IT202100020309A1 - Estratti derivati da olive e pale di fico d’India per l’uso nella prevenzione e nel trattamento della dermatite atopica - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
Campo di applicazione
La presente invenzione si riferisce, in termini generali, all?uso in campo farmaceutico e nutraceutico di estratti derivati da oliva (Olea europea) e da pale di fico d?India (Opuntia ficus-indica) per la prevenzione ed il trattamento della dermatite atopica, nonch? alle composizioni e alle formulazioni comprendenti tali estratti.
Arte nota
La dermatite atopica ? una patologia cronica della pelle, caratterizzata da uno stato di persistente infiammazione di una o pi? aree della pelle, pi? o meno estese, che determina prurito, secchezza, chiazze rosse, spesso con formazione di lesioni e pustole. Solitamente colpisce mani, piedi, gomiti e ginocchia, ma pu? interessare anche polsi, caviglie, viso, collo e torace.
La dermatite atopica ? attualmente una delle pi? diffuse malattie della pelle, si stima che in Europa circa il 2-10% degli adulti ne soffra, e circa il 10-25% dei bambini (Yang et al. Skin Barrier Abnormalities and Immune Dysfunction in Atopic Dermatitis. Int J Mol Sci. 2020 Apr). In particolare, nei bambini si pu? manifestare nei primissimi mesi o anni di vita, generalmente in maniera improvvisa e piuttosto violenta. Anche negli adulti si pu? manifestare in forma improvvisa e in alcuni casi, quando si cronicizza, oltre a causare ispessimenti della pelle, pu? dare origine a fenomeni pruriginosi estremamente fastidiosi, che portano anche ad una ipersensibilit? della pelle, incapace di tollerare i prodotti pi? comuni con cui entra in contatto.
Diversi fattori contribuiscono allo sviluppo della dermatite atopica, sia di tipo genetico, cio? dipendenti dall?ereditariet? della persona, che di tipo esterno e ambientale, quali ad esempio cambiamenti stagionali, sbalzi di temperatura, stress psicofisici, contatto con sostanze chimiche (detergenti, profumi, conservanti), colonizzazione da specie microbica o infezioni.
Sebbene nella maggior parte di individui affetti da dermatite atopica si riscontrino alterazioni della barriera epidermica e problemi di tipo immunologico, le cause alla base della dermatite atopica non sono chiare e spesso decidere come trattarla ? piuttosto complesso.
? noto che numerosi dati di letteratura indicano una correlazione tra dermatite atopica e alterazione delle normali funzioni dell?intestino. Le disfunzioni dell?intestino pi? note associate a pazienti con dermatite atopica sono: l?aumento della permeabilit? intestinale legata ad uno stato infiammatorio dei tessuti; l?alterazione della normale composizione microbica intestinale, definita ?disbiosi?, dove si osserva una riduzione di batteri commensali e aumento di quelli potenzialmente patogeni; diminuiti livelli di acidi grassi a catena corta (Short Chain Fatty Acids, SCFA) che sono prodotti dalla microflora intestinale e hanno funzioni importanti per la salute delle cellule (Pike et al, 1986 Increased intestinal permeability in atopic eczema. J Invest Dermatol. 1986 Feb;86(2):101-4).
In particolare, l?aumentata "permeabilit? intestinale" determina una minore selettivit? dell?epitelio intestinale al passaggio di sostanze che derivano dalla digestione degli alimenti. Questo tipo di selettivit? ? estremamente importante in quanto determina quali sono le sostanze utili che devono essere assorbite dall?intestino, e quali invece sono quelle da respingere in quanto non utili all?organismo o addirittura tossiche.
Il passaggio di sostanze dannose o persino di agenti patogeni, che avviene in pazienti affetti da dermatite atopica perch? caratterizzati da una alterata permeabilit? intestinale, causa fenomeni di infiammazione generalizzati molto seri, che coinvolgono in particolare la pelle con le visibili conseguenze descritte.
Nella pelle, infatti, le principali alterazioni sono legate a: l?aumento della permeabilit? dell?epidermide, analogamente a quanto avviene a livello intestinale; l?assottigliamento dello strato corneo protettivo composto in prevalenza da lipidi; la colonizzazione e la proliferazione del batterio patogeno Staphylococcus aureus; l?aumento del processo infiammatorio, in particolare quello promosso da linfociti T-helper 2 (Th2), che coinvolge la secrezione degli anticorpi IgE e l?innesco di reazioni allergiche (Kim et al. Microbiome of the Skin and Gut in Atopic Dermatitis (AD): Understanding the Pathophysiology and Finding Novel Management Strategies J. Clin. Med. 2019, 8(4), 444).
Il trattamento della dermatite atopica non ? semplice, e talvolta ? poco risolutivo.
Sono disponibili in commercio prodotti lenitivi da usare sulle aree della pelle interessate dalla dermatite, ma essi sono in grado di alleviare solo momentaneamente l'infiammazione e il prurito; inoltre, la presenza di eccipienti nelle creme possono aggravare l?infiammazione, a causa dell?eccessiva sensibilit? della pelle.
In alcuni casi ? possibile ricorrere all?utilizzo di creme o soluzioni di lavaggio contenenti agenti riducenti, come l?Ittiolo Solfonato o il Coal Tar (catrame minerale), ma anche in questi casi l?azione non risulta risolutiva nel tempo.
Nella maggior parte dei casi clinici di dermatite atopica vengono prescritte terapie a base di farmaci corticosteroidi ad uso topico. Sono numerosi i farmaci steroidei attualmente disponibili (chimicamente derivati dall?ormone cortisone), che sono suddivisi in classi a seconda della loro differente potenza d?azione.
Purtroppo, farmaci con una maggiore potenza sono spesso associati ad un rischio maggiore di sviluppare effetti collaterali pi? marcati e di maggiore entit?, e pertanto essi devono essere usati per periodi di tempo pi? brevi e con molta cautela su soggetti sensibili. In particolare, l?effetto collaterale indesiderato pi? preoccupante ? l?atrofia cutanea, che pu? essere persistente e manifestarsi come un assottigliamento pi? o meno marcato della cute e dei tessuti sottocutanei con conseguente formazione di profonde rugosit?, lesioni e perdita di elasticit?.
Altri effetti indesiderati sono rappresentati da follicoliti, eruzioni acneiche, rossori, ipertricosi e svariate reazioni di tipo allergico. Ancora pi? rischiosi sono gli effetti collaterali dei derivati cortisonici nei bambini e neonati, la cui cute e soprattutto lo strato corneo sono pi? sottili rispetto agli individui adulti. I bambini inoltre hanno un maggiore rischio di tossicit? sistemica di questi farmaci in quanto hanno una barriera epidermica non ancora del tutto efficiente e una pi? estesa superficie corporea in rapporto al loro peso (Malik et al. Steroid allergy in patients with inflammatory bowel disease. Br J Dermatol 2007;157:967-9; Baeck et al. Allergic hypersensitivity to topical and systemic corticosteroids: a review. Allergy 2009; 64:978-94).
Studi recenti hanno dimostrato che prodotti definiti probiotici (cio? costituiti da microrganismi vivi e attivi, soprattutto batteri, contenuti in determinati alimenti o integratori) e prebiotici (cio? prodotti a base di sostanze, principalmente fibre idrosolubili, oligo- e polisaccaridi, che promuovono la crescita nell?intestino di specie batteriche utili allo sviluppo della microflora) sono probabilmente i pi? promettenti per la prevenzione e il trattamento della dermatite atopica (Rather et al. Probiotics and Atopic Dermatitis: An Overview. Front. Microbiol., 12 April 2016; D?Auria et al. Probiotics, Prebiotics and Postbiotics in Atopic Dermatitis. Biomed J Sci & Tech Res 22(5)-2019; Rusu et al. Prebiotics and probiotics in atopic dermatitis (Review). Experimental and Therapeutic medicine 18: 926-931, 2019).
Nonostante ci?, questi prodotti non riescono a risolvere del tutto il problema: in et? pediatrica la loro efficacia, ancora ampiamente discussa, sembra essere correlata a diverse variabili, quali l?uso di antibiotici, la dieta prenatale e postnatale, la modalit? di somministrazione e l?ambiente allergenico circostante in casa.
In generale, sembra esserci una forte variabilit? nell?efficacia dei probiotici, ascrivibile al tipo di ceppo utilizzato, al metodo di somministrazione, al tempo di insorgenza della malattia, nonch? alla dimensione, dose e durata del trattamento stesso. (Rather et al.
Probiotics and Atopic Dermatitis: An Overview. Front. Microbiol., 12 April 2016).
Il problema tecnico oggettivo alla base della presente invenzione ? quello di mettere a disposizione almeno un estratto vegetale, ricco di metaboliti secondari, in grado di trattare la dermatite atopica, e che sia sostanzialmente privo degli svantaggi dei prodotti dell?arte nota succitata.
Sommario dell'invenzione
Gli autori della presente invenzione hanno ora trovato che l?estratto da oliva, in particolare l?estratto da oliva derivato da acque reflue di frantoio, ? in grado di prevenire e trattare la dermatite atopica, riducendo in particolare l?infiammazione sia cutanea che intestinale, nonch? favorendo il mantenimento dell?integrit? della barriera intestinale.
Inoltre, gli autori della presente invenzione hanno trovato che il suddetto estratto di oliva ? in grado di agire sinergicamente con l?estratto idrosolubile di pale di fico d?India, ottenuto come descritto nella presente invenzione, per l?uso nella prevenzione e nel trattamento della dermatite atopica, favorendo il mantenimento dell?integrit? non solo della barriera intestinale ma anche di quella epidermica.
In un suo aspetto, la presente invenzione si riferisce dunque ad una composizione comprendente quale principio attivo un estratto idrosolubile di oliva derivato da acque reflue di frantoio per l?uso nella prevenzione e nel trattamento della dermatite atopica.
Preferibilmente, la suddetta composizione comprende un ulteriore principio attivo costituito da un estratto idrosolubile di fico d?India.
Preferibilmente, l?estratto idrosolubile di fico d?India ? ottenuto mediante un procedimento che comprende le seguenti fasi:
i) sottoporre pale di fico d?India precedentemente pulite ad un trattamento al vapore;
ii) pelare le pale di fico d?India ottenute dalla fase i);
iii) omogeneizzare le pale di fico d?India pelate, ottenendo un omogenato;
iv) separare la parte solida di detto omogenato dalla parte liquida, che costituisce detto estratto idrosolubile di fico d?India.
Preferibilmente, nella fase i) il trattamento al vapore avviene ad una pressione fino a 4,5 bar, pi? preferibilmente tra 3 bar e 4,5 bar, per un periodo di tempo compreso tra 5 minuti e 30 minuti, pi? preferibilmente tra 10 minuti e 20 minuti.
Preferibilmente, nella fase iii) le pale di fico d?India pelate hanno una temperatura compresa tra 0-10?C, pi? preferibilmente di circa 5?C.
Preferibilmente, la fase iii) di omogeneizzazione viene eseguita ad una velocit? compresa tra 2000 rpm e 4500 rpm, pi? preferibilmente a 4000 rpm, per un periodo di tempo compreso tra 5-30 minuti.
Preferibilmente, la fase iii) di omogeneizzazione viene eseguita mediante un estrattore.
In accordo con un?altra forma di realizzazione della presente invenzione, la fase iii) ? eseguita ad una velocit? compresa tra 1000 rpm e 2000 rpm, pi? preferibilmente a 1500 rpm, per un periodo di tempo compreso tra 1 minuto e 5 minuti, pi? preferibilmente 3 minuti, in assenza di solventi.
Preferibilmente, dopo la fase iii) e prima della fase iv), viene eseguita una fase iii-bis) di omogeneizzare l?omogenato ottenuto dalla fase iii) ad una velocit? compresa tra 3500 rpm e 4000 rpm, per un periodo di tempo compreso tra 1 minuto e 5 minuti, pi? preferibilmente 3 minuti.
Preferibilmente, la fase iii-bis) di omogeneizzazione avviene in presenza di un solvente scelto tra una soluzione acquosa o una soluzione acquosa salina o acqua, pi? preferibilmente in un rapporto in peso tra l?omogenato ottenuto dalla fase iii) e solvente compreso tra 1:1 e 1:3.
Preferibilmente, la fase iv) avviene mediante centrifugazione o filtrazione.
Preferibilmente, la suddetta composizione comprende ulteriormente almeno un solvente idrofilo selezionato dal gruppo comprendente acqua e soluzioni acquose saline, oppure almeno un solvente organico selezionato dal gruppo comprendente oli, alcoli, glicerolo, acidi organici, ammidi, ammine, aldeidi e chetoni.
Preferibilmente, la composizione contiene, per una parte in peso dell?estratto idrosolubile di fico d?India, da 1 a 10 parti in peso di dell?estratto idrosolubile di oliva, pi? preferibilmente 5 parti in peso dell?estratto idrosolubile di oliva.
Preferibilmente, la composizione contiene, per una parte in peso di detto estratto secco idrosolubile di fico d?India, una parte in peso di detto estratto idrosolubile di oliva.
La presente invenzione riguarda ulteriormente una formulazione farmaceutica comprendente una composizione per l?uso come sopra descritta, e un veicolo farmaceuticamente accettabile.
La presente invenzione riguarda altres? una formulazione nutraceutica comprendente una composizione per l?uso come sopra descritta, e un veicolo accettabile dal punto di vista nutraceutico.
Vantaggiosamente, l?estratto idrosolubile di oliva (Olea europea) secondo la presente invenzione ? in grado di migliorare ed alleviare sensibilmente i danni della dermatite atopica sulla pelle, nonch? favorire il mantenimento dell?integrit? della barriera intestinale, determinando quindi un miglioramento del processo infiammatorio sistemico associato a questa patologia.
Vantaggiosamente, l?estratto idrosolubile di oliva, ricco di polifenoli, ha dimostrato un effetto benefico sul sistema intestinale, dimostrando un?importante azione antinfiammatoria e di miglioramento della permeabilit? intestinale, nonch? un effetto benefico antinfiammatorio sulle cellule della pelle.
Inoltre, vantaggiosamente, la Richiedente ha trovato che una combinazione del suddetto estratto di oliva e dell?estratto idrosolubile di fico d?India (Opuntia ficus-indica), ricco in polifenoli e in pectine, ottenuto secondo la presente invenzione, ? in grado di agire sia a livello intestinale che sulla pelle per la prevenzione e/o il trattamento dei danni causati dalla dermatite atopica.
In particolare, tale combinazione di estratti secondo la presente invenzione, ha inaspettatamente dimostrato un effetto sinergico nel rafforzamento della barriera intestinale ed epidermica, dimostrandosi particolarmente efficace nel contrastare i danni causati dalla dermatite atopica, sia in modelli intestinali che in modelli di epidermide ricostituita. Infatti, la combinazione dell?estratto idrosolubile di oliva e dell?estratto idrosolubile di fico d?India secondo la presente invenzione ? in grado di aumentare la selettivit? della barriera intestinale, evitando l?ingresso di sostanze dannose nell?organismo attraverso l?epitelio dell?intestino, e di rinforzare anche quella epidermica, garantendo una pi? efficace barriera della pelle contro agenti esterni e determinando un miglioramento del processo infiammatorio sistemico associato a questa patologia.
Vantaggiosamente, inoltre, gli estratti idrosolubili di oliva e di fico d?India sono certificati biologici, pertanto privi di potenziali residui di pesticidi; inoltre, l?assenza di metalli pesanti e altre sostanze potenzialmente tossiche nei presenti estratti viene regolarmente monitorata mediante analisi chimiche sul materiale di partenza usato per la preparazione dell?estratto e per l?allestimento della composizione.
Breve descrizione delle figure
La Figura 1A mostra un grafico a barre che riporta i risultati del saggio di citotossicit? (MTT) dell?estratto idrosolubile di oliva (EAVO) secondo la presente invenzione, testato a concentrazioni uguali o inferiori allo 0,05 % (0,5 mg/ml) su cellule epiteliali intestinali umane. Sull?asse delle ordinate ? riportato il numero di cellule vitali espresso in valore percentuale rispetto al controllo, uguale a 100 %.
La Figura 1B mostra un grafico a barre che riporta i risultati del saggio di citotossicit? (MTT) dell?estratto idrosolubile di fico d?India secondo la presente invenzione, testato a concentrazioni uguali o inferiori allo 0,05 % (0,5 mg/ml) su cellule epiteliali intestinali umane. Sull?asse delle ordinate ? riportato il numero di cellule vitali espresso in valore percentuale rispetto al controllo, uguale a 100 %.
La Figura 1C mostra un grafico a barre che riporta i risultati del saggio di citotossicit? (MTT) della combinazione degli estratti EAVO e EIO secondo la presente invenzione; in particolare, l?estratto EAVO ? stato testato alla concentrazione di 0,05 % (0,5 mg/ml), mentre l?estratto EIO ? stato testato a concentrazioni uguali o inferiori allo 0,05% di EIO (0,5 mg/ml), su cellule epiteliali intestinali umane. Sull?asse delle ordinate ? riportato il numero di cellule vitali espresso in valore percentuale rispetto al controllo, uguale a 100 %.
La Figura 2 mostra un grafico a barre che riporta i risultati del saggio di misurazione della resistenza transepiteliale (TEER) su modello di intestino infiammato con estratto di oliva (EAVO) utilizzato alla concentrazione dello 0,05% ed in presenza di LPS (20 ?g/ml). Come controllo positivo ? stato utilizzato il Budesonide alla concentrazione di 3 ?M. Sull?asse delle ordinate ? riportata la riduzione del valore della TEER.
La Figura 3 mostra un grafico a barre che riporta l?effetto dell?estratto di oliva (EAVO), testato alla concentrazione 0,05% (0,5 mg/ml) sull?espressione proteica di IKB? nel modello di intestino infiammato, sia nelle cellule epiteliali intestinali umane che nei macrofagi murini (RAW 264.7). Le cellule sono state stressate con LPS (20 ?g/ml), e come controllo positivo ? stato utilizzato il Budesonide (3 ?M). Sull?asse delle ordinate ? riportato il rapporto tra l?espressione di IKB? e la Vinculina, proteina la cui espressione risulta invariata, rispetto al valore delle cellule stressate con LPS, considerato arbitrariamente pari al 100%. La Figura 4 mostra un grafico a barre che riporta l?effetto dell?estratto di oliva (EAVO), testato alla concentrazione 0,05% (0,5 mg/ml), sulla produzione di Ossido Nitrico (NO) indotta dal trattamento con LPS (20 ?g/ml) nel modello di intestino infiammato. Il Budesonide (3 ?M) ? stato utilizzato come controllo positivo. Sull?asse delle ordinate ? riportata la produzione di NO rispetto al valore prodotto nel compartimento apicale delle cellule stressate con LPS, considerato arbitrariamente pari al 100%.
La Figura 5 mostra un grafico a barre che riporta i risultati del saggio di misurazione della resistenza transepiteliale (TEER) su modello di intestino infiammato trattato con estratto di olio (EAVO) utilizzato alla concentrazione dello 0,05%, l?estratto di fico d?India (EIO) utilizzato alla concentrazione dello 0,01%, e la combinazione degli estratti EAVO e EIO, in presenza di LPS (20 ?g/ml). Come controllo positivo ? stato utilizzato il Budesonide alla concentrazione di 3 ?M. Sull?asse delle ordinate ? riportata la riduzione del valore della TEER.
La Figura 6 mostra un grafico a barre che riporta l?effetto dell?estratto di oliva (EAVO) (0,05%), dell?estratto di fico d?India (EIO) (0,01%) e della loro combinazione (EAVO 0,05% EIO 0,01%) sull?espressione della Claudina 4 (CLDN4), proteina delle giunzioni strette (?Tight junctions?), in cellule epiteliali intestinali inserite nel modello di intestino infiammato. Le cellule sono state stressate con LPS (20 ?g/ml), e come controllo positivo ? stato utilizzato il Budesonide (3 ?M). Sull?asse delle ordinate ? riportato il rapporto tra l?espressione di CDLN4 e la Vinculina, proteina la cui espressione risulta invariata, rispetto al valore delle cellule stressate con LPS, considerato arbitrariamente pari al 100%.
La Figura 7 mostra un grafico a barre che riporta l?effetto dell?estratto di oliva (EAVO) (0,01%), dell?estratto di fico d?India (EIO) (0,002%) e della loro combinazione (EAVO 0,01% EIO 0,002%) sull?espressione genica delle citochine pro-infiammatorie (IL-1?, TNF?, IL-33 e IL-13) nei cheratinociti umani trattati per 4 ore con S. aureus inattivato. Come controllo positivo ? stato utilizzato il desametasone alla concentrazione di 10 ?M. I valori riportati nel grafico sono espressi come percentuali rispetto al campione trattato con S. aureus, stabilito arbitrariamente come 100%.
La Figura 8 mostra un grafico a barre che riporta l?effetto dell?estratto di oliva (EAVO) (0,01%), dell?estratto di fico d?India (EIO) (0,002%) e della loro combinazione (EAVO 0,01% EIO 0,002%) sull?espressione genica delle proteine della barriera epidermica (Filaggrina, Claudina 1 e Claudina 4) in cheratinociti umani trattati per 24 ore con S. aureus inattivato. I valori riportati nel grafico sono espressi come percentuali rispetto al campione trattato con S. aureus, stabilito arbitrariamente come 100%.
La Figura 9 mostra un grafico a barre che riporta i risultati del saggio di misurazione della resistenza transepiteliale (TEER) su modello di epidermide ricostituita in presenza di S. aureus inattivato e delle citochine infiammatorie, IL-13, IL-4 e TNF?. I campioni sono stati trattati con estratto di oliva (EAVO) (0,05%), estratto di fico d?India (EIO) (0,01%) e la loro combinazione (EAVO 0,05% EIO 0,01%). Il TPCK 10 ?M ? stato utilizzato come controllo positivo. Sull?asse delle ordinate ? riportata la riduzione del valore della TEER.
Descrizione dettagliata
La Richiedente ha trovato di particolare interesse per il campo farmacologico e nutraceutico una combinazione di estratti idrosolubili derivati dalla frazione idrofila delle oliva e dalla frazione idrofila delle pale (cladodi) del fico d?India, che sono risultate particolarmente attive nella prevenzione e nel trattamento della dermatite atopica.
In particolare, l?estratto idrosolubile di oliva secondo la presente invenzione, in particolare derivato dalle acque reflue di frantoio, ? in grado di ridurre la permeabilit? intestinale e i processi infiammatori scatenati dalla minore selettivit? della barriera intestinale, contrastando cos? i danni della dermatite atopica sia a livello intestinale che topico.
Infatti, sorprendentemente, l?estratto idrosolubile di oliva ? in grado di ridurre la permeabilit? intestinale in modelli di intestino infiammato, agendo sull?espressione di una delle proteine responsabile della formazione delle giunzioni strette tra le cellule, Claudina 4, nonch? di inibire l?infiammazione in modelli di intestino infiammato, agendo sulla produzione di ossido nitrico e sul pathway di NFKb.
Inoltre, la combinazione dell?estratto idrosolubile di oliva e dell?estratto idrosolubile di fico d?India secondo la presente invenzione ha inaspettatamente dimostrato un effetto sinergico nel rafforzamento della barriera intestinale in modelli di intestino infiammato, agendo ulteriormente sull?espressione della Claudina 4.
Inoltre, la combinazione dei suddetti estratti, secondo la presente invenzione, ? in grado di inibire la produzione di citochine proinfiammatorie in cheratinociti della pelle, rinforzare la coesione tra le cellule epidermiche mediante aumento della produzione di proteine ?della barriera? in cheratinociti primari umani, e ridurre la permeabilit? della barriera della pelle in modelli di epidermide ricostituita.
L?estratto idrosolubile di oliva, secondo la presente invenzione, ? ottenuto mediante il metodo descritto in WO2005123603, il cui contenuto ? qui incorporato per riferimento.
Tale metodo, in particolare, comprende la fase a) di raccogliere le acque reflue di frantoio (?olive mill wastewater?, OMW) dopo la molitura delle olive, preferibilmente dopo meno di 1-3 ore dalla generazione di tale acque reflue nel frantoio, seguita dalla fase b) di regolare il pH di OMW entro un intervallo acido, preferibilmente entro un pH compreso tra 3-4,5, ad esempio mediante l?aggiunta di acido cloridrico e acido citrico.
Successivamente, la fase c) prevede di trattare le OMW mediante idrolisi enzimatica, preferibilmente aggiungendo un complesso enzimatico di pectinasi all'OMW acidificato.
Ad esempio, tale complesso enzimatico di pectinasi pu? essere Pectinex SMASH XXL (Novo Nordisk), estratto da Aspergillus niger, ed ? preferibilmente lasciato reagire sull'OMW ad una temperatura di 30-45?C per 3-5 ore.
Conclusa l?idrolisi enzimatica, la fase d) prevede di separare la fase solida e particellare (tra cui componenti in sospensione) dalla fase liquida parzialmente chiarificata, formatesi a seguito della digestione enzimatica.
Preferibilmente tale fase d) viene eseguita mediante centrifugazione continua, ottenendo cos? un surnatante liquido parzialmente chiarificato, che viene sottoposto alla successiva fase e), e un denso deposito, che pu? essere in tutto o in parte reintrodotto nella fase c) di idrolisi enzimatica e/o che pu? essere riutilizzabile come substrato per la produzione di compost o per processi di fermentazione anaerobica.
La successiva fase e) prevede di trattare la suddetta parte liquida parzialmente chiarificata mediante microfiltrazione tangenziale (MF), ottenendo un primo retentato ed un primo permeato.
La microfiltrazione tangenziale viene preferibilmente effettuata mediante membrane ceramiche di dimensione molecolare compresa tra 0,10 e 1,4 ?m.
A seguito della suddetta fase e), ? possibile effettuare una fase e1) in cui al primo retentato ottenuto dalla suddetta fase di microfiltrazione viene aggiunta acqua, e viene poi effettuata un'ulteriore fase di microfiltrazione (diafiltrazione), ottenendo un diafiltrato.
Il liquido sottoposto alla successiva fase f) di nanofiltrazione tangenziale pu? quindi essere la somma del primo permeato e del diafiltrato ottenuto dalla fase e1).
Inoltre, il suddetto permeato ottenuto dalla fase e) e il suddetto diafiltrato ottenuto dalla fase e1) possono essere sottoposti ad una fase e2) di ultrafiltrazione tangenziale (UF), ottenendo un secondo retentato (riutilizzabile come substrato per la produzione di compost o per processi di fermentazione aerobica o anaerobica) e un secondo permeato, che viene immesso nella successiva fase f).
In particolare, la suddetta ultrafiltrazione tangenziale pu? essere effettuata mediante membrane polimeriche di dimensione molecolare compresa tra 1 e 20 kDalton, e che possono essere realizzate in uno dei seguenti materiali: polisulfone, polietersulfone poliammide o acetato di cellulosa rigenerata.
La successiva fase f) prevede di trattare mediante nanofiltrazione tangenziale (NF) il permeato ottenuto dalla fase precedente, ottenendo un terzo permeato e un terzo retentato.
La nanofiltrazione tangenziale ? preferibilmente eseguita mediante membrane polimeriche di dimensione molecolare compresa tra 150 e 250 Dalton; inoltre, tali membrane sono preferibilmente realizzate in poliammide o nylon composito.
Preferibilmente, la fase solida ottenuta dalla fase d) e il retentato ottenuto dalla fase e) sono riutilizzabili come substrato per la produzione di compost o per processi di fermentazione anaerobica, e il retentato ottenuto dalla fase f) ? riutilizzabile per l'estrazione dei composti polifenolici.
Il suddetto retentato ottenuto dalla fase f) pu? essere essiccato mediante liofilizzazione: esso costituisce l?estratto idrosolubile di oliva derivato da acque reflue di frantoio secondo la presente invenzione.
L?estratto idrosolubile di fico d?India secondo la presente invenzione ? stato ottenuto dalle pale di fico d?India secondo il seguente procedimento.
Dopo aver abbondantemente lavato le pale di fico d?India, esse sono state trattate con vapore ad alta pressione, sono state pelate per la rimozione delle spine e poi sono state trasferite in abbattitore.
Vantaggiosamente, il trattamento con vapore ad alta pressione permette di abbattere la carica microbica presente sulle pale di fico d?India senza che si renda necessario l?utilizzo di sostanze battericide, come ad esempio l?ipoclorito di sodio che risulta essere irritante per la pelle.
In particolare, il trattamento al vapore delle pale di fico d?India avviene ad una pressione fino a 4,5 bar, preferibilmente tra 3 bar e 4,5 bar, per un periodo di tempo compreso tra 5 minuti e 30 minuti, preferibilmente tra 10 minuti e 20 minuti.
Dopo essere state scongelate, secondo una prima forma di realizzazione preferita della presente invenzione, le pale sono state sottoposte ad omogenizzazione in un estrattore a freddo ottenendo cos? una parte solida dell?omogenato separato dalla parte liquida dell?omogenato.
Vantaggiosamente, l?omogeneizzazione in un estrattore a freddo permette di conservare le caratteristiche chimico-fisiche delle molecole termolabili, facilmente alterabili al calore, contenute nelle pale di fico d?India.
In particolare, tale fase di omogeneizzazione avviene ad una temperatura compresa tra 0-10?C, preferibilmente a circa 5?C, (temperatura delle pale di fico) per un periodo di tempo compreso tra 10-30 minuti.
L?omogenato liquido ottenuto dall?estrattore ? quindi liofilizzato: esso costituisce un estratto idrosolubile di fico d?India secondo la presente invenzione.
In accordo con una seconda forma di realizzazione della presente invenzione, ugualmente preferita, dopo essere state scongelate, le pale di fico sono sottoposte ad una prima fase di omogenizzazione in assenza di un solvente in un omogeneizzatore; lo scopo di tale fase ? quello di rompere grossolanamente le pale di fico d?India.
L?omogenato cos? ottenuto, costituito dalla parte liquida e dalla parte solida ottenute dalla prima omogeneizzazione, viene sottoposto ad una seconda fase di omogeneizzazione in presenza di un solvente, ad esempio una soluzione acquosa, una soluzione acquosa salina oppure acqua.
Preferibilmente, il rapporto tra omogenato di pale di fico d?India ottenuto dalla prima fase di omogeneizzazione e solvente, in peso, ? compreso tra 1:1 a 1:3.
Vantaggiosamente, tale seconda omogenizzazione avviene in presenza di un solvente come sopra citato, permettendo cos? una pi? agevole omogeneizzazione e ottenendo di conseguenza un lisato uniforme di pale di fico d?India.
Il lisato ottenuto dalla seconda omogeneizzazione ? quindi sottoposto ad una fase di centrifugazione o una fase di filtrazione, preferibilmente una fase di centrifugazione, per separare la parte solida dell?omogenato dalla parte liquida.
La fase di centrifugazione viene eseguita alle seguenti condizioni: velocit? di centrifugazione compresa tra 5000 e 7000 rpm per un intervallo di tempo compreso tra10 e 30 min.
La fase di filtrazione viene eseguita mediante l?utilizzo di filtri a porosit? variabile tra 60 e 200 micrometri per un intervallo di tempo compreso tra 10 e 30 minuti.
La parte liquida ottenuta mediante centrifugazione (ovvero il surnatante) oppure mediante filtrazione ? poi liofilizzata; essa costituisce un estratto di fico d?India secondo la presente invenzione.
Alternativamente, ? possibile utilizzare un rotoevaporatore, una camera di essiccazione o uno spray-dryer per eliminare la componente liquida.
Formano altres? oggetto dell?invenzione composizioni per uso farmaceutico e nutraceutico comprendenti almeno un estratto della presente invenzione ed eventualmente veicoli, solventi, eccipienti e/o adiuvanti accettabili da un punto di vista farmaceutico e nutraceutico.
Tali composizioni possono essere in forma di gel, creme, lozioni per applicazione cutanea, oppure in forma di compresse, capsule, sospensioni, polveri o bevande per uso orale.
Preferibilmente, il solvente ? preferibilmente un solvente idrofilo, preferibilmente scelto tra acqua e soluzioni acquose saline, oppure uno o pi? solventi organici compatibili con le formulazioni ad uso topico sulla pelle, pi? preferibilmente scelto tra alcoli, glicerolo, acidi organici, ammidi, ammine, aldeidi o chetoni, o una combinazione di uno o pi? tipi di solvente, se miscibili fra loro.
La presente invenzione si riferisce altres? all?uso farmacologico e nutraceutico delle composizioni secondo la presente invenzione per la prevenzione e il trattamento della dermatite atopica.
Queste composizioni rappresentano la materia prima che viene aggiunta ai formulati per la fabbricazione dei prodotti dermatologici, farmacologici o nutraceutici specifici per le diverse applicazioni.
Veicoli accettabili dal punto di vista nutraceutico adatti alle presenti formulazioni da assumere per via orale includono ad esempio fibre, cellulose, polisaccaridi, e lignina.
A titolo esemplificativo e non limitativo della presente invenzione, si riportano di seguito alcuni esempi relativi alla preparazione dell?estratto idrosolubile di oliva, dell?estratto idrosolubile di fico d?India, e delle loro combinazioni. Inoltre, si riportano esperimenti che dimostrano l?attivit? biologica di tali estratti, nonch? delle loro combinazioni, sul benessere della barriera epidermica e della barriera intestinale, nonch? nella riduzione dello stato infiammatorio indotto in cellule umane.
ESEMPI ESEMPIO 1 ? Esempio di estratto idrosolubile di olive ed esempio di metodo di preparazione dell?estratto idrosolubile di fico d?India.
Come esempio di estratto idrosolubile di oliva secondo la presente invenzione ? stato utilizzato l?estratto idrosolubile di oliva in forma di polvere liofilizzata fornita dal produttore PhenoFarm, e venduta con il nome commerciale di ?Phenolea <? >Active Complex?.
Esempio 1A
L?estratto idrosolubile di fico d?India secondo la presente invenzione ? stato ottenuto secondo il seguente procedimento.
1,2 kg di pale di fico d?India appena raccolte sono state lavate abbondantemente con acqua corrente per allontanare eventuali residui di terreno.
Successivamente, le pale sono state trattate con vapore ad alta pressione (fino a 4,5 bar) per circa 15 minuti, pelate per la rimozione delle spine e asciugate con fogli di carta assorbente sotto cappa a flusso laminare orizzontale. Le pale cos? pretrattate vengono successivamente pesate (circa1Kg) e trasferite in abbattitore a temperatura di -30 ?C.
Le pale vengono scongelate a 4?C per una notte e poi sottoposte ad omogenizzazione in un estrattore a freddo alle seguenti condizioni: velocit? di omogeneizzazione 4000 rpm, temperatura delle pale di fico pari a 10? C, 5 minuti per 5 volte, senza aggiunta di solventi, ottenendo cos? una parte solida dell?omogenato separato dalla parte liquida dell?omogenato.
La parte liquida dell?omogenato cos? ottenuta ? stata poi liofilizzata; la resa calcolata ? stata di 35 gr ? 10 gr di polvere per kg di pale di partenza.
Esempio 1B
Viene seguita la procedura dell?esempio 1A fino al trasferimento delle pale pretrattate in abbattitore.
Successivamente, le pale di fico d?India ancora congelate sono state sottoposte ad una prima omogenizzazione ad una velocit? di omogeneizzazione di 1500rpm per 3 minuti, a temperatura ambiente, in assenza di solvente, e poi sono state sottoposte ad una seconda omogenizzazione ad una velocit? di omogeneizzazione di 3800rpm per 3 minuti, a temperatura ambiente, con l?aggiunta di acqua, in un rapporto 1:1.
L?omogenato, cos? ottenuto, ? stato centrifugato a 6300 rpm per circa 15 minuti a 4 <o>C, per precipitare le componenti insolubili.
Il surnatante ottenuto dalla centrifugazione ? stato prelevato e liofilizzato, ottenendo un estratto idrosolubile di fico d?India secondo la presente invenzione.
Esempio 1C
Viene seguita la procedura dell?esempio 1A fino al trasferimento delle pale pretrattate in abbattitore.
Successivamente, le pale di fico d?India ancora congelate vengono sottoposte ad una prima omogenizzazione ad una velocit? di omogeneizzazione di 1500rpm per 3 minuti, a temperatura ambiente, in assenza di solvente, e poi sottoposte ad una seconda omogenizzazione alla velocit? di omogeneizzazione di 3800rpm per 3 minuti, a temperatura ambiente, con l?aggiunta di una soluzione salina (tampone fosfato salino, PBS) in un rapporto 1:1.
L?omogenato, cos? ottenuto, ? stato centrifugato a 6300 rpm per circa 15 minuti a 4 <o>C, per precipitare le componenti insolubili.
Il surnatante ottenuto dalla centrifugazione ? stato prelevato e liofilizzato, ottenendo un estratto idrosolubile di fico d?India secondo la presente invenzione.
Per ottenere un esempio di composizione secondo la presente invenzione, costituita in particolare dalla combinazione del suddetto estratto idrosolubile di olive e del suddetto estratto idrosolubile di fico d?India secondo l?Esempio 1A, in rapporto 5:1, da utilizzare nei test degli Esempi successivi, ? stato eseguito il seguente procedimento.
Ciascuno dei due suddetti estratti ? stato sciolto separatamente alla concentrazione del 10% in acqua mediante agitazione continua per 5 minuti e infine centrifugato al fine di rimuovere il residuo insolubile.
Il surnatante cos? ottenuto ? stato recuperato e utilizzato per i saggi in vitro; i due surnatanti derivati dall?estratto di oliva e dall?estratto di pale d?India suddetti vengono miscelati nel mezzo di coltura di coltura da aggiungere alle cellule da trattare al momento dell?esecuzione dei test descritti negli Esempi successivi.
ESEMPIO 2 ? Saggio di citotossicit?
Allo scopo di determinare le concentrazioni degli estratti da utilizzare per i saggi cellulari, ? stato condotto un saggio di citotossicit? per determinare l?intervallo di concentrazioni in cui gli estratti della presente invenzione risultassero non dannosi per le cellule in fase di crescita.
Questo saggio si basa sull'uso del composto MTT [3-(4,5-dimetiltiazolil)-2,5-difeniltetrazolio-bromuro], che ? basato sulla capacit? dell'enzima deidrogenasi mitocondriale delle cellule vitali di idrolizzare l'anello tetrazolico del MTT (di colore giallo chiaro) e formare cristalli di formazano (di colore blu scuro). Tali cristalli sono impermeabili alle membrane cellulari e si accumulano nel citoplasma delle cellule metabolicamente attive. Il numero di cellule vive e sane ? cos? direttamente proporzionale alla quantit? di formazano prodotto.
Cellule intestinali umane, in numero iniziale di 1,2 x 10<4 >per pozzetto, sono state fatte crescere in piastre da 96 pozzetti nel mezzo di coltura DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (Lonza), supplementato con il 10 % di siero bovino fetale, per circa 8 ore.
Dopo il trattamento con concentrazioni crescenti dei singoli estratti idrosolubili di oliva (EAVO) e di fico d?India (EIO), comprese tra 0,2 % e 0,012 % (2 mg/ml e 120 ?g/ml) per circa 48 ore, le cellule sono state lavate in PBS ed incubate con 100 ?l/pozzetto di ?tampone di reazione? contenente: 10 mM di Hepes, 1,3 di mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM di glucosio e 0,5 mg/ml di substrato colorimetrico MTT in tampone PBS a pH 7,4. Dopo 3 ore di incubazione a 37?C e con 5 % di CO2, ad ogni pozzetto sono stati aggiunti 100 ?l di soluzione solubilizzante contenente 10% di Triton X-100 e 0,1 N di HCl in isopropanolo assoluto. Dopo 12 ore, la reazione colorimetrica ? stata misurata a 595 nm con il lettore di piastre Victor3.
Come mostrato in Figura 1A e 1B, rispettivamente per EAVO e EIO, nessuno degli estratti testati risulta avere alcun effetto tossico sulle cellule a partire da 0,05% (0,5 mg/ml).
Allo scopo di verificare se i due estratti fossero dannosi per le cellule se usati in combinazione, il saggio di citotossicit? ? stato ripetuto a partire da una miscela degli estratti in cui ciascuno ? rappresentato alla sua prima dose non citotossica di 0,05% e mantenendo costante la concentrazione di EAVO e dimezzando la quantit? di EIO. Come mostrato in Figura 1C, la miscela degli estratti non risulta avere alcun effetto citotossico a nessuna concentrazione analizzata.
ESEMPIO 3 - Analisi del contenuto di polifenoli e pectine negli estratti idrosolubili di oliva e di fico d?India secondo la presente invenzione.
Per misurare il contenuto totale di polifenoli presente negli estratti idrosolubili di oliva (EAVO) di fico d?India (EIO) secondo la presente invenzione, ? stata preparata una scala di riferimento a partire da 50 ?g di acido gallico.
In una piastra da 96 pozzetti, sono state preparate diluizioni scalari in acqua degli estratti EAVO e EIO, a partire da 1000 ?g.
A ciascun campione sono aggiunti 50 ?l del reagente Folin-Denis (Sigma-Aldrich) precedentemente diluito in acqua.
La piastra ? stata lasciata per qualche minuto a temperatura ambiente, prima di procedere alla lettura del bianco con lettore di piastre Victor (Perkin-Elmer). Successivamente, sono stati aggiunti 50 ?l di una soluzione 1M Na2CO3 pH 8,9 ai campioni e la piastra ? stata lasciata per 15 minuti a temperatura ambiente, affinch? si sviluppasse il colore blu scuro. Infine, ? stata eseguita una lettura spettrofotometrica a 595 nm con lettore di piastre Victor.
Il contenuto totale di polifenoli, espresso come mg di polifenoli/g di campioni, ? stato calcolato utilizzando come riferimento la retta dell'acido gallico.
Per valutare il contenuto degli zuccheri totali presente negli estratti EAVO e EIO, ? stata preparata una curva standard di mannosio, a partire dalla concentrazione del 2%. Per ciascuno degli estratti da analizzare sono state preparate diluzioni scalari in acqua a partire dal 10% in un volume finale di 0,1 ml.
Per ogni campione sono aggiunti 33 ?l di fenolo e i campioni sono stati miscelati delicatamente. Successivamente sono stati aggiunti 400 ?l di acido solforico H2SO4 in ogni campione, e ciascuno nuovamente miscelato. Dalla soluzione cos? ottenuta sono stati prelevati 100 ?l e trasferiti in duplicato in una piastra da 96 pozzetti, fino allo sviluppo del colore rosso-arancione. La piastra ? stata misurata al lettore di piastre Victor, alla lunghezza d?onda di 490 nm. Il contenuto totale di zuccheri presente nei campioni ? stato calcolato utilizzando come riferimento la retta di mannosio.
Per valutare il contenuto di monosaccaridi e disaccaridi presente negli estratti della presente invenzione, ? stato effettuato il saggio di Benedict.
? stata preparata una curva standard di mannosio, a partire dalla concentrazione del 2%. Per ciascuno degli estratti da analizzare sono state preparate diluzioni scalari in acqua a partire dal 10%. In ogni campione sono stati aggiunti 100 ?l di reagente Benedict, la piastra ? stata sigillata e incubata per 15 minuti a 100 ?C. La piastra ? stata successivamente misurata al lettore di piastre Victor, alla lunghezza d?onda di 535 nm.
Sulla base dei saggi qui riportati, ? stata ottenuta la seguente caratterizzazione chimica:
- Estratto idrosolubile di oliva (EAVO):
1. Contenuto di polifenoli pari a 50 mg di equivalenti di acido gallico /gr di estratto;
- Estratto idrosolubile di fico d?India (EIO):
2. Contenuto di polifenoli pari a 50 mg ?10mg di equivalenti di acido gallico /gr di estratto;
3. Contenuto di zuccheri totali pari a 0.58 ? 0.1 gr/gr di estratto, che corrisponde anche al contenuto di zuccheri mono- e disaccaridi.
ESEMPIO 4 ? Saggi di permeabilit? intestinale e valutazione dell?attivit? antinfiammatoria dell?estratto idrosolubile di oliva in un modello di intestino infiammato.
Al fine di effettuare studi di integrit? della barriera epiteliale intestinale e cercare prodotti che fossero efficaci nel proteggerla e rinforzarla, sono stati allestiti modelli in vitro di intestino ?infiammato?, costituiti da co-colture di cellule epiteliali intestinali umane e cellule del sistema immunitario (macrofagi murini RAW264.7).
Il modello ? stato allestito seminando 4 x 10<4 >cellule epiteliali intestinali su un supporto permeabile (0,4 ?m membrana di poliestere, diametro dell?inserto 24 mm) di una transwell (Costar, Corning Corporeate) e lasciando differenziare le cellule per tre settimane in senso epiteliale intestinale. Al termine del periodo di differenziamento, 1.5 X 10<5 >cellule RAW264.7 sono state seminate in posizione baso-laterale ed incubate per una notte fino a completa adesione delle cellule alla superficie. Il giorno dopo, l?inserto su cui erano state differenziate le cellule intestinali, ? stato aggiunto sui pozzetti precaricati con le cellule RAW264.7, iniziando cos? la co-coltura. Al fine di indurre infiammazione, sulle cellule Raw 264.7 ? stato applicato il composto LipoPoliSaccaride (LPS alla concentrazione di 20 ?g/ml), derivato dal batterio Escherichia coli, che, infiammando, provoca danni all'integrit? delle cellule epiteliali intestinali e determina una riduzione significativa del valore di resistenza elettrica transepiteliale (TEER), misurata nel monostrato delle cellule epiteliali mediante due elettrodi collegati ad un voltmetro (Millicell-ERS (Millipore). Il valore misurato deve essere moltiplicato per l?area del filtro sul quale poggia il monostrato per ottenere il valore assoluto di TEER (espresso in x cm<2>).
Al fine di valutare l?effetto dell?estratto idrosolubile EAVO sull? integrit? della barriera, l?estratto ? stato aggiunto sia in posizione apicale che baso-laterale (alla concentrazione di 0.05%) al modello in co-coltura, ed analizzato tramite misurazione della TEER a T0 e fino a 48 ore dal trattamento.
In Figura 2 ? mostrato come l?estratto idrosolubile EAVO ? in grado di contrastare significativamente la riduzione indotta da LPS sulla barriera epiteliale intestinale, aumentando il valore TEER e suggerendo un effetto di ripristino dell'integrit? della barriera intestinale, simile al Budesonide, un farmaco gluco-corticosteroide di riferimento nelle malattie infiammatorie intestinali e utilizzato come controllo positivo.
Il mantenimento dell'integrit? della barriera epiteliale ? garantito dal complesso di proteine delle giunzioni strette (TJ, tight junctions), tra cui occludina, claudine e zonula occludens, le quali vengono tutte inibite da stress di tipo infiammatorio mediante l?attivazione della via del fattore NF-kB, diminuendo cos? l'integrit? delle TJ.
Al fine di verificare se l?estratto EAVO fosse in grado di ridurre l'attivazione della via infiammatoria di NF-kB e di proteggere quindi le TJ, ? stata analizzata la degradazione della proteina kB inibitoria, IkB-?, mediante esperimenti di Western Blot. Al termine del trattamento e dopo un lavaggio con PBS, le cellule del compartimento apicale e baso-laterale sono state lisate con un buffer di lisi contenente 1% Triton ed inibitori di proteasi e fosfatasi, le proteine risolte su SDS-PAGE ed analizzate per western-blot con l?anticorpo specifico anti-IKB-? (Monoclonal Antibody MA5-15132 Invitrogen), la cui degradazione ? indice dell?attivazione del pathway infiammatorio.
L?estratto idrosolubile EAVO, analogamente al Budesonide, ha contrastato in modo significativo la riduzione dell?espressione di IkB-? in entrambi i tipi di cellule della co-coltura, sia cellule intestinali che macrofagi, indicando un'inibizione della via infiammatoria (Figura 3).
? stata quindi esaminata la produzione di ossido nitrico (NO), uno dei principali mediatori che svolge un ruolo importante nell?attivare risposte infiammatorie.
Al termine delle 48 ore di trattamento, sono stati prelevati uguali volumi del mezzo di coltura dal compartimento apicale (cellule epiteliali intestinali) che baso-laterale (RAW 264.7) e questi sono stati successivamente analizzati attraverso il saggio per la quantizzazione dell?Ossido Nitrico secondo le indicazioni del produttore (Griess Reagent Kit, Invitrogen): il saggio permette di ridurre il nitrito in ossido di azoto grazie all?azione del reagente di Griess. L?ossido di azoto reagisce con il reagente di Griess II, producendo un prodotto che pu? essere rilevato valutando l?assorbanza a 540 nm; mediante tale saggio ? stata quindi valutata la produzione di Ossido Nitrico indotta dallo stress con LPS.
Come mostrato in Figura 4, l?estratto idrosolubile EAVO ha inibito significativamente la produzione di NO, simile al Budesonide, nel modello di co-coltura ed in entrambi i compartimenti.
ESEMPIO 5 ? Saggi di permeabilit? intestinale e riduzione dell?infiammazione degli estratti idrosolubili di oliva e fico d?India su un modello di intestino ricostruito.
Al fine di verificare un eventuale effetto di rafforzamento della barriera intestinale migliorato dell?estratto idrosolubile di oliva secondo la presente invenzione in combinazione con l?estratto di fico d?India, i due estratti ottenuti secondo l?Esempio 1 sono stati miscelati in rapporto estratto idrosolubile di oliva: estratto idrosolubile di fico d?India di 5:1.
La Figura 5 mostra che la combinazione degli estratti secondo la presente invenzione presenta un aumentato effetto di capacit? protettiva della barriera intestinale, misurato come valore TEER, indicando quindi un effetto di potenziamento dell?attivit? protettiva di tale combinazione di estratti nel modello in vitro di intestino utilizzato.
Per verificare se l?effetto protettivo sulla barriera indotto dalla combinazione degli estratti secondo la presente invenzione fosse dovuto ad un effetto sull?espressione del complesso di proteine delle giunzioni strette (TJ), ? stata valutata l?espressione di una di queste proteine, in particolare la Claudina 4 (CDLN4), mediante Western Blot su lisati proteici di cellule epiteliali nel modello di intestino infiammato a 48 ore dal trattamento con i singoli estratti e con la loro combinazione.
Come mostrato in Figura 6, i singoli estratti idrosolubili mostrano un effetto statisticamente significativo sulla barriera intestinale e sull?espressione della Claudina 4; inoltre, la combinazione degli estratti ha mostrato un potenziamento ulteriore di tale effetto, superiore agli effetti dei singoli estratti, ed anche leggermente superiore a quello prodotto dal Budesonide, considerato come controllo positivo.
ESEMPIO 6 - Saggi di protezione della barriera della pelle e permeabilit? dell?estratto idrosolubile di oliva e dell?estratto idrosolubile di fico d?India su cheratinociti primari umani e su un modello di epidermide ricostruita.
Per valutare la potenziale attivit? sulla dermatite atopica della combinazione degli estratti secondo la presente invenzione e testati sul modello di intestino infiammato, ? stata testato l?effetto della combinazione degli estratti secondo la presente invenzione sulla protezione della barriera epiteliale e permeabilit? sulle cellule della pelle.
L?agente di stress selezionato per questo test era il batterio patogeno Staphilococcus aureus, che ? stato associato allo sviluppo della dermatite in quanto presente ad un livello pi? elevato sulla pelle di pazienti affetti rispetto a persone sane.
Inoltre, la presenza di S. aureus varia a seconda delle aree della pelle nel medesimo paziente con dermatite, in particolare tra il 39% su cute non lesionata e il 70% su cute lesionata. La presenza di S. aureus stimola la produzione di citochine infiammatorie da parte dei cheratinociti, inducendo infiammazioni cutanee e, di conseguenza, danni ai tessuti.
? stato quindi indotto uno stato infiammatorio nelle colture di cheratinociti ed ? stato verificato se la produzione di citochine infiammatorie fosse inibita mediante trattamento con gli estratti idrosolubili secondo la presente invenzione, sia usati singolarmente che in combinazione.
Allo scopo di analizzare l?espressione dei geni delle citochine pro-infiammatorie IL1?, TNF-?, IL-33 e IL-13 in cheratinociti primari umani, 6,0 x 10<4 >cellule sono state seminate in piastre da 24 pozzetti. Il giorno dopo le cellule sono state trattate per 4 ore con S. aureus (precedentemente inattivato a 100 ?C per 1 ora e 30 min) e con S. aureus in presenza del singolo estratto idrosolubile di oliva (EAVO, 0,01%), del singolo estratto idrosolubile di fico d?India (EIO, 0,002%), della combinazione dell?estratto idrosolubile di oliva e dell?estratto idrosolubile di fico d?India (EAVO 0,01% EIO 0,002%), e del controllo positivo (desametasone 10 ?M). Le cellule sono state raccolte per l'estrazione dell?RNA, utilizzando il ?GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit? (Sigma, RTN10), secondo la procedura descritta dal fornitore, e processate per RT-PCR.
Gli oligonucleotidi specifici utilizzati sono i seguenti:
IL-1?_for: SEQ ID NO: 1
IL-1?_rev: SEQ ID NO: 2
TNF-?_for: SEQ ID NO: 3
TNF-?_rev: SEQ ID NO: 4
IL-13_for: SEQ ID NO: 5
IL-13_rev: SEQ ID NO: 6
IL-33_for: SEQ ID NO: 7
IL-33_rev: SEQ ID NO: 8
Come mostrato in Figura 7, l?espressione genica delle citochine pro-infiammatorie nei cheratinociti umani ? stata ridotta dal trattamento con l?estratto idrosolubile di oliva (EAVO): in particolare ? stata osservata la riduzione delle citochine, IL-1? e TNF-?, stimolate in modo significativo dall'infezione con S. aureus. Inoltre, il trattamento con l?estratto idrosolubile di oliva (EAVO) ha inibito anche l'espressione delle citochine infiammatorie IL-33 e IL-13, che fanno parte del pathway infiammatorio Th2 e che risultano essere particolarmente elevate a livello delle lesioni cutanee infiammate dei pazienti con dermatite. Questa attivit? ? stata osservata sia per l?estratto idrosolubile di oliva (EAVO) che per la combinazione dell?estratto idrosolubile di oliva e dell?estratto idrosolubile di oliva e dell?estratto idrosolubile di fico d?India (EAVO+EIO).
? altres? noto che la produzione di citochine indotta dalla colonizzazione da parte di S. aureus danneggia a sua volta i punti di coesione tra i cheratinociti nell?epidermide, a causa di una riduzione di espressione dei cosiddetti geni ?barriera?, responsabili della produzione di proteine chiave per il mantenimento dell?integrit? della barriera della pelle.
Per studiare l?effetto di protezione sull?integrit? della barriera epidermica, sono stati valutati gli effetti di S. aureus su cheratinociti umani, in presenza e in assenza degli estratti della presente invenzione.
? stata effettuata l?analisi dell?espressione genica dei cosiddetti ?geni barriera?, Filaggrina e proteine delle TJ come claudina 1 e claudina 4, responsabili della sua integrit?.
Come precedentemente descritto, 6,0 x 10<4 >cheratinociti umani primari sono stati seminati in una piastra da 24 pozzetti ed incubati per 24 ore. Successivamente, le cellule sono state trattate per 24 ore con S. aureus inattivato e in presenza del singolo estratto idrosolubile di oliva (EAVO, 0,01%), del singolo estratto idrosolubile di fico d?India (EIO, 0,002%) ed la loro combinazione (EAVO 0,01% EIO 0,002%). Le cellule sono state infine lisate e l?RNA ? stato estratto utilizzando il ?GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit?, secondo la procedura descritta dal fornitore (Sigma Aldrich), e processate per RT-PCR.
Gli oligonucleotidi specifici utilizzati sono stati i seguenti:
FLG_for: SEQ ID NO:9
FLG_rev: SEQ ID NO:10
CLDN1_for: SEQ ID NO:11
CLDN1_rev: SEQ ID NO:12
CLDN4_for: SEQ ID NO:13
CLDN4_rev: SEQ ID NO:14
La combinazione degli estratti secondo la presente invenzione ha mostrato un effetto significativo nel contrastare la riduzione di espressione dei geni barriera nei cheratinociti primani umani, quali Filaggrina, Claudina 1 e Claudina 4, ridotti significativamente in seguito all'infezione con S. aureus (Figura 8).
Infine, ? stato allestito un modello di epidermide ricostituita in cui i cheratinociti umani sono stati indotti a differenziare e successivamente esposti all?azione di S. aureus e di un cocktail di citochine pro-infiammatorie di tipo Th2, al fine di simulare gli effetti della dermatite atopica sulla pelle umana e riprodurre cos? in maniera pi? realistica possibile le alterazioni della barriera cutanea riscontrate nella pelle del paziente con dermatite.
A tale scopo, 4,0 x 10<4 >cheratinociti primari sono stati seminati su un supporto permeabile (0,4 ?m membrana di poliestere, diametro dell?inserto 24 mm) di una transwell (Costar, Corning Corporeate) in presenza di 200 ?l di mezzo EpiLife completo supplementato con calcio alla concentrazione finale di 1,5 mM; nel compartimento baso-laterale ? stato aggiunto, invece, solo il suddetto mezzo EpiLife completo supplementato con calcio (600 ?l).
Dopo due giorni, il mezzo del compartimento apicale ? stato rimosso per permettere il differenziamento dell?epidermide mediante metodo di coltura ?Air-liquid interface?, mentre nel compartimento basolaterale ? stato sostituito con 800 ?l di mezzo EpiLife completo (supplementato con calcio alla concentrazione finale di 1,5 mM) a cui ? stato aggiunto acido ascorbico (50 ?g/ml). Il mezzo ? stato sostituito ogni due giorni per i successivi 5 giorni. All?ottavo giorno sono stati aggiunti S. aureus con aggiunta di un cocktail di citochine: IL-13 100 ng, TNF? 20 ng, IL-4 100 ng, gli estratti singoli secondo la presente invenzione (EAVO 0,05%; EIO 0,01%), la loro combinazione (EAVO 0,05% EIO 0,01%), e il controllo positivo TPCK 10 ?M.
In particolare, sono stati aggiungi in un volume minimo, sulla superficie apicale dell?inserto.
Dopo 48 ore, ? stata misurata la TEER, cos? come descritto per il modello di intestino infiammato secondo l?Esempio 4, aggiungendo nel compartimento apicale 200 ?l di mezzo, e successivamente rimisurata dopo aver ri-aggiunto i singoli estratti secondo la presente invenzione e la loro combinazione per ulteriori 48 ore.
Come mostrato in Figura 9, nel modello di epidermide ricostituita, la combinazione dell?estratto idrosolubile di oliva e dell?estratto idrosolubile di fico d?India (EAVO+EIO) ha mostrato un evidente incremento del valore TEER, la cui riduzione indica un danno alla barriera epiteliale, sia dopo l'esposizione a S. aureus che al cocktail di citochine infiammatorie, effetto simile a quanto osservato dopo il trattamento con TPCK, una nota molecola ad azione antinfiammatoria.
Questi risultati suggeriscono che l?estratto idrosolubile di oliva secondo la presente invenzione ? in grado di proteggere dai danni causati dalla dermatite atopica, sia a livello dell?epitelio intestinale che a livello epidermico.
Inoltre, la sua combinazione con l?estratto idrosolubile di fico d?India secondo la presente invenzione mostra effetti antiinfiammatori significativamente potenziati, favorendo il mantenimento dell?integrit? delle barriere intestinale e cutanea, la riduzione dei processi infiammatori in particolare causati dalla dermatite atopica a carico sia del sistema intestinale e della pelle.
Claims (16)
1. Composizione comprendente quale principio attivo un estratto idrosolubile di oliva derivato da acque reflue di frantoio, per l?uso nella prevenzione e nel trattamento della dermatite atopica.
2. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 1 comprendente un ulteriore principio attivo costituito da un estratto idrosolubile di fico d?India.
3. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 2, in cui detto estratto idrosolubile di fico d?India ? ottenuto mediante un procedimento che comprende le seguenti fasi:
i) sottoporre pale di fico d?India precedentemente pulite ad un trattamento al vapore;
ii) pelare le pale di fico d?India ottenute dalla fase i); iii) omogeneizzare le pale di fico d?India pelate, ottenendo un omogenato;
iv) separare la parte solida di detto omogenato dalla parte liquida, che costituisce detto estratto idrosolubile di fico d?India.
4. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 3, in cui in detta fase i) detto trattamento al vapore avviene ad una pressione fino a 4,5 bar, preferibilmente tra 3 bar e 4,5 bar, per un periodo di tempo compreso tra 5 minuti e 30 minuti, preferibilmente tra 10 minuti e 20 minuti.
5. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 3 o 4, in cui in detta fase iii), le pale di fico d?India pelate hanno una temperatura compresa tra 0-10?C, preferibilmente di circa 5?C.
6. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 5, in cui detta fase iii) di omogeneizzazione viene eseguita ad una velocit? compresa tra 2000 rpm e 4500 rpm, preferibilmente a 4000 rpm, per un periodo di tempo compreso tra 5-30 minuti.
7. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 6, in cui detta fase iii) di omogeneizzazione viene eseguita mediante un estrattore.
8. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 5, in cui detta fase iii) ? eseguita ad una velocit? compresa tra 1000 rpm e 2000 rpm, preferibilmente a 1500 rpm, per un periodo di tempo compreso tra 1 minuto e 5 minuti, preferibilmente 3 minuti, in assenza di solventi.
9. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 8, in cui dopo detta fase iii) e prima di detta fase iv), viene eseguita una fase iiibis) di omogeneizzare l?omogenato ottenuto da detta fase iii) ad una velocit? compresa tra 3500 rpm e 4000 rpm, per un periodo di tempo compreso tra 1 minuto e 5 minuti, preferibilmente 3 minuti.
10. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 9, in cui detta fase iii-bis) di omogeneizzazione avviene in presenza di un solvente scelto tra una soluzione acquosa o una soluzione acquosa salina o acqua, preferibilmente in un rapporto in peso tra detto omogenato ottenuto da detta fase iii) e solvente compreso tra 1:1 e 1:3.
11. Composizione per l?uso secondo una qualunque delle rivendicazioni 8-10, in cui detta fase iv) avviene mediante centrifugazione o filtrazione.
12. Composizione per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 2-11, comprendente ulteriormente almeno un solvente idrofilo selezionato dal gruppo comprendente acqua e soluzioni acquose saline, oppure almeno un solvente organico selezionato dal gruppo comprendente oli, alcoli, glicerolo, acidi organici, ammidi, ammine, aldeidi e chetoni.
13. Composizione per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 2-12, contenente, per una parte in peso di detto estratto idrosolubile di fico d?India, da 1 a 10 parti in peso di detto estratto idrosolubile di oliva, preferibilmente 5 parti in peso di detto estratto idrosolubile di oliva.
14. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione 13 contenente, per una parte in peso di detto estratto secco idrosolubile di fico d?India, una parte in peso di detto estratto idrosolubile di oliva.
15. Formulazione farmaceutica comprendente una composizione per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-14, e un veicolo farmaceuticamente accettabile.
16. Formulazione nutraceutica comprendente una composizione per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-14, e un veicolo accettabile dal punto di vista nutraceutico.
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