IT8922630A1 - Estere metilico dell'acido 3-/1-metil-4-(3-metil-2-butenil)-imidazol5-il/-2-propenoico e suoi sali, processo di isolamento e composizioni farmaceutiche ed insetticide che li contengono - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

Campo dell'invenzione

La presente invenzione ha per oggetto un prodotto di formula (I ):

ed i suoi sali, utile per la preparazione di composizioni farmaceutiche ed insetticide.

Stato della tecnica

E' noto che i composti capaci di provocare l?inibizione reversibile dell'enzima acetilcolinesterasi, sono utili in terapia per la cura del glaucoma, della miastenia gravls, dell'atonia gastrica, intestinale e vescicale conseguente ad interventi chirurgici addominali,del deficit di memoria che si verifica nelle sindromi demenziali; in campo anestesiologico per terminare gli effetti dei curari di tipo competitivo; in associazione con la succinilcolina per prolungarne l' effetto curaromimetico depolarizzante; in campo tossicologico nel trattamento degli avvelenamenti da atropina, da fenotiazina e

da antidepressivi triciclici. Fra i pi? importanti composti che svolgono questo tipo di azione sono da ricordare la fisostigmina,o eserina, e la neostigmina.

Altri inibitori delle colinesterasi sono largamente usati in agricoltura come insetticidi.

Visto il vasto campo di azione delle sostanze che posseggono le propriet? inibenti dell'enzima acetilcolinesterasi ? evidente l'importanza di preparare sempre nuove sostanze che si rivelino dotate di tale propriet?.

Descrizione dettagliata dell'invenzione

La presente invenzione si riferisce al composto di formula (I):

estere metilico dell'acido 3-[l-metil-4-(3-metil-2-butenil)-imidazol-5-il]-2-propenoico (detto anche Visoltricina) ed ai suoi sali, come cloridrato,nitrato, bromuro, salicilato.

Il prodotto di formula (I) ? stato preparato utilizzando un fungo isolato da grano ed identificato come Fusarium Tricinctum (appartenente alla sezione Sporotrichiella) secondo i procedimenti di isolamento ed identificazione descritti da Nelson et al. (Nelson P.E., Toussoun T.A., Marasas W.F.O. "Fusarium species - an illustrated manual for Identification", The Pennsylvania State University Press, University park, PA, USA, 1983).

Questo composto ? il primo a struttura imidazolica prodotto da funghi del genere Fusarium e pu? essere prodotto su larga scala secondo le metodologie note. Il composto ? presumibilmente prodotto anche da isolati fungini diversi dal Fusarium tricinctum, in particolare da F.chlamydosporum, che appartiene alla stessa sezione (Sporotrichiella) nella classificazione di Nelson et al.(1983), e forse anche da altre specie di Fusarium. Il composto di formula (I) presenta propriet? anticolinesterasiche, senza tuttavia presentare un'azione colinergica diretta, e pu? quindi trovare applicazioni in campo medico e veterinario per tutti gli usi riservati agli anticolinesterasici-parasimpaticomimetici e miotici-antiglaucoma.

Parte sperimentale

1.6 Kg di mais sono suddivisi in otto beute da 1 litro e lasciati ad imbibire con 560 ml di acqua per una notte per poi essere sterilizzati. Questo substrato ? inoculato con una coltura di fungo (Fusarium tricinctum) accresciuto su patatadestrosio-agar e incubato a 20?-22?C per 6 settimane; successivamente la coltura ? seccata per 48h a 60?C e macinata finemente. La coltura viene estratta con 5.4 litri di MeOH/NaCl (1%) 55/45 in due fasi ( la prima tenendo in agitazione in beute da litro per una notte, la seconda con blendor). Questo procedimento ? stato largamente utilizzato per la produzione ed estrazione di metaboliti di Fusarium (vedi Visconti et al. J.Agric.Food Chem. 1989. 37. pag.1348-1351)? La produzione media di Visoltricina da questo substrato si aggira intorno ai 100 mg/kg. Altri cereali (frumento, riso, etc.) possono anche essere utilizzati come substrati.

La Visoltricina pu? essere purificata dall'estratto MeOH/NaCl precedentemente filtrato in vari modi, ad esempio:

a) eliminazione di interferenti liposolubili mediante estrazione con esano (2 estrazioni con 0.5 volumi di esano); estrazione della Visoltricina con metilene cloruro (2 estrazioni con 0.5 volumi di metilene cloruro); concentrazione dell'estratto a piccoli volumi mediante evaporazione sotto vuoto; purificazione su lastre TLC preparative di gel di silice con indicatore di fluorescenza, utilizzando come solventi di eluizione in successione benzene/acetone 12:7 e cloroformio/metanolo 9:1?

b) trasformazione della Visoltricina nel suo sale cloridrato mediante aggiunta di acido cloridrico fino a pH 2, eliminazione di interferenti liposolubili mediante estrazione con esano (2 estrazioni con 0.5 volumi di esano), eliminazione di interferenti solubili in fase organica mediante estrazione con metilene cloruro (0.3 volumi) ; riottenimento della Visoltricina mediante aggiunta di NaOH 10 N alla soluzione acquosa fino a pH 8; recupero della Visoltricina mediante estrazione con metilene cloruro (2 volte con 0.5 volumi); concentrazione a secchezza dell'estratto in metilene cloruro, che viene poi ripreso in un minimo volume di metanolo purificato su lastre di TLC preparative di gel di silice come descritto per il procedimento (a).

Il procedimento (b) permette di ottenere un estratto di Visoltricina con meno composti interferenti.

La Visoltricina pu? essere evidenziata come una banda (o una macchia) scura su lastre con indicatore di fluorescenza irradiate a 254 nm, e/o mediante reazione (su lastra) con una soluzione di p-anisaldeide che sviluppa una colorazione blu in corrispondenza della Visoltricina. Gli Rf,della visoltricina su lastre TLC analitiche sono circa 0.37 in benzene/acetone 12:7 e 0.77 in cloroformio/metanolo 9:1?

Le bande o macchie corrispondenti alla Visoltricina vengono raschiate dalle TLC preparative ed eluite dalla silice con acetone. La soluzione acetonica delle diverse bande eluite viene svaporata sotto un flusso di azoto riscaldando la soluzione a 50 C ed il precipitato di Visoltricina che si forma viene sciolto nel minimo volume di MeOH che, dopo diluizione con acqua, viene ghiacciato e liofilizzato.

La quantit? di Visoltricina pura recuperata da 1.6 Kg di coltura ammonta a 80 mg.

Il prodotto (I) ? stato preparato anche a partire da Fusariura tricinctum accresciuto in coltura statica per 25~40 giorni a temperatura ambiente sui seguenti substrati liquidi:

YES (estratto di lievito 20g/l, saccarosio 40g/l); Czapek-Dox e MYRO (J.M.Farber, G.W.Sanders "Appi. Environ.Microbiol. 1986, 51, 381-384"). I sali della Visoltricina sono stati ottenuti mediante reazione equimolare con l'acido corrispondente.

Caratterizzazione chimico-fisica

La sostanza si presenta di colore bianco, solida a temperatura ambiente con punto di fusione di 93?C. E' solubile in metilene cloruro, cloroformio, acetone,benzene, tetraidrofurano, acido cloridrico 0,1 N; poco solubile in alcool metilico, etile acetato, acetonitrile; insolubile in esano, etere etilico, acqua. La definizione della formula bruta C13H18N2O2, a cui corrisponde un peso molecolare di 234.297 ? stata confermata dall?analisi elementare che ha dato i seguenti risultati :

C = 66.792 (teorico 66.642); H = 7.712 (teorico 7-742); N = 11.912 (teorico 11.962); 0 = 13-592 (teorico 13-662)

e dalla spettrometria di massa :

MS, m/z (intensit? relativa) :

234 (43.M+) , 219 (2), 202 (91) 187 (21), 173 (64), 159 (100), 133 (52).

La perdita di un gruppo metilico dallo ione molecolare (234 amu) d? luogo al frammento 219 amu, il quale a sua volta pu? generare i frammenti 187 (-CH3OH), 133 (-acrilato di metile dalla posizione 5 del nucleo imidazolico) e 159 anni (-CH3OH, CO, picco base). La perdita di alcool metilico dallo ione molecolare d? luogo al frammento 202 amu.

Lo spettro UV in metanolo presenta un massimo di assorbimento a 301 nm con un coefficiente di estinzione molare = 20.304.

Spettro IR (in KBr) :

3097, 2980-2820, 1704, 1633. 1520, 1463, 1433. 1384, 1304, 1276, 1166, 1000, 869. 803 .cm-1.

Il C=0 estereo ed il doppio legame coniugato sono evidenziati dai segnali a 1705 e 1633 cm - Segnali relativi ad alcheni (non tetrasostituiti) coniugati trans-trans sono osservati a 3097, 1633, 1000 e 803 cm"1.

Caratteristici del metilimidazolo sono i segnali a 1520 e 1276 cm .

Spettro NMR

Nella tabella 1 sono riassunti i risultati degli spettri NMR del protone e del 13C della Visoltricina disciolta in CDCl3? Tab. 1. SPOSTAMENTI CHIMICI (ppm) E COSTANTI DI ACCOPPIAMENTO (Hz) PER GLI SPETTRI NMR 1H AND NMR DELLA VISOLTRICINA.

Tutti i valori di spostamenti chimici e costanti di accoppiamento assegnati nello spettro NMR corrispondono con buona approssimazione ai valori calcolati e sono stati confermati da opportuni esperimenti di disaccoppiamento spinspin; le varie assegnazioni sono state confermate anche con la tecnica COSY.

Lo spettro APT (attached proton test) utile per la valutazione del numero di protoni legati ai vari 13C, ha confermato le assegnazioni di cui sopra, evidenziando in particolare 8 atomi di carbonio mono- o trisostituiti (-CH3 o

=CH) e 5 atomi di carbonio bi- o tetrasostituiti (=CH2 o =C=). Reazioni chimiche

La Visoltricina ? stata idrolizzata (formando l'acido corrispondente in seguito a perdita di metanolo) con NaOH 0.1 N in etanolo (0.5 ml per 1 mg di visoltricina) tenuto a reagire per 4 ore. L'idrolizzato, previo allontanamento della Visoltricina residua mediante estrazione con metilene cloruro, ? stato facilmente riesterificato con BF3/MeOH ( 0.5 ml 14% W/V, 20 min a 60?0) per ridare il prodotto originale (Visoltricina) confermato sia per TLC che per GC/MS. Lo stesso prodotto di idrolisi ha reagito con Tri-Sil TBT (Pierce) formando il trimetilsilil-derivato osservabile mediante gascromatografia ad un tempo di ritenzione pi? lungo di quello della Visoltricina.

Attivit? biologica

Per la verifica dell'azione colinergica sono stati effettuati una serie di saggi sul sale cloridrato della Visoltricina.

Una soluzione acquosa al 1% (o 2%) di cloridrato di Visoltricina, instillata (100 ?l) nel sacco congiuntivaie dell'occhio di un coniglio New Zeland bianco, ha sviluppato dopo circa 20 min, e per una durata di circa 4 h, un effetto miotico di intensit? simile a quello provocato da collirio di pilocarpina al 2%. Ad effetto terminato l'occhio ? ritornato normale senza alcun segno di irritazione od altri effetti collaterali. Come nel caso della pilocarpina l'effetto miotico ? stato facilmente annullato per aggiunta di atropina.

In un altro esperimento teso a verificare la capacit? della Visoltricina di attraversare la cornea ? stato eseguito un prelievo di umore acqueo (50 pi) dalla camera anteriore dell'occhio di coniglio (preventivamente anestetizzato) trattato con la Visoltricina, avendo cura di lavare abbondantemente l'occhio con soluzione fisiologica prima di effettuare il prelievo mediante perforazione della cornea con l'ago di una siringa da 1 mi. La stessa operazione di prelievo ? stata eseguita sull'altro occhio dove, prima di instillare la soluzione di Visoltricina ? stata scarificata la cornea al fine di facilitare il passaggio della sostanza all'interno della camera anteriore dell'occhio. L'analisi delle due soluzioni ha confermato la presenza di Visoltricina nell?umore acqueo. Il rapporto fra la quantit? di Visoltricina passata attraverso la cornea non scarificata e quella passata liberamente senza la barriera corneale ? di 1:8.

Meccanismo di azione

Al fine di accertare il meccanismo di azione colinergica, se cio? esso ? di tipo diretto od indiretto, sono stati effettuati i seguenti saggi con il cloridrato di Visoltricina.

Il saggio per l'attivit? muscarinica (colinergica diretta) ? stato effettuato su ileo di cavia in bagno per organi isolati, usando la pilocarpina come riferimento positivo. L'esperimento ha dimostrato che la Visoltricina non ha attivit? muscarinica fino alla concentrazione massima saggiata di 3.4x10-6M- {8x10- 4 g/1) mentre la pilocarpina ? risultata attiva a concentrazioni cento volte inferiori.

L'attivit? anticolinesterasica (colinergica indiretta) ? stata saggiata con il metodo di Ellman et al. (Biochem Pharmacol.1961, 7. 88) su siero umano a confronto con la neostigmina, noto composto ad azione anticolinesterasica di tipo reversibile. La dose inibente l'enzima al 50 % (?50) ? stata valutata a 15'per la Visoltricina pari a 2.6x10 M 0.2 mg per saggio), mentre per la neostigmina si ottenevano risultati simili con 0,05 mg per saggio (Ic5nU = 7.5x10 M).

L'esperimento ha mostrato per la Visoltricina un'attivit? circa 3-4 volte minore.

Una conferma "in vivo" dell'azione colinergica della Visoltricina si ? avuta col manifestarsi di incontinenza urinaria e defecazione in una ratta alla quale erano stati somministrati per via intraperitoneale 5 mg di composto per Kg di peso corporeo. A tali dosi, che risultano essere almeno 10 volte superiori alla DL50 riportata in letteratura per la neostigmina, non erano osservabili altri effetti tossici.

Come si sa l?azione degli inibitori delle colinesterasi varia molto sia in funzione del substrato che della specie animale saggiata.

La Visoltricina ? risultata particolarmente attiva su larve schiuse di Artemia salina (crostacei), con una dose letale al 50% (LD50) pari a 0.2 ?g/ml (8.5x10 -7M). Questa attivit? f? ragionevolmente ritenere che la Visoltricina pu? trovare impiego anche come insetticida in virt? di una forte azione anticolinesterasica sugli insetti.

La Visoltricina, fino a concentrazioni di 2 ?g/ml, non ha mostrato azione citotossica su linee cellulari umane (K-562 e MIN-GL1) e non ha influenzato la proliferazione di linfociti umani stimolata da fitoemaglutinina (PHA).

Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI 1. Composto di formula (I)

   e suoi sali.
2. 2. Composti secondo la rivendicazione 1 in cui i sali del composto di formula (I) sono: cloridrato, nitrato, bromuro, salicilato.
3. 3. Processo per la preparazione del composto di formula (I)

   mediante fermentazione di colture di funghi del genere Fusarium e isolamento della Visoltricina come tale o sotto forma di sale.
4. 4. Processo secondo la rivendicazione 3 in cui il fungo impiegato ? il Fusarium tricinctum.
5. 5. Composizioni farmaceutiche ad attivit? anticolinesterasica parasimpaticomimetica contenenti come principio attivo uno o pi? composti secondo la rivendicazione 1.
6. 6. Uso dei composti secondo la rivendicazione 1 per la preparazione di composizioni farmaceutiche aventi attivit? anticolinesterasica parasimpaticomimetica.
7. 7? Composizioni insetticide contenenti come principio attivo uno o pi? composti secondo la rivendicazione 1.
8. 8. Uso dei composti secondo la rivendicazione 1 per la preparazione di composizioni insetticide.
9. 9. Metodo per combattere gli insetti in cui sono usate composizioni contenenti come principio attivo i composti secondo la rivendicazione 1.
10. 10. Uso dei composti secondo la rivendicazione 1 come anticolesterasici-parasimpaticomimetici e mioticiantiglaucoma.