ITBO20090275A1 - Polipeptide fattore ix modificato, sue utilizzazioni e metodo per la sua produzione - Google Patents

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Description

“POLIPEPTIDE FATTORE IX MODIFICATO, SUE UTILIZZAZIONI E METODO PER LA SUA PRODUZIONEâ€
La presente invenzione à ̈ relativa ad un polipeptide FIX (fattore IX) modificato, una sequenza di nucleotidi, un vettore comprendente tale sequenza di nucleotidi ed un metodo per la produzione del polipeptide FIX modificato.
La presente invenzione à ̈ inoltre relativa a preparazioni farmaceutiche ed utilizzazioni del fattore FIX modificato e della sequenza di nucleotidi.
Il FIX à ̈ una glicoproteina vitamina K-dipendente, appartenente alla famiglia delle serin-proteasi, sintetizzata nel fegato dell’uomo e di altri animali, inclusi i mammiferi, che gioca un ruolo fondamentale sia nella via intrinseca che in quella estrinseca della cascata coagulativa. Il FIX umano circola nel plasma come zimogeno a singola catena composta da 415 aminoacidi. Il FIX umano ha un peso molecolare di 56 kD ed una concentrazione plasmatica di circa 5 µg/ml. Lo zimogeno à ̈ attivato sia dal fattore XI attivato (FXIa), sia dal complesso fattore tissutale (TF) – fattore VII attivato (FVIIa). L’organizzazione strutturale del FIX à ̈ simile rispetto a quella di altre proteine coagulative vitamina K-dipendenti quali il fattore VII (FVII), il fattore X (FX) e la proteina C (PC). La porzione amino-terminale della molecola comprende il dominio “Gla†, una regione ricca di residui gamma-carbossi-glutammici, la cui carbossilazione à ̈ dipendente dalla presenza di vitamina K. La principale funzione fisiologica del FIX, una volta attivato, à ̈ di convertire il fattore X (FX) in fattore X attivato (FXa), in un processo che richiede la presenza di una superficie fosfolipidica, ioni calcio ed una proteina ad effetto cofattoriale, il fattore VIII attivato (FVIIIa). Il FXa a sua volta à ̈ in grado di convertire la protrombina in trombina la quale trasforma il fibrinogeno in fibrina solubile che, polimerizzando, forma il coagulo. L’azione del FXa à ̈ potenziata dalla presenza del fattore V attivato (FVa).
Il gene del FIX umano à ̈ situato sul cromosoma X in posizione Xq27. 1 e contiene 8 esoni di varia lunghezza da 25 paia di basi (bp) fino a 2000 bp. L’mRNA del FIX umano à ̈ lungo circa 3 kb e comprende 205 basi che costituiscono la porzione 5’ UTR, le 1386 basi codificanti per il polipeptide FIX e le 1392 basi della porzione 3’ UTR. Tale mRNA codifica la sintesi di 461 aminoacidi che costituiscono il precursore del FIX umano. Tale precursore (SEQ ID NO: 1) comprende i seguenti segmenti e domini: un peptide di segnale idrofobico (aminoacidi 1-28), un propeptide (aminoacidi 29-46), il Gla-domain (aminoacidi da 47 a 92), un dominio EGF like 1(aminoacidi da 93 a 129), un dominio EGF like 2 (aminoacidi da 130 a 171), un peptide di attivazione (aminoacidi da 192 a 226) ed il dominio serinproteasico (aminoacidi da 227 a 461). La forma matura del FIX umano (SEQ ID NO: 2) perde il peptide di segnale idrofobico ed il propeptide. Di conseguenza le corrispondenti posizioni aminoacidiche dei domini sopramenzionati diventano le seguenti: il Gla-domain (aminoacidi da 1 a 46), il dominio EGF like 1(aminoacidi da 47 a 83), il dominio EGF like 2 (aminoacidi da 84 a 125), il peptide di attivazione (aminoacidi da 146 a 180), ed il dominio serin-proteasico (aminoacidi da 181 a 415).
La SEQ ID NO: 1 (dalla quale deriva la SEQ ID NO: 2) corrisponde a quella presente su PubMed (categoria “Protein†) digitando come accession number AAB59620; tale sequenza di aminoacidi comprende il peptide segnale (46 AA), seguito dalla sequenza aminoacidica della proteina matura.
La carenza genetica di FIX può essere causa di diverse patologie della coagulazione (discoagulopatie): ad esempio, una malattia emorragica chiamata emofilia B nei maschi affetti (malattia genetica legata al sesso). Le emofilie B si possono classificare in tre classi, ognuna delle quali à ̈ caratterizzata dalla presenza di diverse concentrazioni plasmatiche di FIX. Nell’emofilia B grave i livelli plasmatici di attività del FIX sono al di sotto dell’ 1% del normale; nella forma moderata, sono compresi tra l’ 1% ed il 5%; nella forma lieve tra il 5 ed il 25% dei livelli normali. Vi sono poi dei soggetti portatori sani che presentano livelli medi di attività del FIX tra il 25 ed il 50% del normale, ma molti portatori possono avere livelli anche superiori al 50%. I pazienti affetti da emofilia B grave presentano severe manifestazioni emorragiche che possono essere controllate o evitate con la somministrazione di concentrati di origine estrattiva (da plasma umano) o ricombinante di FIX a tutt’oggi disponibile in un’unica formulazione commerciale.
Tentativi di correzione del difetto genetico mediante terapia genica sono risultati finora infruttuosi per problemi di diverso ordine. Innanzitutto, quelli legati alla bassa efficienza di espressione nell’uomo di livelli plasmatici di FIX attorno all’1%, non sufficienti a correggere la malattia; quelli legati alla immunogenicità del trattamento con vettori virali; infine quelli legati agli effetti collaterali della terapia genica stessa che includono epatiti, miositi ed altri.
L’incremento dei livelli di FIX nel plasma al di sopra del normale (intervallo di normalità del FIX nel plasma 70-120%, ovvero 70-120 U/dl, dove per una unità si intende la quantità di FIX contenuta in 1 millilitro di plasma normale, pari a circa 5Î1⁄4g) à ̈ stato associato ad un aumentato rischio di sviluppo di manifestazioni trombotiche in ambito venoso nell’uomo. In particolare, per valori superiori a 150 U/dl à ̈ stato riscontrato un incremento del rischio trombotico di 4. 8 volte (O. R corretto, 4. 8; 95% CI, da 2. 3 a 10. 1). Tuttavia la base genetica dell’incremento dei livelli di FIX nel plasma di tali soggetti non à ̈ mai stata individuata.
Studi di mutagenesi in vitro di espressione di FIX ricombinante mutato hanno dimostrato la possibilità di riprodurre le alterazioni di sintesi e di attività di FIX riscontrate in vivo nei pazienti con emofilia B. Viceversa, tramite la mutagenesi sito specifica in alcune posizioni della molecola di FIX, sono stati prodotti dei mutanti di FIX con “guadagno di funzione†(incremento di attività rispetto alla molecola normale) alterandone la specificità per i substrati fisiologici e/o modificandone altre funzioni. Questi mutanti con “guadagno di funzione†(in particolare con aumento di attività proteasica nei confronti del substrato fisiologico, ovvero del FX, o con aumento di capacità di interazione con il FVIIIa, cofattore del FIXa) allo stato attuale non risultano esistere in natura, né essere stati testati nell’uomo. Più esplicitamente manca ogni evidenza : 1) della esistenza di un portatore umano di FIX mutato (FIX mutante naturale) con “guadagno di funzione†caratterizzato da incremento della attività procoagulante rispetto al FIX normale (WT); 2) di tests condotti in vivo nell’uomo con somministrazioni di FIX ricombinanti modificati; 3) di tests condotti in vivo nell’uomo con somministrazioni di FIX ricombinanti modificati con guadagno di funzione per la profilassi ed il trattamento di pazienti affetti da emofilie (su base genetica o acquisita) o altre discoagulopatie 4) di tests condotti in vivo nell’uomo con somministrazioni di FIX ricombinanti modificati che evidenziassero l’assenza di effetti collaterali.
Scopo della presente invenzione à ̈ quello di fornire un polipeptide FIX modificato, una sequenza di nucleotidi, un vettore comprendente tale sequenza di nucleotidi, ed un metodo per produzione del polipeptide FIX modificato.
Scopo ulteriore della presente invenzione à ̈ fornire preparazioni farmaceutiche ed utilizzazioni del fattore FIX modificato e della sequenza di nucleotidi.
Secondo la presente invenzione vengono forniti un polipeptide, una sequenza di nucleotidi, un vettore, un metodo di produzione, utilizzazioni del polipeptide e della sequenza di nucleotidi e preparazioni farmaceutiche, secondo quanto licitato nelle rivendicazioni indipendenti che seguono e, preferibilmente, in una qualsiasi delle rivendicazioni dipendenti direttamente o indirettamente dalle rivendicazioni indipendenti.
Il contenuto dei riferimenti (articoli, libri di testo, sequenze GenBank ecc.) citati nel presente testo vengono qui integralmente richiamati per completezza di descrizione. In particolare, i riferimenti (articoli, libri di testo, sequenze GenBank ecc.) citati nel presente testo vengono qui incorporati per riferimento.
A meno che non sia specificato esplicitamente il contrario, i seguenti termini presentano il significato qui sotto indicato.
Nel presente testo per “percentuale di identità†e “% di identità†tra due sequenze di amminoacidi (peptidi) o di acidi nucleici (nucleotidi) si intende la percentuale di residui amminoacidici o nucleotidici identici in posizioni corrispondenti nelle due sequenze allineate in modo ottimale.
Per determinare la “percentuale di identità†delle due sequenze di amminoacidi o di acidi nucleici, le sequenze vengono tra loro allineate; per raggiungere un confronto ottimale, nelle sequenze possono venire introdotte interruzioni (vale a dire cancellazioni o inserimenti – i quali possono eventualmente essere anche disposti all’estremità delle sequenze) (gap). I residui amminoacidici e nucleotidici in posizioni corrispondenti vengono quindi confrontati. Quando una posizione nella prima sequenza à ̈ occupata dal medesimo residuo amminoacidico o nucleotide che occupa la corrispondente posizione nella seconda sequenza, le molecole sono identiche in quella posizione. La percentuale di identità tra due sequenze à ̈ funzione del numero di posizioni identiche condivise dalle sequenze [vale a dire % di identità = (numero delle posizioni identiche / numero totale delle posizioni) X 100].
Secondo una vantaggiosa forma di attuazione, le sequenze hanno la stessa lunghezza.
Vantaggiosamente, le sequenze confrontate non presentano interruzioni (o inserimenti).
La percentuale di identità può venire ottenuta utilizzando algoritmi matematici. Un esempio non limitativo di un algoritmo matematico utilizzato per il confronto di due sequenze à ̈ l’algoritmo di Karlin ed Altschul [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 2264-2268] modificato da Karli ed Altschul [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 5873-5877]. Tale algoritmo à ̈ incorporato nei programmi BLASTn e BLASTp di Altschul [Altschul, et al, J. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410].
Allo scopo di ottenere allineamenti anche in presenza di una o più interruzioni (o inserimenti) à ̈ possibile utilizzare metodi che assegnano una penalità relativamente elevata a ciascuna interruzione (o inserimento) ed una penalità inferiore per ciascun residuo amminoacidico o nucleotidico aggiuntivo nell’interruzione (tale residuo amminoacidico o nucleotide aggiuntivo viene definito come estensione dell’interruzione). Alte penalità determineranno, ovviamente, allineamenti ottimizzati con un minore numero di interruzioni.
Un esempio di un programma atto a realizzare questo tipo di allineamento à ̈ il programma BLAST come descritto in Altschul, et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997) 3389-3402. A questo scopo i programmi BLASTn e BLASTp possono essere utilizzati con i parametri di default. Utilizzando i programmi BLAST viene tipicamente impiegata la matrice BLOSUM62.
Un esempio vantaggioso e non limitativo di un programma per realizzare un allineamento ottimale à ̈ GCG Winsconsin Bestfit package (Università del Winsconsin, USA; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Anche in questo caso vengono utilizzati i parametri di default che per una sequenza di amminoacidi prevedono una penalità di -12 per una interruzione ed una penalità di -4 per ciascuna estensione.
Nel presente testo per “percentuale di omologia†e “% di omologia†tra due sequenze di amminoacidi o di acidi nucleici si intende la percentuale di residui amminoacidici o nucleotidi omologhi in posizioni corrispondenti nelle due sequenze allineate in modo ottimale.
La percentuale di omologia fra due sequenze viene determinata in modo sostanzialmente identico a quanto sopra descritto per la determinazione della percentuale di identità eccetto per il fatto che nel calcolo vengono considerate anche le posizioni omologhe e non solo le posizioni identiche.
Per quanto riguarda una sequenza di nucleotidi, due posizioni omologhe presentano due nucleotidi differenti ma che all’interno del proprio codone portano alla codificazione del medesimo amminoacido.
Per quanto riguarda una sequenza di amminoacidi, due posizioni omologhe presentano due amminoacidi omologhi, vale a dire amminoacidi dotati di proprietà chimico-fisiche simili, per esempio, amminoacidi appartenenti a medesimi gruppi come: aromatici (Phe, Trp, Tyr), acidi (Glu, Asp), polari (Gln, Asn), basici (Lys, Arg, His), alifatici (Ala, Leu, Ile, Val), con un gruppo idrossi (Ser, Thr), con catena laterale corta (Gly, Ala, Ser, Thr, Met). Ci si aspetta che sostituzioni tra tali amminoacidi omologhi non cambino il fenotipo delle proteine (sostituzioni conservative di amminoacidi). Specifici esempi di sostituzioni conservative sono note in questo campo tecnico e sono descritte in varia letteratura (ad es., Bowie et al., Science, 247:1306-1310 (1990)).
Ulteriori esempi di programmi e/o articoli relativi alla determinazione di allineamenti e delle percentuali di omologia e/o identità sono indicati in, ad esempio, US2008003202, US2007093443, WO06048777.
Nel presente testo per “posizione corrispondente†si intende una posizione in una sequenza di un polipeptide o di acidi nucleici che corrisponde (si affaccia), a seguito di un allineamento, ad una determinata posizione di una sequenza di riferimento. Ad esempio, una posizione corrispondente ad una posizione determinata del polipeptide FIX presentante la SEQ ID NO: 2 può essere determinata allineando la SEQ ID NO: 2 con un polipeptide di interesse; l’allineamento può essere fatto manualmente o come sopra esposto in relazione alla determinazione della percentuale di identità.
Nel presente testo per “catena nuda†si intende un polipeptide che non à ̈ stato chimicamente modificato; ma contiene solamente amminoacidi legati fra loro in modo covalente.
Nel presente testo per “promotore†si intende una porzione di DNA di un gene che controlla (attiva) la trascrizione di una sequenza di nucleotidi a cui à ̈ legato in modo operativo (non necessariamente confinanti). Il promotore include una o più sequenze di DNA, le quali sono riconosciute dall’RNA polimerasi e vengono legate all’RNA polimerasi in modo che l’RNA polimerasi stesso inizi la trascrizione.
Nel presente testo per “trattare†o “trattamento†di una patologia si intende fare profilassi e/o fare terapia e/o curare tale patologia. Per profilassi si intende, vantaggiosamente, prevenire almeno parzialmente lo sviluppo di una potenziale patologia e/o prevenire il peggioramento dei sintomi o la progressione di una patologia. Vantaggiosamente, per terapia si intende parzialmente o totalmente alleviare i sintomi di una malattia.
Nel presente testo per “vettore†si intende un elemento che à ̈ utilizzato per introdurre un acido nucleico in una cellula per l’espressione o la replicazione di tale acido nucleico. Un esempio di vettori sono gli episomi, i quali sono capaci di replicazione al di fuori di cromosomi. I vettori possono anche essere atti ad essere integrati in cromosomi ospiti. Vettori sono spesso in forma di plasmidi, i quali sono generalmente anelli di DNA a doppia elica.
Nel presente testo “veicolo presentante un acido nucleico†si intende: un vettore, il quale include l’acido nucleico; una cellula, la quale include l’acido nucleico; o un eccipiente farmaceuticamente accettabile combinato per miscelazione all’acido nucleico. Vantaggiosamente, il veicolo à ̈ scelto fra: un vettore ed una cellula.
L’invenzione verrà ora descritta con riferimento al disegno annesso, che ne illustra un esempio d’attuazione non limitativo, in cui:
la figura 1 illustra un SDS-PAGE ed immunoblotting di un polipeptide FIX normale (2), un polipeptide FIX modificato in accordo con la presente invenzione (3), un polipeptide FIX modificato ricombinante in accordo con la presente invenzione (4).
In accordo con un primo aspetto della presente invenzione, viene fornito un polipeptide FIX modificato comprendente un amminoacido scelto nel gruppo consistente di: Leucina, Cisteina, Acido aspartico, Acido glutammico, Istidina, Lisina, Asparagina, Glutammina, Tirosina in una posizione corrispondente alla posizione 338.
Secondo alcune forme d’attuazione, l’amminoacido à ̈ scelto nel gruppo consistente di: Leucina, Acido aspartico, Glutammina.
Secondo alcune forme d’attuazione, l’amminoacido à ̈ scelto nel gruppo consistente di: Acido aspartico, Glutammina.
Secondo alcune forme d’attuazione, l’amminoacido à ̈ Acido aspartico.
Secondo alcune forme d’attuazione, l’amminoacido à ̈ Glutammina.
Secondo alcune forme d’attuazione, l’amminoacido à ̈ scelto nel gruppo consistente di: Acido aspartico, Leucina.
Secondo alcune forme d’attuazione, l’amminoacido à ̈ scelto nel gruppo consistente di: Leucina, Glutammina.
Secondo alcune forme d’attuazione, l’amminoacido à ̈ Leucina.
Il polipeptide FIX modificato deve essere in grado di svolgere la sua funzione all’interno della cascata di coagulazione e può essere di origine sintetica o naturale, ad esempio umana o animale.
Esempi di polipeptide FIX includono (ma non sono limitati a) FIX “wild-type†non modificati (come ad esempio il polipeptide della SEQ ID NO: 2), precursori di tali FIX “wild-type†(come ad esempio il polipeptide della SEQ ID NO: 1), varianti polimorfiche naturali (come ad esempio: un polipeptide presentante un Alanina in una posizione corrispondente alla posizione T148 o un suo polipeptide precursore).
Nel presente testo i loci (posizioni) delle sequenze di amminoacidi modificati o non modificati sono identificati con riferimento ad una numerazione di amminoacidi in posizioni corrispondenti di un polipeptide FIX maturo non modificato come identificato dalla SEQ ID NO: 2. Posizioni corrispondenti possono essere determinate mediante allineamento dei residui non modificati (si veda sopra). A scopo esemplificativo, riportiamo qui di seguito le sequenze e le relative numerazioni del polipeptide FIX maturo (SEQ ID NO: 2) e del precursore del polipeptide FIX (SEQ ID NO: 1).
SEQ ID NO: 1
M, Q, R, V, N, M, I, M, A, E, S, P, G, L, I, T, I, C,
L, L, G, Y, L, L, S, A, E, C, T, V, F, L, D, H, E, N, A, N, K, I, L, N, R, P, K, R, Y1, N2, S3, G4, K5, L6, E7, E8, F9, V10, Q11, G12, N13, L14, E15, R16, E17, C18, M19, E20, E21, K22, C23, S24, F25, E26, E27, A28, R29, E30, V31, F32, E33, N34, T35, E36, R37, T38, T39, E40, F41, W42, K43, Q44, Y45, V46, D47, G48, D49, Q50, C51, E52, S53, N54, P55, C56, L57, N58, G59, G60, S61, C62, K63, D64, D65, I66, N67, S68, Y69, E70, C71, W72, C73, P74, F75, G76, F77, E78, G79, K80, N81, C82, E83, L84, D85, V86, T87, C88, N89, I90, K91, N92, G93, R94, C95, E96, Q97, F98, C99, K100, N101, S102, A103, D104, N105, K106, V107, V108, C109, S110, C111, T112, E113, G114, Y115, R116, L117, A118, E119, N120, Q121, K122, S123, C124, E125, P126, A127, V128, P129, F130, P131, C132, G133, R134, V135, S136, V137, S138, Q139, T140, S141, K142, L143, T144, R145, A146, E147, A148, V149, F150, P151, D152, V153, D154, Y155, V156, N157, S158, T159, E160, A161, E162, T163, I164, L165, D166, N167, I168, T169, Q170, S171, T172, Q173, S174, F175, N176, D177, F178, T179, R180, V181, V182, G183, G184, E185, D186, A187, K188, P189, G190, Q191, F192, P193, W194, Q195, V196, V197, L198, N199, G200, K201, V202, D203, A204, F205, C206, G207, G208, S209, I210, V211, N212, E213, K214, W215, I216, V217, T218, A219, A220, H221, C222, V223, E224, T225, G226, V227, K228, I229, T230, V231, V232, A233, G234, E235, H236, N237, I238, E239, E240, T241, E242, H243, T244, E245, Q246, K247, R248, N249, V250, I251, R252, I253, I254, P255, H256, H257, N258, Y259, N260, A261, A262, I263, N264, K265, Y266, N267, H268, D269, I270, A271, L272, L273, E274, L275, D276, E277, P278, L279, V280, L281, N282, S283, Y284, V285, T286, P287, I288, C289, I290, A291, D292, K293, E294, Y295, T296, N297, I298, F299, L300, K301, F302, G303, S304, G305, Y306, V307, S308, G309, W310, G311, R312, V313, F314, H315, K316, G317, R318, S319, A320, L321, V322, L323, Q324, Y325, L326, R327, V328, P329, L330, V331, D332, R333, A334, T335, C336, L337, R338, S339, T340, K341, F342, T343, I344, Y345, N346, N347, M348, F349, C350, A351, G352, F353, H354, E355, G356, G357, R358, D359, S360, C361, Q362, G363, D364, S365, G366, G367, P368, H369, V370, T371, E372, V373, E374, G375, T376, S377, F378, L379, T380, G381, I382, I383, S384, W385, G386, E387, E388, C389, A390, M391, K392, G393, K394, Y395, G396, I397, Y398, T399, K400, V401, S402, R403, Y404, V405, N406, W407, I408, K409, E410, K411, T412, K413, L414, T415
SEQ ID NO: 2
Y1, N2, S3, G4, K5, L6, E7, E8, F9, V10, Q11, G12, N13,
L14, E15, R16, E17, C18, M19, E20, E21, K22, C23, S24, F25, E26, E27, A28, R29, E30, V31, F32, E33, N34, T35, E36, R37, T38, T39, E40, F41, W42, K43, Q44, Y45, V46, D47, G48, D49, Q50, C51, E52, S53, N54, P55, C56, L57, N58, G59, G60, S61, C62, K63, D64, D65, I66, N67, S68, Y69, E70, C71, W72, C73, P74, F75, G76, F77, E78, G79, K80, N81, C82, E83, L84, D85, V86, T87, C88, N89, I90, K91, N92, G93, R94, C95, E96, Q97, F98, C99, K100, N101, S102, A103, D104, N105, K106, V107, V108, C109, S110, C111, T112, E113, G114, Y115, R116, L117, A118, E119, N120, Q121, K122, S123, C124, E125, P126, A127, V128, P129, F130, P131, C132, G133, R134, V135, S136, V137, S138, Q139, T140, S141, K142, L143, T144, R145, A146, E147, A148, V149, F150, P151, D152, V153, D154, Y155, V156, N157, S158, T159, E160, A161, E162, T163, I164, L165, D166, N167, I168, T169, Q170, S171, T172, Q173, S174, F175, N176, D177, F178, T179, R180, V181, V182, G183, G184, E185, D186, A187, K188, P189, G190, Q191, F192, P193, W194, Q195, V196, V197, L198, N199, G200, K201, V202, D203, A204, F205, C206, G207, G208, S209, I210, V211, N212, E213, K214, W215, I216, V217, T218, A219, A220, H221, C222, V223, E224, T225, G226, V227, K228, I229, T230, V231, V232, A233, G234, E235, H236, N237, I238, E239, E240, T241, E242, H243, T244, E245, Q246, K247, R248, N249, V250, I251, R252, I253, I254, P255, H256, H257, N258, Y259, N260, A261, A262, I263, N264, K265, Y266, N267, H268, D269, I270, A271, L272, L273, E274, L275, D276, E277, P278, L279, V280, L281, N282, S283, Y284, V285, T286, P287, I288, C289, I290, A291, D292, K293, E294, Y295, T296, N297, I298, F299, L300, K301, F302, G303, S304, G305, Y306, V307, S308, G309, W310, G311, R312, V313, F314, H315, K316, G317, R318, S319, A320, L321, V322, L323, Q324, Y325, L326, R327, V328, P329, L330, V331, D332, R333, A334, T335, C336, L337, R338, S339, T340, K341, F342, T343, I344, Y345, N346, N347, M348, F349, C350, A351, G352, F353, H354, E355, G356, G357, R358, D359, S360, C361, Q362, G363, D364, S365, G366, G367, P368, H369, V370, T371, E372, V373, E374, G375, T376, S377, F378, L379, T380, G381, I382, I383, S384, W385, G386, E387, E388, C389, A390, M391, K392, G393, K394, Y395, G396, I397, Y398, T399, K400, V401, S402, R403, Y404, V405, N406, W407, I408, K409, E410, K411, T412, K413, L414, T415.
Analogamente, le posizioni delle sequenze nucleotidiche modificate o non modificate sono identificate, a meno di esplicita indicazione contraria, con riferimento ad una numerazione di nucleotidi in posizioni corrispondenti della sequenza di nucleotidi identificata dal numero di accesso (accession number) K02402 (GenBank). La sequenza di nucleotidi K02402 codifica il precursore del polipeptide FIX (SEQ ID NO: 1) e comprende delle regioni introniche (a questo riguardo si veda Anson DS, Choo KH, Rees DJ, Giannelli F, Gould K, Huddleston JA, Brownlee GG. The gene structure of human anti-haemophilic factor IX. The EMBO Journal 1984;3:1053-1060).
All’interno della definizione di polipeptide FIX modificato ricadono varianti chimeriche, che possono essere prodotte sostituendo amminoacidi o interi domini del FIX con amminoacidi o sequenze di altri fattori appartenenti alla famiglia dei fattori di coagulazione (ad esempi il fattore VII o il fattore X).
Secondo differenti forme di attuazione, il polipeptide FIX modificato qui presentato à ̈ una catena nuda o presenta delle modificazioni post-trascrizionali. Esempi di modificazioni includono una o più modifiche chimiche, che comprendono (ma non sono limitate a): glicosilazione; acilazione; metilazione; fosforilazione; sulfonazione; carbossilazione; salificazione; modificazioni dipendenti dalla vitamina C come, ad esempio, idrolisi della prolina, acido aspartico, lisina oppure amidazione di carbossi terminali; modificazioni dipendenti dalla vitamina K come, ad esempio, carbossilazione dei residui acido glutammico; incorporazione del selenio per formare una o più seleniocisteina/e; incorporazione di una funzionalità PEG (glicole polietilenico).
In aggiunta alle possibili modificazioni qui divulgate, il polipeptide FIX modificato può contenere una o più varianti note dello stato dell’arte, come, ad esempio, iperglicosilazione, deimmunizzazione ed altre (si veda ad esempio: US6277618, US6315995, US6531298, US2004/0102388, US2004/0110675, US2004/0254106, US2005/0100982, US2006/0040856).
Esempi non limitativi di varianti del polipeptide FIX modificato possono essere dedotti da uno più dei seguenti riferimenti: US2006/040856, Friedler et al (2000) J. Biol Chem. 275:23783-23789, US2004/102388, WO2006/018201, Lim et al. (1990) J. Biol. Chem. 265(1):144-150, Cheung et al. (1992) J. Biol. Chem. 267(29):20529-20531, Gui et al. (2002) Blood 100(1):153-158, Schuettrumpf et al. (2005) Blood 105(6):2316-2323, US2004/110675, US6315995.
Secondo alcune, tra loro alternative, forme di attuazione, il polipeptide FIX modificato presenta almeno il 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 94%, 97%, 99%, 100% di omologia (vantaggiosamente identità) con una sequenza di peptidi scelta nel gruppo consistente di: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.
Vantaggiosamente, il polipeptide FIX modificato presenta almeno il 60% di omologia (vantaggiosamente identità) con una sequenza di peptidi scelta nel gruppo consistente di: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.
Vantaggiosamente, il polipeptide FIX modificato presenta almeno l’80% di omologia (vantaggiosamente identità) con una sequenza di peptidi scelta nel gruppo consistente di: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.
Vantaggiosamente, il polipeptide FIX modificato presenta almeno il 90% di omologia (vantaggiosamente identità) con una sequenza di peptidi scelta nel gruppo consistente di: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.
Vantaggiosamente, la sequenza di peptidi à ̈ la SEQ ID NO: 2.
In accordo con un secondo aspetto della presente invenzione, viene fornita una sequenza di nucleotidi codificante il polipeptide FIX del primo aspetto della presente invenzione.
Secondo alcune, tra loro alternative, forme di attuazione, la sequenza di nucleotidi presenta almeno il 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 94%, 97%, 99%, 100% di omologia (vantaggiosamente identità) con la sequenza avente numero di accesso (accession number) K02402 (GenBank).
Vantaggiosamente, la sequenza di nucleotidi presenta almeno il 70% di omologia (vantaggiosamente identità) con la sequenza avente numero di accesso K02402 (GenBank). Vantaggiosamente, la sequenza di nucleotidi presenta almeno il 90% di omologia (vantaggiosamente identità) con la sequenza avente numero di accesso K02402 (GenBank).
Vantaggiosamente, la sequenza di nucleotidi presenta il 100% di omologia (vantaggiosamente identità) con la sequenza avente numero di accesso K02402 (GenBank).
Secondo alcune, tra loro alternative, forme di attuazione, la sequenza di nucleotidi à ̈ una sequenza di RNA e presenta almeno il 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 94%, 97%, 99%, 100% di omologia (vantaggiosamente identità) con la sequenza dalla posizione 31 alla posizione 1411 (SEQ ID NO: 3) (vantaggiosamente dalla posizione 169 alla posizione 1411 - SEQ ID NO: 4) del polinucleotide della figura 2 dell’articolo Anson DS, Choo KH, Rees DJ, Giannelli F, Gould K, Huddleston JA, Brownlee GG. The gene structure of human anti-haemophilic factor IX. The EMBO Journal 1984;3:1053-1060. In questo caso (ovvero con riferimento alle SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4), il numero delle posizioni, fa riferimento alla numerazione riportata nella menzionata figura 2.
Vantaggiosamente, la sequenza di RNA presenta almeno il 80% di omologia (vantaggiosamente identità) con la sequenza SEQ ID NO: 3 (vantaggiosamente, SEQ ID NO: 4). Vantaggiosamente, la sequenza di RNA presenta almeno il 90% di omologia (vantaggiosamente identità) con la sequenza SEQ ID NO: 3 (vantaggiosamente, SEQ ID NO: 4). Vantaggiosamente, la sequenza di RNA presenta almeno il 95% di omologia (vantaggiosamente identità) con la sequenza SEQ ID NO: 3 (vantaggiosamente, SEQ ID NO: 4).
La sequenza di RNA può essere collegata, in testa e/o in coda ad ulteriori catene di nucleotidi che non vengono tradotte o vengono tradotte separatamente.
Secondo alcune, tra loro alternative, forme di attuazione, la sequenza di nucleotidi à ̈ una sequenza di DNA e comprende (in particolare, consiste di) porzioni introniche e porzioni esoniche, le quali presentano una sequenza complessiva (vale a dire considerando le porzioni esoniche senza soluzione di continuità e legate le une alle altre in ordine) con almeno il 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 94%, 97%, 99%, 100% di omologia (vantaggiosamente identità) rispetto una sequenza complessiva delle regioni esoniche della sequenza (SEQ ID NO: 5) della figura 4 dell’articolo Anson DS, Choo KH, Rees DJ, Giannelli F, Gould K, Huddleston JA, Brownlee GG. The gene structure of human anti-haemophilic factor IX. The EMBO Journal 1984;3:1053-1060.
Vantaggiosamente, le porzioni esoniche sono separate tra loro ed ordinate (disposte le une rispetto alle altre) come le rispettive regioni esoniche nella sequenza SEQ ID NO: 5.
Vantaggiosamente, la sequenza complessiva delle porzioni esoniche presenta almeno il 80% di omologia (vantaggiosamente identità) con la sequenza complessiva delle regioni esoniche. Vantaggiosamente, la sequenza complessiva delle porzioni esoniche presenta almeno il 90% di omologia (vantaggiosamente identità) con la sequenza complessiva delle regioni esoniche. Vantaggiosamente, la sequenza complessiva delle porzioni esoniche presenta almeno il 95% di omologia (vantaggiosamente identità) con la sequenza complessiva delle regioni esoniche.
Secondo alcune forme d’attuazione, la sequenza di nucleotidi, comprende una Timina in una posizione corrispondente alla posizione 34099 (ovvero nella corrispondente posizione 32318 secondo la numerazione riportata nella SEQ ID NO: 5; ovvero nella corrispondente posizione 31134 secondo la numerazione riportata nel Database delle mutazioni dell’ Emofilia B (Giannelli et al., Haemophilia B: database of point mutations and short additions and deletions. Nucleic Acids Research 1990;18: 4053-9); ovvero un Uracile nella corrispondente posizione 11180 della SEQ ID NO: 3 o della SEQ ID NO:4).
In altre parole, la menzionata sequenza di nucleotidi si differenzia dalla sequenza avente numero di accesso K02402 (GenBank) almeno per il fatto di portare una mutazione da Guanina a Timina nella posizione 34099 (G34099T) o in una posizione corrispondente (ad esempio la posizione 32318 secondo la numerazione della SEQ ID NO: 5; ovvero da Guanina ad Uracile nella corrispondente posizione 11180 della SEQ ID NO: 3 o della SEQ ID NO:4).
In questo caso, la sequenza di nucleotidi codifica una Leucina in una posizione corrispondente alla posizione 338.
Secondo alcune forme d’attuazione, la sequenza di nucleotidi presenta in posizioni corrispondenti a 34098, 34099 e 34100 una tripletta scelta nel gruppo consistente di: TTA, UUA, TTG, UUG, CTT, CUU, CTC, CUC, CTA, CUA, CTG, CUG, GAT, GAU, GAC, CAA, CAG. In particolare, quando la sequenza di nucleotidi à ̈ una sequenza di DNA, la tripletta à ̈ scelta nel gruppo consistente di: TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG, GAT, GAC, CAA, CAG.
Secondo alcune forme d’attuazione, la sequenza di nucleotidi presenta in posizioni corrispondenti a 34098, 34099 e 34100 una tripletta scelta nel gruppo consistente di: TTA, UUA, TTG, UUG, CTT, CUU, CTC, CUC, CTA, CUA, CTG, CUG, CAA, CAG. In particolare, quando la sequenza di nucleotidi à ̈ una sequenza di DNA, la tripletta à ̈ scelta nel gruppo consistente di: TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG, CAA, CAG. In questi casi, la sequenza codifica una Leucina o una Glutammina in una posizione corrispondente alla posizione 338.
Secondo alcune forme d’attuazione, la sequenza di nucleotidi presenta in posizioni corrispondenti a 34098, 34099 e 34100 una tripletta scelta nel gruppo consistente di: TTA, UUA, TTG, UUG, CTT, CUU, CTC, CUC, CTA, CUA, CTG, CUG. In particolare, quando la sequenza di nucleotidi à ̈ una sequenza di DNA, la tripletta à ̈ scelta nel gruppo consistente di: TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG. Vantaggiosamente, la tripletta à ̈ CTA. In questi casi, la sequenza codifica una Leucina in una posizione corrispondente alla posizione 338.
Secondo alcune forme d’attuazione, la sequenza di nucleotidi presenta in posizioni corrispondenti a 34098, 34099 e 34100 una tripletta scelta nel gruppo consistente di: CAA, CAG. In questi casi, la sequenza codifica una Glutammina in una posizione corrispondente alla posizione 338. Vantaggiosamente, la tripletta à ̈ CAA. Per ottenere la tripletta CAA una Adenina viene inserita al posto della Guanina in posizione 34099.
Secondo alcune forme d’attuazione, la sequenza di nucleotidi presenta in posizioni corrispondenti a 34098, 34099 e 34100 una tripletta scelta nel gruppo consistente di: GAT, GAU, GAC, CAA, CAG. In particolare, quando la sequenza di nucleotidi à ̈ una sequenza di DNA, la tripletta à ̈ scelta nel gruppo consistente di: GAT, GAC, CAA, CAG. In questi casi, la sequenza codifica un Acido aspartico o una Glutammina in una posizione corrispondente alla posizione 338.
Secondo alcune forme d’attuazione, la sequenza di nucleotidi presenta in posizioni corrispondenti a 34098, 34099 e 34100 una tripletta scelta nel gruppo consistente di: GAT, GAU, GAC. In particolare, quando la sequenza di nucleotidi à ̈ una sequenza di DNA, la tripletta à ̈ scelta nel gruppo consistente di: GAT, GAC. In questi casi, la sequenza codifica un Acido aspartico in una posizione corrispondente alla posizione 338. Vantaggiosamente, la tripletta à ̈ GAT. Per ottenere la tripletta GAT à ̈ vengono inserite una Guanina al posto dell’Adenina in posizione 34098, una Adenina al posto della Guanina in posizione 34099 ed una Timina al posto dell’Adenina in posizione 34100.
Le percentuali di omologia (oppure di identità) sopra riportate vengono calcolate non considerando le specifiche posizioni mutate indicate. In altre parole, ad esempio, la sequenza SEQ ID NO: 2 modificata con un Leucina in posizione 338 viene considerata come presentante il 100% di omologia (ed identità) con la sequenza SEQ ID NO: 2 non modificata.
In accordo con un terzo aspetto della presente invenzione, viene fornito un acido nucleico comprendente una sequenza di nucleotidi secondo il secondo aspetto della presente invenzione.
Secondo alcune forme di attuazione, l’acido nucleico comprende un promotore collegato in modo operativo alla sequenza di nucleotidi.
In accordo con un quarto aspetto della presente invenzione, viene fornito un vettore comprendente un acido nucleico come sopra definito in relazione al terzo aspetto della presente invenzione. In particolare, il vettore comprende una sequenza di nucleotidi in accordo con il secondo aspetto della presente invenzione.
Secondo alcune forme di attuazione, il vettore à ̈ scelto tra: un vettore procariota, un vettore eucariota ed un vettore virale.
Vantaggiosamente, il vettore à ̈ un vettore virale. In particolare, il vettore à ̈ scelto tra: un adenovirus, un retrovirus, un herpesvirus, un lentivirus, un poxvirus, un citomegalovirus.
In accordo con un quinto aspetto della presente invenzione, viene fornito un metodo di produzione di un polipeptide FIX modificato, secondo il quale il polipeptide FIX modificato viene espresso mediante un acido nucleico secondo il terzo aspetto della presente invenzione.
Secondo alcune forme di attuazione il metodo comprende le fasi di: introdurre un vettore del quarto aspetto della presente invenzione in una cellula; e
fare una cultura della cellula in modo che il polipeptide FIX venga espresso.
Alternativamente, il polipeptide FIX modificato può essere prodotto da un animale ospite o in vitro dalla menzionata sequenza di nucleotidi.
Secondo un particolare aspetto della presente invenzione, il metodo comprende le fasi di: introdurre la sequenza di nucleotidi del secondo aspetto della presente invenzione in un sistema privo di cellule; esprimere il polipeptide modificato nel sistema privo di cellule.
Secondo un ulteriore particolare aspetto della presente invenzione, il metodo prevede di fare esprimere il polipeptide FIX modificato in un animale transgenico comprendente un acido nucleico in accordo con il terzo aspetto della presente invenzione (in particolare, la sequenza di nucleotidi del secondo aspetto della presente invenzione).
Ospiti utili all’espressione del polipeptide FIX modificato includono: E. coli, lieviti, piante, cellule di insetti, cellule di mammiferi (Pham et al. (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42; Bon et al. (1998) Semin Hematol. 35 (2 Suppl 2): 11-17; Wajih et al. , J. Biol. Chem. 280(36)31603-31607) e animali transgenici.
Gli ospiti possono differire nei loro livelli di produzione delle proteine ed anche nel tipo di modifiche successive alla trascrizione che vengono indotte nel polipeptide FIX modificato.
Ospiti eucarioti possono includere lieviti come Saccharomyces cerevisiae e Pichia Pastoris (Skoko et al.
(2003) Biotechnol. Appl. Biochem. 38(Pt3):257-65), cellule di insetti (Muneta et al. (2003) J. Vet. Med. Sci.
65(2):219-23), piante e cellule di piante come tabacco, riso alghe (Mayfield et al. (2003) PNAS 100:438-442) ecc.
Le piante vengono, tipicamente, modificate mediante trasferimento diretto del DNA e mediante trasformazioni mediate dall’agrobatterio. Vettori, che possono essere utilizzati, vantaggiosamente comprendono sequenze promotrici ed elementi di terminazione e di controllo della trascrizione.
I lieviti vengono, solitamente, modificati mediante vettori episomiali replicanti o mediante una integrazione cromosomica stabile attraverso una ricombinazione omologa. Vantaggiosamente, promotori sono utilizzati per regolare l’espressione genetica. Esempi di promotori includono GAL1, GAL7, GAL5, CUP1. Proteine prodotte dai lieviti sono solitamente solubili; alternativamente, le proteine espresse nei lieviti possono essere secrete.
L’espressione in ospiti eucarioti include inoltre la produzione in animali, per esempio, nel siero, latte ed uova. Animali transgenici per la produzione di polipeptidi FIX sono noti (ad esempio US2002/0166130 e US2004/0133930) e possono essere adattati per la produzione del polipeptide FIX modificato come sopra definito.
Cellule procariote, in particolare E. coli, possono essere vantaggiosamente utilizzate per produrre grandi quantità di polipeptide FIX modificato come sopra definito (Platis et al. (2003) Protein Exp. Purif. 31(2):222-30; Khalizzadeh et al. (2004) J. Ind. Microbiol. Biotechnol.
31(2): 63-69).
I vettori utilizzati per E. coli contengono, vantaggiosamente, promotori che sono atti ad indurre elevati livelli di espressione della proteina e per esprimere proteine che mostrano qualche tossicità per le cellule ospiti. Esempi di promotori sono il T7 ed il SP6 RNA.
Riduttori come il β-mercaptoetanolo possono essere utilizzati per solubilizzare i polipeptidi che dovessero precipitare nell’ambiente citoplasmatico dell’E. coli.
Secondo un sesto aspetto della presente invenzione, viene anche fornito il polipeptide FIX modificato in accordo con il primo aspetto della presente invenzione per un uso come medicamento.
Il polipeptide FIX modificato può essere utilizzato per trattamenti di una patologia singolarmente o in combinazione con altri composti attivi.
Il polipeptide FIX modificato à ̈ utile per trattare discoagulopatie (congenite od acquisite), malattie ematologiche (congenite od acquisite), disordini emorragici (come ad esempio gastriti emorragiche e/o sanguinamento dell’utero), altre patologie in ambito cardiovascolare.
Secondo alcune forme d’attuazione, viene fornito il polipeptide FIX modificato per il trattamento di almeno una discoagulopatia.
Secondo alcune forme d’attuazione, viene fornito il polipeptide FIX modificato per il trattamento di malattie ematologiche.
Secondo alcune forme d’attuazione, viene fornito il polipeptide FIX modificato per il trattamento di disordini emorragici.
Secondo alcune forme di attuazione, il polipeptide FIX modificato viene somministrato ai pazienti periodicamente per periodi di tempo relativamente lunghi oppure prima, durante e/o dopo interventi chirurgici per ridurre e/o prevenire emorragie.
Particolarmente efficace à ̈ l’utilizzazione del polipeptide FIX modificato per il trattamento di discoagulopatie.
Vantaggiosamente, il polipeptide FIX modificato viene utilizzato per il trattamento dell’emofilia, in particolare emofilia A ed emofilia B.
Secondo vantaggiose forme di attuazione, viene fornito il polipeptide FIX modificato per il trattamento dell’emofilia B, vantaggiosamente emofilia B grave e/o moderata.
Vantaggiosamente, il polipeptide FIX modificato viene fornito per il trattamento di mammiferi, in particolare pazienti umani.
Secondo un settimo ed un ottavo aspetto della presente invenzione, vengono forniti: un uso del polipeptide FIX modificato in accordo con il primo aspetto della presente invenzione per la preparazione di un farmaco (preparazione farmaceutica), vantaggiosamente per il trattamento di una discoagulopatia; ed una preparazione farmaceutica comprendente il polipeptide FIX modificato e, vantaggiosamente, almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile.
Secondo alcune forme d’attuazione, la preparazione farmaceutica à ̈ per il trattamento di una patologia scelta nel gruppo: discoagulopatie, malattie ematologiche (congenite od acquisite), disordini emorragici (come ad esempio gastriti emorragiche e/o sanguinamento dell’utero), emofilia (emofilia A oppure emofilia B). Secondo particolari forme d’attuazione, la preparazione farmaceutica à ̈ per il trattamento di una discoagulopatia. Secondo particolari forme d’attuazione, la preparazione farmaceutica à ̈ per il trattamento dell’emofilia.
Secondo un ulteriore aspetto della presente invenzione, viene fornito un metodo per il trattamento di almeno una discoagulopatia, il quale metodo prevede la somministrazione di una quantità efficace di un polipeptide FIX modificato come sopra definito.
Il polipeptide FIX modificato, può essere somministrato come composto puro, tuttavia vantaggiosamente, à ̈ presentato sotto forma di una preparazione farmaceutica. Esempi non limitativi di preparazioni farmaceutiche all’uopo sono qui di seguito esposti.
Il polipeptide FIX modificato può essere formulato per somministrazioni orali, parenterali o rettali o in forme atte a somministrazioni per inalazioni o insufflazioni (sia attraverso la bocca che attraverso il naso). Formulazioni per somministrazioni orali o parenterali sono vantaggiose.
Per somministrazioni orali, le preparazioni farmaceutiche sono in forma di, per esempio, pastiglie o capsule preparate mediante metodologie note con eccipienti accettabili da un punto di vista farmaceutico come agenti leganti (per esempio amido di mais pregelatizzato, polivinilpirrolidone o metilcellulosa); riempitori (fillers) (per esempio lattosio, cellulosa microcristallina o calcio idrogeno fosfato); additivi (per esempio magnesio stearato, talco, silice); disintegranti (per esempio amido di patate); e/o agenti lubrificanti (per esempio sodio lauril solfato). Le pastiglie possono essere rivestite mediante metodi noti. Preparazioni liquide per somministrazioni orali hanno la forma, per esempio, di soluzioni sciroppi o sospensioni, oppure possono essere sotto forma di prodotto secco che può essere disciolto in acqua o un altro liquido prima dell’uso. Tali preparazioni sono preparate in modi noti con additivi accettabili da un punto di vista farmaceutico come agenti di sospensione (suspending agents) (per esempio sorbitolo, derivati di cellulosa, grassi idrogenati commestibili); agenti emulsionanti (per esempio lecitina o acacia); liquidi non acquosi (per esempio olio di mandorla, esteri oleosi, alcol etilico o olii vegetali frazionati); e/o conservanti (per esempio metil o propilp-idrossibenzoati, acido sorbico o acido ascorbico). Le preparazioni possono anche contenere, in casi appropriati, sali tamponanti, agenti coloranti, aromatici e/o dolcificanti.
Preparazioni per somministrazioni orali sono formulate in maniera nota, in modo da dare rilascio controllato del composto attivo.
Il polipeptide FIX modificato viene formulato, in modo noto, per somministrazioni parenterali per iniezione o somministrazione continua. Formulazioni per iniezione sono, vantaggiosamente, in forma di dosi unitarie, per esempio in ampolle o contenitori multidose contenenti conservanti. La composizione può essere in forma di sospensione, in liquidi acquosi o oleosi, e può contenere elementi della formulazione come agenti di dispersione e di stabilizzazione. In alternativa, il composto attivo può essere in polvere per essere disciolto appena prima dell’uso in un liquido all’uopo, per esempio acqua sterilizzata.
Il polipeptide FIX modificato può essere formulato per somministrazioni rettali come supposte o enteroclismi, per esempio contenendo eccipienti per supposte di tipo noto come per esempio burro di cacao od altri gliceridi.
Il polipeptide FIX modificato viene anche formulato, in modo noto, in composizioni a rilascio prolungato. Queste composizioni a rilascio prolungato sono, ad esempio, somministrate mediante un impianto (per esempio subcutaneo, o intramuscolare) o mediante un iniezione intramuscolare. Pertanto, per esempio, il polipeptide FIX modificato viene formulato con adatti materiali polimerici o idrofobici (per esempio una emulsione o un olio) o resine a scambio ionico, o derivati relativamente poco solubili, come sali relativamente poco solubili.
Per somministrazioni intranasali, il polipeptide FIX modificato viene formulato per somministrazioni attraverso un dispositivo (noto), per esempio in polvere con un trasportatore adatto.
I dosaggi del polipeptide FIX modificato dipenderanno dall’età e dalle condizioni del paziente, pertanto il preciso dosaggio dovrà essere deciso volta per volta dal medico. Il dosaggio dipenderà anche dal modo di somministrazione e dal particolare composto selezionato. Dosi utilizzabili possono essere per esempio comprese fra 0,1 mg/Kg e 400 mg/Kg rispetto al peso del corpo al giorno.
Secondo un ulteriore aspetto della presente invenzione, viene fornita la sequenza di nucleotidi in accordo con il secondo aspetto della presente invenzione per un uso come medicamento (vantaggiosamente per il trattamento di una discoagulopatia).
La sequenza di nucleotidi può essere utilizzata per trattamenti di una patologia singolarmente o in combinazione con altri composti attivi.
La sequenza di nucleotidi à ̈ utile per trattare le patologie di cui al sesto aspetto della presente invenzione.
Secondo particolari aspetti della presente invenzione, vengono forniti: l’uso della menzionata sequenza di nucleotidi per la preparazione di un farmaco, vantaggiosamente, per il trattamento di una discoagulopatia; ed una preparazione farmaceutica contenente la sequenza di nucleotidi.
Invece di somministrare il polipeptide FIX modificato à ̈ possibile somministrare la sequenza di nucleotidi che lo codifica.
La sequenza di nucleotidi può essere inserita in cellule e tessuti mediante qualunque metodo noto. La sequenza di nucleotidi può essere incorporata in un vettore per successive manipolazioni.
Per esempio, delle cellule possono essere ingegnerizzate in modo da esprimere il polipeptide FIX modificato, integrando la menzionata sequenza di nucleotidi in una locazione genomica legata in modo operativo a sequenze promotrici. Tali cellule possono essere somministrate ad un paziente localmente o sistemicamente.
Vettori virali che possono essere utilizzati includono poxvirus, herpesvirus, retrovirus, adenovirus, virus adenoassociati ed altri virus adatti alla terapia genica.
I vettori possono rimanere episomiali o possono essere integrati in cromosomi del soggetto trattato. Serotipi di adenovirus sono disponibili commercialmente dalla American Type Culture Collection (ATCC, Rockville).
I vettori virali, in particolare gli adenovirus, vengono utilizzati ex vivo; per esempio, cellule vengono isolate da un paziente e trasdotte con un adenovirus esprimente il polipeptide FIX modificato. Dopo un adeguato periodo di cultura le cellule trasdotte vengono somministrate al paziente localmente o sistemicamente.
Alternativamente, i virus, in particolare gli adenovirus, esprimenti il polipeptide FIX modificato sono isolati e formulati con un eccipiente farmaceuticamente accettabile e somministrati al paziente. Tipicamente, gli adenovirus sono somministrati a dosi da 1 a 1014 particelle per chilogrammo di peso del paziente, generalmente da 106 a 1012 particelle per chilogrammo di peso del paziente.
Esempi aggiuntivi di tipi di cellule per l’espressione ed il rilascio del polipeptide FIX modificato sono fibroblasti e cellule endoteliali (Palmer et al. (1989) Blood 73:483-445; Yao et al (1991) PNAS 88:8101-8105).
Un veicolo presentante la sequenza di nucleotidi menzionata può essere formulato analogamente a quanto sopra descritto per il polipeptide FIX modificato.
La sequenza di nucleotidi e/o farmaci e/o veicoli presentanti la sequenza di nucleotidi stessa possono essere utilizzati per il trattamento di patologie a cui ci si à ̈ sopra riferiti in relazione al polipeptide FIX modificato.
Vantaggiosamente, la menzionata sequenza di nucleotidi viene utilizzata per il trattamento di mammiferi, in particolare pazienti umani.
Secondo un’ulteriore aspetto della presente invenzione, viene fornito un metodo per la rilevazione della proteina del primo aspetto della presente invenzione e/o della sequenza di nucleotidi del secondo aspetto della presente invenzione.
Le metodologie che possono essere utilizzate sono di per sé note nello stato dell’arte possono essere adattate al polimorfismo da ricercare e possono includere, ad esempio, test di tipo immunoenzimatico, test di attività di proteine della coagulazione (inclusa l’attività del FIX), coagulometrici e cromogeni.
Secondo alcune forme di attuazione, il metodo comprende una fase di amplificazione mediante PCR di una porzione di una molecola di acido nucleico (nella quale si vuole verificare la presenza della sequenza di nucleotidi di cui al secondo aspetto della presente invenzione).
Vantaggiosamente, la fase di amplificazione à ̈ preceduta da una fase di purificazione, in particolare isolamento, della molecola di acido nucleico.
Vantaggiosamente, la fase di amplificazione à ̈ seguita da una fase di sequenziamento.
A scopo esemplificativo, per la rilevazione della menzionata sequenza di nucleotidi possono essere seguite le metodologie di cui agli esempi 2 e 3 sottoriportati.
Il metodo per la rilevazione della proteina e/o della sequenza di nucleotidi può essere utilizzato per aiutare ad identificare soggetti che presentino un elevata tendenza a sviluppare malattie del sangue come, ad esempio le trombosi.
Ulteriori caratteristiche della presente invenzione risulteranno dalla descrizione che segue di alcuni esempi meramente illustrativi e non limitativi.
Esempio 1 – Tests di laboratorio di routine eseguiti nel Probando
Sono stati eseguiti i tests coagulativi di laboratorio di routine concernenti lo screening trombofilico su una persona (definito come “Probando†) che presentava episodi di trombosi venosa profonda, ma non ulteriori problemi di salute.
In particolare, sono stati eseguiti: il tempo di protrombina, il tempo di tromboplastina parziale,i livelli di fattore IX, i livelli di fattori VIII ed XI, i livelli di antitrombina (attività ed antigene), i livelli di proteina C (attività coagulometrica e cromogenica, antigene), i livelli di proteina S (antigene totale, antigene libero ed attività), la resistenza alla proteina C attivata, l’ analisi del DNA per fattore V Leiden, l’analisi del DNA per la variante protrombinica G20210A, gli anticorpi antifosfolipidi, il plasminogeno, i tests di fibrinolisi. I tests coagulativi eseguiti nel Probando sono risultati tutti entro i limiti di norma ad eccezione dell’attività del FIX (si veda l’esempio 4 sottoriportato).
Esempio 2 - Isolamento del FIX mutante dal plasma e dal mezzo di coltura cellulare
L’isolamento del FIX dal plasma o dal mezzo di coltura à ̈ stato ottenuto mediante tecniche di immunoaffinità in colonna, utilizzando una resina (sepharose 4B) a cui era stato legato covalentemente un anticorpo monoclonale AHIX-5041 [Haematologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT, USA)] anti-FIX (3.5mg di anticorpo monoclonale per 3 ml di resina di sefarosio) (Hematologic Technologies, Essex Junction, VT, USA). Brevemente, la colonna à ̈ stata equilibrata con buffer contenente Tris 20 mM, NaCl 150mM, Benzamidina 1mM (mM= millimolare). Partendo dal plasma e stata effettuata una precipitazione dei fattori vitamina K dipendenti mediante l’aggiunta di Bario Cloruro. Dopo centrifugazione il sedimento à ̈ stato risospeso in una soluzione contenente EDTA 0. 2M. La preparazione così ottenuta à ̈ stata estensivamente dializzata (2 volte, per almeno 2 ore) in soluzione contenente Tris 20mM, NaCl 150 mM. Dopo la dialisi, la preparazione à ̈ stata fatta passare attraverso la colonna ad una velocità di 0. 5 ml/min. Dopo estensivo lavaggio della colonna (10 volumi/colonna) con buffer Tris/NaCl, l’eluizione à ̈ stata effettuata mediante soluzione di glicina acida (pH 2,45). Il pH dell’eluato à ̈ stato immediatamente neutralizzato mediante aggiunta di Tris 2M a pH 7. 5. Le frazioni di eluato contenenti proteina (testate con la metodica per proteine di Bradford), sono state raccolte in pool e dializzate contro una soluzione di Tris-NaCl, il FIX à ̈ stato quindi concentrato con una micro colonna da 200 µl di sefarosio Q a flusso rapido (scambio ionico). La purezza della preparazione à ̈ stata valutata con la tecnica della colorazione argentica del gel di SDS-PAGE.
Esempio 3 - Studio genetico del FIX
L’amplificazione mediante PCR ed il sequenziamento diretto degli esoni e dei siti di splicing del gene del FIX del Probando sono stati effettuati utilizzando tecniche standardizzate ed i primers come riportato in letteratura (Da: Methods in Molecular Medicine, Vol 31: Hemostasis and Thrombosis Protocols. Edited by D.J. Perry and K.J. Pasi. Humana Press Inc, Totowa, NJ. Chapter 16: Hemophilia B mutational analysis. By Peter Green) Brevemente, l’amplificazione à ̈ avvenuta mediante l’utilizzo di coppie di primers intronici attorno a ciascuno degli otto esoni del gene del FIX. Il sequenziamento à ̈ stato effettuato sul sequenziatore ABI PRISM 310 (Perkin Elmer, Foster City, CA) usando il kit per reazioni di sequenziamento ciclico ABI PRISM BigDye Terminator. I dati di sequenza sono stati analizzati con il programma Sequencing Analysis 3. 0 (Perkin Elmer, CA). La sequenza ottenuta à ̈ stata confrontata con la sequenza del FIX riportata sul database GenBank (accession number: K02402).
L’ analisi della sequenza nucleotidica del gene del FIX nel Probando ha documentato una unica mutazione nell’esone VIII del gene del FIX rispetto alla sequenza normale. Il paziente à ̈ risultato portatore di una mutazione da G a T in posizione 34099 del gene del FIX (sequenza normale del gene del FIX, Gene bank, accession number: K02402), in grado di convertire il codone 338 da Arginina ad Leucina. Pertanto la molecola del FIX presente nel plasma del Probando (FIX mutato) differisce dalla molecola normale di FIX solo per la presenza della sostituzione aminoacidica in posizione 338 dove al posto della Arginina c’à ̈ una Leucina.
Esempio 4 - Mutagenesi in vitro, espressione e purificazione del FIX ricombinante contenente la mutazione 338 Leu
La mutagenesi sito-specifica à ̈ stata eseguita secondo tecniche standard descritte da Kunkel (Kunkel TA. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection; Proc Natl Acad Sci USA 1985, 82: 488-492). Il sequenziamento del cDNA à ̈ stato effettuato per assicurarsi che la mutazione fosse corretta e che non fossero state introdotte nuove mutazioni. L’espressione del FIX ricombinante si à ̈ ottenuta utilizzando la “linea 293 di cellule renali di embrione umano†con le modalità già riportate in letteratura (Chang JL, Jin JP, Lollar P, et al. Changing residue 338 in human factor IX from arginine to alanine causes an increase in catalytic activity. J Biol Chem 1998;273:12089-12094.). L’isolamento del FIX ricombinante dal sopranatante (mezzo di coltura) à ̈ stato ottenuto mediante immunoaffinità su colonna, come sopra descritto. Brevemente, il sovranatante della coltura cellulare à ̈ stato raccolto ogni 24 ore per 10 giorni e conservato a -20°C. Per la purificazione il sovranatante à ̈ stato scongelato ed à ̈ stata aggiunta benzamidina ed EDTA ad una concentrazione finale di 5 milliMolare e 4 milliMolare, rispettivamente. Dopo filtrazione con filtro Millipore, il sovranatante veniva incubato con una resina di Sefarosio Q fast-flow per 12 ore a 4°C. La resina veniva quindi riequilibrata in tampone Tris, NaCl, Benzamidina e caricata su una colonna. L’eluizione avveniva mediante un gradiente di Calcio 0-60 nM. L’eluato veniva quindi dializzato in tampone Tris-NaCl. La preparazione veniva quindi applicata ad una colonna di immunoaffinità con le modalità descritte nell’esempio 2 (nella espressione “in vitro†del ricombinante)†. Partendo dal mezzo di coltura, la procedura à ̈ stata la stessa rispetto al plasma ad eccezione della procedura di precipitazione con BaCl. Il terreno di coltura à ̈ stato centrifugato a 4000g per 20 minuti, quindi sottoposto a dialisi in Tris-NaCl, quindi caricato sulla colonna di immunoaffinità ad una velocità di 0,5 ml/min. Le restanti fasi sono state analoghe a quelle effettuate per il plasma.
Il FIX con la mutazione genica G34099T determinante la sostituzione aminoacidica 338Leu, à ̈ stato ottenuto con tecniche di mutagenesi in vitro ed espressione. Il livello di espressione in coltura cellulare à ̈ risultato simile a quello ottenibile con FIX ricombinante non mutato (molecola normale). In particolare, il livello di espressione per il FIX ricombinante non mutato era tra 750 e 880 ng/ml mentre per il fattore IX ricombinante con la mutazione genica G34099T determinante la sostituzione aminoacidica 338Leu era tra 590 e 620 ng/ml.
Esempio 5 - Dosaggio funzionale del FIX
Il dosaggio funzionale del FIX à ̈ stato eseguito sul plasma del probando con un test coagulometrico utilizzando Actin (Dade Behring, Marburg, Germania) e plasma carente di FIX (Dade Behring, Marburg, Germania). Brevemente, per il test coagulometrico à ̈ stata utilizzata una variante del tempo di tromboplastina parziale (PTT) in un sistema contenente plasma privo di FIX. Dopo l’aggiunta di Calcio Cloruro à ̈ stato misurato il tempo di coagulazione in secondi. Tale tempo di coagulazione à ̈ stato confrontato con quelli di una curva di calibrazione ottenuta con diluizioni seriali di un pool di plasma normale di riferimento contenente una quantità di fattore IX di 5 Î1⁄4g/ml (ovvero il 100%) e la percentuale di FIX presente nel campione calcolata rispetto al 100% del pool di plasma normale (secondo comuni metodi standardizzati).
L’intervallo di normalità per il test era stato precedentemente ottenuto analizzando con lo stesso metodo 100 individui sani, di entrambi i sessi, di età compresa tra 20 e 70 anni.
I livelli di attività del FIX nel Probando sono risultati pari a 776% (intervallo normale su 100 individui sani, 80-120%).
Esempio 6 - Dosaggio del FIX antigene
L’antigene del FIX à ̈ stato determinato con un test in ELISA utilizzando un primo anticorpo monoclonale anti-FIX (Affinity Biologicals, Ontario, Canada) coattato sulla (legato alla) piastra per la cattura ed un secondo anticorpo monoclonale marcato con Horse-Raddish-Peroxidase (HRP) (Affinity Biologicals, Canada) per l’evidenziazione del FIX. La curva di riferimento à ̈ stata costruita diluendo un pool di plasma normale da 1:100 a 1:3200 in buffer per i campioni, secondo le procedure standardizzate. Brevemente, il primo anticorpo à ̈ stato legato alla piastra dopo diluizione in tampone Sodio Bicarbonato a pH basico (pH= 9.0) ad una concentrazione finale di 4 µg/ml. Dopo lavaggio estensivo della piastra con buffer Tris-NaCl-Tween20, i campioni diluiti 1:100 ed 1:200 nello stesso buffer sono stati caricati nei pozzetti ed incubati a temperatura ambiente per 2 ore. Dopo rimozione dei campioni dai pozzetti e lavaggio estensivo con buffer, 100 µl di una soluzione contenente il secondo anticorpo marcato con HRP sono stati aggiunti a ciascun pozzetto ed incubati a temperatura ambiente per due ore. Dopo ulteriori lavaggi, sono stati aggiunti 100 µl di una soluzione contenente tetrametilbenzidina (TMB) ed il colore sviluppatosi veniva misurato con uno spettrofotometro con filtro da 450 nanometri. Il livello di FIX antigene à ̈ stato calcolato rispetto alla curva di riferimento ed espresso come percentuale rispetto al pool di plasma normale. L’intervallo di normalità per il test era stato precedentemente ottenuto con lo stesso metodo analizzando 100 individui sani, di entrambi i sessi, di età compresa tra 20 e 70 anni.
I livelli di antigene del FIX sono risultati pari a 92% (intervallo normale 80-120%). Questo risultato (in combinazione con quanto ottenuto nell’esempio 5) à ̈ compatibile con la presenza di un FIX circolante sintetizzato in quantità normale, ma con una funzione “procoagulante†circa 8-9 volte superiore rispetto a quella della molecola di FIX normale.
Esempio 7 - Livelli di attività ed antigene del FIX dopo ricostituzione di un plasma carente di FIX con FIX estratto dal plasma del probando e con FIX ricombinante
Dopo isolamento del FIX dal plasma del Probando, tale FIX à ̈ stato utilizzato per la ricostituzione di un plasma carente di FIX (Dade-Behring, Milano, Italia) con una concentrazione finale di FIX di 5 Î1⁄4g/ml (pari al 100% del normale). Le misurazioni dell’attività ed antigene del FIX nel plasma così ricostituito erano 740% e 95%, rispettivamente, paragonabili, pertanto, a quelle riscontrate nel plasma del Probando.
Per il dosaggio dell’attività del FIX ricombinante ottenuto in accordo con l’esempio 4 à ̈ stato utilizzato lo stesso sistema, dopo ricomposizione di un plasma carente di FIX con una quantità di FIX ricombinante mutato (rFIX 338Leu) tale da ripristinare la normale concentrazione di FIX nel plasma umano normale, ovvero 5 µg/ml (corrispondente al 100% del normale) (µg =microgrammi). Le misurazioni dell’attività ed antigene del fattore IX ricombinante erano 780% e 90%, rispettivamente, paragonabili pertanto a quelle riscontrate nel plasma del probando. Questo indica che la proteina ricombinante così ottenuta, contenente la sostituzione aminoacidica presente anche nel fattore IX del Probando, presenta una attività biologica almeno 8-9 volte più elevata rispetto a quella del fattore IX normale.
Esempio 8 - SDS-PAGE ed Immunoblotting del FIX
L’SDS-PAGE ed immunoblotting (Western-blot) del FIX à ̈ stato eseguito su gel a gradiente lineare 5-15% secondo le procedure standard. Brevemente, i campioni contenenti FIX normale o FIX ricombinante sono stati caricati nei pozzetti del gel di poliacrilamide e sottoposti ad elettroforesi.
Il FIX Ã ̈ stato quindi sottoposto a transblottaggio su membrana di fluoruro di polivinildene (PVDF) utilizzando un apparato semi-dry (Novablot, GE-Healthcare, Milan, Italy). Il FIX Ã ̈ stato rilevato sulla membrana di PVDF dopo transblottaggio mediante un anticorpo monoclonale anti-FIX coniugato con HRP (Affinity Biologicals, Ontario, Canada).
La Figura 1 mostra che il FIX isolato dal Probando, il FIX ricombinante 338Leu ed il FIX normale presentano la stessa mobilità elettroforetica e lo stesso pattern all’ immunoblotting (nella figura 1, 1 indica marcatori di peso molecolare, 2 indica il FIX normale, 3 indica il FIX modificato maturale, 4 indica il FIX modificato ricombinante.
Non si evidenziano quindi con questa tecnica differenze significative (né quantitative né qualitative) tra il FIX umano normale, il FIX umano mutante naturale 338Leu ed il FIX ricombinante 338Leu.
Da quanto sopra descritto, risulta chiaro che la presenza di un Leucina in una posizione corrispondente alla posizione 338 sorprendentemente potenzia l’attività del polipeptide FIX di quasi otto volte.
La presente invenzione risulta particolarmente migliorativa rispetto allo stato dell’arte poiché fornisce un polipeptide FIX modificato che in vivo nell’uomo non determina alcun effetto collaterale eccezion fatta per l’aumento dell’attività di coagulazione.
Esempio 9 - Mutagenesi in vitro, espressione e purificazione del FIX ricombinante contenente la mutazione 338 Asp (338 Acido Aspartico, 338D)
La mutagenesi sito-specifica à ̈ stata eseguita secondo tecniche standard descritte da Kunkel (Kunkel TA. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection; Proc Natl Acad Sci USA 1985, 82: 488-492) inserendo una Guanina al posto della Citosina in posizione 34098, una Alanina al posto della Guanina in posizione 34099 ed una Timina al posto dell’Alanina in posizione 34100 (la mutagenesi à ̈ stata anche ripetuta inserendo una Guanina al posto della Citosina in posizione 34098, una Adenina al posto della Guanina in posizione 34099 ed una Guanina al posto dell’Adenina in posizione 34100).
Il sequenziamento del cDNA à ̈ stato effettuato per assicurarsi che la mutazione fosse corretta e che non fossero state introdotte nuove mutazioni. L’espressione del FIX ricombinante si à ̈ ottenuta utilizzando la “linea 293 di cellule renali di embrione umano†con le modalità già riportate in letteratura (Chang JL, Jin JP, Lollar P, et al. Changing residue 338 in human factor IX from arginine to alanine causes an increase in catalytic activity. J Biol Chem 1998;273:12089-12094.). L’isolamento del FIX ricombinante dal sopranatante (mezzo di coltura) à ̈ stato ottenuto mediante immunoaffinità su colonna, come sopra descritto. Brevemente, il sovranatante della coltura cellulare à ̈ stato raccolto ogni 24 ore per 10 giorni e conservato a -20°C. Per la purificazione il sovranatante à ̈ stato scongelato ed à ̈ stata aggiunta benzamidina ed EDTA ad una concentrazione finale di 5 milliMolare e 4 milliMolare, rispettivamente. Dopo filtrazione con filtro Millipore, il sovranatante veniva incubato con una resina di Sefarosio Q fast-flow per 12 ore a 4°C. La resina veniva quindi riequilibrata in tampone Tris, NaCl, Benzamidina e caricata su una colonna. L’eluizione avveniva mediante un gradiente di Calcio 0-60 nM. L’eluato veniva quindi dializzato in tampone Tris-NaCl. La preparazione veniva quindi applicata ad una colonna di immunoaffinità con le modalità descritte nell’esempio 2 (nella espressione “in vitro†del ricombinante)†. Partendo dal mezzo di coltura, la procedura à ̈ stata la stessa rispetto al plasma ad eccezione della procedura di precipitazione con BaCl. Il terreno di coltura à ̈ stato centrifugato a 4000g per 20 minuti, quindi sottoposto a dialisi in Tris-NaCl, quindi caricato sulla colonna di immunoaffinità ad una velocità di 0,5 ml/min. Le restanti fasi sono state analoghe a quelle effettuate per il plasma.
Il FIX con la sostituzione aminoacidica 338Asp, à ̈ stato ottenuto con tecniche di mutagenesi in vitro ed espressione. Il livello di espressione in coltura cellulare à ̈ risultato simile a quello ottenibile con FIX ricombinante non mutato (molecola normale). In particolare, il livello di espressione per il FIX ricombinante non mutato era tra 750 e 880 ng/ml mentre per il fattore IX ricombinante con la sostituzione aminoacidica 338Asp era tra 650 e 740 ng/ml.
Esempio 10 - Livelli di attività ed antigene del FIX dopo ricostituzione di un plasma carente di FIX con FIX ricombinante con mutazione 338Asp
Per il dosaggio dell’attività del FIX ricombinante ottenuto in accordo con l’esempio 9 à ̈ stato utilizzato lo stesso sistema, dopo ricomposizione di un plasma carente di FIX con una quantità di FIX ricombinante mutato (rFIX 338Asp) tale da ripristinare la normale concentrazione di FIX nel plasma umano normale, ovvero 5 µg/ml (corrispondente al 100% del normale) (µg =microgrammi). Le misurazioni dell’attività ed antigene del fattore IX ricombinante erano 460% e 98%, rispettivamente. Questo indica che la proteina ricombinante così ottenuta (FIX 338 Asp), presenta una attività biologica almeno 5 volte più elevata rispetto a quella del fattore IX normale.
Esempio 11 - SDS-PAGE ed Immunoblotting del FIX
L’SDS-PAGE ed immunoblotting (Western-blot) del FIX à ̈ stato eseguito su gel a gradiente lineare 5-15% secondo le procedure standard. Brevemente, i campioni contenenti FIX normale o FIX ricombinante sono stati caricati nei pozzetti del gel di poliacrilamide e sottoposti ad elettroforesi. Il FIX à ̈ stato quindi sottoposto a transblottaggio su membrana di fluoruro di polivinildene (PVDF) utilizzando un apparato semi-dry (Novablot, GE-Healthcare, Milan, Italy). Il FIX à ̈ stato rilevato sulla membrana di PVDF dopo transblottaggio mediante un anticorpo monoclonale anti-FIX coniugato con HRP (Affinity Biologicals, Ontario, Canada).
Il FIX ricombinante 338Asp ed il FIX normale presentano la stessa mobilità elettroforetica e lo stesso pattern all’ immunoblotting. Non si evidenziano quindi con questa tecnica differenze significative (né quantitative né qualitative) tra il FIX umano normale ed il FIX ricombinante 338Asp.
Da quanto sopra descritto, risulta chiaro che la presenza di un Acido Aspartico in una posizione corrispondente alla posizione 338 sorprendentemente potenzia l’attività del polipeptide FIX di quasi cinque volte.
La presente invenzione risulta particolarmente migliorativa rispetto allo stato dell’arte poiché fornisce un polipeptide FIX modificato che determina l’aumento dell’attività di coagulazione.
Esempio 12 - Mutagenesi in vitro, espressione e purificazione del FIX ricombinante contenente la mutazione 338 Gln (338 Glutammina, 338Q)
La mutagenesi sito-specifica à ̈ stata eseguita secondo tecniche standard descritte da Kunkel (Kunkel TA. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection; Proc Natl Acad Sci USA 1985, 82: 488-492) inserendo una Adenina al posto della Guanina in posizione 34099 (la mutagenesi à ̈ stata anche ripetuta inserendo una Adenina al posto della Guanina in posizione 34099 ed una Guanina al posto dell’Adenina in posizione 34100). Il sequenziamento del cDNA à ̈ stato effettuato per assicurarsi che la mutazione fosse corretta e che non fossero state introdotte nuove mutazioni. L’espressione del FIX ricombinante si à ̈ ottenuta utilizzando la “linea 293 di cellule renali di embrione umano†con le modalità già riportate in letteratura (Chang JL, Jin JP, Lollar P, et al. Changing residue 338 in human factor IX from arginine to alanine causes an increase in catalytic activity. J Biol Chem 1998;273:12089-12094.). L’isolamento del FIX ricombinante dal sopranatante (mezzo di coltura) à ̈ stato ottenuto mediante immunoaffinità su colonna, come sopra descritto. Brevemente, il sovranatante della coltura cellulare à ̈ stato raccolto ogni 24 ore per 10 giorni e conservato a -20°C. Per la purificazione il sovranatante à ̈ stato scongelato ed à ̈ stata aggiunta benzamidina ed EDTA ad una concentrazione finale di 5 milliMolare e 4 milliMolare, rispettivamente. Dopo filtrazione con filtro Millipore, il sovranatante veniva incubato con una resina di Sefarosio Q fast-flow per 12 ore a 4°C. La resina veniva quindi riequilibrata in tampone Tris, NaCl, Benzamidina e caricata su una colonna. L’eluizione avveniva mediante un gradiente di Calcio 0-60 nM. L’eluato veniva quindi dializzato in tampone Tris-NaCl. La preparazione veniva quindi applicata ad una colonna di immunoaffinità con le modalità descritte nell’esempio 2 (nella espressione “in vitro†del ricombinante)†. Partendo dal mezzo di coltura, la procedura à ̈ stata la stessa rispetto al plasma ad eccezione della procedura di precipitazione con BaCl. Il terreno di coltura à ̈ stato centrifugato a 4000g per 20 minuti, quindi sottoposto a dialisi in Tris-NaCl, quindi caricato sulla colonna di immunoaffinità ad una velocità di 0,5 ml/min. Le restanti fasi sono state analoghe a quelle effettuate per il plasma.
Il FIX con la sostituzione aminoacidica 338Gln, à ̈ stato ottenuto con tecniche di mutagenesi in vitro ed espressione. Il livello di espressione in coltura cellulare à ̈ risultato simile a quello ottenibile con FIX ricombinante non mutato (molecola normale). In particolare, il livello di espressione per il FIX ricombinante non mutato era tra 750 e 880 ng/ml mentre per il fattore IX ricombinante con la sostituzione aminoacidica 338Gln era tra 600 e 720 ng/ml.
Esempio 13 - Livelli di attività ed antigene del FIX dopo ricostituzione di un plasma carente di FIX con FIX ricombinante con mutazione 338Gln
Per il dosaggio dell’attività del FIX ricombinante ottenuto in accordo con l’esempio 12 à ̈ stato utilizzato lo stesso sistema, dopo ricomposizione di un plasma carente di FIX con una quantità di FIX ricombinante mutato (rFIX 338Gln) tale da ripristinare la normale concentrazione di FIX nel plasma umano normale, ovvero 5 µg/ml (corrispondente al 100% del normale) (µg =microgrammi). Le misurazioni dell’attività ed antigene del fattore IX ricombinante erano 1350% e 99%, rispettivamente. Questo indica che la proteina ricombinante così ottenuta (FIX 338 Gln), presenta una attività biologica almeno 13 volte più elevata rispetto a quella del fattore IX normale.
Esempio 14 - SDS-PAGE ed Immunoblotting del FIX
L’SDS-PAGE ed immunoblotting (Western-blot) del FIX à ̈ stato eseguito su gel a gradiente lineare 5-15% secondo le procedure standard. Brevemente, i campioni contenenti FIX normale o FIX ricombinante sono stati caricati nei pozzetti del gel di poliacrilamide e sottoposti ad elettroforesi. Il FIX à ̈ stato quindi sottoposto a transblottaggio su membrana di fluoruro di polivinildene (PVDF) utilizzando un apparato semi-dry (Novablot, GE-Healthcare, Milan, Italy). Il FIX à ̈ stato rilevato sulla membrana di PVDF dopo transblottaggio mediante un anticorpo monoclonale anti-FIX coniugato con HRP (Affinity Biologicals, Ontario, Canada).
Il FIX ricombinante 338Gln ed il FIX normale presentano la stessa mobilità elettroforetica e lo stesso pattern all’ immunoblotting. Non si evidenziano quindi con questa tecnica differenze significative (né quantitative né qualitative) tra il FIX umano normale ed il FIX ricombinante 338Gln.
Da quanto sopra descritto, risulta chiaro che la presenza di una Glutammina in una posizione corrispondente alla posizione 338 sorprendentemente potenzia l’attività del polipeptide FIX di almeno tredici volte.
La presente invenzione risulta particolarmente migliorativa rispetto allo stato dell’arte poiché fornisce un polipeptide FIX modificato che determina l’aumento dell’attività di coagulazione.
Secondo alcuni aspetti della presente invenzione vengono forniti polipeptidi, sequenze di nucleotidi, acidi nucleici, vettori, metodi ed usi in accordo con i seguenti punti.
1.- Polipeptide FIX (fattore IX) modificato comprendente:
un amminoacido scelto nel gruppo consistente di: Leucina, Cisteina, Acido aspartico, Acido glutammico, Istidina, Lisina, Asparagina, Glutammina, Tirosina in una posizione corrispondente alla posizione 338.
2.- Polipeptide secondo il punto 1, in cui l’amminoacido à ̈ scelto nel gruppo consistente di: Leucina, Acido aspartico, Glutammina.
3.- Polipeptide secondo il punto 1, in cui l’amminoacido à ̈ scelto nel gruppo consistente di: Acido aspartico, Glutammina.
4.- Polipeptide secondo il punto 1, in cui l’amminoacido à ̈ Acido aspartico.
5.- Polipeptide secondo il punto 1, in cui l’amminoacido à ̈ Glutammina.
6.- Polipeptide secondo il punto 1, in cui l’amminoacido à ̈ Leucina.
7.- Polipeptide secondo uno dei punti precedenti, e presentante una omologia di almeno il 70% con una sequenza di peptidi scelta nel gruppo consistente di: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.
8.- Polipeptide secondo uno dei punti precedenti, e presentante una omologia di almeno il 90% con una sequenza di peptidi scelta nel gruppo consistente di: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.
9.- Polipeptide secondo uno dei punti precedenti, e presentante una percentuale di identità di almeno il 70% con una sequenza di peptidi scelta nel gruppo consistente di: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.
10.- Polipeptide secondo uno dei punti precedenti, e presentante una percentuale di identità di almeno il 90% con una sequenza di peptidi scelta nel gruppo consistente di: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.
11.- Polipeptide secondo uno dei punti precedenti, in cui la sequenza di peptidi à ̈ la SEQ ID NO: 2.
12.- Sequenza di nucleotidi codificante un polipeptide FIX secondo uno dei punti precedenti.
13.- Sequenza di nucleotidi secondo il punto 12, in cui la sequenza di nucleotidi à ̈ una sequenza di DNA e consiste di porzioni introniche e porzioni esoniche, le quali porzioni esoniche presentano una sequenza complessiva con almeno il 70% di omologia rispetto ad una sequenza complessiva di regioni esoniche di una sequenza SEQ ID NO: 5.
14.- Sequenza di nucleotidi secondo il punto 13, in cui la sequenza complessiva delle porzioni esoniche presenta almeno il 90% di omologia con la sequenza complessiva delle regioni esoniche della sequenza SEQ ID NO: 5.
15.- Sequenza di nucleotidi secondo uno dei punti da 12 a 14, in cui la sequenza di nucleotidi presenta almeno il 50% di omologia con la sequenza avente numero di accesso (accession number) K02402 (GenBank).
16.- Sequenza di nucleotidi, secondo uno dei punti da 12 a 15, e comprendente in posizioni corrispondenti a 34098, 34099 e 34100 una tripletta scelta nel gruppo consistente di: TTA, UUA, TTG, UUG, CTT, CUU, CTC, CUC, CTA, CUA, CTG, CUG, GAT, GAU, GAC, CAA, CAG.
17.- Sequenza di nucleotidi, secondo il punto 16, e comprendente in posizioni corrispondenti a 34098, 34099 e 34100 una tripletta scelta nel gruppo consistente di: TTA, UUA, TTG, UUG, CTT, CUU, CTC, CUC, CTA, CUA, CTG, CUG, CAA, CAG.
18.- Sequenza di nucleotidi, secondo il punto 16, e comprendente in posizioni corrispondenti a 34098, 34099 e 34100 una tripletta scelta nel gruppo consistente di: TTA, UUA, TTG, UUG, CTT, CUU, CTC, CUC, CTA, CUA, CTG, CUG.
19.- Sequenza di nucleotidi, secondo il punto 16, e comprendente in posizioni corrispondenti a 34098, 34099 e 34100 una tripletta scelta nel gruppo consistente di: CAA, CAG.
20.- Sequenza di nucleotidi, secondo il punto 16, e comprendente in posizioni corrispondenti a 34098, 34099 e 34100 una tripletta scelta nel gruppo consistente di: GAT, GAU, GAC, CAA, CAG.
21.- Sequenza di nucleotidi, secondo il punto 16, e comprendente in posizioni corrispondenti a 34098, 34099 e 34100 una tripletta scelta nel gruppo consistente di: GAT, GAU, GAC.
22.- Sequenza di nucleotidi, secondo uno dei punti da 12 a 18, e comprendente una Timina in una posizione corrispondente alla posizione 34099.
23.- Acido nucleico comprendente una sequenza di nucleotidi secondo uno dei punti da 12 a 22.
24.- Acido nucleico secondo il punto 23, e comprendente un promotore collegato in modo operativo alla detta sequenza di nucleotidi.
25.- Vettore comprendente un acido nucleico, secondo il punto 23 o 24.
26.- Metodo di produzione di un polipeptide FIX modificato, secondo il quale il polipeptide FIX modificato viene espresso mediante un acido nucleico secondo il punto 23 o 24.
27.- Metodo secondo il punto 26, e comprendente le fasi di:
introdurre un vettore del punto 25 in una cellula; e
fare una cultura della cellula in modo che il polipeptide FIX venga espresso.
28.- Polipeptide FIX modificato secondo uno dei punti da 1 a 11 per un uso come medicamento.
29.- Polipeptide FIX modificato secondo uno dei punti da 1 a 11 per il trattamento di almeno una discoagulopatia.
30.- Uso di un polipeptide FIX modificato secondo uno dei punti da 1 a 11 per la preparazione di un farmaco per il trattamento di almeno una discoagulopatia in un mammifero.
31.- Sequenza di nucleotidi secondo uno dei punti da 12 a 22 per un uso come medicamento.
32.- Metodo per la rilevazione di una sequenza di nucleotidi di uno dei punti da 12 a 22.
33.- Metodo per la rilevazione di un polipeptide FIX modificato secondo uno dei punti da 1 a 11.
34.- Metodo secondo il punto 32, e comprendente una fase di amplificazione mediante PCR.
BIBLIOGRAFIA:
- Ameri A, Kurachi S, Sueishi K, Kuwahara M, Kurachi K. Myocardial fibrosis in mice with overexpression of human blood coagulation factor IX. Blood. 2003 Mar 1;101(5):1871-3. Epub 2002 Oct 24.
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LISTA DELLE SEQUENZE
<110> Simoni, Paolo
<120> POLIPEPTIDE FATTORE IX MODIFICATO, SUE UTILIZZAZIONI E
METODO PER LA SUA PRODUZIONE
<130> 115/08
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 461
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr 1 5 10 15
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu
20 25 30
Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn
35 40 45
Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys 50 55 60
Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn 65 70 75 80
Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln 85 90 95
Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile
100 105 110
Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys
115 120 125
Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe 130 135 140
Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe 165 170 175
Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala
180 185 190 Glu Ala Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu
195 200 205
Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe 210 215 220
Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp 225 230 235 240 Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile 245 250 255
Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly
260 265 270
Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu
275 280 285
His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn 290 295 300
Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu 305 310 315 320 Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile 325 330 335
Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr
340 345 350
Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val
355 360 365
Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg 370 375 380
Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His 385 390 395 400 Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val 405 410 415
Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly
420 425 430
Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser
435 440 445
Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr
450 455 460
<210> 2
<211> 415
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg 1 5 10 15
Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe
20 25 30
Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly
35 40 45
Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp 50 55 60
Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys 65 70 75 80
Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu 85 90 95
Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr
100 105 110
Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val
115 120 125
Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr 130 135 140
Arg Ala Glu Ala Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu 145 150 155 160 Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn 165 170 175
Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe
180 185 190
Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly
195 200 205
Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu 210 215 220
Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu 225 230 235 240 Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His 245 250 255
His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu
260 265 270
Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile
275 280 285
Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser 290 295 300
Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala 305 310 315 320 Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys 325 330 335
Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly
340 345 350
Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro
355 360 365
His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser 370 375 380
Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys 385 390 395 400 Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr
405 410 415

Claims (1)

  1. RIVENDICAZIONI 1.- Polipeptide FIX (fattore IX) modificato comprendente: un amminoacido scelto nel gruppo consistente di: Leucina, Cisteina, Acido aspartico, Acido glutammico, Istidina, Lisina, Asparagina, Glutammina, Tirosina in una posizione corrispondente alla posizione 338. 2.- Polipeptide secondo la rivendicazione 1, in cui l’amminoacido à ̈ scelto nel gruppo consistente di: Leucina, Acido aspartico, Glutammina. 3.- Polipeptide secondo la rivendicazione 1, in cui l’amminoacido à ̈ scelto nel gruppo consistente di: Acido aspartico, Glutammina. 4.- Polipeptide secondo la rivendicazione 1, in cui l’amminoacido à ̈ glutammina 5.- Polipeptide secondo una delle rivendicazioni precedenti, e presentante una percentuale di identità di almeno il 90% con una sequenza di peptidi scelta nel gruppo consistente di: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. 6.- Sequenza di nucleotidi codificante un polipeptide FIX secondo una delle rivendicazioni precedenti. 7.- Sequenza di nucleotidi secondo la rivendicazione 6, in cui la sequenza complessiva delle porzioni esoniche presenta almeno il 90% di omologia con la sequenza avente numero di accesso (accession number) K02402 (GenBank). 8.- Sequenza di nucleotidi, secondo una delle rivendicazioni da 6 a 7, e comprendente in posizioni corrispondenti alle posizioni 34098, 34099 e 34100 una tripletta scelta nel gruppo consistente di: TTA, UUA, TTG, UUG, CTT, CUU, CTC, CUC, CTA, CUA, CTG, CUG, GAT, GAU, GAC, CAA, CAG. 9.- Polipeptide FIX modificato secondo una delle rivendicazioni da 1 a 5 per un uso come medicamento. 10.- Sequenza di nucleotidi secondo una delle rivendicazioni da 6 a 8 per un uso come medicamento.
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