HUT77756A

HUT77756A - Simaizom sejtburjánzás inhibitor hatású vegyületek és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények

Info

Publication number: HUT77756A
Application number: HU9800942A
Authority: HU
Inventors: Sarah Tobin Allen Novak; Richard Michael Soll
Original assignee: American Home Products Corporation
Priority date: 1994-11-07
Filing date: 1995-11-03
Publication date: 1998-07-28
Also published as: WO1996014324A1; FI971936A0; TW403758B; IL115747A; ES2136888T3; HUT77005A; FI971936A; IL115747A0; ZA959436B; ATE185143T1; DE69512528T2; JPH10508607A; DK0791005T3; GR3031682T3; KR970707140A; AU4108196A; EP0791005B1; MX9703286A; DE69512528D1; US5565432A

Description

A találmány tárgya új benzol-trisav-amidok polianionos benzil-glikozidjai. Közelebbről a találmány benzol-trisav-amidok polianionos benzil-glikozidjaira és simaizomsejt antiburjánzás inhibitorként történő alkalmazására valamint olyan gyógyszerkészítményekre vonatkozik, amelyekkel a túlzott simaizom burjánzással, pl. resztenózissal jellemezhető betegségek és állapotok kezelhetők.

A simaizom sejtburjánzás (SMC) az érelmeszesedés és a transzplantációs arterioszklerózis patogenezisében valamint az érátalakítás valamennyi formájából, pl. angioplasztikából származó sérülésekre adott reakció kritikus eseménye. (Raines E. W.; Ross R. Br. Heart J. 1993, 69 (supplement), S 30; Clowes, A. W.; Reidy, M. A. J. Vasc. Surg 1991, 13, 885; Isik, F. F.; McDonald, T. O.; Ferguson, M.; Yamanaka, E.; Gordon Am. J. Pathol. 1992, 141, 1139). Mind a mai napig nem sikerült klinikailag hatásos simaizom sejtburjánzást gátló anyagokat találni resztenózis elleni szerként történő alkalmazásra (Herrman, J. P.

Aktaszám: -85575-1212A KY/hzs

-2R.; Hermans, W. R. M.; Vos, J.; Serruys P. W. Drugs 1993, 4, 18 és 249).

A sérült terület reendotelializálása egyidejűleg a simaizom sejtburjánzással fő tényező a resztenózis gátlásánál (Casscells, W. Circulation 1992, 86, 722; Reidy, M. A.; Lidner, V. in Endothelial Cell Dysfunctions, Simionescu, N. és Simionescu M., Ed. Plenum Press, NY NY, (1992), 31). így az SMC burjánzásgátlás sikeres megközelítésének nem szabad befolyásolnia az endoteliális (belhám) sejtállapotot vagy más sejttípusok normális működését (Weissberg, P. L.; Grainger, D. J.; Shanahan C. M.; Metcalfe, J. C. Cardiovascular Rés. 1993, 27, 1191).

A glikóz-amino-glikán heparin- és heparán-szulfát az SMC burjánzás endogén inhibitorai és mégis képesek előidézni az endoteliális sejtnövekedést (Castellot, J. J. Jr.; Wright, T. C.; Karnovsky, M. J. Seminars in Thrombosis and Hemostasis 1987, 13, 489; Wight, Τ. N. Arteriosclerosis 1989, 9, 1). Azonban a heparin, heparin fragmensek, kémiailag módosított heparin és alacsony molekulatömegű heparinok és más, heparint utánzó anionos poliszacharidok teljes klinikai előnyei más farmakológiai tulajdonságok következményei lehetnek (különösen antikoagulációs hatásukból eredő túlzott vérzés) összekapcsolva különböző készítmények különbözőségével (Borman, S. Chemical and Engineering News, 1993, június 28, 27; Schmid, Κ. M.; Preisack, M.; Voelker, W.; Sujatta M.; Karsch, K. R. Seminars in Thrombosis and Hemostasis 1993, 19 (Suppl. 1), 155; Amann, F. W.; Neuenschwander, C.; Meyer, B. Seminars in Thrombosis and Hemostasis 1993, 19 (Suppl.1), 160;

Radhakrishnamurthy, B.; Sharma, C.; Bhandaru, R. R.; Berenson, G. S.; Stanzani, L.; Mastacchi, R. Atherosclerosis, 1986 60, 141; Maffrand, J. P.;Hervert, Μ. M.; Bernat, A.; Defreyn, G.; Dlevassee, D.; Savi, P.; Pinot, J. J.; Sampol, J. Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 1991, 17 (Suppl. 2), 186). Minthogy ezen szerek antikoaguláns hatása független az SMC burjánzásgátló hatásától, az lett volna várható, hogy az összetételükben homogénebb polianionos szerek, melyeknek jobban definiált a molekuláris szerkezete, kívánatosabb és kiegyensúlyozottabb profilt mutatnak kevesebb fent említett anionos poliszacharidokkal kapcsolatos mellékhatással.

A WO 92/18546 specifikus heparin szekvenciákat ír le, amelyeket tiszta formában szintézissel vagy heparin fragmens izolálással lehet előállítani, és amelyek SMC burjánzásgátló hatással rendelkeznek. A béta-ciklodextrin-tetradeka-szulfátot simaizom sejtburjánzás gátlóként és hatékony resztenózis inhibitorként írták le (Weisz, Ρ. B.; Hermann, H. C.; Joullie, M. M.; Kumor, K.; Levine, E. M.; Macarak, E. J.; Weiner, D. B. Angiogenesis: Key Principle - Science - Technology - Medicine Steiner R., Weisz, Ρ. B.; Langer, R. Eds. Birkhauser Verlag, Basel Switzerland, 1992, 107.old.; Hermann, H. C.; Okada, S.

S.; Hozakowska, E.; LeVeen, R. F.; Golden, M. A.; Tomaszewski J. E.; Weisz, Ρ. B.; Barnathan E. S. Arteriosclerosis and Thrombosis 1993, 13, 924; Reilly, C. F.; Fujita, T.; McFall, R. C:; Stabilito, I. I.; Wai-si E.; Johnson, R. G. Drug Development Research 1993, 29, 137).Az 5,019,562 számú USA szabadalmi bejelentés ciklodextrinek anionos származékait írja le a nem kívánatos sejt- vagy szövetnövekedéssel kapcsolatos patológiás

-4állapotok kezelésére. A WO 93/09790 szénhidrát-csoportonként legalább 2 anionos csoportot tartalmazó antiproliferativ polianionos ciklodextrin-származékot ír le. Az EP 312087 A2 és EP 312086 A2 szulfátéit bisz-aldonsav-amidok antikoaguláns és antitrombotikus hatását írja le.

A 4,431,636, 6,631,637, 4,431,638 és 4,435,387 számú

USA szabadalmi leírásokban poliszulfatált tio- és oxí-arilglikozid-származékokat írnak le a komplement rendszer (kiegészítő anyag) modulátoraiként.

A találmány szerinti SMC burjánzásgátló vegyületek az irodalomból ismert valamennyi vegyülettől abban különböznek, hogy az SMC burjánzásgátló vegyületek a) benzol-trisav-amidok polianionos benzil-glikozidjai, melyek szerkezetileg nem hasonlítanak a heparinra vagy szulfátéit ciklodextrinekre, b) nem tartalmaznak több mint 3 szomszédos cukormaradékot (triszacharidok) és c) meghatározott szerkezetűek.

A találmány (I) általános képletű benzol-trisav-amidok polianionos benzil-glikozidjaira és ezek felhasználására vonatkozik, ahol

R¹, R², R³ és R⁴ egymástól függetlenül hidrogénatom, SO₃M, vagy a) képletű csoport és minden oligoszacharid-csoport

1-3 cukorcsoportot tartalmaz,

M jelentése lítium, nátrium, kálium vagy ammónium, n értéke 1 vagy 2,

X jelentése halogénatom, rövidszénláncú 1-6 szénatomos alkil- vagy 1-6 szénatomos alkoxicsoport,

Y jelentése karbonil- vagy szulfonilcsoport, vagy gyógyászatilag elfogadható sója.

• ·

-5R¹ többféle előfordulásánál az (I) általános képletű molekulában azonos vagy különböző lehet. Hasonlóképpen R², R³ vagy R⁴ ha többszőr előfordul, akkor lehet azonos vagy különböző a másik R², R³ vagy R⁴ jelentésétől. Ugyanígy egy adott molekulában ha több Y fordul elő és ha több n fordul elő, akkor ezek azonosak vagy különbözők lehetnek.

A rövidszénláncú alkilcsoport egyenes vagy elágazó láncú lehet jelentése például metil-, etil-, propil-, izopropil- vagy butilcsoport. Hasonlóképpen a rövidszénláncú alkoxicsoport lehet egyenes vagy elágazó láncú és lehet például metoxi-, etoxi-, propoxi-, izopropoxi- vagy butoxicsoport.

Előnyös (I) általános képletű vegyületek azok, ahol R¹, R², R³ és R⁴ egymástól függetlenül lehet hidrogénatom,

SO₃M vagy a) képletű csoport, és minden oligoszacharid 1 vagy több cukorcsoportot tartalmaz, M jelentése lítium-, nátrium-, kálium- vagy ammóniumcsoport, n értéke 1 vagy 2,

Y jelentése karbonilcsoport, vagy gyógyászatilag elfogadható sója.

A legelőnyösebb találmány szerinti vegyületek a kővetkezők:

Benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz-{[2-metil-5-(tetra-Oszulfáto-p-glükopiranozil-oximetil)-fenil]-amid} dodeka-nátriumsó vagy gyógyászatilag elfogadható sója;

-6Benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz-{[2-metil-5-(hepta-Oszulfáto-3-cellobiozil-oximetil)-fenil]-amid} heneikoza-nátriumsó vagy gyógyászatilag elfogadható sója;

Benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz-{[2-klór-5-(hepta-Oszulfáto-p-D-maltozil-oximetil)-fenil]-amid} heneikoza-nátriumsó vagy gyógyászatilag elfogadható sója;

Benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz-{[2-klór-5-(hepta-Oszulfáto-p-D-cellobiozil-oximetil)-fenil]-amid} heneikoza nátriumsó vagy gyógyászatilag elfogadható sója;

Benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz-{[2-klór-5-(hepta-Oszulfáto-p-D-laktózil-oximetil)-fenil]-amid} heneikoza-nátriumsó vagy gyógyászatilag elfogadható sója;

Benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz-{[3,5-bisz-(tetra-O-szulfátop-D-glükozil-oximetil)-fenil]-amid} tetrakóza-nátriumsó vagy gyógyászatilag elfogadható sója;

Benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz-{[3,5-bisz-(hepta-Oszulfáto-p-D-cellobiozil-oximetil)-fenil]-amid} tetratetrakontanátriumsó vagy gyógyászatilag elfogadható sója.

A találmány szerinti vegyületeket az 1. reakcióvázlat szerint állíthatjuk elő, ahol R, n és X jelentése a fenti.

így ^e9y 1) képletű glikozil-bromidot 2) képletű benzilalkohollai kondenzálunk katalizátor, pl. higany-bromid, higanycianid, ezüst-triflát vagy ezüst-perklorát jelenlétében aprotikus oldószerben, pl. diklór-metánban, éterben, toluolban vagy nitrometánban -40°C-tól szobahőmérsékletig és így kapjuk a 3) képletű glikozidot.

A 3) képletű vegyület nitrocsoportját redukálószerrel, pl. ónkloriddal redukáljuk poláros aprotikus oldószerben, pl. etil-7acetátban szobahőmérséklettől refluxig, vagy katalitikus hidrogénezéssel katalizátor, pl. palládium/csontszén jelenlétében és így a 4) képletű anilino-származékot kapjuk.

A 4) képletű vegyületet benzol-trisav-kloriddal vagy benzoltriszulfonil-kloriddal kondenzáljuk aminbázis, pl. trietil-amin vagy diizopropil-etil-amin jelenlétében aprotikus oldószerben, pl. diklór-metánban vagy tetrahidrofuránban. A cukrokon jelenlévő bármelyik acetátcsoportot bázissal, pl. nátrium- metoxiddal hidrolizáljuk metanolban vagy vizes nátrium-hidroxid metanolos oldatában szobahőmérséklettől refluxig és néhány vagy valamennyi szabad hidroxilcsoportot a cukrokon szulfatáljuk egy reagens, pl. kén-trioxid-trimetil-amin komplex vagy kén-trioxidpiridin komplex segítségével poláris aprotikus oldószerben, pl. dimetil-formamidban vagy dimetil-szulfoxidban 0 - 100°C-os hőmérsékleten és így kapjuk a (I) általános képletű vegyületeket.

A találmány gyógyszerkészítményekre is vonatkozik, amelyek önmagukban vagy segédanyagokkal, pl. farmakológiai hatás nélküli gyógyászatilag elfogadható anyagokkal együtt egy vagy több benzol-trisav-amid polianionos benzil-glikozidjainak hatásos mennyiségét tartalmazzák. Az ilyen készítmények alkalmasak arra, hogy olyan betegségeket vagy állapotokat kezeljünk a készítményekkel, amelyeket a túlzott simaizom sejtburjánzás jellemez és amelyek gyakran az érplasztikai sebészeti vagy átültetési beavatkozások következtében alakulnak ki, ilyenek pl. a felfújással végzett angioplasztika, érátültetési sebészet, koronária, artéria, bypass műtét és szívátültetések. Más betegségek, melyeknél nem kívánatos az érburjánzás, pl. a magas vérnyomás, asztma és vértolulásos szívelégtelenség. A

-8találmány szerinti vegyületek tehát az ilyen állapotok és betegségek kezelésére használhatók.

A találmány szerinti vegyületeket szisztematikusan adagolhatjuk pl. intravénás injekcióval, rendszerint 0,1 - 10 mg /kg/óra dózisban 5-30 napig, vagy szubkután injekcióval alacsonyabb dózisban vagy orális adagolással az intravénás injekciónál nagyobb dózisban. A találmány szerinti vegyületek lokalizált szállítását el lehet érni transzmembránnal, transzdermálisan vagy más topikális adagolási móddal, megfelelő folyamatos hatóanyag felszabadulást biztosító eszköz, pl. hordozó mátrix segítségével, ahol az ilyet lehet alkalmazni. A találmány szerinti vegyületeket a szokásos segédanyagokkal szerelhetjük ki, pl. használhatunk töltőanyagot, szétesést elősegítő szert, kötőanyagot, kenőanyagot, ízesítőszert, stb. Ezeket ismert módon készíthetjük el. A találmány szerinti vegyületeket bármilyen módon és koncentrációban adagolhatjuk, amely a páciens számára hatékony. A szállítás módját és a gyógyszerdózis koncentrációját valamint a készítmény fajtáját egyénileg határozza meg az orvos vagy más gyógyászati szakember, aki a beteget kezeli.

Sejtburjánzásra gyakorolt hatások

A. Seitforrások

A találmány szerinti vegyületek azon képességét, hogy gátolják a simaizom sejtburjánzást és modulálják az endoteliális sejtnövekedést, izolált aortasejtek alkalmazásával állapítottuk meg, amelyeket kereskedelmi forrásból szereztünk be, vagy bizonyos fajtákat házilag állítottunk elő. A tanulmányban használt sejtvonalak magukba foglalják a humán- és sertésaorta simaizom sejteket és humán aorta endoteliális sejteket. A humán

-9·» · · aorta sejtvonalakat a Clonetics Corporation-től (San Diego) szereztük be.

Egy helyi vágóhídról kapott sertésaortákat a szállítás alatt jegelünk. Az aortát alaposan megtisztítjuk a zsírszövettől és steril foszfát-pufferezett fiziológiás sóoldatban 2 % antibiotikumot tartalmazó antimikotikumban öblítjük (Gibco katalógusszám: 600 - 5240 AG). A szövetet ezután 10 - 15 ml enzimelegyben digeráljuk, amely elegy 165 U/ml I. típusú kollagenázt, 15 ml III. típusú elasztázt, 2 mg/ml BSA-t, 0,375 mg/ml szójabab tripszin inhibitort tartalmaz. Ezután 37°C-on inkubáljuk 10 - 15 percig 5 %-os széndioxid alatt. Ezután a kezelés után a járulékos szervek külső felületét könnyen eltávolítjuk úgy, hogy csipesszel lehántjuk. Az aortát ezután hosszirányban elvágjuk és feltárjuk, az endoteliális réteget pedig kaparással eltávolítjuk.

A sejtek középső rétegét enzimoldattal öblítjük és egy 10 ml enzimoldatot tartalmazó új 100 mm-es edénybe helyezzük. Az aortát finom ollóval felaprítjuk és 2 - 3 óra hosszat 37°C-on 30 ml friss enzimoldattal digeráljuk. A digerálás után a szövetet tűzzel fényesített hegyű steril pasztőr pipettával vagy egy 200 1000 μΙ steril pipettavégű eppendorf pipettával homogenizáljuk. A szuszpenziót ezután 10 percig 8000 rpm mellett centrifugáljuk és a pelletet 4 - 6 ml friss táptalajban szuszpendáljuk és szellőztetett kupakkal rendelkező 4-6 100 mm-es lombikra lemeztenyésztjük. A sejteket hagyjuk összefolyásig növekedni, majd 0,25 %-os tripszinnel hasítjuk. A sejteket kiértékeljük tisztaságra és az összminőségre SMC aktin antitest alkalmazásával.

-10Β. A vegyületek sejtburjánzásra gyakorolt hatásának vizsgálata ³H timidin elegyítéssel

A sejteket korai átoltásban, általában 3-7 átoltásban vizsgáljuk összefolyó körülmények között. A tenyészeteket többüregű 16 mm-es, 24 üregű tenyészedényben növesztjük 199-es táptalajban, amelyet 10 % marha magzati szérummal és 2 % antibiotikummal ill. antimikotikummal egészítünk ki. összefolyásnál a sejteket meghatározott szérummentes táptalajba helyezzük (AIM-V; Gibco) 24 - 48 órára, mielőtt a kísérleti jegyzőkönyvet felvennénk.

Bár a vegyületeket hatékonyabbnak találtuk hosszabb preinkubációval, általában a kísérleteket úgy indítottuk, hogy hozzáadtuk a vegyületet, a ³H timidint és a szérum növekedési faktort a szérummentes szinkronizált sejtekhez és az eredményeket ennek megfelelően jegyeztük fel. A növekedési faktort és a szérum stimulációkat minden sejttípusra optimalizáltuk.

A vegyületeket minden üregbe 50-szeres hígításban adagoltuk (20 μΙ/üreg) és a lemezeket 24 - 36 óra hosszat inkubáltuk 37°C-on 5 %-os széndioxidban. Ebben a sorozatban minden vegyület vízoldékony volt és így a vegyületeket kezdetben vízben oldottuk és sorhígításnak vetettük alá a táptalajba. A vegyületeket rutinszerűen vizsgáltuk 1-100 pmol koncentrációban. Kontrollként egy II. fokozatú sertésbél nyálkahártya heparin nátriumsót használtunk (Sigma H-7005) és ezt rutinszerűen vizsgáltuk valamennyi sejtkészítményben 0,1 - 100 gg/ml koncentrációban.

A kísérlet befejezése után a lemezeket jégre helyeztük, háromszor mostuk jéghideg foszfát-pufferezett fiziológiás sóoldat-11 tál (PBS) és jéghideg 10 %-os triklór-ecetsavban inkubáltuk 30 percig, hogy a savoldékony proteineket eltávolítsuk. Az oldatot szcintillációs fiolákba helyeztük, amelyek 0,4 N-sósavat tartalmaztak (500 μΙ/fiola a nátrium-hidroxid semlegesítésére) és minden üreget kétszer öblítettünk át 500 μΙ vízzel 2 ml/fiola őssztérfogatra.

Háromszoros ismétlésben kaptuk az adatokat, mind a kontrollra, mind a kísérleti mintákra. A 100 %-os kontroll adatokat a maximálisan ingerelt sejtekből kaptuk, a növekedési faktor vagy a szérum ingerlés eredményeképpen. A kísérleti adatokat a növekedési faktorral vagy szérummal maximálisan ingerelt és a vegyülettel kezelt sejtekből kaptuk. Az adatokat a kontroll százalékában fejeztük ki, amelyből meg lehetett határozni a gátlási százalékot vagy az IC₅o értéket. A találmány szerinti vegyületek a simaizom sejtburjánzás hatékony inhibitorai, ahogy ez a I. táblázatból kitűnik. A találmány szerinti vegyületek továbbá humán simaizomsejt burjánzásgátló hatást mutatnak (HAOSMC) abban az esetben is, ahol a burjánzást vagy 10 %-os marha magzati szérum (FBS) vagy trombocitamentes növekedési faktor (PDGF, Upstate Biotechnology Inc., Laké Piacid, New Yorkból beszerzett humán rekombináns PDGF-AB) idézi elő. A 11. példa szerinti szulfátéit vegyület például az FBS által előidézett HAOSMC burjánzást gátolja (IC₅o 100 nM), valamint az 5 ng/ml PDGF által előidézett burjánzást is gátolja (IC₅₀ 1 00 nM).

C. Az endoteliális sejtnövekedésre illetve simaizom sejtburjánzásra gyakorolt hatás

Az endoteliális sejtburjánzás elősegítése a simaizom burjánzás gátlásával egyidejűleg fontos tényező az érátrendezés-12··.· ből eredő sérülésekre adott túlzott reakció gátlásánál. A találmány szerinti vegyületek fokozzák a humán endoteliális sejtnövekedést, amelyet 2 %-os FBS idéz elő a 10 %-os FBS-sel előidézett humán simaizom sejtburjánzással szemben gátló dózisokban, ahogy ezt az 1. ábra mutatja a 11. példa szerinti szulfatált vegyület esetében.

D. Citotoxicitás

Vizuálisan valamennyi sejtről azt találtuk, hogy valamennyi vegyületet nagymértékben tolerálják, azonban annak érdekében, hogy a toxicitást teljesen kizárjuk, megvizsgáltuk a vegyületek citotoxicitását az MTT (3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolium-bromid) kereskedelmi módosításával. Röviden, a sejteket ismét növesztettük 24-üregű lemezeken 70 - 80 %-os összefolyásig és mint fent, szérummentesítettük a kísérleti jegyzőkönyv felvétele előtt 24 - 48 óra hosszat. Annak érdekében, hogy az MTT kísérlettel a toxicitást vizsgáljuk és ne a burjánzást, a sejteket 100 gg/ml gyógyszerrel inkubáltuk friss táptalajban 24 óra hosszat, szérum nélkül, 37°C-on nedvesített széndioxid-inkubátorban. A vegyülettel történő kezelés után MRR (3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazólium-bromid) indikátor festéket adunk hozzá 4 óra hosszat 37°C-on. Ezután a sejteket lízáljuk és minden üregből alikvotokat helyeztünk egy 96 üregű lemezbe analízis céljából. Az 570 nm hullámhossznál mutatott abszorbanciát 630 nm referencia hullámhossz mellett ELISA lemezolvasóval regisztráltuk. Az eredményeket az életképesség %-ában határoztuk meg, miközben nem használtunk gyógyszert (100 %-os életképesség) és előszolubilizációs standardot használva (0 %-os életképesség). A 8-14. példák

-13szerinti szulfátéit vegyületek 250 pmólnál nem mutattak toxicitást.

E. Antikoaguláns hatás

A találmány szerinti vegyületek alvadásgátló hatását egy parciális tromboplasztin időkísérlettel értékeltük ki (APTT) normális humán plazmát alkalmazva, amelyet Fenichel és tsai szerint gyűjtöttünk 5 donorból (Clin. Chem. 1964, 10, 69). Egy BBL fibrométer automatikus precíziós koagulációmérő órát használtunk 0,3 ml mintánál. Egy ellagsavval aktivált parciális tromboplasztint használtunk ezekhez a kísérletekhez és ezt a reagenst hozzáadtuk a humán citrált plazmához, melyet 37°C-on egyensúlyoztunk egy vérrőgmérő órával egy műanyag üregben. 37°C-on kalciumot adtunk hozzá, a vérrőgmérő órát beindítottuk és feljegyeztük a fibrin vérrögképződési időt másodpercekben. A plazmához adott vegyületek hatását 12,5 - 200 pg/ml koncentrációtartományban meghatároztuk. Bármelyik plazmához, amelyik nem alvadt meg 240 mp után, 240 mp-es alvadási időt jegyeztünk fel. Az 1,25 - 10 pg/ml koncentrációtartományban egy nem frakcionált heparin komparátort (összehasonlító műszert) használtunk. Valamennyi koncentrációra az alvadási teszteket háromszoros ismétlésben végeztük el és randomizált (véletlenszerű) blokkszerkezetre a variancia analízisét használtuk az alvadási időkben észlelt különbségek szignifikanciájának meghatározására. A hatást feljegyeztük a heparinhoz viszonyítva, ahol az egynél nagyobb arány azt mutatja, hogy, hogy pg/ml bázisra a heparinhoz viszonyított hatás gyengébb.

• ·

-14I. Táblázat

Példa szerinti szulfátéit vegyület	Sertés simaizomsejt burjánzásgátlás IC₅₀vagy (gátlás % x koncentrációnál)	Antikoagulációs hatás (APTT) heparinhoz viszonyítva
8	247 umól	nem vizsgáltuk
9	12,7 gmól	nem jelentős hatás 25-200 pg/ml-nél
10	11,8 umól	nem vizsgáltuk
11	2,6 μηηόΙ	72
12	2,0 umól	nem vizsgáltuk
13	23-48 % 20 μιηόΙ-ηέΙ	nem vizsgáltuk
14	3,5 μηηόΙ	3,1

F. A resztenózis kísérleti modelljének hatása

0.3 -0,4 kg testsúlyú hímnemű Sprague-Dawley patkányokat, dobozonként 2 patkányt, polikarbonát ketrecekbe helyezünk, melyeket csöves tengeri alommal bélelünk ki és ellátjuk az állatokat Purina 5001 patkánytáplálékkal és vízzel (tetszés szerint, 12 óra/12 órás világosság : sötétség ciklust tartunk fenn, a világosságot reggel 7 órától számítjuk). Akklimatizálódás után a patkányokat véletlenszerűen osztjuk be kezelési csoportokba, csoportonként 12-t. A patkányokat ketaminnal, acepromazonnal és xilazinnal anesztetizáljuk. A nyak elülső részét leborotváljuk és a középső vonal mentén egy 3 cm-es bevágást végzünk, majd a tracheát kivesszük, úgy hogy gyengéden elválasztjuk az alatta levő szöveteket és az izmot. Egy sebhorgot helyezünk be, hogy az izmokat és a szöveteket egymás• ·

-15tói távoltartsa és a közös nyaki verőeret a körülvevő szövetből izoláljuk.

A jobb közös nyaki verőér 2 cm-es szakaszát felemeljük úgy, hogy egy 11 mm-es egymáshoz illesztőt helyezünk az érre a nyaki verőér belső és külső ágainak elágazódása előtti 2-7 cm-re. A közös nyaki veröér 5 mm-es szakaszát az approximátor (egymáshoz illesztő) érfogói között átlyukasztjuk az egyes érfogók szélétől számított 0,5 mm-re egy 30 G tűvel és egy enyhe izotóniás fiziológiai sóoldat áramot fecskendezünk be az izolált szakaszon keresztül, hogy kiöblítsük az esetleges vért. Ezután egy állandó légáramlást vezetünk 30-35 cm3/perc áramlási sebességgel az artérián keresztül 5 percig az ér kiszárítására. Az approximátort (egymáshoz illesztőt) először meglazítjuk, hogy a szegmensből a levegőt eltávolítsuk, majd eltávolítjuk a véráramlás helyreállítására. Enyhe nyomást gyakorolunk a nyakra, ameddig a vérzés meg nem szűnik. A nyakbevágást ezután öszszevarrással elzárjuk és az állatot az eredeti helyére visszaviszszük (kukoricaalommal kibélelt polikarbonát dobozokba).

Egy áloperációt végzünk a kontroll nyúlcsoporton, amelyben a nyaki verőeret ugyan kivettük, de levegőn szárításnak nem tettük ki.

A kísérleti gyógyszereket intravénásán adagoljuk ALZA 2 ml-es 2-ozmotikus szivattyúból 2 hétig, a levegőn szárítás előtt 2 nappal kezdődően. A patkány nyakának hátsó középvonala mentén egy 12 mm-es bevágást végzünk. A szivattyúk behelyezésére egy szubkután zsebet alakítunk ki a vágaton keresztül az állat hátának mentén és a szivattyút a zsebbe beillesztjük és a hozzákapcsolt kanült szubkután az elülső nyakhoz húzzuk,

-16ahol behelyezzük a nyaki verőérbe, amely a sérült arteriális érhez képest ellenkező oldalon helyezkedik el. A sebészetet követően 2 hét múlva a patkányokat anesztetizált kivéreztetéssel leöljük és a sérült arteriális szövetet in situ rögzítjük perfúzióval Zn²⁺formalin segítségével, majd szövettani vizsgálatra eltávolítjuk és kiértékeljük. Az arteriális szövetet 5 mikronos szakaszokra vágjuk 200 - 500 mikron intervallumonként. A keresztmetszeteket lefényképezzük és az arteriális közeget és az intimét digitálissá átalakítjuk és mérjük. Ezeket az értékeket használjuk az érbelhártya, azaz intima/közeg (l/M) arány meghatározására, és a csoportkülönbségeket ANOVA-val hasonlítjuk össze. A találmány szerinti vegyületekrői azt találtuk, hogy a resztenózis ezen kísérleti modelljében az intimális vastagodás effektív inhibitorai. így például a 11. példa szerinti szulfátéit vegyület 50 %-kal gátolta az intimális vastagodást, összehasonlítva a kezeletlen állatokkal 125 pg/ml dózisban a fent leírt eljárás szerint.

A találmány további részleteit a következő példákkal illusztráljuk.

1. Példa

1. Lépés

5-(Tetra-Q-acetil-B-glúkopiranozil-oximetiD-2-metil-1-nitrobenzol

10,3 g, 61,5 mmól 4-metil-3-nitrobenzil-alkohol, 30,3 g,

73,7 mmól acetobróm-glükóz, 13,3 g, 51, 7 mmól higany-cianid és 18,6 g, 52,0 mmól higany-bromid 150 ml nitrometános oldatát szobahőmérsékleten 20 óra hosszat keverjük. A reakcióelegyet 250 ml 2 moláros kálium-bromiddal befagyasztjuk, majd diklór-17metánban extraháljuk. A szerves fázist telített nátrium-hidrogénkarbonáttal és telített konyhasó oldattal mossuk. A szerves fázist magnézium-szulfáttal szárítjuk, bepároljuk. A kapott olajat gyorskromatográfiásan szemi-tisztítjuk. Petroléter és etil-acetát 2:1 arányú elegyével eluáljuk. Az oldószert eltávolítva összesen

16,4 g, 54 % címszerinti vegyületet kapunk színtelen szilárd anyag formájában.

¹H-NMR (CDCI₃, 300 MHz) δ 7,92 (d, 1H), 7,43 (dd, 1H),

7,33 (d, 1H), 5,06 - 5,24 (m, 3H), 4,92 (d, 1H), 4,66 ( d, 1H),

4.59 (d, 1H), 4,28 (dd, 1H), 4,18 (dd, 1H), 3,68 - 3,72 (m, 1H),

2.60 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 2,07 (s, 3H), 2,03 (s, 3H) és 2,01 ppm (s, 3H).

2. Lépés

5-(Tetra-Q-acetil-B-glűkopiranozil-oximetiD-2-metil-fenilamin

6,73 g, 13,5 mmól 5-(tetra-O-acetil-p-glükopiranoziloximetil)-2-metil-nitrobenzol, 150 ml etil-acetátos, 21,4 g, 94, 8 mmól ón-diklorid-dihidrátot tartalmazó oldatát 75°C-on 3 óra hosszat keverjük. Az elegyet lehűtjük, kb. 450 ml telített nátrium-hidrogén-karbonáttal befagyasztjuk, diklór-metánnal hígítjuk és szolka pelyhen keresztül leszűrjük. A szűrlet szerves fázisát magnézium-szulfáttal szárítjuk, bepároljuk. A kapott sárga szilárd anyagot kevés dietil-éterrel mossuk. 3,85 g, 63 % címszerinti vegyületet kapunk.

¹H-NMR (CDCI3. 300 MHz) δ 7,02 (d, 1H), 6,64 (s, 1H), 6,63 (d, 1H), 5,02 - 5,17 (m, 3H), 4,79 (d, 1H), 4,50 - 4,55 (m, 2H),

4,29 (dd, 1H), 4,17 (dd, 1H), 3,64 - 3,68 (m, 1H), 2,18 (s, 3H),

2,11 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 2,01 (s, 3H) és 2,00 ppm (s, 3H).

-182. Példa

1. Lépés

5-(Hepta-O-acetil-8-D-cel lobiozil-oxi meti 0-2-meti 1-1-nitrobenzol

A címszerinti vegyületet 47 %-os termeléssel állítjuk elő az

1. példa 1. lépésének eljárása szerint 4-metil-3-nitrobenzilalkohol és acetobróm-cellobióz alkalmazásával valamint a fagyasztás! lépésben telített nátrium-klorid használatával. Gyorskromatográfiásan tisztítjuk, etil-acetát és petrol-éter 1:2 - 1:1 2:1 arányú elegyével eluáljuk.

¹H-NMR (CDCb, 300 MHz) δ 7,91 (s, 1H), 7,40 (d, 1H), 7,32 (d, 1H), 4,80 - 5,20 (m, 6H), 4,40 - 4,80 (m, 4H), 4,36 (dd, 1H), 4,02 - 4,13 (m, 2H), 3,81 (t, 1H), 3,60 - 3,68 (m, 2H), 2,60 (s, 3H), 2,14 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 2,06 (s, 3H), 2,03 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 2,01 (s, 3H) és 1,98 ppm (s, 3H).

2. Lépés

5-(Hepta-O-acetil-B-D-cellobiozil-oximetil)-2-metil-fenilamin

A címszerinti vegyületet, amely 180 - 182°C-on olvad, 62 %-os termeléssel állítjuk elő 5-(hepta-O-acetil-3-D-cellobioziloximetil)-2-metil-1 -nitrobenzolból az 1. példa 2. lépése szerinti eljárással. Gyorskromatográfiásan tisztítjuk, etil-acetát és petrol-éter 1:1 - 2:1 arányú elegyével eluáljuk.

¹H-NMR (DMSO-de, 400 MHz) δ 6,86 (d, 1H), 6,48 (d, 1H),

6,36 (dd, 1H), 5,24 (t, 1H), 5,10 (m, 1H), 4,80 - 4,90 (m, 3H),

4,61 - 4,72 (m, 2H), 4,56 (d, 1H), 4,30 - 4,31 (m, 2H), 4,22 (dd, 1H), 4,08 (dd, 1H), 3,99 - 4,03 (m, 1H), 3,94 (dd, 1H), 3,73 3,81 (m, 2H), 4,22 (dd, 1H), 4,08 (dd, 1H), 3,99 - 4,03 (m, 1H),

-193,94 (dd, 1H), 3,73 - 3,81 (m, 2H), 2,10 (s, 3H), 2,10 (s, 3H), 2,00 (s, 3H), 1,98 (s, 3H), 1,96 (s, 3H), 1,95 (s, 3H), 1,94 (s, 3H) és 1,91 ppm (s, 1H); tömegspektrum (+FAB) m/z 778.

Analízis a Cs^eNOie képlet alapján: számított: C, 53,97; H, 6,13; N, 1,85;

talált: C, 53,67; H, 5,92; N, 1,62.

3. Példa

1. Lépés

5-(Hepta-O-acetil-8-D-cellobiozil-oximetil)-2-klör-1-nitrobenzol

A címszerinti vegyületet 45 %-os termeléssel állítjuk elő az

1. példa 1. lépése szerint, 4-klór-3-nitrobenzil-alkoholból és acetobróm-cellobiózból valamint a fagyasztás! lépésben telített nátrium-kloridból.

’H-NMR (CDCb, 300 MHz) δ 7,82 (d, 1H), 7,53 (d, 1H), 7,42 (dd, 1H), 4,8 -5,2 (m, 5H), 4,73 (d, 1H), 4,51 - 4,66 (m, 4H), 4,3 - 4,4 (m, 1H), 4,03 - 4,11 (m, 2H), 3,81 (t, 1H), 3,60 - 3,68 (m, 2H), 2,13 (s, 3H), 2,09 (s, 3H), 2,06 (s, 3H), 2,03 (s, 3H), 2,01 (s, 3H), 1,99 (s, 3H) és 1,57 ppm (s, 3H).

2. Lépés

5-(Hepta-O-acetil-B-D-cellobiozil-oximetiD-2-klór-fenil-amin

A címszerinti vegyületet 61 %-os termeléssel állítjuk elő 5(hepta-0-acetil-p-D-cellobiozil-oximetil)-2-klór-1-nitro-benzolból szilárd anyag formájában az 1. példa 2. lépése szerint, éterrel a szilárd anyagot eldörzsölve.

¹H-NMR (CDCb, 300 MHz) δ 7,20 (d, 1H), 6,75 (s, 1H), 6,60 (d, 1H), 4,89 - 5,19 (m, 5H), 4,73 (d, 1H), 4,47 -4,60 (m, 4H),

4,36 (dd, 1H), 4,02 - 4,13 (m, 2H), 3,80 (t, 1H), 3,55 - 3,67 (m, • ·

-202Η), 2,14 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 2,03 (s, 3H), 2,02 (s, 6H), 2,01 (s, 3H) és 2,00 ppm (s, 3H).

4. Példa

1. Lépés

5-(Hepta-O-acetil-B-maltozil-oximetil)-2-klőr-1-nitrobenzol

A címszerinti vegyületet 50 %-os termeléssel állítjuk elő az

1. példa 1. lépése szerint 4-klór-3-nitrobenzil-alkohol, acetobróm-maltóz és telített nátrium-klorid alkalmazásával a fagyasztás! lépésben. Gyorskromatográfiásan tisztítjuk, diklórmetán és etil-acetát 5:1 arányú elegyével eluálva a címszerinti vegyületet kapjuk: parciális ¹H-NMR (CDI₃; 300 MHz) δ 7,83 (d, 1H), 7,53 (d, 1H), 7,42 (dd, 1H), 5,42 (d, 1H), 5,36 (t, 1H), 5,06 (t, 1H), 2,15 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 2,04 (s, 3H), 2,03 (s, 3H), 2,02 (s, 3H) és 2,01 ppm (s, 3H).

2. Lépés

5-(Heota-O-acetil-B-maltozil-oximetil)-2-kl6r-fenil-amin

A címszerinti vegyületet 96 %-os termeléssel állítjuk elő 5(hepta-O-acetil-p-maltozil-oximetil)-2-klór-1 -nitrobenzolból az 1. példa 2. lépése szerinti eljárással. A nyers terméket szilárd anyagként kapjuk és további tisztítás nélkül használjuk fel.

Parciális ¹H-NMR (CDI₃; 300 MHz) δ 7,20 (d, 1H), 6,73 (d, 1H), 6,60 (dd, 1H), 5,41 (d, 1H), 5,30 - 5,39 (m, 2H), 5,23 (t, 1H), 5,05 (t, 1H), 4,83 - 4,89 (m, 2H), 4,74 (d, 1H), 2,16 (s, 3H),

2,11 (s, 3H), 2,032 (s, 3H), 2,027 (s, 3H) és 2,00 ppm (s, 6H).

5. Példa

1. Lépés

5-(Hepta-O-acetil-B-laktozil-oximetil)-2-klór-1-nitrobenzol

-21 A címszerinti vegyületet 51 %-os termeléssel állítjuk elő az 1. példa 1. lépése szerint 4-klór-3-nitrobenzil-alkohol és acetobróm-laktóz alkalmazásával valamint telített nátriumkloriddal a fagyasztás! lépésben. A tisztítást először gyorskromatográfiásan végezzük, diklór-metán és etil-acetát 4:1 arányú elegyével eluálva, majd újra re-flash rekromatografáljuk, diklórmetán és etil-acetát 9:1 arányú elegyével eluálva a címszerinti vegyületet szilárd anyagként kapjuk.

Parciális ¹H-NMR (CDI₃; 300 MHz) δ 7,82 (d, 1H), 7,53 (d, 1H), 7,42 (dd, 1H), 5,35 (d, 1H), 5,21 (s, 1H), 4,87 (d, 1H), 4,66 (d, 1H), 2,15 (s, 3H), 2,13 (s, 3H), 2,06 (s, 6H), 2,05 8s, 6H) és

1,97 ppm (s, 3H).

2. Lépés

5-(Hepta-O-acetil-B-laktozil-oximetil)-2-klór-fenil-amin

A címszerinti vegyületet 94 %-os termeléssel kapjuk az 1. példa 2. lépésének 1. eljárásával 5-(hepta-O-acetil-B-laktoziloximetil)-2-klór-1-nitrobenzolból. A nyers terméket szilárd anyagként kapjuk és további tisztítás nélkül használjuk fel.

Parciális ’H-NMR (CDI₃; 300 MHz) δ 7,19 ( d, 1H), 6,72 (d, 1H), 6,59 (dd, 1H), 5,35 (d, 1H), 5,08 - 5,20 (m, 2H), 4,73 (d, 1H), 2,15 (s, 3H), 2,14 (s, 3H), 2,06 (s, 3H), 2,05 (s, 3H), 2,02 (s, 3H) és 1,97 ppm (s, 3H).

6. Példa

1. Lépés

3.5-Bisz-(hepta-O-acetil-B-D-cellobiozil-oximetil)-1nitrobenzol

A címszerinti vegyületet 42 %-os termeléssel állítjuk elő az

1. példa 1. lépése szerint 1 ekvivalens 5-nitro-m-xil£n-a,a’• ·

-22diolból, 2 ekvivalens acetobróm-cellobiózból és 2 ekvivalens valamennyi egyéb reagensből, pl. telített nátrium-kloridból a fagyasztás'» lépésben. A tisztítást először gyorskromatográfiásan végezzük, etil-acetát és diklór-metán 3:1 arányú elegyével eluálva, majd éterrel eldörzsölve.

¹H-NMR (CDCb, 300 MHz) δ 8,10 (s, 2H), 7,48 (s, 1H), 4,88

- 5,30 (m, 12H), 4,68 (d, 2H), 4,52 - 4,59 (m, 6H), 4,38 (dd, 2H), 4,0 - 4,13 (m, 4H), 3,82 (t, 2H), 3,58 - 3,68 (m, 4H), 2,13 (s, 6H), 2,08 (s, 6H), 2,07 (s, 6H), 2,03 (s, 12H), 2,01 (s, 6H) és

1,98 ppm (s, 6H).

2. Lépés

3.5- Bisz-(hepta-O-acetil-B-D-ceHobiozil-oximetil)-fenil-amin

A címszerinti vegyületet 54 %-os termeléssel állítjuk elő az

1. példa 2. lépésével 3,5-bisz-(p-D-cellobiozil-oximetil)-1nitrobenzol alkalmazásával. A tisztítás etil-acetát és petrol-éter 1:1 arányú elegyével végezzük.

¹H-NMR (CDCb, 300 MHz) δ 6,73 (s, 2H), 6,67 (s, 1H), 5,03

- 5,30 (m, 6H), 4,97 (d, 2H), 4,91 (d, 2H), 4,75 (d, 2H), 4,49 4,61 (6H), 4,37 (dd, 2H), 4,02 - 4,13 (m, 6H), 3,81 (t, 2H), 3,57 3,69 (m, 4H), 2,15 (s, 6H), 2,08 (s, 6H), 2,03 (s, 6H), 2,01 (s, 18H) és 1,98 ppm (s, 6H).

7c Példa

1c Lépés

3.5- Bisz-(tetra-O-acetil-B-D-glükozil-oximetil)-1 -nitrobenzol

A címszerinti vegyületet az 1. példa 1. lépése szerint állítjuk elő 1 ekvivalens 5-nitro-m-xilol-a,a'-diolból, 2 ekvivalens acetobróm-glűkózból és 2 ekvivalens valamennyi egyéb reagensből, valamint telített nátrium-kloridból a fagyasztást lépés-23• · · • ·· » · · »·· ·· ben. Gyorskromatográfiásan tisztítjuk, etil-acetát és diklórmetán 1:4 - 1:2 arányú elegyóvel eluálva a közel tiszta címszerinti vegyületet 29 %-os termeléssel kapjuk, amelyet további tisztítás nélkül használunk fel.

2. Lépés

3.5-Bisz-(tetra-O-acetil-B-D-qlükozil-oximetiD-fenil-amin

A címszerinti vegyületet az 1. példa 2. lépése szerint állítjuk elő 5,29 g 3,5-bisz-(tetra-O-acetil-3-D-glükozil-oximetil)-1nitrobenzolból. Gyorskromatográfiásan tisztítjuk, diklór-metán és etil-acetát 3:2 arányú elegyével eluálva 2,0 g 39 % címszerinti vegyületet kapunk sárga olaj formájában.

Parciális ¹H-NMR (CDCb, 300 MHz) δ 6,56 (s, 3H), 5,0 - 5,2 (m, 6H), 4,8 (d, 2H), 4,4 - 4,6 (m, 4H), 3,7 ppm (széles d, 2H).

8. Példa

1. Lépés

Benzol-1.3.5-trikarbonsav-trisz-fí2-metil-5-(B-glükopiranozil-oximetil)-fenil1-amid)

1,51 g, 3,22 mmól 5-(tetra-O-acetil-p-glükopiranoziloximetil)-2-metil-fenil-amin és 3,22 mmól trietil-amin 35 ml tetrahidrofurános oldatához 285 mg, 1,01 mmól benzol-1,3,5trikarbonsav-kloridot adunk. A reakcióelegyet 4 óra hosszat keverjük, metanollal befagyasztjuk, diklór-metánnal hígítjuk, vízzel mossuk. A szerves fázist magnézium-szulfáttal szárítjuk, bepároljuk. A kapott olajat gyorskromatografálással tisztítjuk. Diklórmetán és etil-acetát 1:1 arányú elegyével eluálva 1,7 g, 70 % nyers terméket kapunk. 983 mg, 0,631 mmól nyersanyag 25 ml metanolos oldatához 9,47 ml, 9,47 mmól 1N-nátrium-hidroxidot adunk. 50°C-on 3 óra hosszat keverjük, majd a reakcióelegyet

-247,58 ml, 7,58 mmól In-sósavval befagyasztjuk és a terméket szűréssel izoláljuk. Vákuumban szárítjuk, 700 mg 100 % nyers, címszerinti vegyületet kapunk. A szilárd anyagot vízben szuszpendáljuk, így a további sókat eltávolítjuk. Tiszta címszerinti vegyületet kapunk, amely 200°C felett olvad.

’H-NMR (DMSO-d_e, 400 MHz) δ 10,3 (s, 3H), 8,73 (s, 3H),

7,37 (s, 3H), 7,28 (d, 3H), 7,23 (d, 3H), 5,10 (bs, 3H), 4,84 (d, 3H), 4,57 (d, 3H), 4,25 (d, 3H), 3,69 (dd, 3H), 3,44 - 3,49 (m, 3H), 3,0 - 3,2 (m, 6H) és 2,28 ppm (s, 9H);

¹³C-NMR (DMSO-d_ei 100 MHz) δ 164,6, 136,1, 135,3, 133,0,

130,3, 129,8, 126,0, 125,7, 102,1, 77,0, 76,8, 73,6, 70,2, 69,2,

61,2 és 17,8 ppm; tömegspektrum (-FAB) m/e 1052,3, 890,3; IR (KBr) 1650 cm*¹.

Analízis a C51H63N3O21 képlet alapján: számított: C, 54,40; H, 6,35; N, 3,73;

talált: C, 54,44; H, 6,15; N, 3,68.

2. Lépés

Benzol-1.3.5-trikarbonsav-trisz-(f2-metil-5-(tetra-Oszulfato-B-glükopiranozil-oximetin-fenill-amidy-dodekanátriumsó

761 mg, 0,748 mmól benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz-{[2metil-5-(p-glükopiranozil-oximetil)-fenil]-amid} és 6,24 g, 44,9 mmól kén-trioxid 30 ml dimetil-formamidos oldatát 70°C-on 4 napig keverjük. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten vízzel befagyasztjuk, bepároljuk. Sephadex G-10 oszlopon kromatográfiásan tisztítjuk, vízzel eluáljuk, majd erősen savas nátrium formájú Dowex 50 X 8 gyantával töltött oszlopon ioncserélésnek ····

-25vetjük alá és 825 mg, 48 % címszerinti vegyületet kapunk színtelen szilárd anyag formájában, amely 200°C felett olvad.

’H-NMR (D₂O, 400 MHz) δ 8,73 (s, 3H), 7,46 - 7,51 (bm, 9H), 4,97 - 5,00 (m, 6H), 4,87 (d, 3H), 4,76 (t, 3H), 4,47 - 4,53 (m, 6H), 4,22 - 4,27 (m, 3H), 4,15 - 4,19 (m, 3H) és 2,37 ppm (s, 9H);

¹³C-NMR (D₂O; 100 MHz) δ 168,3, 135,3, 135,2, 135,0,

134,3, 131,1, 130,0, 128,1, 127,0, 99,1, 76,2, 75,9, 73,4, 72,6,

70,7, 67,8 és 16,8 ppm; tőmegspektrum (elektrospray) (m zNa)/z 736,5 (m-3Na)³', 546,2 (m-4Na)⁴' és 433,4 (m-5Na)⁵·.

Analízis a C₅iH₅iN3O₅iSi₂-1 2H₂O képlet alapján: számított: C, 24,55; H, 3,01; N, 1,68; S, 15,40;

talált: C, 24,29; H, 2,78; N, 2,69; S, 15,84.

9. Példa

1. Lépés

Benzol-1.3.5-trikarbonsav-trisz-fí2-metil-5-(B-cellobioziloximetiD-fenill-amid)

1,49 g, 1,97 mmól 5-(tetra-O-acetil-3-cellobiozil-oximetil)-2metil-fenil-amin és 217 μΙ 1, 97 mmól trietil-amin 35 ml tetrahidrofurános oldatához 174 mg, 0,66 mmól benzol-1,3,5trikarbonsav-kloridot adunk. A reakcióelegyet 4 óra hosszat keverjük, metanollal befagyasztjuk, diklór-metánnal hígítjuk és vízzel mossuk. A szerves fázist magnézium-szulfát felett szárítjuk, bepároljuk. A kapott olajat éterrel eldörzsölve tisztítjuk. 873 mg, 55 % fehéres színű szilárd anyagot kapunk. A nyersanyag 25 ml metanollal készített oldatához 9,1 ml, 9,1 mmól 1Nnátrium-hidroxidot adunk. 50°C-on 3 óra hosszat keverjük, majd a reakcióelegyet 7,64 ml, 7,64 mmól 1N-sósavval befagyasztjuk

·«··

-26és a terméket szűrve izoláljuk. Vákuumszárítás után 408 mg, 80 % címszerinti vegyületet kapunk, amely 200°C felett olvad.

Parciális ¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 10,33 (s, 3H), 8,75 (s, 3H), 7,36 (s, 3H), 7,27 (d, 3H), 7,23 (d, 3H), 5,2 - 5,3 (br, 6), 5,00 (br, 6H), 4,84 (d, 3H), 4,70 (s, 3H), 4,56 - 4,64 (m, 9H),

4.33 (d, 3H), 4,26 (d, 3H), 3,77 (dd, 3H), 3,64 - 3,70 (m, 6H) és

2,27 ppm (s, 9H); ¹³C-NMR (DMSO-d_e, 100 MHz) δ 164,5, 136,0, 135,9, 135,1, 133,0, 130,2, 129,8, 125,9, 125,6, 103,2, 101,8, 80,5, 76,8, 76,4, 75,0, 74,9, 73,3, 73,2, 70,0, 69,4, 61,0, 60,4 és 17,8 ppm; tömegspektrum ((-)-FAB) 1539,2 (m).

2. Lépés

Benzol-1.3.5-trikarbonsav-trisz-ff2-metil-5-(hepta-Oszulfato-B-cellobiozil-oximetiD-fenill-amidl-heneikózanátriumsó

279 mg, 149 mmól benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz-{[2-metil5-(P-cellobiozil-oximetil)-fenil]-amid} és 3,19 g, kén-trioxidtrimetil-amin komplex 30 ml dimetil-formamidos oldatát 70°C-on 4 napig keverjük. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten vízzel befagyasztjuk és vákuumban bepároljuk. A maradékot Sephadex G-10 oszlopon kromatográfiásan tisztítjuk, vízzel eluáljuk. Kationcserét hajtunk végre Dowex 50 x 8 erősen savas nátriumformájú gyantaoszlop alkalmazásával és 357 mg címszerinti vegyületet kapunk cserszínű szilárd anyag formájában, amely 200°C felett olvad.

Parciális ’H-NMR (D₂O, 400 MHz) δ 8,70 (s, 3H), 7,44 -7,52 (m, 9H), 4,99 (d, 3H), 4,97 (d, 3H), 4,86 (d, 3H), 4,83 (d, 3H), 4,68 (d, 3H), 4,64 (d, 3H), 4,58 (dd, 3H), 4,01 - 4,04 (m, 6H) és

2.34 ppm (s, 9H);

*» ·*·«

¹³C-NMR (D₂0, 100 MHz) δ 168,17, 135,4, 135,0, 134,9,

134,2, 131,0, 129,9, 127,9, 126,7, 99,9, 99,2, 77,6, 77,34, 77,31, 77,02, 74,3, 73,6, 73,4, 73,0, 70,6 , 67,6, 66,5 és 16,7 ppm; tömegspektrum (elektrospray) (m - z Na)/z 897,8 (m - 4 Na)^4-, 713,2 (m - 5 na)⁵* és 590,8 (m - 6 Na)®'.

Analízis a CeeH₇2N₃Na2iO₉«S2r18H₂O képlet alapján: számított: C, 20,67; H, 2,70; N, 1,05; S, 16,78; talált: C, 20,35; H, 2,78; N, 1,00; S, 14,19.

10. Példa

1. Lépés

Benzol-1.3.5-trikarbonsav-trisz-(f5-(hepta-O-acetil-B-Dmaltozil-oximetil)-2-klór-fenin-amid)

962 mg, 1,24 mmol 5-(hepta-O-acetil-B-maltozil-oximetil)-2klór-fenil-amin 20 ml, 173 μΙ, 1,24 mmól trietil-amint tartalmazó tetrahidrofurános oldatához hozzáadunk 110 mg, 0,413 mmól benzol-1,3,5-trikarbonsav-kloridot. A reakcióelegyet 90 percig keverjük, metanollal befagyasztjuk, diklór-metánnal hígítjuk és vízzel mossuk. A szerves fázist magnézium-szulfáttal szárítjuk, bepároljuk. Világossárga szilárd anyagot kapunk, melyet gyorskromatográfiásan tisztítunk, diklór-metán és etil-acetát 2:1 - 1:1 arányú elegyével eluálva 607 mg, 59 % címszerinti vegyületet kapunk színtelen szilárd anyag formájában, amely bomlás közben 132°C-on olvad.

Parciális ’H-NMR (CDCI₃, 400 MHz) δ 8,66 (s, 3H), 8,65 (s, 3H), 8,48 (d, 3H), 7,42 (d, 3H), 7,08(dd, 3H), 5,40 (d, 3H), 5,33 (t, 3H), 5,23 (t, 3H), 5,03 (t, 3H), 4, 82 - 4,93 (m, 9H), 4,66 (d, 3H), 4,62 (d, 3H), 4,53 (dd, 3H), 3,67 - 3,70 (m, 3H), 2,14 (s, 3H), 2,10 (s, 3H), 2,04 (s, 3H), 2,01 (s, 3H), 1,99 (s, 3H), 1,995

-28(s, 3H), 1,986 (s, 3H) és 1,97 ppm (s, 3H). ¹³C-NMR (CDCI₃; 100 MHz) δ 170,5, 170,2, 169,9, 169,7, 169,4, 162,9, 137,0, 136,1,

134,1, 129,2, 128,9, 124,2, 123,1, 121,1, 99,1, 95,5, 75,4, 72,6,

72,2, 72,0, 70,1, 70,0, 69,3, 68,5, 68,0, 62,8, 61,5, 20,9, 20,7,

20,6 és 20,5 ppm; tömegspektrum (pozitív (Ca²*) elektrospray) 1262 (m + Ca²*)/2.

Analízis a CioeH_12eCI₃N₃057 · H₂0 képlet alapján: számított: C, 51,83; H, 5,16; N, 1,68;

talált: C, 51,64; H, 5,11; N, 1,53.

2. Lépés

Benzol-1,3.5-trikarbonsav-trisz(f2-klór-5-(B-D-maltozil-oximetiD-fenill-amid)

983 mg, 0,194 mmól benzol-1,3,5-tirkabonsav-trisz{[5(hepta-O-acetil-3-D-maltozil-oximetil)-2-klró-fenil]-amid} 15 ml metanollal készített oldatához 4,67 ml, 4,67 mmól 1N-nátriumhidroxidot adagolunk. 50°Con 4 óra hosszat keverjük, majd az elegyet befagyasztjuk 4,08 ml, 4,08 mmól 1N-sósavval és a terméket leszűrve izoláljuk. Vákuumban szárítva 309 míg, 99 % címszerinti vegyületet kapunk, amely 200°C felett olvad.

Parciális ¹H-NMR (DMSO-d_e, 400 MHz) δ 10,56 (s, 3H), 8,78 (s, 3H), 7,60 (d, 3H), 7,56 (d, 3H), 7,37 (dd, 3H), 5,02 (d, 3H), 4,89 (d, 3H) és 4,63 ppm (d, 3H); 13C-NMR (DMSO-d_e; 100 MHz) δ 164,57, 237,83, 234,73, 234,61, 130,13, 129,36, 128,67, 127,53, 126,85, 102,12, 100,75, 79,54, 76,37, 75,28, 73,45, 73,24, 73,02, 72,42, 69,87, 68,72, 60,76 és 60,64 ppm; tömegspektrum ((-)- FAB) m/z 1598,4 (Μ - H), 1436,3 és 1274,3.

Analízis a CeeH₈4CI₃N3O3e · 9H₂O képlet alapján: számított: C, 44,94; H, 5,83; N, 2,38;

····

-29talált: C, 44,48; H, 5,46; N, 2,78.

3. Lépés

Benzol-1.3.5-trikarbonsav-trisz-U2-klór-5-(hepta-Q-szulfato-B-D-maltozil-oximetil)-fenil1-amid)-heneikőza-nátriumsó

208 mg, 130 mmól benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz-{[2-klór5-(3-D-maltozil-oximetil)-fenil]-amid} és 1,90 g kéntrioxidtrimetil-amin komplex 20 ml dimetil-formamidos oldatát 70°C-on

2,5 napig keverjük, majd a reakcióelegyet szobahőmérsékleten vízzel befagyasztjuk és vákuumban bepároljuk. A maradékot Sephadex G-10 oszlopon kromatográfiásan tisztítjuk, vízzel eluáljuk. Kationcserét hajtunk végre Dowex 50 x 8 erősen savas nátrium formájú, gyantával töltött oszlopon, 400 mg, 82 % címszerinti vegyületet kapunk cserszínű szilárd anyag formájában, amely bomlás közben 178°C felett olvad.

Parciális ¹H-NMR (D2O, 400 MHz) δ 8,74 (s, 3H), 7,67 7,70 (m, 6H), 7,57 (d, 3H), 5,62 (d, 3H), 5,09 (d, 3H), 5,04 (d, 3H), 4,66 (t, 3H), 4,61 (dd, 3H) és 4,52 ppm (t, 3H); ¹³C-NMR (D2O; 100 MHz) δ 168,1, 136,9, 134,7, 132,9, 130,3, 130,1,

129,7, 128,6, 127,6, 98,8, 94,1, 77,4, 76,0, 74,8, 73,4, 73,2,

72,3, 71,8, 69,9, 69,7, 67,6 és 66,1 ppm; tömegspektrum (elektrospray) (m - z Na)/z 1225,0 (m - 3 Na)³', 912,8 (m - 4 Na)⁴', 725,6 (m - 5 Na)⁵' és 601 (m - 6 Na)⁶'.

Analízis a CeeHesCIsNsNa^OggS^ · 4 Na₂SO< · 21 H₂O képlet alapján:

számított: C, 16,90; H, 2,25; N, 0,90; S, 1709; talált: C, 16,77; H, 2,29; N, 0,97; S, 16,90.

····

-3011. Példa

1. Lépés

Benzol-1,3.5-trikarbonsav-trisz(f5-(hepta-O-acetil-B-D-cellobiozil-oximetil)-2-klőr-fenil1-amid1

1,43 g, 1,85 mmól 5-(hepta-O-acetil-p-cellobiozil-oximetil)2-klór-fenil-amin 254 μΙ, 1,85 mmól trietil-amint tartalmazó 25 m, tetrahidrofurános oldatához 163 mg, 0,615 mmól benzol1,3,5-trikarbonsav-kloridot adunk. A reakcióelegyet 90 percig keverjük, metanollal befagyasztjuk, diklór-metánnal hígítjuk és vízzel mossuk. A szerves fázist magnézium-szulfáttal szárítjuk, bepároljuk. A fehéres színű szilárd anyagot gyorskromatográfiásan tisztítjuk. Diklór-metán és etil-acetát 1:1 arányú elegyével eluálva 937 mg, 62 % terméket kapunk. Fehér kristály formájában analitikai mintát kapunk egy külön párlatból, amely 200°C felett olvad.

¹³C-NMR (DCCb; 100 MHz) δ 170,5, 170,4, 170,2, 169,8,

169.6, 169,3, 169,0, 163,0, 137,0, 136,1, 134,0, 129,2, 128,9,

124.7, 123,2, 121,2, 100,75, 99,4, 76,37, 72,90, 72,80, 72,47,

71,93, 71,59, 71,46, 70,1, 67,8, 61,8, 61,5, 20,87, 20,66, 20,60 és 20,50 ppm; tömegspektrum (pozitív (Ca²⁺) elektrospray) (m + Ca/72 1262.

Analízis a C108H126CI3N3O57 · 2H₂O képlet alapján: számított: C, 51,46; H, 5,20; N, 1,67;

talált: C, 51,44; H, 4,88; N, 1,71.

2. Lépés

Benzol-1,3,5-trikarbonsav-triszf f2-klór-5-(B-D-cel lobiozil-oximetiD-feniH-amid)

-31 917 mg, 0,375 mmól benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz{[5(hepta-O-acetil-3-D-cellobiozil-oximetil)-2-klór-fenilg-amid} 25 ml metanolos oldatát 9,0 ml, 9,0 mmól 1-N-nátrium-hidroxiddal kezeljük. 3 óra hosszat 50°C-on keverjük, majd az elegyet szobahőmérsékleten 7,9 ml, 7,9 mmól 1-N sósavval befagyasztjuk és 10 percig keverjük. A szilárd anyagot összegyűjtjük, vákuumban szárítjuk, 579, mg, 96 % címszerinti vegyületet kapunk színtelen szilárd anyag formájában, amely 200°C felett olvad.

¹H-NMR (DMSO-de, 400 MHz) δ 10,57 (S, 3H), 8,78 (s, 3H),

7,58 (s, 3H), 7,55 (d, 3H), 7,36 (d, 3H), 7,36 (s, 3H), 4,87 (d, 3H), 4,34 (d, 3H), 4,25 (d, 3H), 3,77 (d, 3H) és 3,68 ppm (d, 3H); 13C-NMR (DMSO-d6; 100 MHz) δ 164,6, 137,9, 134,7,

134,6, 130,2, 129,4, 128,7, 127,5, 126,9, 103,2, 102,0, 80,5, 76,8, 76,5, 75,0, 73,3, 73,2, 70,0, 68,8, 61,0 és 60,4 ppm; IR (KBr) 1655 cm._t; tömegspektrum (+FAB) m/z 1622,2 (M + Na).

Analízis a CeeH_e4Cl3N₃O₃6 - 5 H₂O képlet alapján: számított: C, 46,86; H, 5,60; N, 2,48;

talált: C, 46,84; H, 5,46; N, 2,37.

3. Lépés

Benzol-1.3.5-trikarbonsav-triszf2-kl6r-5-(hepta-O-szulfo-BD-cellobiozil-oximetiD-fenill-amidj-heneizóza-nátriumsó

403 mg, 0,252 mmól benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz{[2-klór5-(p-D-cellobiozil-oximetil)-fenil]-amid} és 3,89 g, 28 mmól kéntrioxid-trimetil-amin komplex 25 ml dimetil-formamidos oldatát 70°C-on 5 napig keverjük. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten vízzel befagyasztjuk és vákuumban bepároljuk. A maradékot Sephadex G-10 kromatográfiával tisztítjuk, vízzel eluáljuk. Kationcserét hajtunk Dowex 50 x 8 erősen savas nátrium forrná-32• « • ·· • · jú, gyantával töltött oszlopon. 949 mg címszerinti vegyületet kapunk cserszínű szilárd anyag formájában, amely bomlás közben 178°C-on olvad.

parciális ¹H-NMR (D2O, 400 MHz) δ 8,73 (s, 3H), 7,70 (s, 3H), 7,67 (d, 3H), 7,57 ( d, 3H), 4,99 - 5,03 (m, 6H), 4,68 (t, 3H), 4,64 (t, 3H), 4,60 (dd, 3H), 4,24 (d, 3H), 4,20 (t, 3H) és 4,02 - 4,05 ppm (m, 3H); ¹³C-NMR (D2O; 100 MHz) δ 168,1, 139,0, 134,7, 132,8, 130,3, 130,0, 129,6, 128,5, 127,4, 99,9,

99,4, 77,5, 77,4, 77,3, 77,0, 74,3, 73,7, 73,3, 73,1, 70,1, 67,6 és 66,6 ppm.

Analízis a CeeHesChNaNa^Oee · 33 H₂O képlet alapján: számított: C, 18,28; H, 2,93; N, 0,97; S, 15,53;

talált: C, 18,20; N, 2,67; N, 0,76; S, 15,51.

A kapilláris elektroforézis 98 %-os feleslegben mutatja a tisztaságot.

12. Példa

1. Lépés

Benzol-1.3.5-trikarbonsav-trisz(í2-klór-5-fB-D-laktoziloximetiD-fenil-amid)

993 mg, 1,28 mmól 5-(hepta-0-acetil-3-laktozil-oximetil)-2klór-fenilamin 178 μΙ, 1,28 mmól trietil-amint tartalmazó 20 ml tetrahidrofurános oldatához 113 mg, 0,427 mmól benzol-1,3,5trikarbonsav-kloridot adunk. A reakcióelegyet 90 percig keverjük, metanollal befagyasztjuk, diklór-metánnal hígítjuk, vízzel mossuk. A szerves fázist magnézium-szulfáttal szárítjuk, bepároljuk. Fehéres szilárd anyagot kapunk, melyet gyorskromatográfiásan tisztítunk, diklór-metán és etil-acetát 2:1 - 1:1 arányú elegyével eluálva 431 mg, 41 % terméket kapunk. 431 mg, 0,174 r

-33mmól termék 15 ml metanolos oldatát 4,2 ml, 4,2 mmól 1Nnátrium-hidroxiddal kezeljük. 4 óra hosszat 50°C-on keverjük, a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 3,6 ml, 3,6 mmól 1Nsósavval befagyasztjuk, a szilárd anyagot izoláljuk, vákuumban szárítjuk és 193 mg, 69 % címszerinti vegyületet kapunk színtelen szilárd anyag formájában, amely 200°C felett olvad.

parciális ¹H-NMR (DMSO-de, 400 MHz) δ 10,58 (s, 3H), 8,79 (s, 3H), 7,59 (d, 3H), 7,56 (d, 3H), 7,36 (dd, 3H), 4,88 (d, 3H), 4,63 (d, 3H), 4,35 (d, 3H), 4,20 (d, 3H), 3,79 (d, 3H) és 3,11 (s, 3H); ¹³C-NMR (DMSO-de; 100 MHz) δ 164,6, 137,8, 134,7,

134,6, 130,2, 129,4, 128,7, 127,5, 126,8, 103,8, 102,0, 80,7,

75,5, 75,0, 74,9, 73,22, 73,19, 70,5, 68,8, 68,1, 60,5 és 60,3 ppm; tömegspektrum ((-)FAB) m/z 1598,8 és 1600,8 (mindkét ΜΗ).

Analízis a CeeHeíCbNsOse - 9 H₂O képlet alapján: számított: C, 44,94; H, 5,83; N, 2,38;

talált: C, 44,24; H, 5,38; N, 2,29.

2. Lépés

Benzol-1.3.5-trikarbonsav-trisz-ff2-klór-5-(hepta-Oszulfato-B-D-laktozil-oximetil)-feniH-amid)-heneikózanátriumsó

126 mg, 0,079 mmól benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz-{[2klór-5-(p-D-laktozil-oximetil)-fenil]-amid} és 1,5 g, 8,26 mmól kéntrioxid-trimetil-amin komplex 20 ml dimetil-formamidos oldatát 70°C-on 2,5 napig keverjük. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten vízzel befagyasztjuk, vákuumban bepároljuk. A maradékot Sephadex G-10 oszlopon kromatográfiásan tisztítjuk, vízzel eluáljuk. Kationcserét hajtunk vére Dowex 50 x 8 erősen sa··· · • ·

-34vas, gyantával töltött, nátrium formájú oszlopon, 207 mg, 70 % címszerinti vegyületet kapunk cserszínű szilárd anyag formájában, amely bomlás közben 171°C felett olvad.

Parciális ¹H-NMR (D2O; 400 MHz) δ 8,73 (s, 3H), 7,68 (s, 3H), 7,67 (d, 3H), 7,58 (d, 3H), 5,13 (d, 3H), 5,08 (d, 3H), 5,01 (d, 3H), 4,43 (t, 3H) és 4,24 ppm (t, 3H); ¹³C-NMR (D2O; 400 MHz) δ 168,1, 137,0, 134,7, 132,8, 130,3, 130,1, 130,0, 129,6,

128,5, 127,5, 100,9, 99,2, 77,6, 77,0, 75,6, 75,3, 75,04, 74,97,

73,2, 71,7, 70,0, 66,5 és 66,3 ppm; tömegspektrum (elektrospray (m-zNa)/z 913 (M-4Na)⁴' és 725,9 (M-5 Na)⁵.

Analízis a CeeH63CI₃N3Na₂iO₉9S₂i · 21 H₂O képlet alapján: számított: C, 19,23; H, 2,57; N, 1,02; S, 16,33;

talált: C, 19,51; H, 2,61; N, 1,11; S, 15,97.

13. Példa

1. Lépés

Benzol-1.3.5-trikarbonsav-trisz-ff3.5-bisz-/tetra-O-acetil-BD-glükopiranozil-oximetiB-fenin-amidl

861 mg, 1,06 mmól 3,5-bisz-(tetra-O-acetil-p-D-glükoziloximetil)-fenil-amin 147 μΙ, 1,06 mmól trietil-amint tartalmazó 20 ml tetrahidrofurános oldatához 93,6 mg, 0,353 mmól benzol-1,35-trikarbonsav-kloridot adunk. A reakcióelegyet 90 percig keverjük, metanollal befagyasztjuk, diklór-metánnal hígítjuk, vízzel mossuk. A szerves fázist magnézium-szulfát felett szárítjuk, bepárolva világossárga szilárd anyagot kapunk, melyet éterrel eldörzsölve tisztítunk. 849 mg, 0,327 mmól címszerinti vegyületet kapunk színtelen kristályok formájában, op. 120-129°.

’H-NMR (CDCI₃; 400 MHz) δ 9,1 (bs, 3H), 8,73 (s, 3H), 7,67 (s, 6H), 6,99 (s, 3H), 5,18 (t, 6H), 5,10 (t, 6H), 5,03 (dd, 6H),

-354,84 (d, 6H), 4,65 (d, 6H), 4,61 (d, 6H), 4,27 (széles s, 12H), 3,72 - 3,74 (m, 6H), 2,06 (s, 18H), 2,01 (s, 36H) és 1,97 ppm (s, 18H); ¹³C-NMR (CDCI3; 100 MHz) δ 171,2, 170,2, 169,4, 163,9, 138,4, 138,2, 135,7, 129,2, 123,1, 119,5, 100,1, 72,8, 71,9,

71,3, 71,1, 68,4, 62,0, 20,8, 20,64 és 20,56 ppm.

Analízis a Ci₁₇Hi4iN₃0e3 · 2 H₂O képlet alapján: számított: C, 53,36; H, 5,55; N, 1,60;

talált: C, 53,29; H, 5,29; N, 1,61.

2. Lépés

Benzol-1.3.5-trikarbonsav-trisz-(f3.5-bisz-(tetra-O-szulfatoB-D-glükozil-oximetiD-fenill-amidl-tetra-nátriumsó

780 mg, 0,300 mmól benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz-{(3,5bisz-(tetra-O-acetil-p-D-glükopiranozil-oximetil)-fenil]-amid} 15 ml metanolos oldatát, amely 8,1 ml, 8,1 mmól 1N-nátriumhidroxidot tartalmaz, 50°C-on 5 óra hosszat keverjük. A reakcióelegyet lehűtjük szobahőmérsékletre, 7,2 ml. 7,2 mmól 1Nsósavval befagyasztjuk és a benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz{[3,5-bisz-(P-D-glükozil-oximetil)-fenil]-amid} terméket 338 mg mennyiségben, 81 %-os termeléssel izoláljuk és közvetlenül felhasználjuk a következő reakcióban.

Parciális ’H-NMR (DMSO-d_e; 400 MHz) δ 10,73 (s, 3H), 8,74 (s, 3H), 7,78 (s, 6H), 7,22 (s, 3H), 4,88 (d, 6H), 4,57 (d, 6H),

4,29 (d, 6H), 3,71 (d, 6H) és 3,48 (dd, 6H); ¹³C-NMR (DMSO-d₆; 100 MHz) δ 164,5, 138,7, 138,4, 135,3, 129,8, 123,0, 119,1,

102,2, 77,0, 76,8, 73,5, 70,1, 70,0 és 61,1 ppm.

317 mg, 0,200 mmól benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz-{[3,5bisz-(0-D-glükozil-oximetil)-fenilj-amid} és 3,59 g, 25,8 mmól kéntrioxid-trimetil-amin komplex 25 ml dimetil-formamidos olda·· · ·

-36tát 70°C-on 3 napig keverjük. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten vízzel befagyasztjuk, vákuumban bepároljuk. A maradékot Sephadex G-10 oszlopon kromatográfiásan tisztítjuk, vízzel eluáljuk. Sárga szilárd anyagot kapunk, amely az NMR szerint tartalmaz bizonyos maradék trimetil-ammónium-szulfátot. A kationcserélést Dowex 50 x 8 erősen savas gyantát tartalmazó, nátrium formájú oszlopon végezzük, 771 mg, 95 %-os termeléssel kapjuk a címszerinti vegyületet, amely 174°C-on olvad és színtelen szilárd anyag.

¹H-NMR (D₂O; 400 MHz) δ 8,63 (s, 3H), 7,68 (széles s, 6H),

7,44 (széles s, 3H), 5,02 (d, 6H), 4,98 (d, 6H), 4,85 (d, 6H),

4,54 (t, 6H), 4,46 - 4,50 (m, 12H), 4,24 (dd, 6H) és 4,16 ppm (dt, 6H); ¹³C-NMR (D₂O; 100 MHz) δ 167,7, 138,0, 137,1, 135,3, 129,9, 125,3, 122,0, 99,5, 76,2, 75,9, 73,4, 72,6, 70,9 és 67,6 ppm.

Analízis a C_e9H₆9N3Na₂4OiiS₂4-24 H₂O-4Na₂SO4 képlet alapján:

számított: C, 16,45; H, 2,34; N, 0,83; S, 17,82; talált: C, 16,51; H, 2,17; N, 0,84; S, 18,17.

14. Példa

1. Lépés

Benzol-1,3.5-trikarbonsav-trisz-ff3,5-bisz-(B-D-cellobioziloximetiD-fenill-amid)

802 mg, 0,577 mmól 3,5-bisz-(hepta-O-acetil-B-Dcellobiozil-oximetil)-fenil-amin 25 ml tetrahidrofurános oldatához, amely 80,6 μΙ, 1,28 mmól trietil-amint tartalmaz, hozzáadunk 51,2 mg, 0,193 mmól benzol-1,3,5-trikarbonsav-kloridot. A reakcióelegyet 90 percig keverjük, metanollal befagyasztjuk, • ·

-37diklór-metánnal hígítjuk, vízzel mossuk. A szerves fázist magnézium-szulfáttal szárítjuk, bepároljuk. Világossárga szilárd anyagot kapunk, melyet diklór-metán és petrol-éter elegyével eldörzsölve tisztítunk. 777 mg, 94 % terméket kapunk. 777 mg, 0,180 mmól vegyület 25 ml metanolos oldatát 8,1 ml, 8,1 mmól 1 N-nátrium-hidroxiddal kezeljük. 2,5 óra hosszat keverjük 50°Con, majd a reakcióelegyet szobahőmérsékleten befagyasztjuk

7,6 ml, 7,6 mmól 1N-sósav hozzáadásával. A szilárd anyagot összegyűjtjük, reverz fázisú kromatográfiásan tisztítjuk (RP szilícium-dioxid 60), eluálószerként metanol és víz 3:7 arányú elegyét használjuk, majd Sephadex G-10 oszlopon kromatográfiásan tisztítjuk, vízzel eluáljuk. 262 mg, 57 % címszerinti vegyületet kapunk színtelen szilárd anyag formájában, amely 170°C felett bomlás közben olvad.

¹³C-NMR (D₂O), 100 MHz) δ 165,3, 138,4, 137,2, 134,0, 130,0, 123,9, 119,9, 102,6, 101,7, 78,7, 75,9, 75,5, 74,6, 74,2, 73,1, 72,8, 70,6, 69,4, 60,5 és 60,0 ppm.

2. Lépés

Benzol-1.3.5-trikarbonsav-trisz-(í3.5-bisz-(hepta-Oszulfáto-B-D-cellobiozil-oximetiP-fenill-amidl-tetratetrakonta-nátriumsó

139 mg, 0,0543 mmól benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz-{[3,5bisz-(3-D-laktozil-oximetil)-fenil]-amid} és 1,68 g, 12,07 mmól kéntrioxid-trimetil-amin komplex 25 ml dimetil-formamiddal készített oldatát 70°C-on 3 napig keverjük. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten vízzel befagyasztjuk, vákuumban bepároljuk. A maradékot Sephadex G-10 oszlopon kromatográfiásan tisztítjuk, vízzel eluáljuk. Kationcserét hajtunk végre Dowex 50 x 8 erősen

-38savas gyantával töltött nátrium formájú oszlopon. 317 mg, 85 % címszerinti vegyületet kapunk cserszínű szilárd anyag formájában, amely bomlás közben 180°C felett olvad.

¹H-NMR (D2O; 400 MHz) δ 8,64 (s, 3H), 7,67 (s, 6H), 7,46 (s, 3H), 5,02 (d, 6H), 4,96 (d, 6H), 4,64 (t, 6H) és 3,88 - 4,01 (m, 12H); ¹³C-NMR (D2O; 100 MHz) δ 167,7, 138,0, 137,0,

135,3, 129,9, 125,1, 121,8, 99,8, 77,7, 77,5, 77,4, 77,0, 74,2,

73,5, 73,4, 72,9, 71,0, 67,6, 66,1 ppm; tömegspektrum (elektrospray) (m-zNa)/z 883,4 (m - 8 Ba)®', 738,2 (m - 9 Na)⁹’, 662,0 (m - 10 Na)¹⁰’, 599,5 (m - 11 Na)¹¹‘.

Analízis a CiosHiuN3Na₄₂Oi95S4₂-42H₂0 képlet alapján: számított: C, 16,59; H, 2,58; N, 0,55; S, 17,71;

talált: C, 16,47; H, 2,86; N, 0,45; S, 14,72.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. (I) Általános képletű vegyület, ahol

R¹, R², R³ és R⁴ közül mindegyik egymástól függetlenül hidrogénatom, SO3M vagy a) képletű csoport, és valamennyi oligoszacharid csoport 1-3 cukorcsoportot tartalmaz;

M jelentése lítium, nátrium, kálium vagy ammónium, n értéke 1 vagy 2,

X jelentése halogénatom, 1-6 szénatomos alkil- vagy alkoxicsoport,

2. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képletű vegyület, ahol

R¹, R², R³ és R⁴ egymástól függetlenül hidrogénatom, SO₃M vagy a) képletű csoport, és mindegyik oligoszacharid-csoport 1 vagy 2 cukorcsoportot tartalmaz,

M jelentése lítium, nátrium, kálium vagy ammónium, n értéke 1 vagy 2,

X jelentése halogénatom vagy 1-6 szénatomos alkil- vagy alkoxicsoport,

Y jelentése karbonilcsoport, vagy gyógyászatilag elfogadható sója.

3. A 2. igénypont szerinti vegyület, amely lehet

-40benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz-{(2-metil-5-(tetra-Oszulfáto-p-glükopiranozil-oximetil)-fenil]-amid}-dodekanátriumsó vagy gyógyászatilag elfogadható sója; vagy benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz-{[2-metil-5-(hepta-Oszulfáto-p-cellobiozil-oximetil)-fenil]-amid}-heneikóza-nátriumsó vagy gyógyászatilag elfogadható sója, vagy benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz-{[2-klór-5-(hepta-O-szulfátop-D-maltozil-oximetil)-fenil]-amid}-heneikóza-nátriumsó vagy gyógyászatilag elfogadható sója, vagy benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz-[2-klór-5-(hepta-O-szulfátoP-D-cellobiozil-oximetil)-fenilj-amid}-heneikóza-nátriumsó vagy gyógyászatilag elfogadható sója, vagy benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz-{[2-klór-5-(hepta-O-szulfátoP-D-laktozil-oximetil)-fenil]-amid}-heneikóza-nátriumsó vagy gyógyászatilag elfogadható sója, vagy benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz-{[3,5-bisz-(tetra-0-szulfátop-D-glükozil-oximetil)-fenil]-amid}-tetrakóza-nátriumsó vagy gyógyászatilag elfogadható sója, vagy benzol-1,3,5-trikarbonsav-trisz-{[3,5-bisz-(hepta-Oszulfáto-p-D-cellobiozil-oximetil)-fenil]-amid}-tetra-tetrakontanátriumsó vagy gyógyászatilag elfogadható sója.

4. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként hatékony mennyiségű (I) általános képletű vegyületet vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza,

R¹, R², R³ és R⁴ közül mindegyik egymástól függetlenül hidrogénatom, SO₃M vagy a) képletű csoport,

-41 és valamennyi oligoszacharid csoport 1-3 cukorcsoportot tartalmaz;

M jelentése lítium, nátrium, kálium vagy ammónium, n értéke 1 vagy 2,

X jelentése halogénatom, 1-6 szénatomos alkil- vagy alkoxicsoport,

Y jelentése karbonil- vagy szulfonilcsoport.

5. Az (I) általános képletű vegyület vagy gyógyászatilag elfogadható sójának alkalmazása olyan gyógyszer előállítására, amellyel túlzott simaizom burjánzásban szenvedő beteget lehet kezelni, ahol

R¹, R², R³ és R⁴ közül mindegyik egymástól függetlenül hidrogénatom, SO₃M vagy a) képletű csoport, és valamennyi oligoszacharid csoport 1-3 cukorcsoportot tartalmaz;

M jelentése lítium, nátrium, kálium vagy ammónium, n értéke 1 vagy 2,

X jelentése halogénatom, 1-6 szénatomos alkil- vagy alkoxicsoport,

Y jelentése karbonil- vagy szulfonilcsoport.