, 0.45mmol) e l’azide 9a (118 mg, 0.45 mmol) in H2O/t-BuOH 1:1 (2 mL) generano, dopo work-up e purificazione per cromatografia flash (AcOEt-et. petr. 4:1, Rf= 0.50), l’addotto protetto (203 mg, 55%), precursore di 23, come un olio giallo con dati NMR analoghi a quanto riportato per l’addotto protetto precursore di 20. Il prodotto 23 è ottenuto per trattamento con HCl 3M (5 mL) per 16 h a temperatura ambiente, seguito da evaporazione del solvente, con dati NMR analoghi a quanto riportato per 20. [α]<24>
D-63.2 (c 0.3, H2O).
Composto 24 (Schema 5). Seguendo la procedura generale B, l’alchino 3 (200 mg, 0.61 mmol) e l’azide 9a (160 mg, 0.61 mmol) in H2O/t-BuOH 1:1 (2.5 mL) generano, dopo work-up e purificazione per cromatografia flash (AcOEt-et. petr.
4:1, Rf= 0.38), l’addotto protetto (215 mg, 60%), precursore di 24, come un olio giallo con dati NMR analoghi a quanto riportato per l’addotto protetto precursore di 21. Il prodotto 24 è ottenuto per trattamento con HCl 3M (5 mL) per 16 h a temperatura ambiente, seguito da evaporazione del solvente con dati NMR analoghi a quanto riportato per 21. [α]<21>
D-63.5 (c 0.6, H2O).
Composto 25. Seguendo la procedura generale B, l’alchino 4 (222 mg, 0.61 mmol) e l’azide 10b (186 mg, 0.61 mmol) in H2O/t-BuOH 1:1 (2 mL) generano, dopo work-up e purificazione per cromatografia flash (CH2Cl2/MeOH 10:1, Rf= 0.47), l’addotto protetto (201 mg, 49%), precursore di 25, come un olio giallo.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 7.63 (s, 1H), 7.37 (br, 1H), 7.20 (m, 5H), 5.33 (m, 1H), 5.01 (s, 2H), 3.65 (s, 2H), 3.51 (m, 4H), 2.68 (m, 2H), 2.51 (m, 4H), 1.46 (s, 18H), 1.28 (s, 9H) ppm;<13>C NMR (CDCl3, 50 MHz) δ 169.7 (s), 164.1 (s), 162.8 (s), 154.4 (s), 144.0 (s), 139.7 (s), 137.2 (s), 128.3 (d), 127.5 (d), 126.1 (d), 124.3 (d), 88.7 (s), 81.2 (s), 80.0 (s), 52.6 (t), 52.4 (t), 52.1 (t), 50.2 (d), 46.4 (t), 41.0 (t), 28.2 (q), 27.9 (q), 27.6 (q) ppm. Il prodotto 25 è ottenuto per trattamento con HCl 3M (5 mL) per 16 h a temperatura ambiente, seguito da evaporazione del solvente. [α]<24>
D
+70.8 (c 0.6, H2O).<1>H NMR ( D2O, 400 MHz) δ 7.96 (s, 1H), 7.33-7.27 (m, 5H), 5.23 (s, 2H), 5.17 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.87 (s, 2H), 3.45 (m, 4H), 3.21 (m, 2H), 2.67 (m, 4H) ppm.
Composto 26. Seguendo la procedura generale B, l’alchino 5 (319 mg, 0.84 mmol) e l’azide 10a (221 mg, 0.84 mmol) in H2O/t-BuOH 1:1 (3.5 mL) generano, dopo work-up e purificazione per cromatografia flash (CH2Cl2-MeOH 12:1, Rf= 0.46), l’addotto protetto (297 mg, 55%), precursore di 26, come un solido giallo.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 7.54 (s, 1H), 7.30-7.20 (m, 5H), 5.38 (m, 1H), 5.03 (s, 2H), 3.58 (m, 4H), 3.58 (s, 3H), 2.94 (m, 2H), 2.81 (m, 2H), 2.71 (m, 2H), 2.56 (m, 4H), 1.48 (s, 18H) ppm;<13>C NMR (CDCl3, 50 MHz) δ 170.8 (s), 164.4 (s), 162.8 (s), 154.6 (s), 146.4 (s), 139.5 (s), 137.2 (s), 128.6 (d), 127.7 (d), 126.0 (d), 122.8 (d), 88.7 (s), 81.2 (s), 57.3 (t), 52.9 (t), 52.5 (t), 52.0 (q), 50.0 (d), 46.8 (t), 39.7 (t), 28.2 (q), 23.3 (t) ppm. Il prodotto 26 è ottenuto per trattamento con HCl 3M (5 mL) per 16 h a temperatura ambiente, seguito da evaporazione del solvente. [α]<24>
D
+57.2 (c 0.3, H2O).<1>H NMR (D2O, 400 MHz) δ 7.95 (s, 1H), 7.49-7.40 (m, 5H), 5.35-5.31 (m, 3H), 3.82 (m, 4H), 3.67-3.56 (m, 6H), 3.30 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.99 (d, J = 7.2 Hz, 2H) ppm.
Composto 27. Seguendo la procedura generale B, l’alchino 4 (117 mg, 0.32 mmol) e l’azide 9b (98 mg, 0.32 mmol) in H2O/t-BuOH 1:1 (1.5 mL) generano, dopo work-up e purificazione per cromatografia flash (CH2Cl2-MeOH 10:1, Rf= 0.47), l’addotto protetto (93 mg, 43%), precursore di 27, come un olio giallo con dati NMR analoghi a quanto riportato per l’addotto protetto precursore di 25. Il prodotto 27 è ottenuto per trattamento con HCl 3M (5mL) per 16 h a temperatura ambiente, seguito da evaporazione del solvente con dati NMR analoghi a quanto riportato per 25. [α]<24>
D-49.3 (c 0.2, H2O).
Composto 28. Seguendo la procedura generale B, l’alchino 5 (361 mg, 0.95 mmol) e l’azide 9a (250 mg, 0.95 mmol) in H2O/t-BuOH 1:1 (4 mL) generano, dopo work-up e purificazione per cromatografia flash (CH2Cl2-MeOH 12:1, Rf= 0.46), l’addotto protetto (400 mg, 65%), precursore di 28, come un olio giallo con dati NMR analoghi a quanto riportato per il precursore protetto di 26. Il prodotto 28 è ottenuto per trattamento con HCl 3M (5 mL) per 16 h a temperatura ambiente, seguito da evaporazione del solvente con dati NMR analoghi a quanto riportato per 26. [α]<24>
D-48.2 (c 0.6, H2O).
Composto 29. Seguendo la procedura generale B, l’alchino 1 (165 mg, 0.55 mmol) e l’azide 8 (160 mg, 0.55 mmol) in H2O/t-BuOH 1:1 (2 mL) generano, dopo work-up e purificazione per cromatografia flash (AcOEt-et. petr. 2:1, Rf= 0.56), l’addotto protetto (177 mg, 55%), precursore di 29, come un olio giallo.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 11.41 (br, 1H), 8.71 (br, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.40 (m, 5H), 4.92 (s, 2H), 4.66 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.23 (s, 2H), 1.45 (s, 9H), 1.42 (s, 9H), 1.41 (s, 9H) ppm;<13>C NMR (CDCl3, 50 MHz) δ 167.1 (s), 164.9 (s), 163.0 (s), 155.6 (s), 152.5 (s), 143.4 (s), 140.5 (s), 130.0 (d), 129.0 (d), 127.7 (d), 123.7 (d), 82.9 (s), 82.1 (s), 79.0 (s), 52.2 (t), 50.9 (t), 36.2 (t), 28.1 (q), 27.8 (q), 27.7 (q) ppm. MS m/z 353 (4.5), 266 (1.6), 151 (23), 106 (100), 77 (57), 57 (7). Il prodotto 29 è ottenuto per trattamento con HCl 3M (5 mL) per 16 h a temperatura ambiente, seguito da evaporazione del solvente.<1>H NMR (D2O, 400 MHz) δ 7.88 (s, 1H), 7.55-7.47 (m, 5H), 5.23 (s, 2H), 4.51 (s, 2H), 4.49 (s, 2H) ppm.
Composto 30. Seguendo la procedura generale B, l’alchino 2 (200 mg, 0.64 mmol) e l’azide 8 (186 mg, 0.64 mmol) in H2O/t-BuOH 1:1 (2.6 mL) generano, dopo work-up e purificazione per cromatografia flash (AcOEt-et. petr. 4:1, Rf= 0.69), l’addotto protetto (228 mg, 59%), precursore di 30, come un solido bianco.
<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 7.62 (s, 1H), 7.44 (m, 5H), 4.91 (s, 2H), 4.27 (s, 2H), 4.18 (m, 2H), 3.02 (m, 2H), 1.48 (s, 9H), 1.46 (s, 9H), 1.44 (s, 9H) ppm;<13>C-NMR (CDCl3, 50 MHz) δ 167.1 (s), 165.1 (s), 163.1 (s), 160.0 (s), 154.6 (s), 143.2 (s), 140.7 (s), 130.1 (d), 129.0 (d), 127.8 (d), 123.3 (d), 83.9 (s), 82.2 (s), 78.7 (s), 52.4 (t), 50.9 (t), 44.3 (t), 28.4 (q), 28.1 (q), 28.0 (q), 25.4 (t) ppm. MS m/z 601 (M<+>, 0.3), 501 (0.9), 401 (3.7), 106 (11), 77 (4), 57 (49), 41 (100). Il prodotto 30 è ottenuto per trattamento con HCl 3M (5 mL) per 16 h a temperatura ambiente, seguito da evaporazione del solvente.<1>H NMR (D2O, 400 MHz) δ 7.82 (s, 1H), 7.58-7.50 (m, 5H), 5.24 (s, 2H), 4.51 (s, 2H), 3.51 (m, 2H), 3.00 (m, 2H) ppm.
Composto 31. Seguendo la procedura generale B, l’alchino 3 (197 mg, 0.61 mmol) e l’azide 8 (176 mg, 0.61 mmol) in H2O/t-BuOH 1:1 (2.4 mL) generano, dopo work-up e purificazione per cromatografia flash (AcOEt-et. petr. 4:1, Rf= 0.75), l’addotto protetto (232 mg, 62%), precursore di 31, come un olio giallo.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 9.30 (br, 2H), 7.63 (s, 1H), 7.48 (m, 5H), 4.92 (s, 2H), 4.27 (s, 2H), 3.95 (m, 2H), 2.74 (m, 2H), 1.95 (m, 2H), 1.48 (s, 9H), 1.47 (s, 9H), 1.43 (s, 9H) ppm;<13>C NMR (CDCl3, 50 MHz) δ 167.0 (s), 165.1 (s), 163.4 (s), 160.4 (s), 154.7 (s), 146.3 (s), 140.6 (s), 130.7 (d), 129.0 (d), 127.8 (d), 122.7 (d), 83.7 (s), 82.1 (s), 78.5 (s), 52.3 (t), 51.0 (t), 44.1 (t), 28.3 (q), 28.1 (q), 28.0 (q), 23.0 (t), 21.8 (t) ppm. MS m/z 615 (M<+>, 0.2), 515 (0.5), 343 (20), 287 (15), 106 (22), 77 (9), 57 (100). Il prodotto 31 è ottenuto per trattamento con HCl 3M (5 mL) per 16 h a temperatura ambiente, seguito da evaporazione del solvente.<1>H NMR (D2O, 400 MHz) δ 7.78 (s, 1H), 7.60-7.50 (m, 5H), 5.25 (s, 2H), 4.52 (s, 2H), 3.23 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.80 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.97 (m, 2H) ppm.
Composto 32. Seguendo la procedura generale B, l’alchino 5 (372 mg, 0.98 mmol) e l’azide 8 (284 mg, 0.98 mmol) in H2O/t-BuOH 1:1 (4 mL) generano, dopo work-up e purificazione per cromatografia flash (CH2Cl2-MeOH 12:1, Rf= 0.46), l’addotto protetto (450 mg, 68%), precursore di 32, come un solido arancione.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 7.59 (s, 1H), 7.45 (m, 5H), 4.94 (s, 2H), 4.28 (s, 2H), 3.62 (m, 4H), 2.90 (m, 2H), 2.70 (m, 2H), 2.57 (m, 4H), 1.48 (s, 9H), 1.47 (s, 9H), 1.44 (s, 9H) ppm. Il prodotto 32 è ottenuto per trattamento con HCl 3M (5 mL) per 16 h a temperatura ambiente, seguito da evaporazione del solvente.<1>H NMR (D2O, 400 MHz) δ 8.01 (s, 1H), 7.53-7.34 (m, 5H), 5.2 (s, 2H), 4.44 (s, 2H), 4.07 (m, 2H), 3.75 (m, 2H), 3.65 (m, 2H), 3.57 (m, 4H), 3.25 (m, 4H) ppm.
Composto 33. Seguendo la procedura generale B, l’alchino 2 (140 mg, 0.45 mmol) e l’azide 12 (125 mg, 0.45 mmol) in H2O/t-BuOH 1:1 (2.0 mL) generano, dopo work-up e purificazione per cromatografia flash (AcOEt-et. petr. 4:1, Rf= 0.43), l’addotto protetto (159 mg, 60%), precursore di 33, come un olio giallo.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 9.24 (br, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.29-7.14 (m, 2H), 7.01-6.93 (m, 2H), 5.35 (m, 1H), 5.01 (s, 2H), 4.18 (m, 2H), 3.57 (s, 3H), 3.05 (m, 2H), 2.80 (m, 2H), 1.49 (s, 9H), 1.47 (s, 9H) ppm;<13>C NMR (CDCl3, 50 MHz) δ 170.5 (s), 164.3 (s), 161.6 (d, JCF= 163 Hz), 159.4 (s), 154.4 (s), 145.4 (s), 135.5 (s), 127.8 (dd, JCF= 8.3 Hz, 2C), 123.4 (s), 115.4 (dd, JCF=22 Hz, 2C), 84.0 (s), 78.8 (s), 52.8 (t), 51.9 (q), 49.5 (d), 44.1 (t), 39.8 (t), 28.3 (q), 28.0 (q), 25.3 (t) ppm. Il prodotto 33 è ottenuto per trattamento con HCl 3M (5 mL) per 16 h a temperatura ambiente, seguito da evaporazione del solvente. [α]<24>
D+55.2 (c 0.5, H2O).<1>H NMR (D2O, 400 MHz) δ 7.86 (s, 1H), 7.41 (dd, J = 8.8, 5.2 Hz, 2H), 7.16 (t, J = 8.8 Hz, 2H), 5.31 (m, 1H), 5.26 (d, J = 4.4 Hz, 2H), 3.52 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.04-2.97 (m, 4H) ppm.
Composto 34. Seguendo la procedura generale B, l’alchino 3 (146 mg, 0.45 mmol) e l’azide 12 (125 mg, 0.45 mmol) in H2O/t-BuOH 1:1 (2.0 mL) generano, dopo work-up e purificazione per cromatografia flash (AcOEt-et. petr. 4:1, Rf= 0.6), l’addotto protetto (96 mg, 37%), precursore di 34, come un olio giallo.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 9.34 (br, 1H), 7.86 (br, 1H), 7.19-7.12 (m, 3H), 6.99-6.90 (m, 2H), 5.33 (m, 1H), 5.03 (s, 2H), 3.88 (m, 2H), 3.55 (s, 3H), 2.77 (t, 4H), 1.63 (m, 2H), 1.48 (s, 9H), 1.46 (s, 9H) ppm. Il prodotto 34 è ottenuto per trattamento con HCl 3M (2 mL) per 16 h a temperatura ambiente, seguito da evaporazione del solvente. [α]<24>
D+59.2 (c 0.3, H2O).<1>H NMR (D2O, 400 MHz) δ 7.81 (s, 1H), 7.42 (dd, J = 8.8, 5.2 Hz, 2H), 7.17 (t, J = 8.8 Hz, 2H), 5.32 (m, 1H), 5.26 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 3.22 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.00 (m, 2H), 2.82 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.98 (m, 2H) ppm.
Composto 35. Seguendo la procedura generale B, l’alchino 3 (117 mg, 0.36 mmol) e l’azide 11 (100 mg, 0.36 mmol) in H2O/t-BuOH 1:1 (2.0 mL) generano, dopo work-up e purificazione per cromatografia flash (AcOEt-et. petr. 4:1, Rf= 0.6), 35 protetto (88 mg, 34%) come un olio giallo con dati NMR analoghi a quanto riportato per il precursore protetto di 34. Il prodotto 35 è ottenuto per trattamento con HCl 3M (5 mL) per 16 h a temperatura ambiente, seguito da evaporazione del solvente con dati NMR analoghi a quanto riportato per 34. [α]<24>
D-56.0 (c 0.3, H2O).
Composto 36 (schema 6). Seguendo la procedura generale B, l’alchino 7 (158 mg, 0.57 mmol) e l’azide 13 (107 mg, 0.57) in H2O/t-BuOH 1:1 (1 mL) generano, dopo work-up e purificazione per cromatografia flash, (AcOEt-Et2O 2:1, Rf= 0.3), l’addotto 39.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 8.18 (d, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.30 (t, 2H), 7.05 (t, 2H), 5.43 (q, 1H), 5.03 (br, 1H), 4.41 (t, 2H), 3.71 (s, 2H), 3.64 (s, 3H), 3.61 (d, 2H), 3.09 (s, 2H), 2.92 (t, 2H), 2.33 (s, 3H), 1.40 (s, 9H) ppm. Successivamente, trattando 39 con una miscela 1:1 di TFA:CH2Cl2(3.8 mL) per 2h a temperatura ambiente, seguito da evaporazione dei solventi, si ottiene il prodotto 40 con una resa del 93%.<1>H NMR (D2O, 200 MHz) δ 8.03 (br, 1H), 7.26 (s, 1H), 7.14 (t, 2H), 6.87 (t, 2H), 5.02 (m, 1H), 4.53 (d, 2H), 4.29 (s, 3H), 3.80 (s, 2H), 3.38 (s, 2H), 3.31 (d, 2H), 2.68 (dd, 2H), 2.65 (s, 3H), 2.00 (s, 3H) ppm. Ad una soluzione di 40 (150 mg, 0.40 mmol) e trietilammina (62 μL, 0.40 mmol) in CH2Cl2anidro (2 mL) è aggiunta una soluzione di N,N’-di-Boc-N’’-triflilguanidina (171 mg, 0.40 mmol) in 2 mL di CH2Cl2anidro (2 mL), e la miscela è lasciata a reagire per 16 h a temperatura ambiente. Dopo eliminazione del solvente e purificazione cromatografica (AcOEt-Et2O 1:1, Rf= 0.14), si ottiene il prodotto 41 (55 mg, 0.09 mmol) co una resa del 25%.<1>H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 11.40 (s, 1H), 9.20 (d, 1H), 8.48 (m, 1H), 8.39 (d, 1H), 7.68 (t, 1H), 7.31 (t, 2H), 7.06 (t, 2H), 5.40 (q, 1H), 4.61 (t, 2H), 3.92 (q, 2H), 3.74 (s, 2H), 3.62 (s, 3H), 3.18 (s, 2H), 2.37 (s, 3H), 1.51 (s, 9H), 1.47 (s, 9H) ppm. Il prodotto 36 è ottenuto con una resa quantitativa per trattamento del composto 41 (55 mg, 0.09 mmol) con HCl 3M (1 mL) per 16 h a temperatura ambiente, seguito da evaporazione del solvente.<1>H NMR (D2O, 200 MHz) δ 8.09 (s, 1H), 7.21 (m, 2H), 6.95 (t, J = 8.7 Hz, 2H), 5.10 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.48-4.40 (m, 6H), 3.91 (s, 2H), 3.55 (m, 2H), 2.78 (s, 3H) ppm; 13C NMR (D2O, 50 MHz) d 173.5 (s), 163.6 (s), 163.2 (s), 157.3 (d, JCF= 140 Hz), 135.2 (s), 134.7 (s), 127.4 (d, 2C), 127.3 (s), 114.8 (dd, JCF=11 Hz, 2C), 55.0 (d), 49.5 (q), 49.3 (t), 48.6 (t), 44.7 (t), 40.6 (t), 39.9 (t), 39.1 (t). [α]<24>
D+18.6 (c 0.3, H2O).
Composto 37. Il composto 37 è preparato analogamente a quanto descritto per 36, a partire dall’alchino 6 (122 mg, 0.65 mmol) e dall’azide 13 (180 mg, 0.65 mmol), con dati NMR analoghi a quanto riportato per 36. [α]<24>
D+23.2 (c 0.3, H2O).
Saggio di legame al recettore su fase solida. [<125>I]-Echistatina, marcata con il metodo della lattoperossidasi ad una attività specifica di 2000 Ci/mmol, e le integrine αvβ3 e αvβ5 purificate dalla placenta umana sono usate per i saggi in vitro. I recettori purificati αvβ3 e αvβ5 sono diluiti rispettivamente a 500 ng/mL e 1000 ng/mL in tampone 20 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2. Un’aliquota dei recettori diluiti (100 μL/pozzetto) è aggiunta ad una piastra a 96 pozzetti per microtitolazione (Optiplate-96 HB, PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA) e incubata per 16 h a 4 °C. La piastra è quindi lavata una volta con un tampone di incubazione [20 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, 1% BSA] e incubata per ulteriori 2 h a temperatura ambiente. La piastra è trattata due volte con lo stesso tampone, quindi esperimenti di legame competitivo sono realizzati con una concentrazione fissa di [<125>I]-Echistatina (0.05 nM e 0.1 nM per αvβ3 e αvβ5 rispettivamente) e concentrazioni da 0.01 nM a 100 μM dei composti in esame. Tutti i saggi sono realizzati in triplicato ad un volume finale di 0.2 mL, ognuno contenente le seguenti specie: 0.05 mL di [<125>I]-Echistatina, 0.04 mL del composto in esame e 0.11 mL di tampone di incubazione. Il legame non specifico è definito come l’[<125>I]-Echistatina legata in presenza di un eccesso (1 μM) di echistatina non marcata. Dopo incubazione per 3 h a temperatura ambiente, la piastra è lavata tre volte tampone di incubazione, quindi è valutata la radioattività in un contatore per micropiastra Top-Count NXT (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA) usando 200 μL/pozzetto di liquido scintillante MicroScint-40 (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA).
Analisi dei dati. I valori di IC50sono determinati interpolando i dati di inibizione del legame con la regressione non-lineare usando il pacchetto software GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Prism, San Diego, CA). Inoltre, laddove la pendenza di Hill delle curve risulta significativamente inferiore all’unità (K < -0.80), i dati sono analizzati nuovamente con un modello di legame a due siti. Le curve di spiazzamento meglio interpolate (p < 0.05) con un modello a due siti piuttosto che con uno a sito unico sono considerate significative.
Saggi su linee cellulari di melanoma. La linea cellulare selezionata per questo studio è la linea A375M, cellule di melanoma selezionate in vivo a partire da cellule A375P isolate da un melanoma umano amelanotico. L’espressione del pattern integrinico RGD dipendente, integrina αvβ3, αvβ5, α5β1, delle cellule A375M è determinata con la tecnica della citometria a flusso (FACScanto, Becton & Dickinson) e mediante RT-PCR. Per valutare la capacità delle molecole di formula (I) di legarsi alle integrine della superficie delle cellule di melanoma, sono studiati i livelli di inibizione che le molecole RGD compatibili inducono sull’adesione di queste stesse cellule su substrati di vitronectina, fibronectina e osteopontina. Una valutazione spettrofotometrica del contenuto cellulare delle piastre da coltura usate nei test di adesione assicura l’attendibilità ed il confronto dei risultati ottenuti nei diversi esperimenti che sono eseguiti.

Claims (10)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Composti di formula (I) dove:
    A = -Y-V o -X-W; B e C diversi fra loro e diversi da A sono -H, -Y-V o -X-W; in cui V è un gruppo COOH oppure CONHOH; V-Y- è scelto nel gruppo V-(CH2)p-CH(R5)-N(R4)-CO-(CH2)m-Q(R1)-(CH2)r-, V-(CH2)p-CH(R5)-N(R4)-(CH2)m-, V-(CH2)p-CH(R5)-N(R4)-CO-(CH2)m-,
    dove Q = N, O; m e r sono indipendentemente = 1,2,3; p = 0,1,2; se Q = N allora R1 = H, alchile; se Q è O allora R1 è assente; R4 = H, alchile, arile opzionalmente sostituito; R5 = catena laterale di un amminoacido, oppure scelto nel gruppo
    suddetti anelli opzionalmente sostituiti, dove R6, R7 ed R8 sono indipendentemente scelti nel gruppo H, alchile, cicloalchile; W è un gruppo guanidinio oppure un suo isostere scelto nel gruppo
    dove R9 = H, NH2, CH3, CF3, e R10 = H, alchile, cicloalchile, arile; W-X- è scelto nel gruppo W-(CH2)n-, W-CO(CH2)n-,
    incluse tutte le possibili variazioni dei centri stereogenici, sali farmaceuticamente accettabili, e inclusa l’eventuale presenza di uno o più radioisotopi.
  2. 2. Composti di formula (I) secondo la rivendicazione 1 caratterizzati da una delle seguenti formule (Ia)-(Ib)
    dove X, Y, V e W sono come definiti nella rivendicazione 1.
  3. 3. Composti secondo la rivendicazione 2 in cui W-X- è scelto nel gruppo W-(CH2)n-, dove n=1,2,3; V-Y- è scelto nel gruppo -CH2-CO-N(R4)-CH(R5)-CH2-V, -CH2-N(R1)-CH2-CO-N(R4)-CH(R5)-CH2-V, dove R1 = H, alchile; R4 = H, Me, Ph; R5 = H, Ph, opzionalmente sostituito; W è un gruppo guanidinio oppure un gruppo
    V è un gruppo COOH oppure CONHOH.
  4. 4. Processo per la preparazione di composti di formula (I) secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-3, detto processo comprendente una cicloaddizione 1,3-dipolare di Huisgen tra un’azide J-N3ed un alchino K-C≡CH in cui J e K sono precursori dei gruppi A e B o C.
  5. 5. Composti secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-3 per l’uso come medicamenti e/o diagnostici.
  6. 6. Composti secondo la rivendicazione 5 per l’uso come inibitori delle integrine.
  7. 7. Composizioni farmaceutiche comprendenti almeno un composto di formula (I) secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-3 ed almeno un altro ingrediente farmaceuticamente accettabile.
  8. 8. Uso dei composti di formula (I) secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-3 per la preparazione di composizioni farmaceutiche per il trattamento di patologie in cui le integrine sono coinvolte.
  9. 9. Uso secondo la rivendicazione 8 in cui dette patologie sono connesse ad un‘alterata angiogenesi e insorgenza-progressione di tumori, osteoporosi, o artrite reumatoide.
  10. 10. Uso di dei composti di formula (I) secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-3 come intermedi per la preparazione di composti marcati con radioisotopi o composti coniugati con altre sonde o probe molecolari per la diagnosi di patologie in cui le integrine sono coinvolte.
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