IT202100021863A1 - Morfolino pirimidine per l’uso nella prevenzione e/o nel trattamento di stati di ipereccitabilità neuronale - Google Patents
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- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
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Description
Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:
?MORFOLINO PIRIMIDINE PER L?USO NELLA PREVENZIONE E/O NEL TRATTAMENTO DI STATI DI IPERECCITABILIT? NEURONALE?
Campo tecnico dell?invenzione
L?invenzione riguarda l?uso di composti a struttura morfolino pirimidinica nella prevenzione e/o nel trattamento di stati di ipereccitabilit? neuronale.
Stato della tecnica
Le terapie esistenti per trattare gli stati di ipereccitabilit? neuronale in particolar modo l?epilessia, mirano per lo pi? a impedire la generazione del potenziale d?azione o ad aumentare l?attivazione del sistema inibitorio. Sebbene il 70% dei pazienti epilettici rispondano positivamente a queste terapie, circa il 30% dei pazienti rimanenti non trova beneficio dai convenzionali approcci terapeutici. Alla base di questa mancata risposta farmacologica ci possono essere molteplici ragioni, tra cui il bersaglio molecolare non corretto o la presenza di eventuali riarrangiamenti del tessuto che rendono inefficace il farmaco utilizzato.
Sussiste pertanto la necessit? di individuare nuovi composti utili nella prevenzione e/o nel trattamento di stati di ipereccitabilit? neuronale.
ATR ? una serina/treonina protein chinasi da sempre nota per il suo coinvolgimento nel rilevamento del danno al DNA cos? come nell'attivazione del checkpoint del danno al DNA, che porta all'arresto del ciclo cellulare negli eucarioti. ATR viene attivata in risposta al DNA persistente a filamento singolo, che ? un intermedio comune formato durante il rilevamento e la riparazione del danno al DNA. Grazie a questi suoi importanti ruoli ? stata vista essere direttamente coinvolta nelle malattie oncologiche sia nella generazione che nella propagazione di tumori.
EP 2579877 descrive composti a struttura morfolino pirimidinica, processi per la loro preparazione, loro composizioni farmaceutiche loro uso in terapia, per esempio nel trattamento di una malattia proliferativa, come il cancro, e in particolare di una malattia mediata da mutazioni del gene ATM (ataxia telangiectasia mutated) e dagli inibitori della protein-chinasi RAD-3-correlata, comunemente chiamata ATR, aventi attivit? antitumorale.
Elenco e breve descrizione delle figure
La Figura 1 mostra la durata d?azione del composto AZD6738 1?M in neuroni ippocampali DIV 13-14 in coltura: l?effetto sul blocco della proteina chinasica ATR ottenuto da un singolo trattamento con AZD6738 dura tra le 48 e 72 ore.
La Figura 2 mostra l?effetto indotto dal trattamento acuto con AZD6738 sulla trasmissione neuronale in vitro. Colture di neuroni ippocampali div 13-14 trattati una sola volta con AZD 1?M mostrano: normali livelli di calcio basale (A); funzione sinaptica alterata come evidenziato dalla riduzione della frequenza dei potenziali post-sinaptici eccitatori in miniatura (mEPSCs) e aumento dei potenziali post-sinaptici inibitori in miniature (mIPSCs) (B); un aumento delle sinapsi inibitorie e riduzione di quelle eccitatorie mediante esperimenti di immunofluorescenza (C).
La Figura 3 mostra l?effetto indotto dal trattamento cronico di AZD6738 su neuroni ippocampali in vitro. Colture di neuroni ippocampali maturi (div 13-14) trattati cronicamente con AZD6738 (da div 13 a div 21, a giorni alterni) mostrano un aumento della trasmissione inibitoria e riduzione di quella eccitatoria come rilevato da registrazioni di elettrofisiologia (A) ed esperimenti di immunofluorescenza (B). L?aumento della rete inibitoria e la riduzione dell?attivit? eccitatoria sono responsabili della ridotta attivit? spontanea spike dei neuroni (C).
La Figura 4 mostra la capacit? di AZD6738 di impedire la trascrizione del fattore Egr1 in vitro. Dati di rtPCR in vitro indicano come colture neuroni ippocampali trattati cronicamente con AZD (da div 13 a div 21, ogni 72 ore) mostrano il blocco specifico della trascrizione del fattore Egr1 nonostante sia promossa l?attivit? neuronale attraverso l?agente depolarizzante KCl.
La Figura 5 mostra l?effetto di AZD6738 sulla trascrizione di Egr1, che si riflette in una ridotta trascrizione di canali del calcio in vitro, in particolare della subunit? Cacna1h/Cav3.1. Vengono mostrati risultati di rtPCR analizzati 30 minuti dopo l?attivazione indotta da KCl. E? possibile notare come se pur nel controllo si abbia solo un blando aumento nella trascrizione delle subunit? calcio Cacna1h/Cav3.1 e Cacn2d4/Cav3.2, in questi neuroni il trattamento cronico con AZD6738 comunque porta ad una riduzione della trascrizione della subunit? Cacna1h/Cav3.1 gi? in condizioni basali (? presumibile pensare che l?effetto sulle subunit? calcio post KCl sia osservabile a tempi pi? lontani ad esempio dopo 1 ora dalla stimolazione). Il trattamento cronico con AZD6738 riduce la trascrizione di geni target di Egr1 coinvolti negli stati di ipereccitabilit? come i canali al calcio ed in particolare per la subunit? Cacna1h/Cav3.1 mentre nessun effetto sembra esserci sulla subunit? Cacn2d4/Cav3.2
La Figura 6 mostra i risultati dell?analisi della durata d?azione in vivo attraverso esperimenti di biochimica svolti a partire da tessuti ippocampali di topi trattati con AZD6738 a seguito di singola somministrazione intranasale, risultata pari a circa 48-60 ore.
La Figura 7A, B, C e D mostra la down-regolazione trascrizionale a seguito di trattamento con AZD6738 mediante esperimenti di RNA sequencing.
La Figura 8 mostra l?effetto anticonvulsivante in vivo di AZD6738.
La Figura 9 mostra come il trattamento con AZD6738 controlli i livelli di trascrizione del fattore di trascrizione EGR1 durante lo status epilepticus.
Sommario dell?invenzione
L?invenzione si riferisce all?uso di composti a struttura morfolino pirimidinica di formula (I):
nella prevenzione e/o nel trattamento di stati di ipereccitabilit? neuronale.
Descrizione dettagliata dell?invenzione
Oggetto della presente invenzione sono composti di formula (I):
in cui
R<1 >? scelto tra morfolin-4-il e 3-metilmorfolin-4-il, preferibilmente ? 3-metilmorfolin-4-il;
R<2 >?
n ? 0 o 1;
R<2A>, R<2C>, R<2E >e R<2F >sono ciascuno indipendentemente idrogeno o metile;
R<2B >e R<2D >sono ciascuno indipendentemente idrogeno o metile;
R<2G >? scelto tra -NHR<7 >e -NHCOR<8>, preferibilmente ? -NH2, -NHMe e -NHCOMe; R<2H >? fluoro;
R<3 >? metile;
R<4 >e R<5 >sono ciascuno indipendentemente idrogeno o metile, o R<4 >e R<5 >insieme all?atomo a cui sono legati formano l?anello A;
A ? un anello C3-6-cicloalchile o un anello eterociclico saturo a 4-6 membri contenente un eteroatomo scelto tra O e N;
R<6 >? idrogeno;
R<7 >? idrogeno o metile;
R<8 >? metile;
o loro sali farmaceuticamente accettabili,
per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento di stati di ipereccitabilit? neuronale. Si ? sorprendentemente trovato che i composti dell?invenzione come di seguito definiti, in particolare AZD6738, inducono un aumento della trasmissione inibitoria e una riduzione di quella eccitatoria in neuroni ippocampali in coltura a seguito di trattamento sia acuto che cronico, agendo quindi sul controllo degli stati di ipereccitabilit? neuronale. Sulla base di questo risultato ottenuto grazie a registrazioni elettrofisiologiche in vitro e di immunofluorescenza, si ? investigato anche il possibile meccanismo molecolare responsabile di questo effetto sull?ipereccitabilit? neuronale. Attraverso risultati di biologia molecolare in particolare di PCR, ? stato trovato che i composti dell?invenzione, in particolare AZD6738, prevengono l?aberrante attivazione di un fattore di trascrizione, l?EGR1, che pu? effettivamente essere considerato un marker di ipereccitazione in stati di epilessia nell?uomo. Questo potenziale meccanismo molecolare d?azione spiegherebbe come i composti dell?invenzione, in particolare AZD6738, siano in grado di agire (frenando) l?eccitabilit? neuronale.
Inaspettatamente, il blocco dell?attivit? chinasica della proteina ATR indotto dal legame con i composti dell?invenzione, in particolare AZD6738, permette di prevenire e/o trattare gli stati di ipereccitabilit? neuronale come confermato dai dati su modelli in vitro, inducendo ad esempio un effetto anticonvulsivante come confermato dai dati su modelli in vivo (di convulsioni acute), rappresentando quindi un nuovo target per la prevenzione e/o il trattamento di patologie come l?epilessia.
I test condotti indicano che il blocco della chinasi ATR in neuroni maturi ippocampali porta ad uno sbilanciamento dell?equilibrio eccitazione/inibizione (E/I ratio) a favore dell?inibizione, rendendo ATR un bersaglio terapeutico alternativo per bloccare gli stati di ipereccitabilit? neuronale. Esperimenti in vivo in topi controllo in cui ? stato indotto uno status epilepticus acuto lo hanno confermato, dimostrando come l?inibitore di ATR, AZD6738, sia un nuovo anticonvulsivante. Inoltre, l?importante riduzione dell?E/I ratio ottenuta mediante il composto AZD6738 pu? indurre effetti positivi anche in condizioni patologiche quali stati psichiatrici legati a stress, ansia, depressione e schizofrenia, molti degli approcci farmacologici attualmente in uso inducono in parte simili effetti funzionali. Mediante RNA sequencing ? stato possibile poi confermare una grande sovrapposizione tra i geni deregolati dall?AZD6738 e quelli con farmaci antidepressivi.
Secondo un ulteriore aspetto, l?invenzione ? relativa ai composti come sopra definititi, per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento di patologie e/o disturbi caratterizzati da stati di ipereccitabilit? neuronale, ad esempio come anticonvulsivanti. I composti di formula (I) secondo l?invenzione sono utili nella prevenzione e/o nel trattamento di patologie e/o disturbi caratterizzati da stati di ipereccitabilit? neuronale come epilessia, malattie neuropsichiatriche e stati psichiatrici, come ad esempio ansia, stati di stress, depressione e schizofrenia. Inoltre, i composti di formula (I) secondo l?invenzione possono utili come antidepressivi come supportato dll?analisi bioinformatica di RNA sequencing svolta in ippocampi prelevati da topi che hanno ricevuto AZD6738 intranasale, che indica tra i geni pi? deregolati quelli smossi da antidepressivi come la paroxetina.
I composti secondo l?invenzione sono utili in metodi di trattamento comprendenti la somministrazione di tali composti a un soggetto che ne ha bisogno o nella preparazione di un medicamento nella prevenzione e/o nel trattamento di patologie e/o disturbi caratterizzati da stati di ipereccitabilit? neuronale, ad esempio come anticonvulsivanti, in particolare nella prevenzione e/o nel trattamento di epilessia, malattie neuropsichiatriche, come ad esempio ansia, stati psichiatrici come schizofrenia, stress e depressione.
Nel caso i composti dell?invenzione contengano uno o pi? atomi di carbonio stereogenici (asimmetrici) possono esistere come stereoisomeri (isomeri ottici), ossia come enantiomeri o come diastereoisomeri o loro miscele. Secondo la presente invenzione, i composti possono essere in forma di enantiomeri otticamente puri; diastereoisomeri puri; miscele di enantiomeri; miscele di diastereomeri; miscele racemiche, racemi o miscele racemate di enantiomeri. Inoltre, secondo la presente invenzione, i composti possono essere in forma di tautomeri e loro miscele, solvati e loro miscele.
Nel caso i composti dell?invenzione contengano gruppi salificabili, si intendono compresi nell?ambito dell?invenzione i sali con basi o acidi organici o inorganici farmaceuticamente accettabili.
Per sali farmaceuticamente accettabili si intendono sali di acidi o basi inorganiche od organiche.
Un sale del composto pu? presentare vantaggi dovuti a una o pi? propriet? fisiche, quali un?aumentata stabilit? farmaceutica alle differenti temperature ed umidit? o migliorate solubilit? in mezzo acquoso od oleoso.
In generale questi sali possono essere preparati con metodi convenzionali facendo reagire un composto della presente invenzione con un acido o una base appropriati.
Sali farmaceuticamente accettabili dei composti della presente invenzione possono essere preparati da un acido inorganico o organico. Esempi di sali sono: cloridrico, bromidrico, fumarato, metansulfonato, citrato e maleato e con acido fosforico e solforico.
Basi farmaceuticamente accettabili per formare i sali dei composti della presente invenzione possono essere inorganiche od organiche. I sali metallici preferiti possono essere con metalli alcalini o alcalino-terrosi ed altri sali con metalli fisiologicamente accettabili. I sali possono essere anche formati con potassio, sodio, calcio, magnesio, e ammine organiche come trietilammina, etanolammina, dietanolammina, trietanolammina, morfolina, N-metilpiperidina, N-etilpiperidina, dibenzilammina o aminoacidi come lisina.
I composti di formula (I) possono anche essere forniti come esteri idrolizzabili in vivo. Un estere idrolizzabile in vivo di un composto di formula (I) contenente gruppo carbossilico o idrossilico ?, per esempio, un estere farmaceuticamente accettabile che viene scisso nel corpo umano o animale per produrre l?acido o l?alcol corrispondente. Tali esteri Gli esteri farmaceuticamente accettabili adatti al gruppo carbossilico includono esteri C1-6alcossimetil per esempio metossimetil; esteri C1-6alcanoilossimetil per esempio pivaloilossimetil; esteri di ftalidile; esteri C3-8cicloalcossicarbonilossiC1-6alchil per esempio 1- cicloesilcarbonilossietile; esteri 1,3-diossolen-2-onilmetil per esempio 5-metil-1,3-diossolen-2-onilmetil, e esteri C1-6alcossicarbonilossietile per esempio 1-metossicarbonilossietile; e pu? essere formato con qualsiasi gruppo carbossilico nei composti di qui descritti.
Gli esteri farmaceuticamente accettabili adatti per l?idrossi includono esteri inorganici come gli esteri di fosfato (compresi gli esteri ciclici fosforamidici) e gli eteri ?aciloalchilici e i composti correlati che, come risultato dell?idrolisi in vivo dell?estere si rompono per dare il/i gruppo/i idrossi precursore. Esempi di ?-acilossialchil eteri includono acetossimetossi e 2,2-dimetilpropionilossimetossi. Una selezione di gruppi che formano esteri idrolizzabili in vivo per il gruppo idrossi includono C1-10alcanoil, per esempio formil, acetil, benzoil, fenilacetil, benzoil e fenilacetil sostituiti; C1-10alcossicarbonil (per dare esteri alchilici carbonati), per esempio etossicarbonil; di-C1-4alchilcarbamoil e N-(di-C1-
4alchilaminoetil)-N-C1-4alchilcarbamoil (per ottenere carbammati); di-C1-4alchilaminoacetil e carbossiacetil. Esempi di sostituenti dell?anello su fenilacetile e benzoile includono aminometile, C1-4alchilaminometil e di-(C1-4alchil)aminometil, e morfolino o piperazino legati da un atomo di azoto dell?anello tramite un gruppo di collegamento metilenico in posizione 3 o 4 dell?anello benzoilico.
Altri interessanti esteri idrolizzabili in vivo includono, per esempio, RAC(O)OC1-
6alchil-CO-, dove RA ? per esempio, benzilossi-C1-4alchil o fenile. Sostituenti adatti su un gruppo fenile in tali esteri includono, per esempio, 4-C1-4piperazino-C1-4alchil, piperazino-C1-4alchil e morfolino-C1-4alchil.
Significati opportuni per qualsiasi gruppo R o sostituente di tale gruppo comprendono:
per C1-3alchil: metile, etile, propile e iso-propile;
per C1-6alchil: C1-3alchil, butil, 2-metilpropil, tert-butil, pentil, 2,2-dimetilpropil, 3-metilbutil e esil;
per C3-6cycloalchil: ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil e cicloesil;
per C3-6cycloalchilC1-3alchil: ciclopropilmetil, ciclopropiletil, ciclobutilmetil, ciclopentilmetil e cicloesilmetil;
per arile: fenile;
per arilC1-3alchil: benzil e fenetil;
per il carbocilil: aril, cicloesenil e C3-6cicloalchil;
per alogeno: fluoro, cloro, bromo e iodo;
per C1-3 alcossi: metossi, etosi, propossi e isopropossi;
per C1-6alcossi: C1-3alcossi, butossi, tert-butossi, pentilossi, 1-etilpropossi ed esilossi;
per C1-3alcanoil: acetil e propanoil;
per C1-6alcanoil: acetil, propanoil e 2-metilpropanoil;
per eteroaril: piridinil, imidazolil, pirimidinil, tienil, pirrolil, pirazolil, tiazolil, triazolil, ossazolil, isossazolil, furanil, piridazinil e pirazinil;
per gli eteroarilC1-3alchili: pirrolilmetil, pirroliletile, imidazolilmetil, imidazoliletile, pirazolilmetil, pirazoliletil, furanilmetil, furaniletil, tienilmetil, theinilethil, piridinilmetil, piridiniletile, pirazinilmetile, piraziniletile, pirimidinilmetile, pirimidiniletile, pirimidinilpropile, pirimidinilbutile, imidazolilpropile, imidazolilbutile, 1,3,4-triazolilpropil e ossazolilmetil;
per eterociclici: eteroaril, pirrolidinil, piperidinil, piperazinil, azetidinil, morfolinil, diidro-2H-piranile, tetraidropiridina e tetraidrofuranile;
per eterociclici saturi: ossetanile, pirrolidinile, piperidinile, piperazinile, azetidinile, morfolinile, tetraidropiranile e tetraidrofuranile.
Significati preferiti dell?anello A, n, R<1>, R<2>, R<4>, R<5>, R<6>, R<7 >e R<8>, da soli o in combinazione tra loro, sono i seguenti:
In un aspetto n ? 0.
In un altro aspetto n ? 1.
In un aspetto, R<1 >? selezionato tra morfolin-4-il e 3-metilmorfolin-4-il.
In un ulteriore aspetto, R<1 >? 3-metilmorpholin-4-il.
In un ulteriore aspetto, R<1 >?
In un ulteriore aspetto, R<1 >? In un aspetto R<2 >?
In un aspetto R<2 >?
In un aspetto R<2 >?
In un aspetto R<2 >?
R<2A >? l'idrogeno.
R<2B >? l'idrogeno.
R<2C >? idrogeno.
R<2D >? l'idrogeno.
R<2E >? l'idrogeno.
R<2F >? l'idrogeno.
In un aspetto dell'invenzione R<2G >? selezionato tra -NHR<7 >e -NHCOR<8>.
In un aspetto dell'invenzione R<2G >? -NHR<7>.
In un aspetto dell'invenzione R<2G >? -NHCOR<8>.
In un aspetto dell'invenzione R<2G >? selezionato da -NH2, -NHMe e -NHCOMe. In un aspetto dell'invenzione R<2G >? -NH2.
In un aspetto dell'invenzione R<2G >? -NHMe.
In un aspetto dell'invenzione R<2G >? -NHCOMe.
In un aspetto dell'invenzione R<4 >e R<5 >sono idrogeno.
In un aspetto dell'invenzione R<4 >e R<5 >sono metile.
In un aspetto dell'invenzione R<4 >e R<5 >insieme all'atomo a cui sono legati formano l?anello A.
In un aspetto dell'invenzione l?anello A ? un C3-6cicloalchile o un anello eterociclico saturo a 4-6 membri contenente uno eteroatomo scelto tra O e N
In un altro aspetto l?anello A ? un anello ciclopropile, ciclobutile, ciclopentile, oxetanil, tetraidrofurile, tetraidropiranile, azetidinil, pirrolidinil o piperidinil.
In un altro aspetto l'anello A ? un anello ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil, tetraidropiranil o piperidinil.
In un altro aspetto l'anello A ? un anello ciclopropil, ciclopentil, tetraidropiranil o piperidinil.
In un altro aspetto l'anello A ? un anello ciclopropil, tetraidropiranil o piperidinil.
In un altro aspetto l'anello A ? un anello ciclopropil o tetraidropiranil.
In un altro aspetto l'anello A ? un anello piperidinil.
In un altro aspetto l'anello A ? un anello tetraidropirani.
In un altro aspetto l'anello A ? un anello ciclopropil.
In un aspetto R<6 >? idrogeno.
In un aspetto R<7 >? idrogeno o metile.
In un aspetto R<7 >? metile.
In un aspetto R<7 >? idrogeno.
In un aspetto R<8 >? metile.
Secondo un aspetto preferito, nei composti di formula (I), o in un loro sale farmaceuticamente accettabile:
R1 ? scelto tra morfolin-4-il e 3-metilmorfolin-4-il;
n ? 0 o 1;
R<2A >? idrogeno;
R<2B >? idrogeno;
R<2C >? idrogeno;
R<2D >? idrogeno;
R<2E >? idrogeno;
R<2F >? idrogeno;
R<2G >? scelto tra -NHR7 e -NHCOR8;
R<2H >? fluoro;
R<3 >? metile;
R<4 >e R<5 >insieme all'atomo a cui legati formano l?anello A;
l?anello A ? un anello C3-6cicloalchil o un anello eterociclico saturo a 4-6 membri contenente un eteroatomo selezionato da O e N;
R<6 >? idrogeno;
R<7 >? idrogeno o metile; e
R<8 >? metile.
Secondo un altro aspetto, nei composti della formula (I), o in un loro sale farmaceuticamente accettabile:
R<1 >? scelto tra morfolin-4-il e 3-metilmorpholin-4-il;
n ? 0 o 1;
R<2A >? idrogeno;
R<2B >? idrogeno;
R<2C >? idrogeno;
R<2D >? idrogeno;
R<2E >? idrogeno;
R<2F >? idrogeno;
R<2G >? scelto tra -NH2, -NHMe e -NHCOMe;
R<2H >? fluoro;
R<3 >? metile;
R<4 >e R<5 >insieme all'atomo a cui legati formano l?anello A;
l?anello A ? un anello C3-6cicloalchile o un anello eterociclico saturo a 4-6 membri contenente un eteroatomo scelto tra O e N; e
R6 ? idrogeno.
Secondo un altro aspetto, nei composti di formula (I), o in un loro sale farmaceuticamente accettabile:
R<1 >? scelto tra morfolin-4-il e 3-metilmorfolin-4-il;
n ? 0 o 1;
R<2A >? idrogeno;
R<2B >? idrogeno;
R<2C >? idrogeno;
R<2D >? idrogeno;
R<2E >? idrogeno;
R<2F >? idrogeno;
R<2G >? selezionato da -NHR<7 >e -NHCOR<8>;
R<2H >? fluoro;
R<3 >? metile;
R<4 >e R<5 >insieme all'atomo a cui legati formano l?anello A;
l?anello A ? un ciclopropile, ciclobutile, ciclopentile, ossetanile, tetraidrofurile, tetraidropiranile, azetidinile, pirrolidinile o anello piperidinilico;
R<6 >? idrogeno;
R<7 >? idrogeno o metile; e
R<8 >? metile.
Secondo un altro aspetto, nei composti di formula (I), o in un loro sale farmaceuticamente accettabile:
R<1 >? scelto tra morfolin-4-il e 3-metilmorpholin-4-il;
n ? 0 o 1;
R<2A >? idrogeno;
R<2B >? idrogeno;
R<2C >? idrogeno;
R<2D >? idrogeno;
R<2E >? idrogeno;
R<2F >? idrogeno;
R<2G >? selezionato da -NH2, -NHMe e -NHCOMe;
R<2H >? fluoro;
R<3 >? metile;
R<4 >e R<5 >insieme all'atomo a cui legati formano l?anello A;
l?anello A ? un anello ciclopropile, ciclobutile, ciclopentile, ossetanile, tetraidrofurile, tetraidropiranile, azetidinile, pirrolidinile o piperidinilico; e
R<6 >? idrogeno.
Secondo un altro aspetto, i composti hanno formula (Ia), o un loro sale farmaceuticamente accettabile:
in cui
l?anello A ? un anello ciclopropil, tetraidropiranil o piperidinil;
R<2 >?
n ? 0 o 1;
R<2A >? idrogeno;
R<2B >? idrogeno;
R<2C >? idrogeno;
R<2D >? idrogeno;
R<2E >? idrogeno;
R<2F >? idrogeno;
R<2G >? selezionato da -NHR<7 >e -NHCOR<8>;
R<2H >? fluoro;
R<3 >? metile;
R<6 >? idrogeno;
R<7 >? idrogeno o metile; e
R<8 >? metile.
Secondo un altro aspetto, nei composti di formula (Ia), o in un loro sale farmaceuticamente accettabile:
l?anello A ? un anello ciclopropil, tetraidropiranil o piperidinil;
R<2 >?
n ? 0 o 1;
R<2A >? idrogeno;
R<2B >? idrogeno;
R<2C >? idrogeno;
R<2D >? idrogeno;
R<2E >? idrogeno;
R<2F >? idrogeno;
R<2G >? selezionato da -NH2, -NHMe e -NHCOMe;
R<2H >? fluoro;
R<3 >? metile;
R<6 >? idrogeno.
Secondo un altro aspetto, nei composti di formula (Ia), o in un loro sale farmaceuticamente accettabile:
l?anello A ? un anello ciclopropil, tetraidropiranil o piperidinil;
R<2 >?
n ? 0 o 1;
R<2A >? idrogeno;
R<2B >? idrogeno;
R<2C >? idrogeno;
R<2D >? idrogeno;
R<2E >? idrogeno;
R<2F >? idrogeno;
R<2G >? -NHR<7>;
R<2H >? fluoro;
R<3 >? metile;
R<6 >? idrogeno; e
R<7 >? idrogeno.
Secondo un altro aspetto, nei composti di formula (Ia), o in un loro sale farmaceuticamente accettabile:
l?anello A ? un anello ciclopropil;
R<2 >?
n ? 0;
R<2A >? idrogeno;
R<2B >? idrogeno;
R<2C >? idrogeno;
R<2D >? idrogeno;
R<2E >? idrogeno;
R<2F >? idrogeno;
R<2G >? -NHR7;
R<2H >? fluoro;
R<3 >? metile;
R<6 >? idrogeno; e
R<7 >? metile.
Composti particolarmente preferiti per gli usi descritti sono i composti di formula (I) o (Ia), o loro sali farmaceuticamente accettabili, scelti nel gruppo consistente in:
4-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[(R)-S-metilsolfonimidoil)metil]pirimidin-2-il}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina;
4-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-(S)-S-metilsolfonimidoil)ciclopropil]-pirimidin-2-il}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina;
4-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-((R)-S-metilsolfosulfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina;
N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-((R)-S-metilsolfoniomidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazolo-2-amina;
N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-(S)-S-metilsolfoniomidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-ammina;
4-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-((R)-S-etilsolfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-indolo;
4-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-(S)-S-metilsolfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-indolo;
1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-((R)-S-metilsolfoniomidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-amina;
1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-(S)-S-metilsolfoniomidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-ammina;
4-fluoro-N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-((R)-S-metilsolfosulfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazolo-2-amina;
4-fluoro-N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-(S)-S-metilsolfosulfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazolo-2-amina;
4-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-(S-metilsolfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina;
N-metil-1-{4-[-metil-1-(S)-S-metilsolfoniomidoil)etile]-6-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-amina;
N-metil-1-{4-[1-metil-1-((R)-S-metilsolfosulfonimidoil)etile]-6-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]pirimidin-2-il}-1Hbenzimidazol-2-amina;
N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[4-(S)-S-metilsolfonimidoil)tetraidro-2H-pirano-4-il]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazolo-2-ammina;
N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[4-((R)-S
metilsolfonimidoil)tetraidro-2H-pirano-4-il]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazolo-2-ammina;
4-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[4-(S)-S-metilsolfonimidoil)tetraidro-2H-pirano-4-il]pirimidin-2-il}-1H-indolo;
4-fluoro-N-metil-1-{4-[1-metil-1-((S)-S-metilsolfosulfonimidoil)etil]-6-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-amina;
4-fluoro-N-metil-1-{4-[1-metil-1-((R)-S-metilsolfosulfonimidoil)etil]-6-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-amina;
6-fluoro-N-metil-1-{4-[1-metil-1-((R)-S-metilsolfosulfonimidoil)etil]-6-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-amina;
5-fluoro-N-metil-1-{4-[1-metil-1-((R)-S-metilsolfosulfonimidoil)etil]-6-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-amina;
5-fluoro-N-metil-1-{4-[1-metil-1-((S)-S-metilsolfosulfonimidoil)etil]-6-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-amina;
6-fluoro-N-metil-1-{4-[1-metil-1-((S)-S-metilsolfosulfonimidoil)etil]-6-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-amina;
6-fluoro-N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-((R)-S-metilsolfosulfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazolo-2-amina;
5-fluoro-N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-((R)-S-metilsolfosulfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazolo-2-amina;
5-fluoro-N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-(S)-S-metilsolfosulfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazolo-2-amina; ecstasy 6-fluoro-N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-(S)-S-metilsolfosulfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-amina.
Secondo un altro aspetto dell'invenzione, i composti, o loro sali farmaceuticamente accettabili, sono scelti tra:
4-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[(R)-(S-metilsolfonimidoil)metil]pirimidin-2-il}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina;
4-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-(S)-S-metilsolfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-ml}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina;
4-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-((R)-S-metilsolfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina;
N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-(R)-(S-metilsolfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazolo-2-ammina; e
N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-(S)-(S-metilsolfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-ammina, Secondo un aspetto ulteriormente preferito i composti hanno formula:
pi? preferibilmente sono scelti tra:
4-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-((S)-S-metilsolfonimidoil) ciclopropil]pirimidin-2-il}- 1H-pirrolo[2,3-b]piridina; e
4-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-((R)-S-metilsolfonimidoil) ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina;
particolarmente preferito ? il composto di formula (Ic?), noto anche come AZD6738 o Ceralasertib,
La dose giornaliera di principio attivo da somministrare pu? essere una singola dose oppure pu? essere una quantit? efficace suddivisa in pi? dosi minori da somministrare nell?arco della giornata. Il regime di dosaggio e la frequenza di somministrazione per il trattamento delle malattie menzionate con i composti dell?invenzione o con loro composizioni farmaceutiche saranno selezionati in base a una variet? di fattori, inclusi ad esempio et?, peso corporeo, sesso e condizioni mediche del paziente nonch? gravit? della malattia, via di somministrazione, considerazioni farmacologiche ed eventuale terapia concomitante con altri farmaci. In alcuni casi, possono essere usati livelli di dosaggio inferiori o superiori al suddetto intervallo e/o pi? frequenti, a giudizio del medico e in base allo stato della malattia.
I composti dell?invenzione possono essere somministrati per via inalatoria, orale, topica, parenterale, ad esempio in formulazioni contenenti veicoli e/o eccipienti farmaceuticamente accettabili. Preferibilmente, i composti dell?invenzione vengono somministrati per via nasale (intranasale), ad esempio per iniezione intranasale, questa via di somministrazione consente vantaggiosamente l?assorbimento attraverso la mucosa nasale evitando/riducendo gli effetti collaterali associati alle vie di somministrazione con effetto sistemico, in particolare nei trattamenti cronici.
I seguenti esempi illustrano ulteriormente l?invenzione.
Esempi
Saggi biologici
Esempio 1 ? Valutazione della durata d?azione di AZD6738 (1?M) nei neuroni ippocampali DIV 13-14 in coltura
Per valutare la durata d?azione dell?inibitore della chinasi ATR in vitro, i neuroni ippocampali sono stati ricavati mediante espianto da ippocampo da embrioni allo stato gestazionale E18 e piastrati ad alta densit? come descritto in Pizzamiglio et al, 2016 e Pizzamiglio et al, 2021. Arrivati al giorno 14 dello sviluppo (div 14) sono stati trattati con veicolo (DMSO - controllo) o con AZD6738 (1?M). I neuroni dopo 2 ore, 24 ore, 48 ore e 96 ore dal trattamento con AZD6738 hanno ricevuto H2O2, ovvero un agente tossico responsabile del danno a singolo filamento di DNA e quindi dell?attivazione di ATR, e dopo 2 ulteriori ore i campioni sono stati opportunamente raccolti per le indagini biochimiche mediante Western Blotting (analisi quantitativa delle proteine). I neuroni trattati con veicolo e H2O2 mostrano l?aumento della forma fosforilata per ATR rispetto a quella totale (pATR/ATR) ad indicare l?avvenuta attivazione della chinasi in studio. Al contrario, nei neuroni trattati con AZD6738 l?attivazione della chinasi ATR viene impedita sia nei campioni che hanno ricevuto H2O2 dopo 2 ore ma anche nei neuroni che hanno ricevuto H2O21 e 2 giorni dopo AZD6738 (24 e 48 ore). I neuroni che hanno ricevuto H2O2 3 giorni (96 ore) dopo AZD6738 mostrano invece una normale attivazione della chinasi, ad indicare che dopo 3 giorni l?effetto di blocco ? oramai svanito (Fig.1).
Esempio 2 ? Valutazione dell?effetto indotto dal trattamento acuto di AZD6738 (1?M) sulla trasmissione neuronale in vitro
Colture di neuroni ippocampali div 13-14 preparate e piastrate ad alta densit? come descritto in Pizzamiglio et al, 2016 e Pizzamiglio et al, 2021 hanno ricevuto nel mezzo di coltura AZD67381?M o veicolo (controllo - DMSO) e, dopo 24 ore, sono stati sottoposti a esperimenti di imaging del calcio e immunofluorescenza per valutare potenziali effetti tossici, cos? come indagini di elettrofisiologia, per analizzare possibili variazioni di tipo funzionale. Quindi, neuroni div 14 sono stati incubati con l?indicatore ratiometrico del calcio FURA-2 AM (Fura-2 acetossimetilestere; 1:100 in mezzo neuronale) e dopo 30 minuti di incubazione il segnale fluorescente emesso dal FURA-2 (a 510 nm) ? stato analizzato in seguito a eccitazione alternata alle lunghezze d?onda 340 e 380 nm (DF340/380). Questo segnale riflettendo le variazioni del calcio intracellulare, mette in luce eventuali alterazioni di omeostasi di calcio che sono in genere indice di possibile tossicit? neuronale. I dati di imaging del calcio hanno mostrato livelli paragonabili di calcio basali intracellulari tra neuroni trattati con veicolo (DMSO) e AZD6738 ad indicare che il trattamento subito dai neuroni non altera le dinamiche di calcio (Fig 2A) indicando cos? un profilo di sicurezza di AZD6738.
Infine, l?analisi dell?attivit? spontanea in miniatura eccitatoria ed inibitoria (mEPSCs e mIPSCs) ? stata valutata attraverso registrazioni elettrofisiologiche di patchclamp. Nella soluzione di registrazione ? stata aggiunta Tetrodotossina (TTX, 1?M) ovvero una tossina che, impedendo la generazione del potenziale d?azione, permette la misurazione del rilascio del neurotrasmettitore Glutammato e GABA in condizioni basali/spontanee. Gli esperimenti funzionali di elettrofisiologia indicano chiaramente che AZD6738 modifica in maniera opposta il rilascio di questi due neurotrasmettitori: ovvero, mentre quello di glutammato responsabile dell?eccitazione neuronale viene ridotto (come indicato dalla riduzione della frequenza dei mEPSCs), quello del GABA responsabile dell?inibizione neuronale viene aumentato (come indicato dai valori di frequenza dei mIPSCs). Questi risultati indicano (Fig. 2B) i) un effetto di AZD6738 sulla capacit? di riciclo delle vescicole sinaptiche oltre che sulla variazione del numero delle vescicole stesse ancorate alla terminazione presinaptica e/o ii) un effetto di AZD6738 sul mantenimento delle sinapsi (stabilizzazione di quelle inibitorie e riduzione del numero di quelle eccitatorie). Entrambi questi meccanismi indicano un aumentato contributo della componente inibitoria nel sistema trasmettitoriale indotto da AZD6738. Questo aspetto ? stato indagato anche mediante esperimenti di immunofluorescenza su neuroni fissati con paraformaldeide e poi colorati con anticorpi (Abs) contro: i) la proteina del citoscheletro b3-Tubulina, ii) il marcatore selettivo della presinapsi eccitatoria vGlut1, iii) il marcatore selettivo della presinapsi inibitoria vGAT. Le immagini acquisite attraverso il microscopio confocale sono state analizzate al fine di ottenere i dati di densit? delle sinapsi: numero di punti positivi vGlut1/micron di dendrite marcato con tubulina e numero di punti positivi vGAT/micron di dendrite marcato con tubulina. Le analisi indicano chiaramente come ci sia nei neuroni trattati con AZD6738 un aumento dei punti vGAT-positivi e una riduzione dei punti vGlut1 positivi (Fig.2C), ovvero le indagini di immunofluorescenza confermano i risultati di elettrofisiologia che indicano uno sbilanciamento sinaptico a favore di quelle inibitorie. Dagli stessi esperimenti di immunofluorescenza si evincono anche i dati di ?mean intensity? e ?average size?, ovvero intensit? media di fluorescenza e dimensione media dei punti fluorescenti, che pure si correlano perfettamente con le analisi di densit?, ovvero indicano una diminuzione di questi parametri nel caso della sinapsi eccitatorie ed un aumento degli stessi parametri nel caso delle sinapsi inibitorie.
Esempio 3 ? Valutazione dell?effetto indotto dal trattamento cronico di AZD6738 (1?M) sulla trasmissione neuronale in vitro
Colture di neuroni ippocampali div 13 preparate piastrate ad alta densit? come descritto in Pizzamiglio et al, 2016 e Pizzamiglio et al, 2021 hanno ricevuto nel mezzo di coltura AZD67381?M o veicolo (controllo - DMSO) a giorni alterni fino a div 21. Questi esperimenti sono stati svolti al fine di valutare la comparsa di effetti indotti da AZD6738 rispetto a quelli ottenuti in seguito al trattamento acuto. I neuroni div 21 sono stati quindi analizzati attraverso esperimenti di elettrofisiologia ed immunofluorescenza come descritto nell?esempio 2. L?analisi delle correnti eccitatorie ed inibitorie (mEPSCs e mIPSCs) ha messo in luce alterazioni della trasmissione basale paragonabili a quelli osservati mediante trattamento acuto (aumento della trasmissione spontanea inibitoria e diminuzione di quella eccitatoria, (Fig 3A). Coerentemente, anche le analisi di immunofluorescenza hanno confermato ancora una volta un aumento dei punti sinaptici vGAT positivi ad indicare un aumento delle sinapsi inibitorie ed una riduzione dei punti vGlut1 positivi (Fig 3B). In particolare, negli esperimenti di immunfluorescenza sono state valutate alterazioni sia relative alla presinapsi che alla postsinapsi eccitatoria ed inibitoria attraverso una doppia marcatura: ovvero ? stata valutata la collocalizzazione tra i marcatori pre e post delle sinapsi inibitorie mediante la positivit? per i markers vGAT e Gephyrin (il marcatore specifico del postsinaptico inibitorio), cos? come la collocalizzazione tra i marcatori pre e post della sinapsi eccitatoria attraverso la positivit? ai markers vGlut1 e PSD-95 (il marcatore specifico del compartimento postsinapsitco eccitatorio). Gli esperimenti hanno evidenziato la riduzione dei punti collocalizzanti eccitatori e l?aumento dei punti collocalizzanti inibitori, confermando in maniera ancora pi? robusta il cambiamento dell?equilibrio Eccitazione/Inibizione (E/I ratio) a favore di quello inibitorio in seguito a trattamento cronico con AZD6738 (Fig 3B). A questo punto ? stato valutato attraverso nuove registrazioni di elettrofisiologia l?impatto di questi cambiamenti di rete neuronale in termini di scarica neuronale (firing). Difatti se all?interno della rete c?? un maggiore numero di terminazioni che mediano l?inibizione, la possibilit? di generare un potenziale d?azione, ovvero lo spike, dovrebbe essere diminuita. A questo scopo, sono state svolte registrazioni elettrofisiologiche in modalit? ?cell attached? mantenendo il potenziale di membrana a -60 mV. Si ? rilevata cos? la capacit? di scarica dei neuroni attraverso la misurazione degli eventi di spike che si generano spontaneamente. L?analisi della frequenza di questi eventi spontanei mostra come il numero di eventi/sec (Hz) nei neuroni trattati con AZD6738 sia significativamente ridotta rispetto a quelli che hanno solo ricevuto la soluzione veicolo (Fig.3C). Questi risultati indicano non solo che i neuroni trattati con AZD6738 hanno un maggior numero di sinapsi inibitorie, ma che queste sono funzionanti/attive e sono responsabili della creazione di una rete spontaneamente pi? inibita.
I presenti risultati indicano che sia il trattamento cronico che acuto di AZD6738 in neuroni ippocampali maturi determina la creazione di una rete neuronale in cui prevale (?vince?) il sistema inibitorio, indicando l?utilit? di AZD6738 nella prevenzione e/o nel trattamento di patologie caratterizzate da ipereccitabilit? neuronale, quali epilessia, stati ansiosi e psichiatrici legati a stress, ansia e depressione, schizofrenia grazie alla capacit? di AZD6738 di agire supportando l?attivazione del sistema inibitorio.
Esempio 4 - Valutazione della capacit? di AZD6738 di impedire la trascrizione del fattore Egr1 in vitro
Studi di letteratura hanno recentemente classificato come marcatore di epilessia nell?uomo il fattore di trascrizione Egr1, visto che il suo aumento in RNA messaggero ? stato ritrovato in individui con epilessia cronica. Sono stati quindi svolti degli esperimenti di rtPCR in neuroni trattati cronicamente con AZD6738 (o soluzione veicolo, DMSO) al fine di osservare potenziali variazioni dei livelli di mRNA del fattore di trascrizione Egr1 in condizioni di aumentata attivit? neuronale, cos? come anche di altri fattori di trascrizione dipendenti da variazioni di attivit?. Per cui oltre a Egr1, sono stati valutati anche i livelli di mRNA di Fos, Egr4 e Npas4. A questo scopo ? stato messo a punto un protocollo di stimolazione in vitro sulla base di lavori presenti in letteratura in cui l?ipereccitabilit? ? stata indotta attraverso l?uso dello stimolo depolarizzante KCl 50mM per una durata di 30 minuti in presenza di TTX 0,5?M, al fine di contenere lo stato di eccitazione ed evitare l?induzione di morte generalizzata. Per questo motivo ? stato necessario usare sia neuroni di controllo in DMSO (ovvero il veicolo) che neuroni in DMSO+TTX 0,5?M. Quindi in totale sono stati usati 3 gruppi sperimentali per i neuroni trattati cronicamente con DMSO (DMSO; DMSO+TTX 0,5 ?M; DMSO+ TTX 0,5?M+ KCl 50mM) e 3 gruppi sperimentali per neuroni trattati cronicamente con AZD6738 (AZD; AZD+TTX 0,5 ?M; AZD+TTX 0,5?M+KCl 50mM). L?analisi di fold change, ovvero il numero di volte che i livelli di mRNA relativi ai fattori di trascrizione in esame sono stati trovati cambiati, indica chiaramente che tutti questi fattori di trascrizione (ad eccezione di Egr4) vengono trascritti significativamente di pi? con l?aumento dello stato di depolarizzazione (gruppo TTX vs TTX+KCl 50mM). Guardando i neuroni trattati cronicamente con AZD6738, si nota che il livello basale di trascrizione di questi fattori non cambia ma quando andiamo a stimolare con agente depolarizzante si ha aumento dei livelli in mRNA solo per i fattori Fos e NPAS4, l?unico che non viene aumentato in trascrizione ? proprio Egr1 (Fig.4).
I dati, quindi, indicano il blocco selettivo della trascrizione del fattore Egr1 nonostante sia promossa l?attivit? neuronale attraverso l?agente depolarizzante KCl.
Esempio 5 ? Valutazione dell?effetto del blocco trascrizionale indotto da AZD6738 su Egr1 sulla trascrizione del canale del calcio Cacna1h/Cav3.1 in vitro Recentemente ? stato dimostrato che nelle regioni regolatorie dei geni che codificano per i canali del calcio voltaggio dipendenti (VDCC) e le loro subunit?, i siti di legame per Egr1 sono fortemente sovra-rappresentati ad indicare che Egr1 ? un fattore di trascrizione che regola la trascrizione dei VDCC. ? stato quindi valutato se in condizioni basali e di depolarizzazione i neuroni trattati con AZD6738, avendo normali livelli di Egr1, avessero anche normali livelli di canali calcio. Si ? osservato che i livelli di mRNA della subunit? Cacna1h/Cav3.1 dei canali del calcio non vanno incontro ad incremento significativo 30 minuti dopo il trattamento con l?agente depolarizzante KCl in neuroni controllo, ma sorprendentemente il trattamento cronico con AZD6738 riduce i livelli di Cacna1h/Cav3.1 gi? in condizioni basali (Fig.5). Questo risultato suggerisce il blocco della trascrizione Egr1-mediato come potenziale meccanismo molecolare sul quale agire attraverso il bloccante AZD6738, negli stati di ipereccitabilit?. L?impedita attivazione del fattore trascrizionale Egr1 impedisce l?aumento dei VDCCs, quindi il blocco trascrizionale indotto da AZD6738 su Egr1 si riflette su una ridotta trascrizione del canale del calcio Cacna1h/Cav3.1 in vitro. Inoltre, dati di RNA sequencing in vivo confermano tra i geni down-regolati anche quello che codifica per la subunit? al calcio Cacn1G (si veda ad esempio saggio biologico dell?Esempio 7).
Esempio 6 - Valutazione della durata d?azione di AZD6738 in vivo
Al fine di valutare la durata d?azione di AZD6738 in vivo, ? stata indotta l?attivazione di ATR inducendo un danno al singolo filamento di DNA attraverso somministrazione di acido kainico (KA, 25mg/Kg). Secondo il protocollo sperimentale topi maschi adulti di circa 3 mesi hanno ricevuto AZD6738 (dose 20mg/Kg; concentrazione 80mM; 0,6ml/gr di topo) attraverso la via nasale e, dopo 24 ore o 48 ore hanno ricevuto KA intraperitoneale. Gli ippocampi sono stati espiantati dopo 30 minuti dalla somministrazione di KA e quindi i livelli di p-ATR/ATR in tessuti espiantati sono stati valutati. I risultati di Western Blotting indicano come in topi trattati con DMSO e 24 ore dopo con KA ci sia un aumento della forma fosforilata di ATR a indicare che il danno al DNA ? stato indotto e la proteina ATR si ? attivata. I risultati indicano anche che i topi che invece hanno ricevuto AZD6738 sia 24 che 48 ore prima non presentano l?aumento di p-ATR/ATR, ad indicare che l?azione del bloccante AZD6738 sull?attivit? chinasica di ATR ? ancora presente dopo 2 giorni. Per tanto si pu? concludere che in vivo, in seguito a una singola somministrazione intranasale, il blocco dell?attivit? chinasica di ATR mediante AZD6738 ? pari a circa 48-60 ore (Fig.6).
Esempio 7 - Analisi del profilo di espressione di RNA messaggero (mRNA) in tessuti ippocampali ottenuti da topi trattati con AZD6738 intranasale
Al fine di analizzare in modo completo i cambiamenti trascrizionali legati all?uso di AZD6738 in vivo in seguito a somministrazione intranasale, topi P40 maschi hanno ricevuto AZD6738 (80mM) o veicolo (controllo -DMSO). 48 ore dopo gli animali sono stati sacrificati, il tessuto ippocampale prelevato e successivamente ? avvenuta l?estrazione dell?RNA al fine di permettere il sequenziamento. I trascritti che si spostano rispetto alla condizione di controllo con una variazione ? 2 volte e un valore di P-aggiustato <0,05 sono stati considerati come espressi differenzialmente statisticamente significativi (Fig. 7A e 7B). Per capire l?influenza del trattamento con AZD6738 sulla regolazione dei processi biologici, i geni differenzialmente espressi (DEG) sono stati classificati funzionalmente mediante analisi di Gene Ontology (GO) e si ? trovato che i geni sovraregolati e i geni sottoregolati appartengono a categorie funzionali distinte. In particolare, guardando le repository ?componenti cellulari GO? e ?funzioni molecolari GO? ? stato trovato un arricchimento di DEGs down-regolati che cadono nelle categorie ?ionotropic glutamate receptors? e ?glutamate receptor binding? a confermare che anche in vivo in seguito a blocco acuto della kinasi ATR si assiste ad un freno della trascrizione dei componenti sinaptici eccitatori (Fig.7D). Inoltre, interrogando le repository pi? legate ai ?transcription factors? ? stato trovato che i geni pi? deregolati sono quelli controllati dai fattori di trascrizione Egr1 (Fig.7C, destra), come evidenziato dai pi? alti scores nel grafico (indice della maggiore significativit?). Globalmente, questi risultati indicano che l'inibizione della proteina di riparazione del DNA, ATR, mediante AZD6738 modifica i meccanismi trascrizionali e trasduzionali controllando: i) la composizione e struttura delle sinapsi eccitatorie e inibitorie e ii) l'ipereccitabilit? neuronale attraverso la regolazione dell?attivit? di fattori di trascrizione come SP1 e EGR1. Anche il fattore di trascrizione NPAS1 ? risultato altamente down-regolato dall?RNA sequencing.
In fine, i dati di RNA sequencing in vivo hanno anche indicato tra i geni downregolati anche quello che codifica per la subunit? al calcio Cacn1G (Fig.7D).
Esempio 8 ? Valutazione dell?effetto anticonvulsivante di AZD6738 in vivo Al fine di valutare il potenziale ruolo anticonvulsivante di AZD6738 ? stata valutata la sua capacit? di impedire l?induzione delle crisi convulsive nel modello farmacologico descritto largamente in letteratura dell?acido kainico (KA). Mediante una singola somministrazione di KA (25mg/Kg) si induce in topi maschi adulti (et? P90) uno stato convulsivo caratterizzato dalla comparsa di manifestazioni comportamentali epilettiche. Lo stato convulsivo mostra una durata totale di circa 3 ore durante le quali i comportamenti convulsivi crescono di intensit? con il trascorrere del tempo, ai quali viene assegnato uno score secondo l?Indice di Racine. In particolare, si attribuisce il seguente score alle differenti manifestazioni: stadio 1= immobilit?; stadio 2= estensione degli arti anteriori e/o della coda, postura rigida; fase 3= movimenti ripetitivi, oscillazione della testa; fase 4= sollevamento su due zampe e caduta (crisi generalizzata); stadio 5= sollevamento su due zampe e caduta continui; stadio 6= gravi convulsioni di tutto il corpo; rotolamenti; fase 7= morte.
Quindi la valutazione dello stato convulsivo avviene attraverso osservazione continua da parte dello sperimentatore e lo score che viene assegnato ogni 5 minuti permette di mettere in luce la progressione dello stato convulsivo nel tempo per ogni animale. Nell?esperimento gli animali P90 sono stati trattati con una singola somministrazione intranasale di AZD6738 (80mM) o DMSO e dopo 48 ore sono state indotte le crisi convulsive secondo il protocollo sopra descritto ed ? stato assegnato lo score secondo l?Indice di Racine. I risultati indicano che il tempo necessario per indurre la prima crisi (?Latency time?, min) ? per lo pi? uguale tra i due gruppi sperimentali, ovvero sia topi DMSO+KA che AZD6738+KA necessitano dello stesso tempo per manifestare la prima crisi tonico-clonica (Fig.8). Quando si va a descrivere la risposta degli animali al KA lungo un periodo di 3 ore (Seizure score), indicando la media dello score assegnato ad ogni punto sperimentale, si vede chiaramente come negli animali trattati con AZD6738 si genera uno stato epilettico caratterizzato da manifestazioni meno gravi e per lo pi? sotto-convulsivanti. L?analisi globale dello score di crisi nell?arco delle tre ore (Mean seizure score) indica infatti una riduzione significativa negli animali che hanno ricevuto AZD6738. Gli animali trattati con AZD6738 raggiungono al massimo lo stadio 4, ovvero generano solo singole crisi convulsive, cos? come l?analisi del tempo trascorso in crisi nell?arco delle tre ore ? significativamente ridotto nei topi trattati con AZD6738 (Time spent in seizure). Infine, mentre il 30% degli animali che hanno ricevuto DMSO muore entro 2 ore e mezza dall?iniezione di kainato, nessuno di quelli trattati con AZD6738 ? morto. Inoltre, analizzando il numero di animali che sviluppano almeno una crisi epilettica, si vede come l?80% dei topi che hanno ricevuto DMSO sviluppano crisi, mentre solo la met? di quelli trattati con AZD vanno incontro a stato convulsivo. L?insieme dei risultati indica che l?uso di AZD6738 impedisce l?innesco di uno stato ipereccitato continuo e grave motivo, i cui benefici principali sono: i) ridotta severit? dello stato convulsivo generato; ii) riduzione significativa del tempo trascorso in attivit? epilettica; iii) riduzione della mortalit? associata allo stato convulsivo acuto generalizzato.
Esempio 9 ? Valutazione dell?effetto in vivo sull?incremento dei livelli di Egr1 con un singolo trattamento con AZD6738
I risultati in vitro indicano che tra gli effetti di AZD6738 c?? l?impedita trascrizione e possibilmente traduzione di Egr1. Sono stati analizzato i livelli proteici di Egr1 negli ippocampi espiantati dai topi trattati con DMSO o AZD6738 e poi iniettati con KA (come descritto dell?esempio 8). I risultati di Western Blotting indicano un significativo aumento dei livelli del fattore di trascrizione Egr1 in animali DMSO+KA rispetto agli animali controllo, incremento che per? viene prevenuto nei topi che sono stati trattati con AZD6738 48 ore prima dello Status Epilettico (Fig.9A). Questi risultati confermano quanto descritto negli Esempi sopra dalle osservazioni in vitro.
Claims (14)
- RIVENDICAZIONI 1. Composti di formula generale (I): in cui
- R<1 >? scelto tra morfolin-4-il e 3-metilmorfolin-4-il; R<2 >?
- n ? 0 o 1; R<2A>, R<2C>, R<2E >e R<2F >sono ciascuno indipendentemente idrogeno o metile; R<2B >e R<2D >sono ciascuno indipendentemente idrogeno o metile; R<2G >? scelto tra -NHR<7 >e -NHCOR<8>; R<2H >? fluoro; R<3 >? metile; R<4 >e R<5 >sono ciascuno indipendentemente idrogeno o metile, o R<4 >e R<5 >insieme all?atomo a cui sono legati formano l?anello A; A ? un anello C3-6-cicloalchile o un anello eterociclico saturo a 4-6 membri contenente un eteroatomo scelto tra O e N; R<6 >? idrogeno; R<7 >? idrogeno o metile; R<8 >? metile; o loro sali farmaceuticamente accettabili, per l?uso come medicamento nella prevenzione e/o nel trattamento di stati di ipereccitabilit? neuronale. 2. Composti per l?uso secondo la rivendicazione 1, in cui R<1 >? 3-metilmorfolin-4-il. 3. Composti per l?uso secondo la rivendicazione 1 o 2, aventi formula (Ia):
- in cui l?anello A ? un anello ciclopropil, tetraidropiranil o piperidinil; R<2 >?
- n ? 0 o 1; R<2A >? idrogeno; R<2B >? idrogeno; R<2C >? idrogeno; R<2D >? idrogeno; R<2E >? idrogeno; R<2F >? idrogeno; R<2G >? selezionato da -NHR<7 >e -NHCOR<8>; R<2H >? fluoro; R<3 >? metile; R<6 >? idrogeno; R<7 >? idrogeno o metile; e R<8 >? metile; o un loro sale farmaceuticamente accettabile. 4. Composti per l?uso secondo le rivendicazioni 1-3, scelti nel gruppo consistente in: 4-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[(R)-S-metilsolfonimidoil)metil]pirimidin-2-il}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina; 4-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-(S)-S-metilsolfonimidoil)ciclopropil]-pirimidin-2-il}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina; 4-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-((R)-S-metilsolfosulfonimidoil)ciclopropil]- pirimidin-2-il}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina; N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-((R)-S-metilsolfoniomidoil)ciclopropil] pirimidin-2-il}-1H-benzimidazolo-2-amina; N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-(S)-S-metilsolfoniomidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-ammina; 4-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-((R)-S-etilsolfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-indolo; 4-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-(S)-S-metilsolfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-indolo; 1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-((R)-S-metilsolfoniomidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-amina; 1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-(S)-S metilsolfoniomidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-ammina; 4-fluoro-N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-((R)-S-metilsolfosulfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazolo-2-amina; 4-fluoro-N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-(S)-S-metilsolfosulfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazolo-2-amina; 4-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-(S-metilsolfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina; N-metil-1-{4-[-metil-1-(S)-S-metilsolfoniomidoil)etile]-6-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-amina; N-metil-1-{4-[1-metil-1-((R)-S-metilsolfosulfonimidoil)etile]-6-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]pirimidin-2-il}-1Hbenzimidazol-2-amina; N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[4-(S)-S-metilsolfonimidoil)tetraidro-2H-pirano-4-il]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazolo-2-ammina; N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[4-((R)-S-metilsolfonimidoil)tetraidro-2H-pirano-4-il]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazolo-2-ammina; 4-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[4-(S)-S-metilsolfonimidoil)tetraidro-2H-pirano-4-il]pirimidin-2-il}-1H-indolo; 4-fluoro-N-metil-1-{4-[1-metil-1-((S)-S-metilsolfosulfonimidoil)etil]-6-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-amina; 4-fluoro-N-metil-1-{4-[1-metil-1-((R)-S-metilsolfosulfonimidoil)etil]-6-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-amina; 6-fluoro-N-metil-1-{4-[1-metil-1-((R)-S-metilsolfosulfonimidoil)etil]-6-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-amina; 5-fluoro-N-metil-1-{4-[1-metil-1-((R)-S-metilsolfosulfonimidoil)etil]-6-[(3R)-3metilmorfolin-4-il]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-amina; 5-fluoro-N-metil-1-{4-[1-metil-1-((S)-S-metilsolfosulfonimidoil)etil]-6-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-amina; 6-fluoro-N-metil-1-{4-[1-metil-1-((S)-S-metilsolfosulfonimidoil)etil]-6-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-amina; 6-fluoro-N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-((R)-S-metilsolfosulfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazolo-2-amina; 5-fluoro-N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-((R)-S-metilsolfosulfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazolo-2-amina; 5-fluoro-N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-(S)-S-metilsolfosulfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazolo-2-amina; ecstasy 6-fluoro-N-metil-1-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-(S)-S-metilsolfosulfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-benzimidazol-2-amina. 5. Composti per l?uso secondo le rivendicazioni 1-4, aventi formula:
- 6. Composti per l?uso secondo la rivendicazione 5, scelti tra: 4-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-((S)-S-metilsolfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}- 1H-pirrolo[2,3-b]piridina; e 4-{4-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-6-[1-((R)-S-metilsolfonimidoil)ciclopropil]pirimidin-2-il}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina.
- 7. Composto per l?uso secondo la rivendicazione 6, avente formula:(Ic?).
- 8. Composti per l?uso secondo le rivendicazioni 1-7, nella prevenzione e/o nel trattamento di patologie e/o disturbi caratterizzati da stati di ipereccitabilit? neuronale.
- 9. Composti per l?uso secondo le rivendicazioni 1-8, come anticonvulsivanti.
- 10. Composti per l?uso secondo le rivendicazioni 1-8, nella prevenzione e/o nel trattamento di epilessia.
- 11. Composti per l?uso secondo le rivendicazioni 1-8, nella prevenzione e/o nel trattamento di malattie neuropsichiatriche o stati psichiatrici.
- 12. Composti per l?uso secondo la rivendicazione 11, in cui malattie neuropsichiatriche o stati psichiatrici sono ansia, stati legati a stress, schizofrenia, depressione.
- 13. Composti per l?uso secondo le rivendicazioni 1-12, somministrati per via nasale.
- 14. Composti per l?uso secondo la rivendicazione 13, somministrati per iniezione intranasale.
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