IT202100020837A1 - Procedimento per rilevare acidi nucleici di patogeni da campioni biologici nativi su chip mems - Google Patents
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Description
Descrizione del trovato avente per titolo:
"PROCEDIMENTO PER RILEVARE ACIDI NUCLEICI DI PATOGENI DA CAMPIONI BIOLOGICI NATIVI SU CHIP MEMS?
CAMPO DI APPLICAZIONE
Il presente trovato si riferisce ad un procedimento per rilevare acidi nucleici di patogeni (virus, batteri, funghi e muffe) in campioni biologici umani e veterinari. In particolare, il trovato si riferisce ad un procedimento basato su Reverse transcriptase Real Time polymerase chain reaction (RT-qPCR) per fare diagnosi di virus patogeni a RNA e su Reai Time PCR (qPCR) per fare diagnosi di vims patogeni a DNA a partire da fluidi o campioni biologici di origine umana o veterinari infetti o potenzialmente infetti.
STATO DELLA TECNICA
I virus sono piccoli patogeni (20-300 nm il diametro) costituiti da un involucro lipidico e proteico che racchiude il materiale genetico: DNA o RNA. I vius sono in grado di invadere le cellule del corpo e utilizzare le componenti della cellula per moltiplicarsi, danneggiare e distuggere le cellule infette. Negli ultimi anni la medicina ha dovuto affrontare virus sconosciuti per i quali gli unici trattamenti disponibili sono quelli in grado solo di alleviare i sintomi. Infatti, gli antibiotici non funzionano per le infezioni virali e i farmaci antivirali devono essere progettati secondo la peculiare fisiopatologia virale.
Di recente, diversi virus hanno innescato epidemie considerevoli, mietendo migliaia di vite. Un esempio ? il ceppo virale che ha causato l'epidemia di Ebola tra il 2014 ed il 2016 in Africa occidentale, che ha ucciso fino al 90% delle persone infettate. Al giorno d'oggi, la pandemia da SARS-CoV-2 sta attualmente causando epidemie in tutto il mondo, rappresentando una seria minaccia per la salute pubblica poich? non ci sono ancora farmaci efficaci per debellarla e la durata dei vaccini ? stimata a meno di un anno. SARS-CoV-2 ? un nuovo coronavirus che causa una malattia denominata "Coronavirus Disease 2019" (COVID-19). ? correlato a lievi sintomi simil-influenzali, ma pu? provocare una sindrome respiratoria acuta grave, che porta anche alla morte nel 3-4 % dei casi (Rapporto sulla situazione - 46?, pubblicato dall'Organizzazione Mondiale della Sanit? - OMS).
Analogamente a SARS-CoV-2, nellambito veterinario l?Herpesvirus Equino- 1 (EHV-1) ? la causa dell?epidemia pi? grave che si sia registrata in Europa da diversi decenni fra gli equidi, che da febbraio 2021 ha gi? causato un gran numero di decessi ed un?incidenza elevata di casi clinici gravi (fonte: Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie). EHV-1 ? responsabile di forme respiratorie, prevalentemente nei giovani esemplari, abortigene e neurologiche (conosciute anche come forme paralitiche o ?equine herpesvirus myeloencephalopathy? (EHM)). A causa della gravit? dei sintomi e della rapida diffusione del virus, la F?d?ration Equestre Internationale (FEI) ha indetto la cancellazione di eventi intemazionali in 11 paesi del continente europeo dal 1? marzo all'l 1 aprile 2021.
Al fine di limitare la diffusione drammaticamente alta e rapida di patogeni per l?uomo o per gli animali (virus e batteri o funghi e relative resistenze), la tempestiva diagnosi ? fondamentale per circoscrivere i focolai e contenere la propagazione del patogeno.
Infatti, tra le esigenze di ricerca date dall'Organizzazione Mondiale della sanit? (OMS) vi ? la diagnostica rapida Point of Care (PoC) da utilizzare a livello comunitario per l'identificazione rapida in loco delle malattie e per il contenimento dei focolai.
Gli sforzi della comunit? di ricerca mondiale sembrano segnare progressi su due fronti: test immunologici (ELISA manuale, a flusso laterale o automatico, test rapidi specifici per antigene o anticorpi) e test molecolari per lo sviluppo di diagnostica in vitro (IVD) per rilevare l'acido nucleico attraverso Reai Time PCR (qPCR). In effetti, la tecnica qPCR ? un metodo sensibile e accurato di prima scelta che permette di fare targeting in multiplex, riducendo notevolmente il costo per campione.
Tuttavia, la tecnica qPCR ? piuttosto laboriosa, richiede molto tempo, necessita di personale qualificato, strumenti costosi e voluminosi. Pertanto, il costo di installazione iniziale ? significativamente elevato, soprattutto per i paesi in via di sviluppo/sottosviluppati
Un altro svantaggio della qPCR rispetto ai test diagnostici rapidi ? il requisito di una temperatura controllata e stabile durante il trasporto e la conservazione dei reagenti, che aumenta notevolmente i costi e in alcuni casi preclude l'adozione di RT-qPCR e qPCR come strumento di diagnosi.
Negli ultimi anni, sono emerse diverse tecnologie che cercano di risolvere questo problema. Tra questi, i saggi gelificati e liofilizzati sono particolarmente utili per semplificare l'uso e per aumentarne la stabilit? a temperatura ambiente.
Inoltre, per lo pi?, Reverse transcriptase Real Time polymerase chain reaction (RT-qPCR) e Reai Time PCR (qPCR) necessitano materiale genetico (RNA e DNA rispettivamente) isolato e purificato rispetto al campione biologico di partenza. Il processo di estrazione dell?acido nucleico, che precede la fase di amplificazione, richiede personale qualificato, strumenti dedicati con conseguenti costi di strumentazione e consumabili, e aumenta la probabilit? di cross-contaminazioni fra i diversi campioni processati contemporaneamente.
Il processo di estrazione pu? essere eseguito attraverso vari metodi, ad esempio con l?ausilio di biglie magnetiche cariche positivamente o metodi di trattamento chimico o termico. Queste tecniche hanno velocizzato il processo, senza per? risolvere il problema di ricorrere per forza ad una apparecchiatura separata o di una laboriosa procedura manuale per la fase di estrazione.
Di recente altri attori del settore, con lo scopo di velocizzare e semplificare i processi noti, hanno messo a punto tecniche di estrazione semplificate o alternative, ad esempio con reagenti per la lisi. Ma anche queste soluzioni alternative non sono universali e non sono sufficienti a risolvere in maniera efficiente la problematica.
Al giorno d'oggi, i test diagnostici point-of-care (POC) vengono sviluppati per facilitare e velocizzare la diagnostica. Per queste nuove piattaforme, la miniaturizzazione e il multiplexing offrono un grande potenziale per migliorare il trattamento dei pazienti attraverso il rilevamento rapido ed accurato dei casi di infezione, sia negli studi medici che nelle cliniche sul campo. Poich? gli obiettivi principali sono simili, non ? inaspettato che le tecnologie RT-qPCR, qPCR e POC vengano fuse per affrontare i problemi di contenimento della diffusione dei virus.
In alcuni esempi, come le applicazioni di queste metodiche sul campo, sia in ambito veterinario che in ambito umano, i POC risultano l?unica strategia percorribile per la tempestiva diagnosi ed il contenimento di focolai infettivi.
La Richiedente ha ideato, sperimentato e realizzato la presente invenzione per superare gli inconvenienti dello stato dell'arte e per ottenere questi ed altri scopi e vantaggi.
ESPOSIZIONE DEL TROVATO
Il presente trovato ? espresso e caratterizzato nelle rivendicazioni indipendenti. Le rivendicazioni dipendenti espongono altre caratteristiche del presente trovato o varianti dell?idea di soluzione principale.
In accordo con i suddetti scopi, e per risolvere il suddetto problema tecnico in modo nuovo ed originale, ottenendo anche notevoli vantaggi rispetto allo stato della tecnica anteriore, una cartuccia MEMS (Micro Electro-Mechanical System) pronta all?uso secondo il presente trovato, comprende una o pi? miscele di reazione per qPCR o RT-qPCR liofilizzate o sottoposte a gelificazione, essicazione o trattate con procedimenti di conservazione analoghi e permettono l?identificazione in multiplex fino a 24 target appartenenti a patogeni quali virus e/o batteri e/o funghi e/o muffe a partire da campioni biologici nativi trattati con soluzione ipotonica che permette il rilascio di acidi nucleici liberi nella soluzione senza la necessit? di una fase di purificazione.
In modo opportuno la cartuccia comprende una o pi? sedi di reazione, denominate pozzetti. L?una o pi? miscele di reazione di cui sopra sono posizionate allinteno delle sedi di reazione.
Preferibilmente, previa fase di miscelazione del campione biologico con una soluzione ipotonica, la cartuccia consente in un successivo tempo, senza ulteriore intervento da parte di un operatore, le fasi di retrotrascrizione (se richiesta), amplificazione e rilevazione grazie alla presenza a bordo di tutti i reagenti necessari, inclusi enzimi termoresistenti.
Favorevolmente, il rapporto in volume tra il campione biologico e la soluzione ipotonica (campione:soluzione) ? compreso tra 1:0,5 e 1:50. Preferenzialmente, le sedi di reazione sono realizzate in cera o materiale idrofobico trasparente alla fluorescenza. In tal modo il materiale permette la sigillatura delle sedi quando esse sono sottoposte a cicli termici, in particolare durante una successiva fase di rilevazione della presenza di virus patogeni. Ci? permette di evitare crosscontaminazioni fra le varie sedi in cui possono verificarsi diverse reazioni su differenti campioni biologici nativi.
Con ciclo termico si intende un trattamento termico, in particolare durante il quale il campione ? sottoposto ad un riscaldamento seguito da un raffreddamento.
La cartuccia pu? contenere almeno un reagente di controllo positivo, un reagente di controllo negativo e/o un reagente di controllo interno per verificare il funzionamento della cartuccia e per valutare la presenza di inibitori in ciascun campione biologico.
In accordo con forme di realizzazione le miscele di reazione contengono un set di primer e probe liofilizzati specifici per identificare esclusivamente alcuni patogeni per l?uomo (ad esempio SARS-CoV-2) o per gli animali (ad esempio EHV-1 o EHV-4).
Vantaggiosamente, la cartuccia ? utilizzabile esclusivamente su un termociclatore dedicato che pu? essere un POC.
Secondo un altro aspetto del trovato ? previsto un procedimento di analisi di campioni biologici, per rilevare acidi nucleici di patogeni quali virus, batteri, funghi e muffe o marcatori clinici da campioni di sangue intero o plasma o altro liquido biologico. Tale procedimento comprende in sequenza una fase di trattamento del campione con almeno un reagente dedicato, per l?ottenimento di acidi nucleici liberi in soluzione, una successiva fase di caricamento della soluzione ottenuta in una cartuccia MEMS (Micro Electro-Mechanical System), ed una fase di rilevazione della presenza di virus patogeni mediante un trattamento termico dedicato la cui fase iniziale permette il rilascio di acidi nucleici per la reazione di retrotrascrizione ed amplificazione. All?interno della cartuccia MEMS si trovano reagenti liofilizzati e/o gelif?cati e/o essiccati e/o trattati con metodi di conservazione analoga, idonei a reazioni di qPCR (Real Time Polymerase Chain Reaction) o RT-qPCR (Reverse Transcriptase Real Time Polymerase Chain Reaction) per la rilevazione di DNA o RNA rispettivamente.
La fase iniziale di trattamento del campione biologico comprende preferenzialmente la miscelazione del campione biologico con una soluzione ipotonica e, successivamente, un riscaldamento della soluzione ottenuta. Tale sotto-fase di riscaldamento ? vantaggiosamente eseguita direttamente nella cartuccia MEMS e permette di evitare la purificazione dell?acido nucleico e rende gli acidi nucleici idonei alle reazioni di retro trascrizione ed amplificazione con enzimi termoresistenti. Secondo forme di realizzazione, la fase di trattamento del campione pu? comprendere una lisi osmotica e termica del campione biologico e pu? avvenire direttamente all?interno della cartuccia MEMS con reagenti pronti all?uso al fine di identificare la presenza di virus o marcatori proteici di svariate patologie cliniche.
La sotto-fase di riscaldamento del campione biologico comprendente preferibilmente l?applicazione di una o pi? rampe termiche, per completare la lisi o altra reazione con la soluzione ipotonica.
Secondo forme di realizzazione, la sotto-fase di riscaldamento prevede di portare la miscela contenente gli acidi nucleici ad una temperatura compresa tra 80?C e 120?C, preferibilmente tra 90?C e 100?C, per un intervallo di tempo compreso tra 20 secondi e 30 minuti, preferibilmente tra 30 secondi e 10 minuti.
Il rapporto in volume tra campione e soluzione ipotonica (campione:soluzione) pu? essere compreso tra 1:0,5 e 1:50.
La miscela di reazione pu? contenere enzimi termoresistenti necessari a ciascuna delle fasi di retro-trascrizione e/o amplificazione in grado di resistere a temperature dell? ordine di 90?C per un tempo maggiore di 3 minuti, cio? enzimi che non perdono la loro attivit? quando sottoposte a queste condizioni termiche per il tempo indicato regolare anche quando in forma liofilizzata nella cartuccia MEMS.
La fase di rilevazione ? preferibilmente eseguita tramite uno strumento per qPCR (Real Time Polymerase Chain Reaction) o RT-qPCR (Reverse Transcriptase Real Time Polymerase Chain Reaction) (in una delle sue forme un POC, Point of Care) allinteno della cartuccia i cui reagenti liofilizzati e/o gelificati e/o essiccati e/o trattati con procedimento di conservazione analogo permettono di identificare pi? target all?interno di una sola miscela di reazione sfruttando i diversi spettri di eccitazione ed emissione di molecole dette fluorofori, permettendo cos? reazioni in multiplex per l?identificazione fino a 24 target per cartuccia.
Preferibilmente, la cartuccia comprende una o pi? sedi di reazione realizzate in cera o materiale idrofobico trasparente alla fluorescenza che ne realizza la sigillatura quando sottoposto ad un ciclo termico e permette di evitare cross-contaminazione fra le varie reazioni ed i differenti campioni biologici nativi.
Secondo forme di realizzazione il procedimento prevede almeno un controllo positivo, un controllo negativo e/o un controllo interno per verificare il funzionamento della cartuccia e per valutare la presenza di inibitori in ciascun campione biologico.
Preferenzialmente, le miscele di reazione contengono set di primer e probe liofilizzati specifici per l?identificazione esclusiva di alcuni patogeni sia per l?uomo (es. SARS-CoV-2) che per gli animali (es. EHV-1, EHV-4).
? vantaggioso prevedere che la fase di rilevazione avvenga all? interno di una cartuccia con tecnologia MEMS utilizzabile esclusivamente su un dispositivo dedicato. Tale dispositivo dedicato ? preferibilmente un termociclatore dedicato, in grado di sottoporre i campioni a cicli termici. Il dispositivo dedicato pu? essere un POC.
Favorevolmente, il procedimento ? compatibile con campioni biologici nativi di origine respiratoria o altri campioni contraddistinti da alta viscosit?.
In accordo con forme di realizzazione, in cui la fase di trattamento del campione rende disponibile l?acido nucleico in soluzione, il procedimento comprende, successivamente alla suddetta fase, il caricamento del campione biologico, nella sua miscela, in cartuccia MEMS gi? precaricata con reagenti pronti all?uso, seguito da uno stadio di retro-trascrizione del RNA a cDNA (ove necessario) e successivamente da una fase di amplificazione degli acidi nucleici cDNA o DNA.
A tale scopo il procedimento pu? prevedere di caricare almeno una porzione del campione biologico miscelato nella soluzione ipotonica su un dispositivo di reazione, sul quale avvengono le reazioni necessarie per le fasi di trattamento, amplificazione e di rilevazione. Tale dispositivo pu? essere del tipo della cartuccia eventualmente monouso, ad esempio del tipo a tecnologia MEMS (Micro Electro-Mechanical Systems).
Vantaggiosamente la cartuccia comprende una pluralit? di sedi di reazione, configurate come pozzetti, in cui sono presenti reagenti stabilizzati (liofilizzati, gelificati, essiccati o similari) per testare la presenza di una pluralit? di sequenze specifiche, dette target.
In tal caso, la sotto-fase di trattamento termico del campione biologico nella soluzione ipotonica ? eseguita, in una delle sue forme, in uno strumento dedicato configurato per eseguire anche le fasi di amplificazione e di rilevazione. In particolare, lo strumento ? configurato per eseguire le fasi di RT-qPCR o di qPCR.
DESCRIZIONE DI ALCUNE FORME DI REALIZZAZIONE
Si far? ora riferimento nel dettaglio alle possibili forme di realizzazione del trovato, fomite a titolo esemplificativo non limitativo. Anche la fraseologia e terminologia qui utilizzata ? a fini esemplificativi non limitativi.
Il procedimento secondo il trovato permette di eseguire analisi su campioni biologici di origine umana o altro, infetti o potenzialmente infetti da batteri, virus, funghi, muffe e loro resistenze, o marcatori clinici da campioni biologici.
I campioni biologici possono essere, a titolo puramente esemplificativo, feci e fluidi corporei come sangue, siero, plasma, urine, liquor (fluido cefalorachidiano), mucosa del tratto naso/orofaringeo, saliva o sputo, prelevati tramite metodologie note, ad esempio prelievo tramite siringa, tampone naso/orofaringeo, lavaggio bronchiolo-alveolare (BAL), puntura lombare o altri.
In accordo con il trovato, il procedimento prevede una fase iniziale di diluzione di un campione biologico, gi? acquisito, in una soluzione ipotonica. Con soluzione ipotonica si intende una soluzione la cui pressione osmotica ? minore della pressione osmotica all? interno delle cellule del campione biologico da analizzare. Si tratta tipicamente di una soluzione acquosa tale per cui gli acidi nucleici contenuti nelle cellule del campione biologico sono liberati nella soluzione ipotonica, e cos? disponibili per le successive fasi del procedimento. Vantaggiosamente, gli enzimi impiegati sono del tipo commercialmente disponibili.
La diluzione del campione nella soluzione ipotonica ? tale per cui il rapporto in volume tra campione e soluzione ipotonica campione: soluzione ? compreso tra 1:0,5 e 1:50.
La soluzione ipotonica prevede la presenza di acqua ultrapura (resistivit? di 18,2 ??-cm, TOC <10 ppb e conta batterica <10 CFU/ml) priva di endotossine, priva di DNAse, RNAse e proteasi, ovvero Molecular Biology Grade. La soluzione ipotonica pu? anche comprendere, reagenti protettivi che proteggono il materiale biologico da reazioni indesiderate che potrebbero alterare o danneggiare il campione. Un esempio di reagente protettivo comprende gli inibitori di nucleasi utilizzabili per reazioni di biologia molecolare.
Una volta preparata la miscela, parte di essa ? vantaggiosamente caricata su un dispositivo monouso per l analisi del campione biologico. Il dispositivo monouso pu? essere una cartuccia usa e getta, in particolare una cartuccia MEMS, in cui ? realizzata una pluralit? di pozzetti, cio? di incavi atti a contenere un volume predeterminato di soluzione liquida, in questo caso un volume della miscela precedentemente preparata.
Prima di trasferirvi la miscela contenente il campione, in ciascun pozzetto ? stata predisposta una pluralit? di reagenti per testare la presenza di un numero predeterminato di target, ad esempio fino a 24 target. I reagenti sono di tipo noto e sono previsti sotto forma stabilizzata tale da consentirne la conservazione, ad esempio sotto forma liofilizzata, gelificata, essiccata o similare.
Tra i reagenti predisposti nella cartuccia sono previsti dei primers e delle sonde, usualmente note come probe, in quantit? tale da risultare ad una concentrazione compresa tra 0,1 ?? e 1,5?? nell?aliquota di miscela contenente il campione. La quantit? di primer e di probe va quindi calcolata sulla base della concentrazione desiderata e del volume di miscela da caricare nel pozzetto.
Il semplice caricamento di una aliquota di miscela nei pozzetti mette il campione in presenza dei reagenti per poter eseguire i test e cos? poter verificare la presenza di virus nel campione. La cartuccia caricata ? introdotta in un apposito strumento configurato per trattare termicamente il campione e per eseguire fasi di termociclatura.
In particolare lo strumento ? configurato per applicare protocolli velocizzati ed ottimizzati grazie alle particolari caratteristiche di termoconducibilit? della tecnologia MEMS che garantisce prestazioni molto superiori rispetto ai metodi standard di riferimento. Lo strumento ? programmabile a seconda dei cicli termici, ed ? comandato da apposito programma per computer in base alle necessit? analitiche del test.
Successivamente la miscela contenente il campione ? sottoposta ad un primo trattamento termico il cui scopo ? rendere maggiormente disponibili gli acidi nucleici mediante lisi osmotica e termica del campione. Tale primo trattamento termico pu? prevedere di sottoporre il campione ad una temperatura compresa tra 90?C e 100?C per un tempo compreso tra 30 secondi e 10 minuti.
A tale scopo, gli enzimi impiegati sono termoresistenti, ossia non sono denaturati se sottoposti a temperature maggiori di 90?C per un tempo di almeno 3 minuti, e mantengono un?attivit? enzimatica.
Si noti che la diluzione del campione nella soluzione ipotonica ed il primo trattamento termico di cui sopra sono due sotto-fasi della fase trattamento degli acidi nucleici dal campione da analizzare.
In seguito alla sotto-fase di trattamento di lisi termica, si procede con le fasi di retro-trascrizione (ove necessario), amplificazione degli acidi nucleici e di rilevazione, ossia le tecniche di RT-qPCR, nel caso in cui gli acidi nucleici siano RNA, o di qPCR, nel caso si analizzi DNA.
Nello specifico, in caso di analisi di RNA, il primo trattamento termico di cui sopra ? seguito da una fase di retro-trascrizione del RNA ad una temperatura compresa fra 50?C e 70?C per un tempo compreso tra 30 secondi e 35 minuti. In caso di analisi di DNA invece, si esegue il primo trattamento termico sopra descritto senza la fase di retrotrascrizione.
Si provvede poi ad applicare ripetutamente un ciclo termico per l?esecuzione della reazione di amplificazione. Il ciclo termico per l?amplificazione pu? essere ripetuto per un numero compreso tra 25 e 45 cicli.
La fase di rilevazione si conclude utilizzando tecniche di rilevamento della fluorescenza emessa dai fluorofori, ovvero proteine legate alle sonde, dopo eccitazione delle stesse con determinate lunghezze d?onda.
Tali fasi di trattamento termico, amplificazione e di rilevazione sono eseguite direttamente nello strumento in cui ? stata inserita la cartuccia, in modo noto, grazie alla capacit? dello strumento di eseguire cicli termici per l amplificazione nonch? la capacit? di eccitare e leggere determinate lunghezze d?onda.
Si noti che oltre ai reagenti per l?identificazione di target di interesse, nei pozzetti possono essere presenti anche dei reagenti per controlli positivi, negativi e/o intemi/endogeni, il cui scopo ? di verificare il corretto funzionamento del test stesso nonch? la presenza di acidi nucleici e la qualit? del campione di partenza. Si pu? anche prevedere di aggiungere uno o pi? eccipienti specifici, ad esempio il mannitolo, e/o sucrosio, e/o glieina, e/o destrano e/o il trealosio che possono essere utili per l?esecuzione di un successivo protocollo di liofilizzazione degli acidi nucleici estratti. Il principale vantaggio del trovato sta nell?applicazione di tecniche di RT-qPCR o qPCR in tempo reale in una cartuccia MEMS pronta all?uso, senza la necessit? di eseguire la fase di estrazione degli acidi nucleici dal campione da analizzare. Partendo da un campione nativo ? possibile eseguire un procedimento finora complesso in maniera semplice ed ergonomica per lutilizzatore, tramite un dispositivo monouso ed uno strumento facile da usare e semplice dal punto di vista tecnico e costruttivo e che comporta costi minori rispetto alle tecniche tradizionali.
Grazie alla predisposizione dei reagenti sotto forma stabilizzata nella cartuccia, l?operatore che esegue il test non deve provvedere alla preparazione della miscela di reazione per la retro-trascrizione del RNA a DNA, e neanche alla preparazione della miscela di reazione contenente i reagenti per l amplificazione e la rilevazione.
Lo strumento utilizzato per eseguire i cicli termici comprende una componente ottica che permette di ottenere una lettura ripetuta dei valori ottenuti dopo ogni ciclo termico, ad esempio valori di fluorescenza. I dati raccolti sono poi elaborati tramite apposti algoritmi integrati in un software per diagnostica in vitro (IVD) in modo da fornire un risultato finale.
Il trovato permette pertanto di analizzare un campione biologico con l?ausilio di un dispositivo MEMS senza ricorrere a strumentazione dedicata per le procedure standard di biologia molecolare, in particolare per la fase iniziale di estrazione degli acidi nucleici dal campione.
Ci? permette di ridurre i costi ed i tempi di analisi rispetto alle tecniche note.
Inoltre, grazie al trovato, i tempi di risposta dei test in biologia molecolare sono notevolmente abbreviati, il che rende il dispositivo MEMS e la corrispondente strumentazione idonei per la funzione di strumento Point of Care (POC), molto utile per la diagnosi di SARS-CoV-2 o di EHV-1, tra altri, in luoghi come reparti clinici, pronto soccorso o ambulatori veterinari, o altri luoghi idonei a testare campioni in modo rapido ed efficiente.
Il procedimento secondo il trovato, applicato su un dispositivo MEMS, consente il rilascio di DNA o RNA da campioni biologici mediante un semplice pretrattamento con una soluzione ipotonica acquosa contenente reagenti dedicati, in un solo contesto di procedura tecnica con enzimi e primer/probe specifici.
A processo di preparazione del campione finito, il chip MEMS ? pronto a ricevere una aliquota del campione biologico gi? miscelato con la soluzione ipotonica che attiva la fase di rilascio di acidi nucleici. Il campione pu? essere stato ottenuto indifferentemente tramite qualsiasi modalit? di prelievo, quale ad esempio tampone, tampone naso faringeo, campione salivare o altro.
Lo strumento dedicato per l amplificazione e la rilevazione degli acidi nucleici ? programmabile a seconda dei cicli richiesti dal programma operativo e guidato da software peculiare in base alle necessit? analitiche del test.
A titolo di esempio sono stati eseguiti test per SARS-CoV-2 e test per EHV-1 da tampone naso faringeo rispettivamente umano ed equino con l?uso di uno strumento come sopra indicato e mediante il metodo sopra descritto, con ottimi risultati in termini di tempistica e di semplicit? d?uso.
L?adozione delle tecnologie descritte e delle procedure analitiche adottate consente l?esecuzione diretta e semplificata per l?utente di un test tecnologicamente complicato tramite l?utilizzo di uno strumento ed un dispositivo estremamente semplificato e quindi pi? economico rispetto a quanto gi? presente sul mercato.
Tale semplificazione del processo consente un?enorme riduzione di passaggi manuali quali potrebbero introdurre errori o contaminazioni con altri campioni o con sostanze che potrebbero inibire l amplificazione o degradare l?acido nucleico (RNA o DNA). La diminuzione dei passaggi da effettuare velocizza l?esecuzione del test stesso e quindi dei tempi di diagnosi che a loro volta comportano la possibilit? di una terapia mirata e tempestiva per il paziente/animale fondamentalmente per ridurne la mortalit?.
E chiaro che al procedimento per rilevare virus in campioni biologici fin qui descritto possono essere apportate modifiche e/o aggiunte di parti o fasi, senza per questo uscire dall?ambito del presente trovato come definito dalle rivendicazioni.
Claims (18)
1. Cartuccia MEMS (Micro Electro-Mechanical Systems) pronta all?uso, in cui una o pi? miscele di reazione per qPCR o RT-qPCR sono liofilizzate o sottoposte a gelificazione, essicazione o trattate con procedimenti di conservazione analoghi e permettono l?identificazione in multiplex fino a 24 target appartenenti a patogeni quali virus e/o batteri e/o funghi e/o muffe a partire da campioni biologici nativi trattati con soluzione ipotonica che permette il rilascio di acidi nucleici liberi nella soluzione senza la necessit? di una fase di purificazione.
2. Cartuccia come nella rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto che, previa fase di miscelazione di detto campione biologico con la soluzione ipotonica, consente senza ulteriore intervento da parte di un operatore, le fasi di retrotrascrizione (se richiesta), amplificazione e rilevazione grazie alla presenza a bordo di tutti i reagenti necessari, inclusi enzimi termoresistenti.
3. Cartuccia come nella rivendicazione 1 o 2, caratterizzata dal fatto che il rapporto in volume tra campione biologico e soluzione ipotonica (campione: soluzione) ? compreso tra 1:0,5 e 1:50.
4. Cartuccia come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, caratterizzata dal fatto che comprende una o pi? sedi di reazione realizzate in cera o materiale idrofobico trasparente alla fluorescenza che ne realizza la sigillatura quando sottoposto ad un ciclo termico e permette di evitare cross-contaminazione fra le varie reazioni ed i differenti campioni biologici nativi.
5. Cartuccia come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto di contenere almeno un reagente di controllo positivo, un reagente di controllo negativo e/o un reagente di controllo interno per verificare il funzionamento della cartuccia stessa e per la valutazione della presenza di inibitori nel singolo campione biologico.
6. Cartuccia come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto che le miscele di reazione contengono set di primer e probe liofilizzati specifici per l identificazione esclusiva di alcuni patogeni sia per l?uomo (es. SARS-CoV-2) che per gli animali (es. EHV-1, EHV-4).
7. Cartuccia come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto di essere utilizzabile esclusivamente su un termociclatore dedicato che pu? essere un POC.
8. Cartuccia come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto di essere compatibile con campioni biologici nativi di origine respiratoria o altri campioni contraddistinti da alta viscosit?.
9. Procedimento per rilevare patogeni in campioni biologici, comprendente una fase di trattamento di un campione biologico con almeno un reagente dedicato, una successiva fase di caricamento della soluzione ottenuta in una cartuccia MEMS (Micro Electro-Mechanical Systems) al cui interno si trovano reagenti liofilizzati e/o gelificati e/o essiccati e/o trattati con metodi di conservazione analoga, idonei a reazioni di qPCR (Reai Time Polymerase Chain Reaction) o RT-qPCR (Reverse Transcriptase Real Time Polymerase Chain Reaction) per la rilevazione di DNA o RNA rispettivamente e una fase di rilevazione della presenza di virus patogeni mediante un trattamento termico dedicato la cui fase iniziale permette il rilascio di acidi nucleici per la reazione di retrotrascrizione ed amplificazione.
10. Procedimento come nella rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che la fase di trattamento del campione biologico comprende la miscelazione di detto campione biologico con una soluzione ipotonica e, successivamente, un riscaldamento della soluzione ottenuta direttamente nella cartuccia MEMS che permette di evitare la purificazione dell?acido nucleico e rende gli acidi nucleici idonei alle reazioni di retrotrascrizione ed amplificazione con enzimi termoresistenti.
11. Procedimento come nella rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che il riscaldamento prevede di portare la miscela contenente gli acidi nucleici ad una temperatura compresa tra 80?C e 120?C per un tempo compreso tra 20 secondi e 30 minuti.
12. Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 11, caratterizzata dal fatto che il rapporto in volume tra campione biologico e soluzione ipotonica (campione: soluzione) ? compreso tra 1:0,5 e 1:50
13. Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 12, caratterizzato dal fatto che la fase di rilevazione ? eseguita tramite uno strumento per qPCR (Real Time Polymerase Chain Reaction) o RT-qPCR (Reverse Transcriptase Reai Time Polymerase Chain Reaction) (in una delle sue forme un POC, Point of Care) allintero oella cartuccia i cui reagenti liofilizzati e/o gelificati e/o essiccati e/o trattati con procedimento di conservazione analogo permettono di identificare pi? target all? interno di una sola miscela di reazione sfruttando i diversi spettri di eccitazione ed emissione di molecole dette fluorofori, permettendo cos? reazioni in multiplex per l identificazione fino a 24 target per cartuccia.
14. Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 13, caratterizzato dal fatto che la cartuccia comprende una o pi? sedi di reazione realizzate in cera o materiale idrofobico trasparente alla fluorescenza che ne realizza la sigillatura quando sottoposto ad un ciclo termico e permette di evitare cross-contaminazione fra le varie reazioni ed i differenti campioni biologici nativi.
15. Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 14, caratterizzato dal fatto di contenere almeno un controllo positivo, un controllo negativo e/o un controllo interno per verificare il funzionamento della cartuccia stessa e per la valutazione della presenza di inibitori nel singolo campione biologico.
16. Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 15, caratterizzato dal fatto che le miscele di reazione contengono set di primer e probe liofilizzati specifici per l?identificazione esclusiva di alcuni patogeni sia per l?uomo (es. SARS-CoV-2) che per gli animali (es. EHV-1, EHV-4).
17. Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 16, caratterizzato dal fatto che la fase di rilevazione avviene all?interno di una cartuccia con tecnologia MEMS (Micro Electro-Mechanical Systems) utilizzabile esclusivamente su termociclatore dedicato che pu? essere un POC.
18. Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 17, caratterizzato dal fatto di essere compatibile con campioni biologici nativi di origine respiratoria o altri campioni contraddistinti da alta viscosit?.
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