IT202000004291A1 - Processo per la purificazione di alcaloidi indolo carbazolici - Google Patents
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Description
Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:
?PROCESSO PER LA PURIFICAZIONE DI ALCALOIDI INDOLO CARBAZOLICI?
Sfondo dell'invenzione
Staurosporina (5S,6R,7R,9R)-6-metossi-5-metil-7-metilammimo-6,7,8,9,15,16-esaidrossi-5H,14H-5,9-epossi-4b,9a,15-triazadibenzo[b,h]ciclonona[1,2,3,4-jkl]-cyclopenta[e]-as-indacen-14-one, avente formula (1), ? un alcaloide indolo carbazolico isolabile dal batterio gram-positivo Streptomyces staurosporeus, come descritto da ?mura et al. (J. Antibiot. 1977; 304:275-282).
Il composto, attivo come inibitore della protein-chinasi, ? utilizzato come intermedio nella preparazione di midostaurina (N-[(5S,6R,7R,9R)-6-metossi-5-metil-14-oxo-6,7,8,9,15,16-esaidro-5H,14H-5,9-epossi-4b,9a,15-triazadibenzo[b,h]ciclonona-[1,2,3,4-jkl]ciclopenta[e]-as-indacen-7-il]-N-metilbenzammide) (2), principio attivo indicato per il trattamento di leucemia mieloide acuta, leucemia mastocitica, mastocitosi sistemica aggressiva o associata a neoplasie ematologiche.
Considerando l?utilizzo della Staurosporina (1) nella preparazione del principio attivo (2), ? fondamentale sviluppare un metodo di isolamento che ne permetta l?ottenimento con un profilo di impurezze il pi? basso possibile.
Un metodo di isolamento prevede la purificazione della Staurosporina utilizzando un processo cromatografico, come in ?mura et al. (J. Antibiot. (1977); 30(4):275-282); questo metodo, tuttavia, si rivela dispendioso in termini di tempi e materiali quando portato su scala industriale. Una soluzione a questa problematica ? rappresentata dall?utilizzo di un processo di acido-base che porta alla precipitazione di un sale della Staurosporina (1). Il brevetto US 8,710,216 descrive, ad esempio, un processo che prevede un?iniziale salificazione della Staurosporina (1) con acido metansolfonico, rimozione delle impurezze per trattamento con carbone attivo, separazione della soluzione contente il sale metansolfonico purificato e riprecipitazione della Staurosporina (1) per trattamento con una base. Con questa procedura ? possibile ottenere un prodotto con livello di purezza superiore al 98%.
Considerato l?utilizzo della Staurosporina (1) come precursore della midostaurina (2) rimane viva la necessit? di sviluppare altre metodologie di isolamento della Staurosporina (1) con un livello di impurezze il pi? basso possibile.
Descrizione dell?invenzione
La richiedente ha sviluppato un metodo di purificazione della Staurosporina (1) che permette di mantenere la percentuale di impurezze inferiore a quella riportata nell?arte nota. E? stato infatti sorprendentemente osservato che il trattamento di una soluzione alcolica di Staurosporina (1) con un acido minerale, in particolare con acido cloridrico, non solo causa la precipitazione del relativo sale (a differenza di quanto riportato nel sopracitato brevetto US 8, 710, 216, in cui non si osserva la precipitazione del sale dell?acido metansolfonico), ma incide anche sul profilo delle impurezze presenti nella Staurosporina (1) base libera. Ancora pi? sorprendentemente, la richiedente ha osservato che, a seconda della quantit? di acido utilizzata per la precipitazione del sale, si formano sali diversi e forme polimorfe diverse.
Un primo aspetto della presente invenzione ? rappresentano dal processo di preparazione della Staurosporina (1) con ridotto contenuto di impurezze, che prevede l?iniziale trattamento di Staurosporina (1) grezza con un acido minerale a dare un sale precipitato, seguito dall?isolamento del sale precipitato, quindi dal trattamento del sale isolato con una base organica e, infine, dall?isolamento della base libera della Staurosporina (1) purificata. Con la definizione ?Staurosporina (1) grezza? o ?di partenza?, ai fini della presente invenzione si intende Staurosporina (1) commercialmente disponibile e contente una percentuale di impurezze totali media all?analisi HPLC compresa tra 1% e 2%. Preferibilmente, la purezza HPLC viene determinata secondo il metodo riportato in seguito nella sezione Metodi.
Un secondo aspetto dell?invenzione ? rappresentato dai sali della Staurosporina (1) ottenuti per trattamento con un acido minerale, in particolare con acido cloridrico, preferibilmente con acido cloridrico concentrato. Ancora pi? in particolare, il sale ottenuto per trattamento della Staurosporina (1) con acido cloridrico concentrato al 37% ? il sale bis-cloridrato di Staurosporina (3). Preferibilmente, la quantit? di acido cloridrico al 37% aggiunta ? compresa tra 3 e 7 equivalenti rispetto a Staurosporina (1) grezza.
Staurosporina bis-cloridrato (3)
Un terzo aspetto dell? invenzione ? rappresentato dai sali della Staurosporina (1) e dalle forme polimorfe del sale Staurosporina bis-cloridrato (3). In particolare, le forme polimorfe del sale bis-cloridrato di Staurosporina (3) sono la Forma A e la Forma B. L?utilizzo di queste forme polimorfe all?interno del processo oggetto del primo aspetto dell?invenzione si rivela sorprendentemente vantaggioso, poich? permette di ridurre il contenuto di alcune impurezze non eliminabili applicando metodi analoghi riportati nell?arte nota (ad esempio il sopracitato brevetto US 8,710,216).
Un quarto aspetto dell?invenzione ? rappresentato dall?utilizzo di un acido minerale in forma liquida, preferibilmente acido cloridrico al 37%, per la preparazione dei sali di Staurosporina (1); in particolare, questo processo si rivela vantaggioso, rispetto a quanto riportato da ?mura et al., poich?, soprattutto a livello industriale, la gestione di un reagente liquido risulta pi? pratica e sicura rispetto a quella di un reagente gassoso. Preferibilmente, la quantit? di acido cloridrico al 37% aggiunta ? compresa tra 1 e 10 equivalenti rispetto alla Staurosporina (1) grezza. Ancora pi? in particolare, l?utilizzo di un acido minerale in forma liquida, preferibilmente acido cloridrico al 37%, permette di ottenere oltre al sale bis-cloridrato di Staurosporina (3), anche un sale di Staurosporina mono-cloridrato (4) in forma cristallina e non in forma amorfa, come per il processo di ?mura et al.
Staurosporina mono-cloridrato (4)
Con particolare riferimento al primo aspetto dell?invenzione, una realizzazione preferita ? rappresentata dal processo 1 che prevede i seguenti passaggi:
a. aggiunta di un solvente polare protico alla Staurosporina (1), con formazione della miscela di reazione A;
b. riscaldamento della miscela di reazione A;
c. aggiunta alla miscela di reazione A di un acido minerale, con formazione della miscela di reazione B;
d. raffreddamento della miscela di reazione B;
e. isolamento del sale della Staurosporina dalla miscela di reazione B;
f. aggiunta di un solvente polare protico al sale della Staurosporina, con formazione della miscela di reazione C;
g. riscaldamento della miscela di reazione C;
h. aggiunta di una base alla miscela di reazione C, con formazione della miscela di reazione D;
i. raffreddamento della miscela di reazione D;
j. isolamento della Staurosporina (1) dalla miscela di reazione D.
In un aspetto preferito, il solvente polare protico utilizzato al passaggio a ? un alcol alifatico lineare o ramificato C1-C4, preferibilmente metanolo.
In un ulteriore aspetto preferito, al passaggio b la miscela di reazione A ? riscaldata ad una temperatura compresa tra 40?C e 120?C; preferibilmente la temperatura di riscaldamento ? pari a 65?C (temperatura di riflusso del metanolo).
In un ulteriore aspetto preferito, l?acido minerale utilizzato al passaggio c ? scelto tra acido fluoridrico, acido bromidrico, acido cloridrico, acido perclorico, acido iodidrico, acido nitrico acido, acido fosforico, acido solforico e acido borico; preferibilmente acido cloridrico al 37%.
In un ulteriore aspetto preferito della realizzazione, la quantit? di acido cloridrico al 37% alla miscela di reazione A aggiunta ? compresa tra 1 equivalente e 10 equivalenti rispetto alla Staurosporina (1).
In un ulteriore aspetto preferito, la quantit? di acido cloridrico al 37% ? compresa tra 1 e 1,5 equivalenti rispetto a Staurosporina (1).
In un ulteriore aspetto preferito; la quantit? di acido cloridrico al 37% ? compresa tra 3 e 3,5 equivalenti rispetto a Staurosporina (1).
In un ulteriore aspetto preferito, la quantit? di acido cloridrico al 37% ? compresa tra 6 e 7 equivalenti rispetto a Staurosporina (1).
In un ulteriore aspetto preferito, la miscela di reazione B ? raffreddata in un intervallo di temperatura compreso tra -10?C e 40?C, preferibilmente a 20?C.
Tipicamente, al passaggio e il sale della Staurosporina ? isolato utilizzando una delle comuni tecniche di separazione solido-liquido quali filtrazione, centrifugazione, distillazione e decantazione; preferibilmente il sale di Staurosporina ? isolato per filtrazione.
In un ulteriore aspetto, il solvente polare protico utilizzato al passaggio f ? un alcol alifatico lineare o ramificato C1-C4, preferibilmente metanolo.
In un ulteriore aspetto, al passaggio g la miscela di reazione C ? riscaldata ad una temperatura compresa tra 40?C e 120?C; preferibilmente la temperatura di riscaldamento ? pari a 65?C (temperatura di riflusso del metanolo).
In un ulteriore aspetto preferito, la base utilizzata al passaggio h ? scelta tra ammoniaca, ammine primarie, secondarie o terziarie alifatiche o aromatiche; pi? preferibilmente la base utilizzata ? la trietilammina.
In un ulteriore aspetto, la quantit? di trietilammina aggiunta alla miscela di reazione C ? compresa tra 1 equivalente e 10 equivalenti, preferibilmente trietilammina ? tra 1 e 4 equivalenti, rispetto a Staurosporina (1) di partenza.
In un ulteriore aspetto preferito, al passaggio i la miscela di reazione D ? raffreddata in un intervallo di temperatura compreso tra -10?C e 40?C; pi? preferibilmente la sospensione ? raffreddata a 25?C.
In un ulteriore aspetto preferito, al passaggio j la Staurosporina (1) purificata ? isolata utilizzando una delle comuni tecniche di separazione solido-liquido quali filtrazione, centrifugazione, distillazione e decantazione; preferibilmente la Staurosporina (1) purificata ? isolata per filtrazione.
Tipicamente, la Staurosporina (1) purificata ? isolata con un contenuto di impurezze ridotto in un intervallo compreso tra 50% - 100%, pi? preferibilmente tra 60% - 100%, rispetto alla Staurosporina (1) di partenza.
Con particolare riferimento alle forme polimorfe del sale di Staurosporina biscloridrato (3) che costituiscono il terzo aspetto della presente invenzione, una realizzazione preferita ? rappresentata dalla forma polimorfa solida A il cui lo spettro X-RPD mostra una struttura cristallina e comprende riflessioni distintive, espresse come angoli 2?? e con intensit? relativa maggiore o uguale a 5%, approssimativamente pari a: 6.8 ? 9.1 ? 13.5 ? 27.0 ? 27.7 ? 33.9 (? 0.2). Pi? in dettaglio, lo spettro X-RPD della forma A mostra una struttura cristallina e comprende riflessioni distintive, espresse come angoli 2?? e con intensit? relativa maggiore a 1%, approssimativamente pari a: 6.2 ? 6.8 ?7.0 ? 9.1 ? 13.5 ? 14.1 ? 14.8 ? 16.8 ? 18.2 ? 20.2 ? 21.1 ?21.8 ? 23.6 ?24.3 ? 26.8 ? 27.0 ?27.7 ? 28.3 ? 32.9 ? 33.9 ? 42.8 ? 48.1 (? 0.2). Ancora pi? in dettaglio, lo spettro X-RPD della forma A mostra una struttura cristallina e comprende riflessioni distintive, espresse come angoli 2??, approssimativamente pari a: 6.2 ? 6.8 ? 7.0 ? 9.1 ?11.8 ? 12.2 ? 13.5 ? 14.1 ?14.3 ? 14.8 ?15.7 ? 16.0 ?16.8 ? 18.2 ? 19.0 ? 19.7 ? 20.2 ?20.6 ? 21.1 ?21.5 ? 21.8 ? 22.3 ?23.6 ? 24.3 ? 24.9 ? 26.0 ? 26.8 ? 27.0 ?27.7 ? 28.3 ?28.7 ? 29.3 ? 29.7 ? 30.6 ? 31.1 ? 31.5 ? 32.0 ? 32.9 ? 33.9 -35.5 ? 38.8 ? 40.9 ? 41.5- 42.8 ? 48.1 (? 0.2).
Un ulteriore aspetto preferito ? rappresentato dal processo di purificazione della Staurosporina (1) che prevede l?isolamento della Staurosporina bis-cloridrato (3) forma A al passaggio e; tale processo, che comprende i passaggi a-j come per il processo 1, prevede preferibilmente l?utilizzo al passaggio c di una quantit? di acido cloridrico al 37% compresa tra 6 e 7 equivalenti, preferibilmente pari a 6.7 equivalenti, rispetto alla Staurosporina (1).
In un ulteriore aspetto preferito, la quantit? di trietilammina aggiunta alla miscela di reazione C al passaggio h ? pari a 2,1 equivalenti rispetto alla. Staurosporina (1) di partenza.
In un ulteriore aspetto preferito, la Staurosporina (1) ? isolata con un contenuto di impurezze rispetto a Staurosporina (1) di partenza ridotto in un intervallo compreso tra 50% - 100%; preferibilmente, in un aspetto ancora pi? vantaggioso, il contenuto di impurezze ? ridotto di almeno il 65%.
In un ulteriore aspetto preferito, la quantit? delle impurezze con tempo di ritenzione 0.668 (nel seguito definite anche ?Impurezze 5 e 6?) secondo il metodo HPLC applicato (descritto nella sezione metodi) ? ridotta rispetto a Staurosporina (1) grezza in un intervallo compreso tra 50 % - 100%; preferibilmente, in un aspetto ancora pi? vantaggioso, il contenuto di impurezze con tempo di ritenzione 0.668 secondo il metodo HPLC applicato ? ridotto di almeno 79%.
Sempre con riferimento alle forme polimorfe del sale dei Staurosporina bis-cloridrato, un?ulteriore realizzazione preferita ? rappresentata dalla forma solida polimorfa B il cui spettro X-RPD mostra una struttura cristallina e comprende riflessioni distintive, espresse come angoli 2?? e con intensit? relativa maggiore o uguale a 5%, approssimativamente pari a: 6.2 ? 9.2 ? 9.8 ? 11.3 ? 12.4 ? 20.1 ? 21.8 ? 25.8 (? 0.2). Pi? in dettaglio, lo spettro X-RPD della forma B mostra una struttura cristallina e comprende riflessioni distintive, espresse come angoli 2?? e con intensit? relativa maggiore a 1%, approssimativamente pari a: 6.2 ? 8.4 ? 9.2 ? 9.8 ? 10.3 ? 11.3 ? 12.4 ? 12.8 ? 14.6 ? 15.0 ? 17.2 ? 17.8 ? 18.4 ? 18.9 ? 19.7 ? 20.1 ? 20.6 ? 21.8 ? 22.3 ? 23.1 ? 24.4 ? 25.0 ? 25.8 ? 26.1 ? 27.0 ? 30.2 ? 32.1 ? 40.9 (? 0.2). Ancora pi? in dettaglio, lo spettro X-RPD della forma B mostra una struttura cristallina e comprende riflessioni distintive, espresse come angoli 2??, approssimativamente pari a 5.7 ? 6.2 ?7.6 ? 8.4 ? 9.2 ? 9.8 ? 10.3 ? 11.3 ? 12.4 ? 12.8 ? 13.8 ? 14.6 ? 15.0 ?15.8 ? 17.2 ? 17.8 ? 18.4 ? 18.9 ?19.2 ? 19.7 ? 20.1 ? 20.6 ? 21.8 ? 22.3 ? 22.8 ? 23.1 ?23.9 ? 24.4 ? 25.0 ? 25.8 ? 26.1 ? 27.0 ?28.2 ? 28.9 ? 30.2 ? 32.1 ? 33.0 ? 34.9 ? 35.9 ? 37.5 ? 38.6 ? 40.9 (? 0.2).
Un ulteriore aspetto preferito ? rappresentato dal processo di purificazione della Staurosporina (1) che prevede l?isolamento della Staurosporina bis-cloridrato (3) forma B; tale processo, che comprende i passaggi a-j come per il processo 1, prevede preferibilmente l?utilizzo al passaggio c di una quantit? di acido cloridrico al 37% compresa tra 3 e 3,5 equivalenti, preferibilmente pari a 3,1 equivalenti, rispetto alla Staurosporina (1).
In un ulteriore aspetto preferito, la quantit? di trietilammina aggiunta alla miscela di reazione C al passaggio h ? pari a 3.6 equivalenti rispetto alla Staurosporina (1) di partenza.
In un ulteriore aspetto preferito, il riscaldamento della miscela di reazione C secondo il passaggio g ? opzionale.
In un ulteriore aspetto preferito dell?invenzione, la Staurosporina (1) purificata ? isolata con un contenuto di impurezze ridotto in un intervallo compreso tra il 50% - 100% rispetto alla Staurosporina (1) di partenza; preferibilmente, il contenuto di impurezze ? ridotto di almeno il 74%.
Con particolare riferimento al quarto aspetto dell? invenzione, una realizzazione vantaggiosa ? rappresentato dalla forma solida di sale di Staurosporina mono-cloridrato (4), il cui spettro X-RPD mostra una struttura cristallina e comprende riflessioni distintive, espresse come angoli 2?? e con intensit? relativa maggiore o uguale a 5%, approssimativamente pari a: 4.9 ? 9.8 ? 14.6 ? 19.5 (? 0.2). Pi? in dettaglio, lo spettro X-RPD del sale di Staurosporina mono-cloridrato (4) mostra una struttura cristallina e comprende riflessioni distintive, espresse come angoli 2?? e con intensit? relativa maggiore a 1%, approssimativamente pari a: 4.9 ? 5.7 ? 8.0 ? 8.7 ? 9.8 ?14.6 ? 15.3 ? 16.8 ? 17.6 ? 19.5 ? 23.6 ? 24.4 ? 26.5 ? 34.4 (? 0.2). Ancora pi? in dettaglio, lo spettro X-RPD della Staurosporina mono-cloridrata (4) mostra una struttura cristallina e comprende riflessioni distintive, espresse come angoli 2??, approssimativamente pari a: 4.9 ? 6.8 ? 5.7 ? 8.0 ? 8.7 ? 9.8 ? 12.5 ? 14.6 ? 15.3 ? 16.8 ? 17.6 ? 19.5 ? 23.6 ? 24.4 ? 25.0 ? 26.5 ? 29.3 ? 34.4 ? 39.9 ? 44.7 (? 0.2).
Un ulteriore aspetto preferito della realizzazione ? rappresentato dal processo 2 di preparazione della Staurosporina mono-cloridrato (4); tale processo, che comprende i passaggi a-e come per il processo 1, prevede preferibilmente l?utilizzo al passaggio c di una quantit? di acido cloridrico al 37% compresa tra 1 e 1,5 equivalenti, preferibilmente pari a 1,1 equivalenti, rispetto alla Staurosporina (1).
Sezione Sperimentale
Il reticolo di diffrazione ? stato registrato utilizzando un diffrattometro Bruker D2-Phaser con i seguenti parametri:
Tubo anodo: Cu
Generatore di tensione (kV): 30
Generatore di corrente (mA): 10
Lunghezza d?onda ?1 and ?2 (?): 1.54056, 1.54439
Intensit? rapporto (?2/?1): 0.500
Spinner: off
Intervallo angolare (2??): 2.00 - 50.00
Step size (2??): 0.020
Tempo per step (sec): 3.0
Le analisi del contenuto di impurezze nella Staurosporina (1), nel sale della Staurosporina mono-cloridrata (4) e nella Staurosporina bis-cloridrata (3) sono state effettuate mediante HPLC con la strumentazione e le condizioni riportate sotto.
Sistema HPLC comprendente una pompa quaternaria, un compartimento con
colonna termostata e rivelatore UV-Visibile, connesso al software Empower o un
equivalente.
Colonna
Fase stazionaria: Gemini NX C 18.
Dimensione: l =150 mm; I.D. = 4.6 mm, particle size 3 ?m.
Produttore: Phenomenex; P/N: 00F-4453-E0.
Fase mobile
Solvente A: Ammonio bicarbonato 5 mM in acqua (pH portato a 10.0) e aggiunta
di 0,1 mM di EDTA
Solvente B: Acetonitrile
Gradiente lineare
tempo (min) solvente A (%) solvente B (%)
0.0 55 45
9.0 30 70
11.0 5 95
14.0 5 95
14.5 55 45
20 55 45
Condizioni di analisi
Velocit? di flusso: 0.8 ml/minuto
Rivelazione: 294 nm
Volume di iniezione: 10 ?l
Temperatura della colonna: 30?C
Temperatura dell?autocampionatore: 5?C
Tempo di corsa: 20 minuti
Esempi preparativi
Esempio 1 (secondo l'invenzione) ? Purificazione della Staurosporina (1) Preparazione della Staurosporina bis-cloridrato (3) Forma A (passaggi a-e) Staurosporina (1) (4,58 Kg, titolo HPLC 88%, 8,66 mol) ? stata aggiunta a metanolo (22,5 L); nella miscela di reazione ottenuta, portata a riflusso, ? stata gocciolata una soluzione di acido cloridrico al 37% (6,7 eq., 4,87 L, 58 mol) in metanolo (18 L). Al termine delle aggiunte ? stato possibile osservare la completa dissoluzione del solido. La miscela di reazione cos? ottenuta ? stata mantenuta sotto agitazione e a riflusso per due ore, durante le quali si ? verificata la precipitazione di un secondo solido di colore giallo senape. La sospensione ? stata portata a temperatura ambiente e dopo filtrazione sono stati ottenuti 5,5 Kg di Staurosporina bis-cloridrato (4) Forma A.
*Staurosporina bis-cloridrato (3) Forma A, per effetto della miscela eluente si dissocia dando Staurosporina (1).
La percentuale di impurezze totale, misurata secondo il metodo HPLC sopra riportato, ? portata da 1,45% a 0,4%.
Lo spettro X-RPD della forma A mostra una struttura cristallina e comprende riflessioni distintive, espresse come angoli 2??, approssimativamente pari a:
1) 6.8 ? 9.1 ? 13.5 ? 27.0 ? 33.9 (? 0.2), intensit? relativa maggiore o uguale a 5%;
2) 6.2 ? 7.0 ? 14.1 ? 14.8 ? 16.8 ? 18.2 ? 20.2 ? 21.1 ? 21.8 ? 23.6 ? 24.3 ? 26.8 ? 27.7 ? 28.3 ? 32.9 ? 42.8 ? 48.1 (? 0.2), intensit? relativa compresa tra 1% e 5%, estremi esclusi;
3) 11.8 ? 12.2 ? 14.3 ? 15.7 ? 16.0 ? 19.0 ? 19.7 ? 20.6 ? 21.5 ? 22.3 ? 24.9 ? 26.0 ? 28.7 ? 29.3 ? 29.7 ? 30.6 ? 31.1 ? 31.5 ? 32.0 ? 35.5 ? 38.8 ? 40.9 ? 41.5 (? 0.2), intensit? relativa minore o uguale a 1%.
Preparazione della Staurosporina (1) base libera (passaggi f-j)
Staurosporina bis-cloridrato (4) Forma A, ottenuta al passaggio e, ? stata aggiunta a metanolo (15 L); alla miscela di reazione ? stata aggiunta trietilammina (2,5 L, 2,1 eq., 18,2 mol) (pH >8,5), la miscela di reazione ? stata portata a riflusso ed ? stata mantenuta sotto agitazione per un?ora. La miscela di reazione ? stata raffreddata fino a temperatura ambiente e quindi filtrata. Il solido ottenuto ? stato lavato con metanolo (2 x 5 L) quindi seccato a 60?C sotto vuoto per 20 ore. Sono stati ottenuti 3,74 Kg di Staurosporina (1) base libera
La percentuale di impurezze totale, misurata secondo il metodo HPLC sopra riportato, ? portata da 0,4% a 0,14%. Considerando l?intero processo 1 (passaggi a-j), si osserva una riduzione totale delle impurezze del 65%.
E? degno di nota il fatto che la percentuale delle impurezze 5 e 6, registrate a tempo di ritenzione 0,668 applicando il metodo HPLC sopra riportato, ? portata da 0,24% a 0,05%. Questo risultato, che corrisponde ad una riduzione della quantit? delle impurezze 5 e 6 pari a 79,1%, ? sorprendete in quanto, applicando metodi analoghi riportati nell?arte nota (ad esempio il sopracitato brevetto US 8,710,216) la percentuale di tali impurezze rimane invariata, come evidenziato dall?Esempio 4 (di confronto) a seguire.
Lo spettro X-RPD della Staurosporina (1) mostra una struttura cristallina e comprende riflessioni distintive, espresse come angoli 2??, approssimativamente pari a:
1) 8.0 ? 8.5 ? 12.4 ? 12.8 ? 13.0 ? 14.7 ? 16.3 ? 16.9 ? 18.1 ? 19.1 ? 23.2 ? 24.2 (? 0.2), intensit? relativa maggiore o uguale a 5%;
2) 6.4 ? 7.7 ? 11.6 ? 17.6 ? 20.2 ? 21.0 ? 22.5 ? 24.7 ? 25.5 ? 26.1 ? 26.6 ? 28.9 ? 29.6 ? 29.8 ? 30.4 ? 31.6 ? 32.4 ? 36.5 ? 42.8 ? 45.4 (? 0.2), intensit? relativa compresa tra 1% e 5%, estremi esclusi;
3) 27.4 ? 27.9 ? 34.7 ? 37.1 ? 37.5 ? 38.5 ? 38.9 ? 40.4 ? 46.5 (? 0.2), intensit? relativa minore o uguale a 1%.
Esempio 2 (secondo l'invenzione) ? Purificazione della Staurosporina (1) Preparazione Staurosporina bis-cloridrato (3) Forma B (passaggi a-e) Staurosporina (1) (1 g, titolo HPLC 88%, 1,89 mmol) ? stata aggiunta a metanolo (5 mL); nella miscela di reazione, portata a riflusso, ? stata gocciolata una soluzione di acido cloridrico al 37% (3,1 eq. 0,49 mL, 5,9 mmol) in metanolo (1 mL). Al termine delle aggiunte ? stato possibile osservare la completa dissoluzione del solido. La miscela cos? ottenuta ? stata mantenuta sotto agitazione e a riflusso per 15 minuti, durante i quali si ? verificata la precipitazione di un solido cristallino giallo. La miscela ? stata portata a temperatura ambiente e dopo filtrazione si sono ottenuti 928 mg Staurosporina biscloridrato (3) Forma B.
La percentuale di impurezze totale, misurata secondo il metodo HPLC sopra riportato, ? portata da 1,3% a 0,5%.
*Staurosporina bis-cloridrato (3) Forma B, per effetto della miscela eluente si dissocia dando Staurosporina (1).
Lo spettro X-RPD della Forma B mostra una struttura cristallina e comprende riflessioni distintive, espresse come angoli 2??, approssimativamente pari a:
1) 6.2 ? 9.2 ? 9.8 ? 11.3 ? 12.4 ? 20.1 ? 21.8 ? 25.8 (? 0.2), intensit? relativa maggiore o uguale a 5%;
2) 8.4 ? 10.3 ? 12.8 ? 14.6 ? 15.0 ? 17.2 ? 17.8 ? 18.4 ? 18.9 ? 19.7 ? 20.6 ? 22.3 ? 23.1 ? 24.4 ? 25.0 ? 26.1 ? 27.0 ? 30.2 ? 32.1 ? 40.9 (? 0.2), intensit? relativa compresa tra 1% e 5% ,estremi esclusi;
3) 5.7 ? 7.6 ? 13.8 ? 15.8 ? 19.2 ? 22.8 ? 23.9 ? 28.2 ? 28.9 ? 33.0 ? 34.9 ? 35.9 ? 37.5 ? 38.6 (? 0.2), intensit? relativa minore o uguale a 1%.
Preparazione della Staurosporina (1) base libera (passaggi f-j)
Staurosporina bis-cloridrato (3) Forma B, ottenuta al passaggio e, ? stata aggiunta a metanolo; alla miscela di reazione ? stata aggiunta trietilammina (693 mg, 3,6 eq, 6,86 mmol). La miscela ? stata agitata per 15 minuti e quindi filtrata. Il solido ottenuto ? stato lavato con metanolo (1,5 mL) quindi seccato a 60?C sotto vuoto per 20 ore. Sono stati ottenuti 928 mg Staurosporina (1) base libera.
La percentuale di impurezze totale, misurata secondo il metodo HPLC sopra riportato, ? portata da 0,5% a 0,34%. Considerando l?intero processo 1 (passaggi a-j), si osserva una riduzione totale delle impurezze del 74%.
Esempio 3 (secondo l'invenzione) ? Purificazione della Staurosporina (1)
Preparazione della Staurosporina mono-cloridrato (4) (passaggi a-e)
Staurosporina (1) (5 g, titolo HPLC 88%, 9,44 mmol) ? stata aggiunta metanolo (20 mL); nella miscela di reazione, portata a riflusso, ? stata aggiunta goccia a goccia una soluzione di acido cloridrico al 37% (1,03 g, 1,1 eq., 10,38 mmol). Dopo 30 minuti a riflusso e sotto agitazione, la sospensione ? stata raffreddata a temperatura ambiente e filtrata.
La percentuale delle impurezze, misurata secondo il metodo HPLC sopra riportato ? 0,59%.
Lo spettro X-RPD della Staurosporina mono-cloridrato (4) mostra una struttura cristallina e comprende riflessioni distintive, espresse come angoli 2??, approssimativamente pari a:
1) 4.9 ? 9.8 ? 14.6 ? 19.5 (? 0.2), intensit? relativa maggiore o uguale a 5%;
2) 5.7 ? 8.0 ? 8.7 ? 15.3 ? 16.8 ? 17.6 ? 23.6 ? 24.4 ? 26.5 ? 34.4 (? 0.2), intensit? relativa compresa tra 1% e 5% ,estremi esclusi;
3) 6.8 ? 12.5 ? 25.0 - 29.3 ? 39.9 ? 44.7 (? 0.2), intensit? relativa minore o uguale a 1%.
Preparazione Staurosporina (1) base libera (passaggi f-j)
Staurosporina mono-cloridrato (4) ottenuta al passaggio e ? stata aggiunta a metanolo (17,5 mL); alla miscela ? stata aggiunta trietilammina (1,15 g, 1,2 eq., 11,4 mmol) (pH >8,5), poi si ? portata la miscela di reazione a riflusso ed ? stata mantenuta sotto agitazione per un?ora. La miscela di reazione ? stata raffreddata fino a temperatura ambiente e quindi filtrata. Il solido ottenuto ? stato lavato con metanolo (2 x 10 mL) quindi seccato a 60?C sotto vuoto per 20 ore. Sono stati ottenuti 3,7 g di staurosporuina (1).
Esempio 4 (di confronto) ? Purificazione della Staurosporina (1), secondo il brevetto US 8,710,216
Staurosporina (1) (5 g, titolo HPLC 88%, 9,44 mmol) ? stata sospesa in etanolo (22 mL); alla miscela di reazione, riscaldata a 70?C, ? stato aggiunto acido metansolfonico (1 g, 10,37 mmol, 1,1 eq.). Si ? osservato il completo scioglimento del solido. La miscela di reazione ottenuta, dopo l?aggiunta di carbone attivo (0,44 g) e celite (2 g), ? stata mantenuta a 70?C per un?ora. La miscela di reazione ? quindi filtrata a caldo ed il residuo solido ? lavato con etanolo (2 x 4,5 mL). Al filtrato, raffreddato a 60?C, si ? aggiunta goccia a goccia trietilammina (1,15 g, 11,31 mmol, 1,2 eq.) in etanolo (4,5 mL). La miscela ottenuta per effetto delle aggiunte ? stata mantenuta sotto agitazione a 60?C per 30 minuti, quindi raffreddata a 20?C e mantenuta sotto agitazione per ulteriori 16 ore. Dopo aver filtrato la sospensione e lavato il solido residuo con etanolo (2 x 4,5 mL), sono stati ottenuti 5,88 g di solido bagnato; per essicamento in stufa a 60?C sotto vuoto per 20h, sono stati ottenuti 4,25 g di Staurosporina (1)
Esempio 5 (di confronto) ? Purificazione della Staurosporina (1), come da ?mura et al. (J. Antibiot. (1977); 30(4):275-282)
Staurosporina (5 g, titolo HPLC 88%, 9,44 mol) ? stata sciolta in 250 mL di CHCl3, quindi HCl gassoso (generato separatamente per gocciolamento di HCl 37% in H2SO4 98%) ? stato gorgogliato nella miscela di reazione.
Durante il gorgogliamento si ? formato un solido cristallizzato bianco. Il gorgogliamento ? stato interrotto quando non c?era pi? comparsa di ulteriore cristallizzato (in totale sono stati gocciolati 2,8 g di HCl 37%, circa 3 eq.). Il solido ? stato filtrato ed essiccato in stufa a 50?C per 18 h. Si sono ottenuti 4,4 g di Staurosporina mono-cloridrato (4).
*Staurosporina mono-cloridrato (4), per effetto della miscela eluente si dissocia dando Staurosporina (1).
L?XRPD del sale cloridrato (amorfo) ? riportato in Figura 1.
Claims (13)
- RIVENDICAZIONI 1. Processo per la purificazione della Staurosporina (1), che comprende la salificazione di Staurosporina (1)per trattamento con un acido minerale a dare un sale precipitato, l?isolamento del sale di Staurosporina (1) precipitato, il trattamento del sale di Staurosporina (1) isolato con una base organica e l?isolamento di Staurosporina (1).
- 2. Processo secondo la rivendicazione 1, che comprende i seguenti passaggi: a. aggiunta di un solvente polare protico alla Staurosporina (1), con formazione della miscela di reazione A; b. riscaldamento della miscela di reazione A in un intervallo di temperatura compreso tra 40?C e 120?C; c. aggiunta alla miscela di reazione A di un acido minerale, con formazione della miscela di reazione B; d. raffreddamento della miscela di reazione B in un intervallo di temperatura compreso tra -10?C e 40?C; e. isolamento del sale della Staurosporina dalla miscela di reazione B; f. aggiunta di un solvente polare protico al sale della Staurosporina, con formazione della miscela di reazione C; g. riscaldamento della miscela di reazione C in un intervallo di temperatura compreso tra 40?C e 120?C; h. aggiunta di una base alla miscela di reazione C, con formazione della miscela di reazione D; i. raffreddamento della miscela di reazione D in un intervallo di temperatura compreso tra -10?C e 40?C; j. isolamento della Staurosporina (1) dalla miscela di reazione D.
- 3. Processo secondo la rivendicazione 2, che comprende l?utilizzo ai passaggi a e f di un alcol alifatico lineare o ramificato C1-C4.
- 4. Processo secondo la rivendicazione 2, che comprende l?utilizzo al passaggio c di un acido minerale scelto fra acido fluoridrico, acido bromidrico, acido cloridrico, acido perclorico, acido iodidrico, acido nitrico acido, acido fosforico, acido solforico e acido borico.
- 5. Processo secondo la rivendicazione 4, che comprende l?utilizzo al passaggio c di acido cloridrico al 37%.
- 6. Processo secondo la rivendicazione 5, che comprende l?utilizzo al passaggio c di acido cloridrico al 37% in una quantit? di equivalenti rispetto alla Staurosporina (1) compresa tra 1 e 10.
- 7. Processo secondo la rivendicazione 5, che comprende l?utilizzo al passaggio c di acido cloridrico al 37% in una quantit? di equivalenti rispetto alla Staurosporina (1) pari a 1,1.
- 8. Processo secondo la rivendicazione 5, che comprende l?utilizzo al passaggio c di acido cloridrico al 37% in una quantit? di equivalenti rispetto alla Staurosporina (1) pari a 3,1.
- 9. Processo secondo la rivendicazione 5, che comprende l?utilizzo al passaggio c di acido cloridrico al 37% in una quantit? di equivalenti rispetto alla Staurosporina (1) pari a 6,7.
- 10. Processo secondo la rivendicazione 2, che comprende l?utilizzo al passaggio h di una base organica scelta fra ammoniaca, ammine primarie, secondarie o terziarie alifatiche o aromatiche.
- 11. Il sale della Staurosporina bis-cloridrato (3)nella sua forma polimorfa Forma A con una struttura cristallina e spettro X-RPD che comprende riflessioni distintive, espresse come angoli 2??, approssimativamente pari a: I. 6.8 ? 9.1 ? 13.5 ? 27.0 ? 33.9 (? 0.2), intensit? relativa maggiore o uguale a 5%; II. 6.2 ? 7.0 ? 14.1 ? 14.8 ? 16.8 ? 18.2 ? 20.2 ? 21.1 ? 21.8 ? 23.6 ? 24.3 ? 26.8 ? 27.7 ? 28.3 ? 32.9 ? 42.8 ? 48.1 (? 0.2), intensit? relativa compresa tra 1% e 5% ,estremi esclusi; III. 11.8 ? 12.2 ? 14.3 ? 15.7 ? 16.0 ? 19.0 ? 19.7 ? 20.6 ? 21.5 ? 22.3 ? 24.9 ? 26.0 ? 28.7 ? 29.3 ? 29.7 ? 30.6 ? 31.1 ? 31.5 ? 32.0 ? 35.5 ? 38.8 ? 40.9 ? 41.5 (? 0.2), intensit? relativa minore o uguale a 1%.
- 12. Il sale di Staurosporina bis-cloridrato (3) nella sua forma polimorfa Forma B con una struttura cristallina e spettro X-RPD che comprende riflessioni distintive, espresse come angoli 2??, approssimativamente pari a: I. 6.2 ? 9.2 ? 9.8 ? 11.3 ? 12.4 ? 20.1 ? 21.8 ? 25.8 (? 0.2), intensit? relativa maggiore o uguale a 5%; II. 8.4 ? 10.3 ? 12.8 ? 14.6 ? 15.0 ? 17.2 ? 17.8 ? 18.4 ? 18.9 ? 19.7 ? 20.6 ? 22.3 ? 23.1 ? 24.4 ? 25.0 ? 26.1 ? 27.0 ? 30.2 ? 32.1 ? 40.9 (? 0.2), intensit? relativa compresa tra 1% e 5% , estremi esclusi; III. 5.7 ? 7.6 ? 13.8 ? 15.8 ? 19.2 ? 22.8 ? 23.9 ? 28.2 ? 28.9 ? 33.0 ? 34.9 ? 35.9 ? 37.5 ? 38.6 (? 0.2), intensit? relativa minore o uguale a 1%.
- 13. Il sale di Staurosporina mono-cloridrato (4)con una struttura cristallina e spettro X-RPD che comprende riflessioni distintive, espresse come angoli 2??, approssimativamente pari a: I. 4.9 ? 9.8 ? 14.6 ? 19.5 (? 0.2), intensit? relativa maggiore o uguale a 5%; II. 5.7 ? 8.0 ? 8.7 ? 15.3 ? 16.8 ? 17.6 ? 23.6 ? 24.4 ? 26.5 ? 34.4 (? 0.2), intensit? relativa compresa tra 1% e 5% ,estremi esclusi; III. 6.8 ? 12.5 ? 25.0 - 29.3 ? 39.9 ? 44.7 (? 0.2), intensit? relativa minore o uguale a 1%. Milano, 2 marzo 2020
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