HUT76327A - Pharmaceutical compositions catalyzing decomposition of peroxy-nitrite - Google Patents

Description

Peroxinitrit bomlását elősegítő katalizátort tartalmazó gyógyszerkészítmények

A találmány peroxinitrit bomlását elősegítő katalizátort tartalmazó gyógyszerkészítményekre vonatkozik.

Közelebbről a találmány szerinti készítmények alkalmasak a peroxinitrit bomlása révén bizonyos betegségek kezelésére, a készítmények egy fémkomplexet tartalmaznak. A peroxinitrit bomlása során előnyösen jóindulatú anyagok képződnek, amelyek meggátolják káros bomlástermékek, így oxigéngyökök képződését, továbbá megakadályozzák a peroxinitrit jelenlétében végbemenő szuperoxid dizmutáz (SÓD) inaktiválódást. így a találmány szerinti fémkomplexek, valamint az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények alkalmasak betegségek kezelésére, amelyeket kedvezően befolyásol a peroxinitrit bomlásának egy a természetes mértéket meghaladó mértékű gyorsítása és ez akkor következik be, ha a találmány szerinti gyógyszerkészítményeket a gyorsításhoz hatásos mennyiségben egységdózisok formájában adagoljuk.

Más szavakkal, a találmány szerinti új gyógyszerkészítmények két előnnyel szolgálnak a betegségek kezelésénél (1)

84769-7337-OE/KmO • · · ·

- 2 gyorsítják a peroxinitrit katalitikus bomlását, és (2) védik az SOD-t a peroxinitrittel történő inaktiválással szemben.

Ily módon a találmány szerinti gyógyszerkészítmények alkalmasak humán betegségek kezelésére, amelyeket előnyösen befolyásol az említett bomlás azáltal, hogy védelmet nyújt a humán szervezetben a peroxinitrit jelenlétéből adódó, eddig nem ismert káros hatásokkal szemben. Továbbá, mivel SÓD inaktiválással szemben is védelmet nyújtanak a készítmények, ez a bomlás a szuperoxid túltermelődéssel kapcsolatos betegségek ellen is véd.

Az említett betegségek közé tartoznak például a következők: ischémiás reperfúziós károsodások, így például agyvérzés, fejsérülés és myocardiális ischémia, szepszis, krónikus és akut gyulladások (így például artritisz és gyulladásos bélbetegségek, stb.), felnőtt respirációs distressz szindróma, rák, bronchopulmonáris diszplázia, a rák kezelésével kapcsolatos mellékhatások, szív-érrendszeri betegségek, diabétesz (nem beleértve a vanádium-porfirin komplexekkel végzett kezelést), multiplex sclerosis, Parkinson-kór, örökletes izomsorvadásos laterális sclerosis, kolitisz és specifikus idegi betegségek, előnyösen ischémiás reperfúzió, gyulladások, szepszis, multiplex sclerosis, Parkinson-kór és agyvérzés.

A nitrogén(ll)oxidról (NO) ismert, hogy kettős fiziológiai szerepe van, egyrészt hasznos messenger molekula, másrészt káros intermedier. A nitrogén(ll)-oxid számos sejttípusban képződik, így például makrofágokban, neurofilekben, hepatocitákban és endoteliális sejtekben [Hibbs és munkatársai, Science, 235, 473-476 (1987); Rimele és munkatársai, J. Pharmacol. Exp. Ther., 245, 102-111 (1988); Curran és munka• ·

- 3 társai, J. Exp. Med., 170, 1769-1774 (1989); és Piamer és munkatársai: Natúré, 327, 524-526 (1987). Az NO képződéséért felelős kémiai reakciót különböző enzimek katalizálják, ezeket nitrogénul )oxid szintáz (NOS) enzimként említjük, ezek az L-arginint citrullinné és NO-vá alakítják [Forstermann és munkatársai: Biochemical Pharmacology, 42, 1849-1857 (1991)]. Bár az NO szerepét mint jelző molekuláét a guanilát cikláz stimulálásában jól leírták [Monocada és munkatársai, Pharmacological Reviews, 43, 109-142 (1991), a citotoxikuj? szerepe még mindig tisztázatlan.

Az utóbbi időben tanulmányok jelentek meg, amelyekben leírják, hogy az NO önmagában nem tehető felelőssé a sejtkárosodásért [Absts. of 1 st Annual Mtg. of Oxygen Society, 1993. november 12-14., Charleston, SC, Nitric Oxide Requires Superoxide to Exert Bactericidal Activity, L. Brunnelli és J.S. Beckmanj. Helyette egy sokkal reakcióképesebb vegyület, a peroxinitrit - ez a szuperoxid és NO reakciója révén jön létre - játszik fontos szerepet a citotoxicitásban, amelyet az NO túltermelés esetén észlelnek. A peroxinitritről ismert, hogy protonok hatására bomlik. A protonnal katalizált peroxinitrit bomlás (a továbbiakban természetes mértékű bomlás) mértékét különböző pH-tartományokban tanulmányozták [Keith és munkatársai:

J. Chem. Soc (A), 90. oldal (1969)]. Ha a pH értéke 7,4, és a hőmérséklet 37 °C, a peroxinitrit bomlásának megfigyelt sebessége 3,6 χ 10'¹ sec'¹ [Beckman és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 87. kötet, 1620-1624. oldal (1990)]. Ez a vizsgálat kimutatta, hogy a peroxinitrit bomlása során egy erős oxidáló hatású anyag képződik, amelynek a reaktivitása hasonló a hidroxilcsoportéhoz, mint azt megállapították a dezoxiribóz vagy

- 4 dimetil-szulfoxid oxidációjával, azzal a további kiegészítéssel, hogy a szuperoxid dizmutáz védi a vaszkuláris szöveteket, amelyek patológiai körülmények között szuperoxid és NO képződésére stimuláltak, azáltal, hogy megakadályozza a peroxinitrit képződését [Beckman és munkatársai: apparent Hydroxyl Radical Production by Peroxynitrite: Implications fór Endothelial Injury from Nitrit Oxide and Superoxide, in Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87. kötet, 1629-1624. oldal, 1990. február].

Továbbá azt is megállapították, hogy a peroxinitrit bomlásakor hidroxilcsoport és nitrogén-dioxid képződik, amely egy hatásos nitrálószer. Mindkét anyag egy hatásos oxidálószer, amelyek a lipid membránnal és a szulfhidril-csoportokkal reakcióba lépnek [Radi és munkatársai: Peroxynitrite Oxidation of Sulfhydryls, The Journal of Biological Chemistry, 266. kötet, 7. szám, 4244-4250. oldal, 1990. március 5.].

Hardy és munkatársai kimutatták, hogy az O₂' és a nitrogén(ll)-oxid közötti kölcsönhatás révén peroxinitrit képződik vagy az O₂’ protonálása révén perhidroxil-csoport képződik, és ezek résztvesznek a HAE sejtek neutrofil-közvetített elpusztításában (FASEB Meeting on April 5-9, 1992 in Anaheim,

California). Hardy és munkatársai továbbá kimutatták a peroxinitrit szerepét a humán endoteliális sejtek oxidatív károsodásában is (Abstract in the Experimental Biology section of FASEB on March 29-April 1, 1993 in New Orleans, LA).

Más szavakkal, számos hivatkozásban ismertetik a peroxinitrit bomlásából származó káros termékeket.

Továbbá kimutatták, hogy a peroxinitrit és Mn és Fe SÓD közötti reakció az enzim inaktiválását eredményezi [Radi és

- 5 munkatársai, Arch. Biochem. Biophys., 288, 481-487 (1991)]. Nem ismert, hogy a peroxinitrit inaktiválja a CuZn SOD-t is.

így a peroxinitrit bomlásának hatását akár annak révén, hogy káros bomlástermékek képződnek, akár azért, mert az SOD-t inaktiválja, számos betegségben kimutatták.

így például Rachmilewitz és munkatársai tanulmányozták a peroxinitrit káros hatását patkány vastagbélre [Rachmilewitz és munkatársai: Peroxynitrite-induced Rat Colitis: A New Model of Coloniv Inflammation from Gastroenterology 105(6) (1993)].

Beckman és munkatársai kimutatták (US. P 5 277 908 számú szabadalmi leírás), hogy peroxinitrit képződik a szuperoxid (O₂‘) és nitrogén(l l)-oxid reakciója révén az ischémiás, gyulladásos vagy szeptikus hatásoknak kitett szövetekben. Beckman és munkatársai szerint az SÓD hiányok és a peroxinitrit kapcsolatban van az izomsorvadásos laterális sclerosissal (ALS) [Natúré, 364. kötet, 1993. augusztus 12], Hogg és munkatársai, valamint Beckman és munkatársai kimutattak kapcsolatot a peroxinitrit és az ateroszklerózis között [Biochemical Society Transactions, 21. kötet, received December 22, 1992 and in Extensive Nitration of Protein Tyrosines in Humán Atherosclerosis Detected by Immunohistochemistry, Bioi. Chem. Hoppe-Seyler, 375. kötet, 81-88, 1994. február]. Továbbá, a peroxinitrit szerepét mutatták ki különböző betegségek esetében is, így például a cigaretta füsttel kapcsolatos tüdő-megbetegedés, ateroszklerózis, izomsorvadásos laterális sclerosis, hideg-indukált agy ödéma esetén [Chem. Rés. Toxicol., 5. kötet, 3. szám, 425-431. oldal (1992). Lásd továbbá a Cold-induced Brain Edema in Mice, The Journal of Biological • · · · • · · · · · • · · • * · *« • · ·

- 6 Chemistry, 268. kötet, 21. szám, július 25.-i kiadás, 15394-15398. oldal (1993)].

A legutóbbi időkben Scherch és munkatársai gerinc-neuron toxicitási vizsgálatot fejlesztettek ki azon hatóanyagok kiválasztására, amelyek blokkolják a peroxinitrit toxicitást [23rd Annual Meeting of the Society fór Neuroscience, Washington, D.D., November?-^., 1993, and abstracted in Society fór Neuroscience Abstracts 19 (1-3), 1993 and Biosis, 94: 4951].

Továbbá, peroxinitrit jelenlétének csökkenése révén az SÓD inaktiválódásának megakadályozásával a találmány szerinti megoldás fokozza a szuperoxid dizmutáz ismert fiziológiai előnyeit betegségek kezelésénél, amely kezelések ilyen előnyökön alapulnak. így a találmányunk oltalmi köre kiterjed az SÓD és SOD-analóg anyagokkal történő ismert kezelésekre is.

Beckman és munkatársai a fent hivatkozott szabadalmi leírásban leírják, hogy az SÓD katalizálja az oxigéngyök szuperoxid dizmutálását, és leírják irodalmi hivatkozásokkal, hogy az SOD-t és variánsait általánosan alkalmazzák az oxidációs károsodások megelőzésére vagy csökkentésére agyvérzés, továbbá fejsérülések, miokardiális ischémia, abdominális vaszkuláris elzáródások, cystitis és különböző gyulladásos betegségek kezelésénél. Beckman és munkatársai szintén felismerték a peroxinitrit jelenlétét ezen és más, az O₂' jelenlétével kapcsolatos betegségekben anélkül, hogy továbbfejlesztéseket megjelöltek volna.

További ismertetések találhatók olyan betegségekkel kapcsolatban, amelyek kezelésénél SOD-t vagy ehhez hasonló vegyületeket alkalmaznak, az EP 524 161 számú szabadalmi leírásban.

- 7 Az US Ρ 5 284 674 számú szabadalmi leírásban porfirin komplexeket ismertetnek, amelyek értékes diagnosztikumok és terápiás szerek, a Hei 5-331 063 számú japán közzétett szabadalmi leírásban phaeophorbide analógokat ismertetnek, amelyek endocerin receptor antagonisták, az US P 5 286 474 számú szabadalmi leírásban carotenoporphyrineket ismertetnek, amelyek alkalmasak emlős tumor szövetek kimutatására és láthatóvá tételére, az US P 5 283 255 számú szabadalmi leírásban hasonló nitrogéntartalmú makrociklusokat ismertetnek komplexált fém nélkül, ezek citotoxikus szerek. A találmány szerinti fémkomplexekhez hasonló anyagokat és azok alkalmasságát sehol nem ismertették.

A fémkomplexek hasznosságát azonban leírták a következő helyeken: intermedierként a JP 0 5277377-A szabadalmi leírásban és MRI szerként az US P 5 284 944 számú szabadalmi leírásban; cián pigmentként az US P 5 286 592 számú szabadalmi leírásban; fotokonduktív ftalocianin készítményként az US P 5 283 146. számú szabadalmi leírásban; jelzőrétegként egy optikai jelzőközegben az US P 5 284 943 számú szabadalmi leírásban, és infravörös abszorbensként és kimutató, jelzőanyagként az US P 5 296 1632 számú szabadalmi leírás kivonatában.

A vas-hemoproteinről leírták, hogy hatásos szer a nitrogén(ll)-oxid megkötésében vagy oxidálásában, amely anyag káros fiziológiai hatású ha citokinek vagy endotoxinok indukálják, az említett anyag különböző betegségek, így például szeptikus sokk kezelésére alkalmazható (WO 93/16721).

Egyéb komplexeket és alkalmazásukat is leírták. így például ruténium-ftalocianinokat ismertetnek mint vízoldható szereket fotodinamikus rák kezelésére (Platinum Metals Rév.,

- 8 1995, 39, (1), 14-18; bizonyos szerves fémkomplexeket ismertetnek különböző gyulladások kezelésére (USP 4 866 054, porfirint és ftalocianin antivirális készítményeket ismertetnek HÍV fertőzések gátlására vagy HÍV replikáció gátlására (US P 5 109 016); mangán mezo-tetra(4-szulfonáto-fenil)-porfirin előállítását és alkalmazását ismertetik tumor szelektív MRI kontrasztszerként; a JP 03273082 számú szabadalmi leírás kivonatában peroxid-degradáló fém-porfirineket ismertetnek antioxidánsként való alkalmazásra élelmiszereknél és más egyéb termékeknél; az US P 4 758 429 számú szabadalmi leírásban vas-tetrafenil-porfirin-szulfonát-acetátot ismertetnek mágneses vagy elektromos dipólusok aktiválására váltakozó elektromágneses mezővel együtt artritisz és nem-fertőző kötőszöveti betegségek esetén; az EP 392 666 számú szabadalmi leírás kivonatában nemtoxikus labilis fémeket vagy komplexeket, így például 1,5,9,13-tetraaza-ciklohexadekánt ismertetnek vírus, így például HÍV vírus kezelésére. A CA 119:203240 irodalmi helyen bizonyos metalloporfirineket ismertetnek hipoglikémiás szerként (FR P 91-6174 számú szabadalmi leírás). Számos egyéb további irodalmi hivatkozásban a fémkomplexek hasonló alkalmazását ismertetik.

Továbbá a JP 05331063 számú szabadalmi leírásban nitrogéntartalmú, bizonyos makrociklusokat ismertetnek mint endotelin receptor antagonistákat magas vérnyomás, akut veseelváltozások, kardiomiopátia és miokardiális infarktus kezelésére és megelőzésére.

A találmány gyógyszerkészítményekre vonatkozik, amelyek alkalmazhatók betegségek kezelésére, amelyek a peroxinítrít bomlásával előnyösen befolyásolhatók, és amely készítmények

- 9 gyorsítják, a természetes szintű bomlást meghaladó mértékben a peroxinitrit bomlását a peroxinitrittel kapcsolatos betegségekben szenvedő betegeknél, ha ezeket a készítményeket, amelyek fémkomplexeket tartalmaznak, a betegeknek adagoljuk. A peroxinitrit előnyösen jóindulatú anyagokká bomlik. A vegyület egy ligandum szerkezetű vegyület, amely komplexált fémet, így például valamely átmenetifémet, például valamely következő fémet tartalmaz: Mn, Fe, Ni és V. Az előnyös ligandumok makrociklusos ligandumok, így például porfirinek, azaz makrociklusok, stb.

A találmány szerinti új gyógyszerkészítmények, amelyek alkalmasak emlősöknél, beleértve az embereket is, a peroxinitrit hiányával előnyösen befolyásolható betegségek kezelésére, ha azokat a betegeknek a bomlás gyorsítására hatásos mennyiségben adagoljuk, a következő vegyületeket tartalmazzák:

(I) általános képletű vegyületnek megfelelő vegyület, amely képletben

R3, Re, Rs vagy R₁₂ jelentése egymástól függetlenül H, alkil-, alkenil-, CH₂COOH, fenil-, piridinil- vagy N-alkil-piridil-csoport - ezeket az (a), (b) és (c) képlettel írjuk le -, és amelyek a szénatomhoz kapcsolódnak, és a fenilcsoport adott esetben valamely következő csoporttal szubsztituálva van: halogénatom, alkil-, aril-, benzil-, COOH, CONH₂, SO₃H, NO_2i NH_2i N(R)₃ ⁺ képletű csoport, ahol

R jelentése hidrogénatom, alkil- vagy alkil-aril-csoport;

a pi rid i η i I csoport adott esetben valamely következő csoporttal szubsztituálva van: halogénatom, alkil-, aril-,

- 10 • · · · ; • · · · · .

··· *·** ···· · · • · · benzil-, COOH, CONH₂, SO₃H, NO_2l NH₂, N(R)₃ ⁺ vagy NHCOR' általános képletű csoport, ahol R jelentése a fenti és R' jelentése alkilcsoport, és az N-alkil-piridin-csoport adott esetben a következő csoportokkal szubsztituálva van: halogénatom, alkil-, aril-, benzil-, COOH, CONH₂, SO₃H, NO₂, NH₂, N(R)₃ ⁺ vagy NHCOR' általános képletű csoport, ahol R és R' jelentése a fenti;

Rí, R₂, R_4i Rs, R₇, Re, Rio vagy R₄₁ jelentése egymástól függetlenül H, alkil-, alkenil-, karboxialkil-, Cl, Br, F, NO₂, hidroxi-alkil- vagy SO₃H csoport, vagy Rí és R₂ jelentése együttesen egy 5-8 szénatomos, előnyösen 6 szénatomos gyűrűt alkotnak;

X és Y jelentése alkalmas ligandum vagy töltés-semlegesítő anion, amely bármilyen monodentát vagy polidentát koordináló ligandumból vagy ligandum rendszerből vagy annak megfelelő anionjából (például benzoesav vagy benzoát anion, fenol vagy fenoxid anion, alkohol vagy alkoxid anion) származik, és jelentése egymástól függetlenül valamely következő csoport: halid, oxo, aquo, hidroxo, alkohol, fenol, dioxigén, peroxo, hidroperoxo, alkilperoxo, arilperoxo, ammónia, alkil-amino, aril-amino, heterociklusos alkil-amino, heterociklusos aril, amino, amin-oxidok, hidrazin, alkil-hidrazin, aril-hidrazin, nitrogén(ll)oxid, cianid, cianát, tiocianát, izocianát, izotiocianát, alkil-nitril, aril-nitril, alkil-izonitril, aril-izonitril, nitrát, nitrit, azido, alkil-szulfonsav, aril-szulfonsav, alkil-szulfoxid, aril-szulfoxid, alkil-aril-szulfoxid, alkil-szulfénsav, aril-szulfénsav, alkil-szulfinsav, aril-szulfinsav, alkil-tiol-karbonsav, aril-tiol-karbonsav,

- 11 alkil-tiol-tiokarbonsav, aril-tiol-tiokarbonsav, alkil-karbonsav (például ecetsav, trifluor-ecetsav, oxálsav), aril-karbonsav (például benzoesav, ftálsav), karbamid, alkil-karbamid, aril-karbamid, alkil-aril-karbamid, tiokarbamid, alkil-tiokarbamid, aril-tiokarbamid, alkil-aril-tiokarbamid, szulfát, szulfit, biszulfát, biszulfit, tioszulfát, tioszulfit, hidroszulfit, alkil-foszfin, aril-foszfin, alkil-foszfin-oxid, aril-foszfin-oxid, alkil-aril-foszfin-oxid, alkil-foszfin-szulfid, aril-foszfin-szulfid, alki l-aril-foszfín-szulfíd, alkil-foszfonsav, aril-foszfonsav, alkil-foszfinsav, aril-foszfinsav, alkil-foszfinossav, aril-foszfinossav, foszfát, tiofoszfát, foszfit, pirofoszfit, trifoszfát, hidrogén-foszfát, dihidrogén-foszfát, alkil-guanidino, aril-guanidino, alkil-aril-guanidino, alkil-karbamát, aril-karbamát, alkil-aril-karbamát, alkil-tiokarbamát, aril-tiokarbamát, alkil-aril-tiokarbamát, alkil-ditiokarbamát, aril-ditiokarbamát, alkil-aril-ditiokarbamát, bikarbónát, karbonát, perklorát, klorát, klorit, hipoklorit, perbromát, bromát, bromit, hipobromit, tetrahalo-manganát, tetrafluor-borát, hexafluor-foszfát, hexafluor-antimonát, hipofoszfit, jodát, perjodát, metaborát, tetraaril-borát, tetraalkil-borát, tartarát, szalicilét, szukcinát, citrát, aszkorbát, szacharinét, aminosav, hidroxaminsav, tiotozilát, továbbá ioncserélő gyantákból vagy gyantarendszerekből származó anionok; azzal a megkötéssel, hogyha az X és Y-tartalmú komplex pozitív töltésű, akkor Z jelentése egy ellenion, ami független X-től vagy Y-tól, vagy ha az X és Y-tartalmú komplex negatív töltésű, akkor Z jelentése egy ellenion, amely valamely következő:

- 12 alkáli vagy alkálifém-kation, szerves kation, így például alkil- vagy alkil-aril-ammónium kation; és

M jelentése valamely következő fém: Mn, Fe, Ni vagy V;

(II) általános képletű vegyület - a képletben

R' jelentése CH vagy N;

Rí, R2, R3. R4, Rs, Re, R7, Re, Re, R10, R11, R12, R13, R14, R15 és R₁₆ jelentése egymástól függetlenül valamely következő csoport: H, SO₃H, COOH, NO₂, NH₂ vagy N-alkil-amino-csoport,

X, Y, Z és M jelentése a fenti;

(Illa) általános képletű vegyület, amely képletben

Rí, Rs, R9 és Ri₃ jelentése egymástól függetlenül vegyértékkötés vagy CH₂ csoport;

R2, R2', R4, R4', Re, Re', Re, Rs', R10, Rio', R12, R12', R14, R14', R16, R₁₆' jelentése egymástól függetlenül H vagy alkilcsoport;

R3, R7, R11, R15 jelentése egymástól függetlenül H vagy alkilcsoport;

X, Y, Z és M jelentése a fenti;

(IIIB) általános képletű vegyület, amely képletben

Rí, R₅, R₈ és R₁₂ jelentése egymástól függetlenül vegyértékkötés vagy CH₂ csoport;

R2, R₂', R4, R4¹, Re, Re', R7, R9, R9', R11, R11', R13, Ri3', R14 jelentése egymástól függetlenül H vagy alkilcsoport;

R₃ és R10 jelentése egymástól függetlenül H vagy alkilcsoport;

X, Y, Z és M jelentése a fenti;

- 13 (NIC) általános képletű vegyület a képletben

R_1t R₄, R_8i R12 jelentése egymástól függetlenül vegyértékkötés vagy CH₂ csoport;

R2, R2', R3, Rs, Rs'. R7. R9. Ra', R11, Ru', R13, R13', R14 jelentése egymástól függetlenül H vagy alkilcsoport;

R₁₀ jelentése H vagy alkilcsoport;

X, Y, Z és M jelentése a fenti;

(IIID) általános képletű vegyület, a képletben

Rí, R₄, R₇ és Rio jelentése egymástól függetlenül vegyértékkötés vagy CH₂ csoport;

R2, R₂*. R3, Rs, Rs', Re, Re, Rs', R9, R11, R11' és Ri₂ jelentése egymástól függetlenül H vagy alkilcsoport;

X, Y, Z és M jelentése a fenti;

(IHE) általános képletű vegyület - a képletben

R,, R₄, R₈ és Rn jelentése egymástól függetlenül vegyértékkötés vagy CH₂ csoport;

R2, R3, R3', Rs, Rs', R7, R?', R9, R10, Rio', R12, R12' és R13 jelentése egymástól függetlenül H vagy alkilcsoport;

R₆ jelentése hidrogénatom vagy alkilcsoport;

X, Y, Z és M jelentése a fenti;

(IMF) általános képletű vegyület - a képletben

Rí, R₄, R_7i és R₁₀ jelentése egymástól függetlenül H vagy alkilcsoport;

R2, R3, Rs', Rs, Rs', Re, Re, R9, Rg', R11, Rí? és Ri₂ jelentése egymástól függetlenül H vagy alkilcsoport;

X, Y, Z és M jelentése a fenti;

- 14 (IIIG) általános képletű vegyület - a képletben

Rí, R3, R4 és R₆ jelentése egymástól függetlenül H vagy alkilcsoport;

R₂ és R_s jelentése egymástól függetlenül H, alkil-, SO₃H, NO₂, NH_2l halogén, COOH és N(R)₃* csoport, ahol R jelentése a fenti;

X, Y, Z és M jelentése a fenti;

(IIIH) általános képletű vegyület - a képletben

Rí, R2, R3, R4 jelentése egymástól függetlenül H, alkil-, SO₃H, NO₂, NH₂, halogén, COOH vagy N(R)₃ ⁺ képletű csoport, ahol R jelentése a fenti,

X, Y, Z és M jelentése a fenti;

(IV) általános képletű vegyület - a képletben

Rí, Rí', R₂, Rí', R3, R3'. R4, R4', Rs, Rs', Re, Re', R7 és R₇' jelentése egymástól függetlenül H, alkil, alkoxi, NO₂, aril, halogén, NH₂, SO₃H csoport, és R₆, Re', R7 és R?' mindegyike együttesen egy másik R₆, Re', R7 és R₇' csoporttal egy ciklusos, előnyösen 6 szénatomos cikloalkilcsoportot is alkothat,

M¹ jelentése Fe, Ni vagy V,

X, Y és Z jelentése a fenti gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal együtt, előnyösen egységdózis formában.

A fenti képletekben X, Y és Z mindegyikének jelentése gyógyászatilag elfogadható anion vagy kation.

- 15 Az 1. ábrán bemutatjuk a k_Obx és a katalizátorkoncentráció összefüggését Fe(lll)TMPS és Fe(lll)TPPS esetén, az összefüggés jelzi a peroxinitrit fémkomplexszel történő bomlásának katalitikus jellegét.

A 2. ábrán bemutatjuk a CuZnSOD peroxinitrittel való inaktiválását.

A 3. ábrán bemutatjuk a CuZnSOD koncentrációfüggő védelmét a peroxinitrittel való inaktiválással szemben Fe(lll)TMPyP peroxinitrit dekompozíciós katalizátor alkalmazásával.

A 4. ábrán bemutatjuk a CuZnSOD koncentrációfüggő védelmét a peroxinitrittel való inaktiválással szemben Fe(lll)TMPS peroxinitrit dekompozíciós katalizátor alkalmazásával.

Az 5. ábrán bemutatjuk a humán mikrovaszkuláris endoteliális sejt peroxinitrit-közvetített károsodását. A peroxinitritet közvetlenül az ⁵¹Cr-jelzett HMDE sejtekre visszük, amelyeket 96-lyukú sejttenyésztő lemezeken tenyésztettünk. 45 perc elteltével meghatároztuk a specifikus sejtkárosodást, és ezt összefüggésbe hoztuk a peroxinitrit koncentrációval a legkisebb négyzetes regressziós vonallal. A megadott értékek három párhuzamos érték átlagát jelentik +/-SEM.

A 6. ábrán bemutatjuk azon kísérlet eredményét, amikor a HDME sejtekhez a sejtkárosodási vizsgálatnál peroxinitrit katalizátorokat Fe(TMPyP) (háromszögletű) és Ni(ll)dienoN₄)PF₆(körkörös) adagoltunk közvetlenül a peroxinitrit adagolását megelőzően. 45 perc elteltével meghatároztuk a specifikus sejtkárosodást a radiojelzett anyagnak a közegbe való felszabadulásával. A megadott értékek három párhuzamos mérés átlagértékét jelentik +/- 16 SEM. A *p<0,01 vs. 0 pmól kontrollt a Dunnett teszttel határoztuk meg.

A 7. ábrán bemutatjuk a neutrofil-közvetített károsodás gátlását humán aorta endoteliális sejtek esetén Fe(TMPyP) alkalmazásával. Az Fe(TMPyP) peroxinitrit katalizátort a sejtkárosodás vizsgálatnál a neutrofilekhez közvetlenül a TNF/C5a-val való aktiválás előtt adagoltuk. 2 óra elteltével meghatároztuk a specifikus sejtkárosodás mennyiségét, a tápközegben a felszabadult radiojelzett anyag meghatározásával. Az értékek három párhuzamos átlagértékét jelentik +/- SEM. A *p<0,01 vs. 0 pmól kontrollt a Dunnett teszttel határoztuk meg.

A 8. ábrán bemutatjuk azon kísérletünk eredményét, amelynél a PN(peroxinitrit)-közvetített károsodásból származó RAW sejtek védelmét vizsgáltuk Ni és Fe katalizátorokkal. Az RAW

264.7 sejteket egy 96-lyukú lemez lyukaiba helyeztük körülbelül 2x10⁵/lyuk mennyiségben. Mindegyik lyukba ezután PN-t adagoltunk 360 mikromól mennyiségben, növekvő koncentrációjú Ni katalizátor vagy FeTMPyP jelenlétében, ez teljes védelmet biztosított a PN-közvetített károsodással szemben, ezt a sejteknek azzal a képességével határoztuk meg, hogy metabolizálják az Alamar Blue-t egy fluoreszcens termékké. A meghatározásokat 4 párhuzamos átlagaként adjuk meg +SEM.

A 9. ábrán bemutatjuk a PN-közvetített RAW sejtkárosodással szembeni védelmet Fe katalizátor jelenlétében. A sejteket 500 pmól PN-nel kezeltük a következő katalizátorok jelenlétében vagy azok nélkül: FeTMPyP, FeTMPS, FeTPPS. A sejtek életképességét a leírtak szerint határoztuk meg, és az 1, 2, 3 számmal jelöltük. Az értékek négy párhuzamos érték átlagát jelentik ±sem.

- 17 A 10. ábrán bemutatjuk az FeTMPS, FeTMPyP vagy ZnTMPyP hatását (30 mg/kg i.v. bolus), amelyet 3 órával az E. coli lipopoliszacharid (LPS, 3 mg/kg, i.v. bolus) adagolása után 3 órával adagoltunk, a radiojelzett albumin szivárgásának növekedésére (plazma extravazáció, μΙ/g szövet), amelyet 1 órával később (például 4 órával az LPS adagolás után) figyeltünk meg patkány jejunumban. Az eredményeket 4-8 párhuzamos mérés átlagaként adjuk meg ±sem.

A fenti képleteknél az alkilcsoport jelentése egyenes vagy elágazó láncú, 1-22 szénatomos, előnyösen 1-18 szénatomos, még előnyösebben 1 - 12 szénatomos alkilcsoport. Ilyenek például a következők: metil-, etil-, η-propil-, izopropil-, n-butil-, izobutil-, szek-butil-, terc-butil-, pentil-, izoamil-, hexil-, oktil-, nonil-, decil-, dodecil-, tetradecil-, hexadecil-, oktadecil- és eikozilcsoport. Az arilcsoport jelentése akár önmagában, akár kombinációban fenil- vagy naftilcsoport, amely adott esetben egy vagy több valamely következő csoporttal szubsztituálva van: alkil-, cikloalkil-, cikloalkenil-, aril-, heterociklusos, alkoxi-aril-, alkaril-, alkoxi-, halogén, hidroxi-, amin-, ciano-, nitro-, alkil-tio, fenoxi-, éter, trifluor-metil-, stb., továbbá fenil-, p-tolil-, 4-metoxi-fenil-, 4-(terc-butoxi)-fenil-, 4-fluor-fenil-, 4-klór-feniI-, 4-hidroxi-fenil-, 1-naftil-, 2-naftil-csoport stb. Az aralkilcsoport jelentése valamely fenti alkil- vagy cikloalkilcsoport, amelyben egy hidrogénatomot arilcsoporttal szubsztituáltunk, így például lehet benzil-, 2-fenil-etil-csoport stb. A heterociklusos csoport jelentése olyan csoport, amely a szénatom mellett a gyűrűben legalább egy másik atomot tartalmaz, leggyakrabban nitrogén-, oxigén- és kénatomot. Ilyen heterociklusos csoportok a korlátozás szándéka nélkül a követ- 18 kezők: ρirroIidiniI-, piperidil-, imidazoIidiηiI-, tetrahidrofuriI-, tetrahidrotienil-, furil-, tienil-, piridil-, kinolil-, izokinolil-, piridaziniI-, pirazinil-, indolil-, imidazoliI-, oxazolil-, tiazolil-, pirazolil-, piridinil-, benzoxadiazolil-, benzotiadiazolil-, triazolilés tetrazolilcsoport. A cikloalkilcsoport jelentése 3-10 szénatomos, előnyösen 3-8 szénatomos, különösen előnyösen 3-6 szénatomos cikloalkilcsoport, ilyenek például a korlátozás szándéka nélkül a következők: ciklopropil-, ciklobutil-, ciklopentil-, ciklohexil-, cikloheptil-, ciklooktil- és perhidronaftil-csoport. A cikloalkenilcsoport jelentése olyan cikloalkilcsoport, amely egy vagy több kettőskötést tartalmaz, ilyenek például a ciklopentenil-, ciklohexenil-, ciklookteniI-, ciklopentadienil-, ciklohexadienil- és ciklooktadienil-csoportok.

A találmány szerinti (I) általános képlettel leírt makrociklusos ligandumokat általánosan ismert szintetikus eljárások szerint lehet előállítani, ilyen eljárásokat ismertetnek például a következő irodalmi helyeken:

1) Campestrini, S.; Meunier, B. Inorg. Chem. 31. 1999-206 (1992).

2) Róbert, A.; Loock, B.; Momenteau, M.; Meunier, B.: Inorg. Chem. 30, 706-711 (1991).

3) Lindsey, J.S.; Wagner, R.W.: J. Org. Chem. 54, 828-836 (1989).

4) Zipplies, M.F.; Lee, W.A.; Bruice, T.C.: J. Am. Chem. Soc. 108, 4433-4445 (1986).

A találmány szerinti (II) általános képletű makrociklusos ligandumokat a szakterületen ismert általános szintetikus eljárások szerint lehet előállítani. Ilyen eljárásokat ismertetnek például a következő helyeken:

- 19 1) Néhány vegyület kereskedelmi forgalomban beszerezhető, ezek Porphyrin Products, Inc. (Logan, Utah) gyártmányok.

2) Y.L. Meltze; Phthalocyanine Technology in Chemical Process Reviews No. 42.; Noyes Data Corp., Park Ridge, N.J. (1970).

A találmány szerinti (III) általános képletű makrociklusos ligandumokat a szakterületen ismert általános szintetikus eljárások szerint lehet előállítani. Ilyen eljárásokat ismertetnek például a következő helyeken:

1) Goedken, V.L.; Molin-Case, J.; Whang, Y-A; J.C.S. Chem. Comm. 337-338 (1973);

2) Martin, J.G.; Cummings, S.C.; Inorg. Chem. 12, 1477-1482 (1973).

3) Riley, D.P.; Stone, J.A.; Busch, D.H.: J. Am. Chem. Soc.

98, 1752-1762 (1976).

4) Dabrowiak, J.C.; Merrell, P.H.; Stone, J.A.; Busch, D.H.:

J. Am. Chem. Soc. 95, 6613-6622 (1973).

5) Riley, D.P.; Busch, D.H.; Inorg. Chem. 23, 3235-3241 (1984).

6) Watkins, D.D.; Riley, D.P.; Stone, J.A.; Busch, D.H.; Inorg. Chem. 1_5, 387-393 (1976).

7) Riley, D.P.; Stone, J.A.; Busch, D.H.; J. Am. Chem. Soc.

99, 767-777 (1977).

A találmány szerinti (IV) általános képletű makrociklusos ligandumokat a szakterületen ismert általános szintetikus eljárások szerint lehet előállítani. Ilyen eljárásokat ismertetnek például a következő helyeken:

1) Diehl, H.; Hoch, C.C.: Inorganic Synthesis 3. kötet, 196.

oldal. McGra-Hill, New York (1950).

- 20 2) Srinivasan, K.; Michaud, P.; Kochi, J.K.; J. Am. Chem. Soc. 108. 2309-2320 (1986).

3) Samsel, E.G.; Srinivasan, K.; Kochi, J.K: J. Am. Chem. Soc. 107. 7606-7617 (1985).

A találmány szerinti vegyületek tartalmazhatnak egy vagy több aszimmetriás szénatomot, és így ezek optikai izomerjeik formájában vagy a racém vagy nem racém keverékeik formájában szintén előfordulhatnak. Az optikai izomereket a racém keverékből ismert módon rezolválással tudjuk kinyerni, például úgy, hogy az optikailag aktív savval diasztereomer sókat képezünk. Ilyen savak például a borkősav, diacetil-borkősav, dibenzoil-borkősav, ditoluoil-borkősav és kámforszulfonsav, majd a kapott diasztereomer keverék szétválasztását kristályosítással, majd az optikailag aktív bázis felszabadításával végezzük. Egy másik módszer az optikai izomerek szétválasztására a királis kromatográfiás oszlop alkalmazása, ezt az enantiomerek szétválasztásának optimalizálása érdekében választjuk. Egy másik módszer szerint kovalens diasztereomer molekulákat állítunk elő úgy, hogy a találmány szerinti vegyület egy vagy több szekunder amincsoportját egy aktivált formában lévő optikailag tiszta savval vagy optikailag tiszta izocianáttal reagáltatjuk. Az előállított diasztereomereket ismert módon választjuk szét, így például kromatográfiával, desztillációval, kristályosítással vagy szublimációval, majd ezután hidrolizálással nyerjük a tiszta enantiomer ligandumot. Az optikailag aktív találmány szerinti vegyületeket előállíthatjuk az optikailag aktív kiindulási anyagok, így például természetes aminosavak alkalmazásával is.

- 21 • ·

A találmány szerinti fémkomplexek peroxinitrit bomlást katalizáló aktivitásuk vizsgálatához a peroxinitritet savas hidrogén-peroxid és nátrium-nitrit reagáltatásával állítjuk elő, majd ezt a vegyületet nátriumsóvá alakítjuk Halfpenny és Robinson módszere szerint [J. Chem. Soc., 928-938 (1952)]. A peroxinitrit abszorpciós maximuma 302 nm-nél van, extinciós koefficiense 1670 M¹cm'¹. Ily módon közvetlenül megfigyelhető a peroxinitrit bomlása stop-flow spektrofotometriás analízissel, és a bomlás 302 nm-nél történő kimutatásával. Azaz, ha a peroxinitritre vonatkozóan egy a természetes bomlási sebességet meghaladó bomlási sebességet észlelünk az adott fémkomplexet találmány szerinti hatású fémkomplexnek minősítjük.

Azt találtuk továbbá, hogy a peroxinitrit inaktiválja a CuZnSOD enzimet koncentrációtól függő mértékben. Mivel ismert, hogy a peroxinitrit inaktiválja az MnSOD-t is [Peroxynitrite-Mediated Tyrosine Nitration Catalyzed by Superoxide Dismutase by Ischiropoulos és munkatársai: Archives of Biochemistry and Biophysics, 298. kötet, 2. szám, november 1, 431-437. oldal (1992)], a találmány szerinti vegyületek védik a CuZnSOD-t is a peroxinitrittel való inaktiválástól.

A fentiek alapján a találmány szerinti vegyületek alkalmazhatók humán betegségek kezelésére, amelyeket előnyösen befolyásol az SÓD enzim jelenléte.

A találmány szerinti készítményekkel végzett kezelés tehát olyan betegségek esetében alkalmazható, amelyeket a peroxinitrit jelenléte, vagy pedig a védőhatású SÓD enzim hiánya vált ki, ilyenek például a miokardiális infarktus, agyvérzés vagy az autoimmun betegségek. Ez utóbbival kapcsolatban kimutatták azt is, hogy kapcsolatban van a peroxinitrit jelenlétével.

• ·

- 22 A találmány szerinti fémkomplexeket a következőkben ismertetésre kerülő peroxinitrit bomlására kifejtett hatásuk alapján vizsgáltuk.

A fentiekben leírt találmány szerinti vegyületek és származékaik ekvivalensei azok, amelyek egyébként megfelelnek ezeknek a vegyületeknek, és ugyanilyen általános tulajdonságokkal rendelkeznek, ilyenek például a tautomerek, valamint az olyan vegyületek, ahol egy vagy több különböző R csoport a fentiekben megadott szubsztituensek egyszerű változata, azaz például ahol a szubsztituens magasabb szénláncú alkilcsoport, mint ami meg van adva, vagy ahol a tozilcsoportok más nitrogén- vagy oxigén-védőcsoportok, vagy az O-tozilcsoport egy halid. Az egyvegyértékü anionok helyett más, 1-től eltérő töltésű anionok, így például karbonát, foszfát vagy hidrogén-foszfát is alkalmazható addig, amíg ez a komplex aktivitását hátrányosan nem befolyásolja. Azonban az 1 vegyértékütői eltérő anionok kissé módosítják a fentiek szerinti komplexek általános képletét. Továbbá, ahol a szubsztituens jelentése lehet hidrogénatom is, a pontos kémiai természete a szubsztituensnek, ami a hidrogéntől eltérő, és azon a helyen áll, így például szénhidrogéncsoport vagy halogénatom vagy hidroxi-amino vagy más egyéb funkciós csoport, nem kritikus addig, amíg az hátrányosan nem érinti a vegyület általános aktivitását és/vagy előállítási eljárását.

A kémiai reakciók, amelyeket az irodalmi hivatkozásokban leírnak, általában a legszélesebb értelmezés szerint alkalmasak a találmány szerinti vegyületek előállítására. Esetenként azonban egy adott reakció nem alkalmazható mindegyik vegyülethez, amely az oltalmi körbe tartozik. Ezeket a vegyületeket azonban • ··· ·

• · ·

- 23 a szakember könnyen felismeri, illetve kiválasztja. Ilyen esetekben vagy a reakciót kell megfelelően ismert módon átalakítani, például egy csoport megfelelő védőcsoporttal való ellátásával, vagy egy másik reagens alkalmazásával, vagy pedig más egyéb leírt reakciót vagy más ismert reakciót kell az adott vegyület előállításához alkalmazni. Az előállítási eljárásoknál felhasználásra kerülő kiindulási anyagok mindegyike ismert, vagy ismert módon előállítható.

A találmány szerinti leírásból, valamint a példákból a szakember számára a megvalósítás és alkalmazás nyilvánvaló. A következőkben ismertetésre kerülő előnyös kiviteli formák csak az illusztrációt szolgálják, és semmiképpen sem korlátozóak az oltalmi körre nézve.

A példákban felhasználásra kerülő reagenseket eredeti formájukban alkalmaztuk, hacsak másképpen nem jelöljük. Az

5,10,15,20-tetrakisz(N-metil-4-piridil)-porfirin-tetratozilátot és acetato-5,10,15,20-tetrakisz(4-szulfonáto-fenil)porfirin vas (III) vegyületet a Porphyrin Products Inc. (Logan, UT) cégtől szereztük be. A vas(lIl)-citrát és vas(lll)EDTA komplexeket az Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wl) cégtől szereztük be. Az NMR spektrumokat Varian VXR-300 vagy Varian VXR-400 típusú spektrométerekkel vettük fel. A kvalitatív és kvantitatív tömegspektrumokat Finnigan MAT90, Finnigan 4500 és VG40-250T típusú spektrométerekkel vettük fel.

- 24 1. Példa

Acetato(5,10,15,20-tetrakisz(N-metil-4-piridil)-porfinato)vas(lll)tetra-tozilát, Fe(lll)TMPyP előállítása

0,3 g, 0,231 mmól 5,10,15,20-tetra-(N-metíI-piridil)-porfin-tetratozilátot (H₂TMPyP) bemérünk egy 100 ml-es gömblombikba, amely mágneses keverővei van felszerelve, és az anyagot minimális mennyiségű MeOH-ban feloldjuk. Ezután 0,120 g, 0,692 mmól vízmentes Fe(OAc)₂-t, majd közvetlenül utána 25 ml jégecetet és 100 μΙ trietil-amint adagolunk. A keveréket visszafolyatásig melegítjük. A reakció lefutását látható spektroszkópiával követjük, és akkor tekintjük befejezettnek, amikor 426 nm-nél egy erős sáv jelenik meg, jelezve a fémezett-porfirin kialakulását. Az MeOH-t ezután elpárologtatjuk, a visszamaradó szilárd anyagot minimális mennyiségű MeOH-ban oldjuk, a keveréket vákuumban összesen kb. 20 ml térfogatra betöményítjük, ekkor a reagálatlan Fe(OAc)₂ kicsapódik. A szilárd anyagot centrifugálással az anyalúgtól elválasztjuk, az anyalúgot Sephadex LH-20 töltetű oszlopon (2 x 30 cm) MeOH-val kromatografáljuk. A kezdeti színezett sávokat összegyűjtjük, az Fe(lll)TMPyP(OAc)-t kicsapással elválasztjuk az oldószer elpárologtatósa után, majd a visszamaradó anyagot éterrel elkeverjük, így 85 mg (26 %) kívánt terméket nyerünk, ezt tömegspektroszkópiával azonosítjuk.

2. Példa

5.10.15.20- tetrakisz(3,5-diszulfonált mezitiI)-porfirin oktanátriumsó előállítása (H₂TMPS)

5.10.15.20- tetramezitil-porfirint (H₂TMP) állítunk elő úgy, hogy pirrolt és mezitil-aldehidet kondenzálunk egy lezárt üveg-

- 25 csőben Badger módszere szerint [G.M. Badger, R.A. Jones, R,L. Laslett: Austr. J. Chem. 17, 1022 (1964)], vagy úgy, hogy kolidint visszafolyatás közben melegítünk a Meunier irodalomban leírt módszere szerint [Meunier és munkatársai: Nouv. J. Chim., 10. 39-49 (1986)]. A klór-szennyeződéseket benzolban,

2,3-diklór-5,6-dicián-1,4-benzokinon jelenlétében végzett oxidációval, majd a bázikus alumínium-oxidon végzett kromatográfiával eltávolítjuk. Mindkét módszerrel közel azonos kihozatallal nyerjük a H₂TMPS-t.

A H₂TMPS előállítását Meunier [Meunier és munkatársai: Inorg. Chem. 31. 1999-2006 (1992)] módszerének csekély változtatásával állítjuk elő. Egy 25 ml-es gömblombikot felszerelünk egy visszafolyató kondenzálóval és egy keverővei, és bemérünk 1,0 g, 1,28 mmól H₂TMP-t, majd hozzáadunk 10 ml oleumot (H₂SO₄ + 18-23 % SO3), és a keveréket 80 °C-on 40 percig keverjük, majd lehűtjük, hozzáadunk cseppenként 100 ml vizet jéghűtés mellett. A kapott vizes oldatot 2 n NaOH-val semlegesítjük (kb. 220 ml), pH = 6-7 közötti értékig. A vizet ezután elpárologtatjuk, a visszamaradó szilárd anyagot minimális mennyiségű MeOH-val elkeverjük, a kiváló csapadékot szűrjük, és a szürletet vákuumban 60 ml térfogatra betöményítjük, A kiváló csapadékot (további Na₂SO₄) centrifugálással elválasztjuk. A felülúszót szárazra pároljuk, így 1,59 g, 78 % kívánt szulfonált porfirint nyerünk.

- 26 3. Példa

Acetato-5,10,15,20-tetrakisz(3,5-diszulfonátomezitil)-porfirin mangán(lll) oktanátriumsó (Mn(lll)TMPS) előállítása

0,2 g, 0,125 mmól H₂TMPS-t és 0,296 g, 1,71 mmól Mn(OAc)₂-t feloldunk 38 ml vízben, és 85 °C-on 1 órán át melegítjük. A reakció lefutását spektrometriával követjük, és akkor tekintjük befejezettnek, amikor a Sorét sávot (416 nm), ami jellemző a porfirin szabad bázisra, egy új sáv helyettesíti 460 nm-en, ez jellemző az Μ η (111 )-porf i ri n anyagra. A reakciókeveréket ezután vákuumban 10 ml térfogatra betöményítjük, és Dowex 50WX-8 kationcserélő gyantán (H+ forma) kromatografáljuk, a feleslegben lévő Mn(OAc)₂ eltávolítására. Az eluátumot ezután 10 ml térfogatra betöményítjük, a pH értékét H = 8-ra beállítjuk 1 n NaOH oldattal, majd a kapott oldatot szárazra pároljuk. A visszamaradó anyagot 7 ml MeOH-ban feloldjuk, és Sephadex LH-20 töltetű oszlopon kromatografáljuk, eluensként MeOH-t alkalmazunk. A bíborszínű sávokat gyűjtjük, ezt szárazra pároljuk, így 0,175 g (90 %) kívánt krémezett porfirint nyerünk, ezt tömegspektroszkópiával azonosítjuk.

4. Példa

Acetato-5,10,15,20-tetrakisz(3,5-diszulfonátomezitil)-porfirin vas (lll)-oktanátriumsó (Fe(lll)TMPS) előállítása

0,2 g, 0,125 mmól H₂TMPS-t és 0,3 g, 1,72 mmól Fe(OAc)₂-t feloldunk 38 ml vízben, majd visszafolyatásig melegítjük, és a reakció lefutását spektrokszópiával követjük. A reakció befejezése után az elegyet szűrjük, a térfogatát 10 ml-re betöményítjük, és a visszamaradó narancssárgás-barnás színű keveréket • » · ·

- 27 Dowex 50WX-8 kationcserélő gyanta oszlopon (H+ forma) átengedjük a feleslegben lévő Fe(OAc)₂ eltávolítására. Az eluátum térfogatát 10 ml-re csökkentjük, a pH-t pH = 7,5 értékre beállítjuk 1 n NaOH oldattal. A kapott oldatot szárazra pároljuk, a maradékot 7 ml MeOH-ban oldjuk, Sephadex LH-20 töltetű oszlopon kromatografáljuk MeOH-val. A narancssárgás-barnás sávokat szárazra pároljuk, így 0,170 g, 72 % kívánt Fe-porfirint nyerünk. Az anyagot tömegspektroszkópiával azonosítjuk.

5. Példa

Acetato-5,10,15,20-tetrakisz(3,5-diszulfonatomezitil)-porfirin nikkel(ll)-oktanátriumsó (Ni(ll)TMPS) előállítása

0,1 g, 0,063 mmól H₂TMPS-t és 0,156 g, 0,63 mmól Ni(OAc)₂-t feloldunk 20 ml vízben, visszafolyatás közben 3 órán át melegítjük, amikoris a keverék narancsszínű lesz, jelezve az Ni-porfirin jelenlétét. A reakció teljes végbemenetelét látható spektroszkópiával követjük. A reakciókeveréket 5 ml térfogatra betöményítjük, Dowex 50 WX-8 ioncserélő oszlopon (H+ forma) kromatografáljuk a feleslegben lévő Ni(OAc)₂ eltávolítására. Az eluátumot 5 ml térfogatra betöményítjük, a pH értékét pH = 8-ra beállítjuk 1 n NaOH oldattal, a kapott oldatot szárazra pároljuk, a visszamaradó anyagot 7 ml MeOH-ban oldjuk és Sephadex LH-20 töltetű oszlopon kromatografáljuk (MeOH). Az oldószer eltávolítása után nyerjük a terméket, ez 0,090 g, 85 % kívánt fémezett porfirin, ezt tömegspektroszkópiával igazoljuk.

- 28 ·: :. :. ?· >

6. Példa

N, N'-etilén-bisz(3,3'-dimetoxi-szalicilidén-amin) ligandum előállítása

Coleman és munkatársai módszerét módosítva járunk el [Coleman és munkatársai: Inorg. Chem. 20, 700 (1981)]. Egy 100 ml-es gömblombikot felszerelünk keverővei, és bemérünk 25 ml abszolút etanolt és 3,04 g, 0,02 mól 3-metoxi-szalicil-aldehidet. 20 ml vízmentes etanolból és 0,601 g, 0,01 mól etilén-diaminból frissen készített oldatot egy adagban szalicil-aldehidhez adagoljuk. A keveréket 1 órán át visszafolyatás közben melegítjük, amikoris sárgás narancsszínű csapadék válik ki. A terméket szűréssel elválasztjuk, 100 ml forró etanollal mossuk, vákuumban szárítjuk, így 4,4 g, 98 % kívánt terméket nyerünk.

7. Példa

Klór-[N, N*-éti lén-bisz(3,3'-di metoxi-szalicil idén-amináto)vas(lll) előállítása

O, 05 g, 0,188 mmól N,N'-etilén-bisz(3,3'-dimetoxi-szalicilidén-amint) feloldunk 20 ml MeOH-ban, hozzáadunk 0,030 g, 0,188 mmól Fe(CI)3-t egy adagban. Az oldatot visszafolyatás közben 1 órán át melegítjük, majd az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A bíborszínű maradékot minimális mennyiségű vízzel mossuk, a szilárd anyagot 10 ml MeOH-ban feloldjuk, szűrjük, majd az oldószert eltávolítjuk, így 0,047 g, 70 % kívánt vaskomplexet nyerünk.

••·· ···· ·

- 29 8. Példa

12.14- Dimetil-1,4,8,11-tetraaza-ciklotetradeka-11,13-dienátonikkel(ll)-hexafluorofoszfát, Ni(ll)([14]dienoN₄)PF₆ előállítása

Az Ni(ll)[14]dienoN₄)PFe vegyületet Matin és Cummings módszere szerint állítjuk elő [Martin, J.G.; Cummings, S.C.: Inorg. Chem. 12, 1477-1482 (1973)]. A vegyületet tömegspektroszkópiával azonosítjuk, eszerint a kapott vegyület megegyezik a kívánt szerkezettel.

9. Példa

12.14- Dimetil-1,4,8,11-tetraazaciklotetradeka-11,14-diénato-nikkel(ll)-hexafluorofoszfát,

Ni(ll)([14]diénN₄)(PF_s)₂, Ni(ll)([14]diénN₄)(PF₆)₂ előállítása

Az Ni(ll)([14]diénN₄)(PF₆)2-t Martin és Cummings módszere szerint állítjuk elő Ni(ll)([14]dienoN₄)PF₆-ból. [Martin, J.G.; Cummings, S.C.: Inorg. Chem. 12. 1477-1482 (1973)].

10. Példa

6,8,15,17-Tetrametil-dibenzo[b,i][1,4,8,11]tetraazatetradeka-2,4,7,9,12,14-hexaénatonikkel(ll), Ni(ll)[14]12énN₄ előállítása

Az Ni(ll)[14]12énN₄ vegyületet Goendken és munkatársai szerint állítjuk elő [Goendken és munkatársai: J.C.S. Chem. Comm., 337-338 (1973)]. A kapott komplexet tömegspektroszkópiával vizsgáljuk. Megállapítjuk, hogy az megegyezik a kívánt szerkezettel.

11. Példa

A példában bemutatjuk a peroxinitrit törzsoldat előállítását, amit a vizsgálatokhoz alkalmaztunk. Az előállítást Hughs és

- 30 munkatársai [Hughs, M.N.; Nicklin, H.G.: J. Chem. Soc. (A), 450-452 (1968)] által leírt módszer módosított változatával végeztük.

ml, 0,6 mólos NaNO₂ oldathoz 0 °C hőmérsékleten erőteljes keverés közben azonos térfogatú HCI/H₂O₂ oldatot adagolunk (0,6 mmól HCl és 0,7 mól H₂O₂), majd azután azonnal gyorsan hozzáadunk 10 ml, 0,75 mólos NaOH-t. A kapott sárga oldatot 25 mg MnO₂-vel 3 percig kezeljük, majd utána rögtön leszűrjük, a szűrletet -20 °C hőmérsékletű fagyasztóba tesszük, ott tartjuk néhány napon át, amikoris a nátrium-peroxinitrit frakcionálódása figyelhető meg egy finom sárga réteg formájában, ami a lombik tetején helyezkedik el. Ezt a sárga réteget elválasztjuk, ez kb. 1 ml 280 mmól-os nátrium-peroxinitrit oldat. Ezt az oldatot -20 ’C-on több napon át tárolhatjuk, minimális peroxinitrit bomlás mellett.

12. Példa

A példában leírjuk az eljárást, amellyel stopped-flow kinetikus analízis segítségével meghatározzuk, hogy a vegyület peroxinitrit bomlását elősegítő katalizátor-e.

A vizsgálatokat kálium-foszfát pufferek (Calbiochem) alkalmazásával végeztük, ezek mindegyike biológiai tisztaságú, és az előállításukhoz ultratisztaságú vizet alkalmaztunk Riley módszere szerint [Riley, D.P. és munkatársai: Anal. Biochem. 196. 344-349 (1991)]. A kinetikai vizsgálatokat OLIS-Rapid Scanning Stopped-Flow Spectrometer (On-Line Instrument Systems Inc., Bogart, Georgia) és OLIS-RSM-1000 operációs rendszer alkalmazásával végeztük. A peroxinitrit erős abszorpciót mutat 302 nm-nél (extinkciós koefficiens = 1670 M'¹ cm'¹), • ·

- 31 és a bomlási folyamat elsőrendű nátrium-peroxinitritben és elsőrendű protonokban [Hughs, M.N.; Nicklin, H.G.: J. Chem. Soc., (A), 450-452 (1968)], t_1/2 = 1,9 másodperc, 37 °C hőmérsékletnél pH = 7,4 [Beckman, J.S. és mts.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87, 1620-1624 (1990)].

Meghatároztuk e kísérletben a nátrium-peroxinitrit természetes háttér bomlási sebességét a következőképpen. Egy 24 mmól-os nátrium-peroxid törzsoldatot 50 mmól NaOH-ban egy kis térfogatú fecskendőbe vittünk, és 100 mmól kálium-foszfátot, pH = 7,4, bemértünk a stop-flow spektrofotométer nagy térfogatú fecskendőjébe. A stop-flow méréseket 22 °C 1 °C értéknél végeztük. Az oldatoknak a mintatartóba való beinjektálása a nátrium-peroxinitrit törzsoldat kb. 25-szörös hígítását eredményezte. A nátrium-peroxinitrit bomlása elsőrendű peroxinitritben, ti_/2 = 5,2 mp, és k_Ob_S = 1,39 χ 10'¹ + 0,15 mp‘¹. A katalitikus peroxinitrit bomlási aktivitás meghatározásához a fémkomplexet 100 mmól kálium-foszfátpufferban (pH = 7,4) oldottuk, és az oldatot a nagy fecskendőbe adagoltuk, és a peroxinitrit bomlását a fentiek szerint vizsgáltuk. A katalitikus sebesség konstans (k_cat M'¹ sec'¹) értékét a vizsgált komplexre különböző komplex koncentrációknál határoztuk meg, és ábrázoltuk a kobs vs [komplex] értékeket, az 1. táblázat szerinti komplexekre vonatkozóan. A k„bs értékeket három stopped-flow analízis átlagából nyertük mindegyik katalizátor koncentrációra. A különböző vegyületekre jellemző analízis adatokat az 1. ábrán mutatjuk be. Az egyszerű két- és háromértékű Mn, Fe, Co, Cu és Ni kloridsók nem mutattak katalitikus aktivitást a peroxinitrit bomlására 0,05 mmól és az alatti koncentrációkban.

- 32 • · · · · ·

1. Táblázat

Katalitikus sebességi konstansok a nátrium-peroxinitrit bomlására különböző fémkomplexek esetén pH = 7,4 és 22 °C értékeknél

A példa száma	Komplex	kcat (M 1 sec'1)
1.	Fe(lll)TMPyP	2,75 χ 10+6
	Fe(lll)TPPS	2,06 χ 10+6
	Methemoglobin	3,20 x 10+5
	Oxihemoglobin	2,94 χ 10*5
4.	Fe(lll)TMPS	1,60 x 10+5
5.	Ni(ll)TMPS	8,72 x 10+4
7.	Fe(lll)(3,3'MeO2Salen)	5,00 x 10+4
3.	Mn(lll)TMPS	2,90 x 10+4
8.	Ni(ll)[14]dienoN4)PF6	2,05 x 10+4
9.	Ni(l l)[14]diénN4)(PF6)2	1,80 x 10+4
10.	Ni(ll)[14]12énN4	1,70 x 10+4
	Fe(lll)EDTA	2,00 x 10+4
	Fe(lll)citrát	1,50 x 10+4
2.	H2TMPS	inaktív
1(SM)b	H2TMPyP	inaktív
	ZnTMPyP	inaktív
	Ni(CR)CI2 a	inaktív

^a CR = 2,12-dimetil-3,7,11,17-tetraazabiciklo[11.3.1 jheptadeka-1(17),2,11,13,15-pentán. ^b kiindulási anyag.

13. Példa

A példában bemutatjuk a CuZn-szuperoxid dizmutáz (CuZnSOD) inaktiválódását peroxinitrit hatására, valamint a 12. példa szerinti aktív, peroxinitrit bomlását elősegítő katalizátorok védő hatását a peroxinitrit inaktiválásával szemben.

- 33 Szarvasmarha máj CuZnSOD (DDI Pharmaceuticals Inc., Mountain View CA) törzsoldatokat állítunk elő úgy, hogy kb. 1 mg enzimet feloldunk 10 ml 50 mmólos kálium-foszfát pufferben pH = 7,4 értéknél. A kapott oldat dizmutáz-szuperoxiddal szembeni aktivitását Riley módszere szerint határoztuk meg [Riley, D.P. és munkatársai, Anal. Biochem., 196, 344-349 (1991)]. A k_obs értékek mindegyike három párhuzamos mérés átlaga, ezeket stopped flow spektrofotométeren (gyártó: Kinetic Instruments Inc., Ann. Arbor, Ml) végeztük, amit egy MAC IICX pc-vel kapcsoltunk össze.

CuZnSOD inaktiválódása peroxinitrittel

A peroxinitrit inaktiválását 1 ml CuZnSOD törzsoldatban vizsgáltuk, ezt 50 mmól-os kálium-foszfát pufferhoz adagoltuk (pH = 7,4), olyan mennyiségben, hogy az ossz térfogat 10 ml legyen a peroxinitrit és az EDTA oldatok adagolása után. Ehhez az oldathoz különböző mennyiségű peroxinitritet adagoltunk (25 mmól-os törzsoldatból), úgy, hogy a peroxinitrit végső koncentrációja a vizsgálatoknál 0, 25, 50, 75, 75 és 100 pmól legyen. A peroxinitrit beadagolása után 100 pl 2,5 mólos EDTA törzsoldatot adagoltunk mindegyik vizsgálandó oldathoz úgy, hogy az EDTA végső koncentrációja 250 pmól legyen. Mindegyik oldatot stopped-flow analízissel vizsgáltuk szuperoxid dizmutáz aktivitásra. A kobs vs peroxinitrit koncentráció görbét a 2. ábrán mutatjuk be. A kontroll reakció, amelynél CuZnSOD-t alkalmaztunk csak 250 pmól EDTA és 100 pmól kálium-nitrit vagy -nitrát jelenlétében, nem mutatott csökkenést a CuZnSOD aktivitásban.

14. Példa

CuZnSOD védése a peroxinitrittel való inaktiválással szemben peroxinitrit dekompozíciós katalizátorok alkalmazásával

A vizsgálati oldatokat a fentiek szerint állítottuk elő, kivéve a különböző peroxinitrit dekompozíciós katalizátorok adagolását. A végső oldat térfogatot 10 ml-re állítottuk be. A vizsgálati oldatokhoz Fe(lll)TMPyP-t (0,5 és 1 μίτιόΙ végső koncentrációban) és Fe(lll)TMPS-t (1,0 és 5,0 μηηόΙ végső koncentrációban) adagoltunk. Az oldatokat ezután különböző mennyiségű peroxinitrittel kezeltük, ezek végső koncentrációja 0, 25, 50, 75 és 100 μπόΙ volt. A peroxinitrites kezelés után EDTA-t adagoltunk 250 pmól koncentrációban. Az oldatokat ezután vizsgáltuk az SÓD aktivitásra. A különböző katalizátor koncentrációknál felvett kobs vs [peroxinitrit] görbék mutatják az Fe(lll)TMPyP s Fe(lll)TMPS anyagok védő hatását, ezt a 3. illetve a 4. ábrán mutatjuk be. A vizsgálati körülmények között az Fe(lll)TMPyP és Fe(lll)TMPS nem mutatott katalitikus hatást a szuperoxid dizmutációjára.

15. Példa

In vitro értékelés

Anyagok: Humán rekombináns tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-a), beszerzése Genzyme Corporation, Cambridge, MA; humán rekombináns complement C5A és L-arginin (L-arg), beszerzése Sigma Chemical Company, St. Louis, MO; autentikus peroxinitrit 50 mmól-os NaOH-ban, előállítása a fentiek szerint:

Endoteliális sejtek izolálása: humán dermális mikrovaszkuláris endoteliális sejteket (HDME sejtek) állítottunk elő

- 35 újszülött fitymájából, már korábban leírt módszer szerint [Marks, R.M., Czerniecki, M., és Penny, R., In Vit. Cell. Devel. Bioi., 21. 627-635 (1985)]. A különböző donorokból származó újszülött fitymaszövetet 70 %-os etanollal mostunk, kis darabokra vágtuk, majd tripszinbe (0,6 %; Irvine Scientific, Santa Ana, CA)és EDTA-ba (1 %, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) merítettük 7-9 percre. Az endoteliális sejteket eltávolítottuk úgy, hogy a szövet nem keratinizálódott felületét egy szike pengéjével nyomtuk. A sejteket 35 % Percoll sűrűség gradiensen keresztül (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) centrifugáltuk. A centrifugálást 250 x g mellett 10 percig végeztük, ezután a kisebb mint 1,048 g/ml sűrűségű sejteket összegyűjtöttük és egy zselatinnal borított szövettenyésztő edényre (0,1 %; Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) vittük. A szennyező sejteket naponta eltávolítottuk egy 25-ös tűvel, amelyet egy tuberkulin fecskendőhöz erősítettünk. A tisztított endoteliális sejteket növesztettük 5 passzálással (kb. 8 populációs egyesítés), közegként MCDB 131 tápközeget alkalmaztunk (endoteliális alaptápközeg; Clonetics Corporation), amely még a következőket tartalmazta: 30 % humán szérum (Bio Wittaker, Inc., Walkersville, MD), 10 ng/ml EGF (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA), 2 mmól L-glutamin (Irvince Scientific, Santa Ana, CA) és 250 pg/ml dibutiril cAMP, 1 qg/ml hidrokortizon (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). Ezeket a sejteket normál endoteliális sejtként jellemeztük, endoteliális sejt markerekkel (Faktor Vili immunoreaktivitás, sejt-kapcsolatos angiotenzin konvertáló enzim aktivitás és alacsony sűrűségű lipoprotein felvétel). A sejteket lefagyasztottuk az ötödik passzálásnál 10 % DMSO-ban a további vizsgálatokhoz való al- 36 kalmazáshoz a mikoplazmára való negatív tesztelés után (Coriel Institute, Camden, NJ).

Neutrofilek előállítása: humán neutrofileket izoláltunk egészséges donorok perifériális véréből [Look, D.C., Rapp, S.R., Keller, B.T. és Holtzman, M. J.: Am. J. Physiol., 263. L79-L87 (1992)]. Az EDTA anti-koagulált vért elválasztottuk egy egyetlen lépcsős sűrűség centrifugálással (PMN Prep, Robbins Scientific, Sunnyvale, CA), majd ezt követően többször átmostuk Hank-féle pufferolt sóoldattal (HBSS; Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) és az eritrociták hipotóniás lízisét végeztük. A készítmények neutrofil-tartalma >95 % mennyiségű és életképességük >95 % trypan blue (GIBCO Laboratories, Grand Island NY) kizárásnál. A tisztított neutrofileket HBSS-ben szuszpendáltuk, amely még 0,01 % BSA-t (Miles, Inc.,

Kankakee, IL) és 300 pmól L-arg-t (HBSSBA) tartalmazott 5 x 10⁶ sejt/ml koncentrációnál.

Endoteliálís sejtkárosodás vizsgálata: A stimulált neutrofilek vagy a peroxinitrit citotoxikus hatását az endoteliálís sejtekre az ⁵¹Cr-felszabadulási vizsgálattal végeztük Moldow módszere szerint [Moldow és munkatársai: Methods Enzymol., 105. 378-385 (1984)]. Ötödik passzált HDME sejteket növesztettünk kb. 1-2 χ 10⁴ sejt/cm² (kb. 90 %-os összefolyás) sűrűségig, 96-lyukú mikrotiter lemezekben, és 18 órán át 10 uCi/ml nátrium[⁵¹Cr]kromáttal jelöltük (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL). A HDME sejteket citokin-aktiváltuk 4 órán át 100 U/ml humán rekombináns tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-a; Genzyme Corporation, Cambridge, MA) alkalmazásával, majd kétszer HBSSBA-val mostuk. 2,5 x 10⁵/lyuk mennyiségben neutrofil szuszpenziókat adagoltunk, és hagytuk ülepedni 15

- 37 percen át. Hacsak másképpen nem említjük, a neutrofilek aktiválását 25 U/ml TNF-a alkalmazásával végeztük 10 percen át, majd 3 pg/ml komplement komponens C5a (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) anyaggal folytattuk az aktiválást. Az inkubálást 2 órán át 37 °C-on végeztük. Az autentikus peroxinitritek esetében azokat neutrofilek távollétében adagoltuk. A peroxinitritet közvetlenül a HDME sejtréteghez adtuk, 25 mmól-os törzsoldatból 50 mmól-os NaOH-ban, a végső koncentráció 0 - 800 pmól volt. Mindegyik inhibitort frissen készítettük közvetlenül a vizsgálat előtt HBSSBA-ban, és 1/10 lyuktérfogat mennyiségben adagoltuk a peroxinitrit adagolása vagy a neutrofiles aktiválás előtt.

Az ⁵¹Cr felszabadulást a lyukakban a felülúszóból határozzuk meg (oldható frakció). A monorétegeket gyengén átmossuk HBSSBA-val a nem-adherált sejtek eltávolítására, és a mosófolyadékot egyesítjük az oldható frakcióval. Az egyes lyukakból származó adherált sejteket 1 n NaOH-val oldjuk, és egy külön csőbe visszük át. Mindegyik frakciót gamma-szcintillációs spektrometriával analizáljuk. Az eredményeket ⁵¹Cr felszabadulás százalékban fejezzük ki a következő összefüggés alapján: % felszabadulás = cpm (oldható + nem-adherált/össz cpm lyukanként) x 100. A specifikus citotoxicitás vonatkozik a stimulált neutrofilek és nem-stimulált neutrofilek ⁵¹Cr felszabadulása közötti különbségre (általában 1-2 % fenti spontán felszabadulás). Az eredményeket 2-3 párhuzamos méréssel igazoltuk, és az adatokat ezek átlagaként adtuk meg.

Mint az az 5. ábrából kitűnik, a peroxinitrát adagolása az endoteliális sejtekhez dózisfüggő mértékben eredményezi a sejtkárosodást, mutatva a peroxinitrit citotoxikus hatását. Azok • ·

- 38 a komplexek, amelyeknél a stopped-flow analízissel kimutattuk, hogy peroxinitrit bomlást katalizáló hatásúak, képesek védőhatást kifejteni a peroxinitrit által közvetített sejtkárosodásra, 6. ábra. Ezek a komplexek ugyancsak képesek a neutrofilek által közvetített sejtkárosodás elleni védőhatás kifejtésére dózisfüggő mértékben, 7. ábra.

16. Példa

Sejtvédelem kimutatása peroxinitrit bomlást elősegítő katalizátorok alkalmazásával

Sejt életképességi vizsgálatot végeztünk, hogy gyorsan megállapítsuk a peroxinitrit (PN) katalizátorok hatásosságát a PN-közvetített károsodással és elhalással szemben. A sejtek károsítására szintetikus PN-t adagoltunk exogén a sejtekhez. A PN katalizátoroknak a sejtekkel szembeni védőhatásának még jobb meghatározása érdekében olyan mennyiségben adagoltuk a peroxinitritet, amely maximális károsodást (100 %) vált ki a sejtekben, ez 50 mmól peroxinitrit NaOH-ban, és ezt a sejteket tartalmazó vizsgáló lyukakba katalizátor jelenlétében vagy anélkül adagoltuk. Maga az NaOH hordozó nem volt toxikus.

A sejteket (RAW 264,7 sejtek vagy P815 masztocitoma sejtek; American Type Culture Collection, Rockville, MD) 96-lyukú szövettenyésztő lemezekre rétegeltük összefolyásig. Mindegyik lyukat kétszer Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt sóoldattal (DPBS; GIBCO BRL, Grand Island, NY) mostuk a protein és más szérumkomponensek eltávolítására, amelyek az exogén peroxinitrittel reakcióba léphetnek. Mindegyik lyukba ezután 200 μΙ DPBS-t adagoltunk. A PN-t ezután külön lyukba vittük növekvő koncentrációban, és vizsgáltuk a sejtek életképessé··*·

- 39 gét. Azt a dózist használtuk a katalizátor védőhatásának kimutatására, amelynél maximális sejtpusztulást értünk el.

Az egyes, sejteket tartalmazó lyukakba ezután foszfáttal pufferolt sóoldatot adagoltunk 200 μΙ mennyiségben, amely növekvő mennyiségben tartalmazta a katalizátort. A maximális dózisú PN-t ezután beadagoltuk a sejtekhez, majd 15 perc elteltével a közeget eltávolítottuk, és a sejteket vagy hagytuk egy éjszakán át Earles minimum essential közegben fenolvörös nélkül 10 % borjúszérummal állni, vagy a sejtlemezeket vizsgáltuk mitochondriális integritásra az Alamar Blue életképességi vizsgálattal [Alamar Biosciences, Inc.; Sacramento, CA.). Mindegyik esetben a sejteket 37 °C-on 5 % CO₂ jelenlétében inkubáltuk.

A sejtkárosodást a következőképpen határoztuk meg. Mindegyik lyukba 10 % Alamar Blue-t adagoltunk Earles MÉM tápközegben (tf/tf), amely még 10 % FBS-t is tartalmazott, 1-2 órán át. A festék sejt metabolizmusa fluoreszcens terméket eredményez, amely közvetlenül összefüggésben van az életképes sejtek számával. Továbbá, a fluoreszcens metabolit termelődése lineáris 2 órán át. Ezután meghatároztuk a fluoreszcens termék mennyiségét 100 μΙ kondicionált tápközegben, ami a lyukakból származott, majd IDEXX fluoreszcens síkleolvasóval (értékbeállítás: 1 %) vizsgáltuk 575 nm emissziós hullámhoszszon, 545 nm-en való gerjesztés/aktiválás után. Az életképesség mértékét vagy abszolút fluoreszcens egységekben, vagy a kezeletlen sejtekhez viszonyított százalékos értékben adtuk meg.

Mint az a 8. ábrából kitűnik, mind az Fe-, mind az Ni-koordinált katalizátorok védelmet fejtettek ki a patkány monocita-makrofág RAW 264.7 sejtvonalakkal szemben; ennél a • ··

- 40 kísérletnél a PN-t olyan dózisban adagoltuk, ami 50 %-os mértékben csökkentette a sejtek életképességét.

Összehasonlítva a növekvő PN dózisokat az RAW és P815 sejtek esetén, nem találtunk bizonyítékot a differenciált peroxinitrit-közvetített károsodásokkal szembeni érzékenységre (adatok nem láthatók). Azonban, mint az a 9. ábrából kitűnik, szignifikáns sejtvédelem mutatható ki Fe-TMPyP, FeTMPS és FeTPPS esetén, míg a H₂TMPyP és ZnTMPyP viszonylag hatástalan volt (adat nem látható), ez az eredmény konzisztens a katalitikus hatás hiányával. Ha a katalizátort a PN adagolása után adagoltuk, az nem volt képes a sejteket a sejtkárosodástól megvédeni (adat nem látható), jelezve, hogy a katalizátor a sejteket közvetlenül a PN által okozott oxidatív károsodástól védi meg.

17. Példa

In vivő értékelés

Karrageen-indukált talp ödéma: A peroxinitrit katalizátorok in vivő hatását karrageen-indukált talp ödéma esetén vizsgáltuk. Ezen gyulladásos in vivő modell kiválasztását az indokolta, hogy 1) a gyulladásos választ NOS inhibitorok blokkolják, és 2) a szuperoxid dizmutáz (SÓD) is blokkolja. Ez jelzi mind az NO, mind az O₂‘ részvételét. A kísérletnél hím Sprague-Dawley patkányokat alkalmaztunk (Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, IN), a patkányok tömege 175 - 200 g, az állatoknak szubplantáris injekció formájában a jobb hátsó talpba karrageent adagoltunk (0,1 ml 1 %-os szuszpenzió 0,85 % sóoldatban). A talptérfogatot plethysmometer-rel mértük közvetlenül a karrageen injekció előtt, majd 1 órás intervallumokban 1-6

- 41 órán át. Az ödémát a talptérfogat növekedésével fejeztük ki (milliliterben), amelyet a karrageen injekció beadagolása után észleltünk, viszonyítva az egyes állatoknál az injekció előtt meghatározott értékekhez.

A patkányoknak az aktív vagy inaktív peroxinitrit katalizátorokat bolus i.v. injekció formájában adagoltuk, 1 órával a karrageen intraplantáris injekcióját követően; a talpak duzzadását ezután minden 1 órában mértük 6 órán át. A relatív százalékos gátlás értékét a 2. táblázatban foglaljuk össze. Az adott kísérleti körülmények között az inaktív peroxinitrit katalizátorok (H₂TMPS, ZnTMPyP vagy MnTPPS, mindegyik 30 mg/kg mennyiségben vagy FeCI₃ 5 mg/kg mennyiségben, n = 6) nem gátolták az ödéma kialakulását.

2. Táblázat

Talpödéma százalékos gátlása peroxinitrit dekompozíciós katalizátorokkal

Vegyület	Dózis (mg/kg)	Idő (óra) a karrageen adagolása után
1	2	3	4	5	6
FeTMPS	3	0	42	47	47	33	33
	10	0	61	60	53	53	47
	30	0	85	80	80	80	81
FeTMPy	3	0	9	10	17	6	0
	10	0	13	11	28	21	2
	30	0	44	43	50	32	32
FeTPPS	3	0	29	20	20	19	5
	10	0	17	20	23	19	20
	30	0	27	25	30	34	33

• · ·

Vegyület	Dózis (mg/kg)	Idő (óra) a karrageen adagolása után
1	2	3	4	5	6
ZnTMPS	30	0	0	0	0	0	0
H2TMPS	30	0	0	0	0	0	0
MnTMPS	30	0	0	0	0	0	0

A talpödéma százalékos gátlási értékeit a kontroll értékekhez viszonyítva határoztuk meg, mindegyik esetben azonos ponton végeztük a mérést. Mindegyik pont az n = 6 kísérleti állat átlagértéke ± s.e.m.

Bélkárosodás kiváltása endotoxinnal patkányoknál

A több szervet érintő károsodás szindróma (Multiple organ failure syndrome (MOFS)), ami a szeptikus támadásokat követően alakul ki, a legtöbb esetben halálos. Az MOFS motor-ja a gasztrointesztinális traktus és különösen a vékonybél. Igen kiterjedt károsodás található a bél nyálkahártyákban a jelentős mértékű érszűkület következtében. Az ischémia és a hipoxia nyálkahártya károsodást eredményez, és ezt találtuk a legtöbb állatnál (patkány, macska, kutya), valamint embereknél is. A nyálkahártya károsodás eredete a hipoxia. A reperfúzió alatt (pl. a kezdeti komoly érszűkületet követően) O₂' szabadulhat fel, és ez fontos szerepet játszik a nyálkahártya patogenézisében a gyomor-bél (Gl) rendszerben. A sphlanchnic artéria elzáródása által kiváltott sokkból eredő bélkárosodás megakadályozható a szuperoxid dizmutázzal, és az LPS-kiváltott bélgyulladás a nitrogén(ll)-oxid nem-szelektív inhibitoraival (Boughton-Smith, N.K. és munkatársai, 1993). Lényeges » * «· ·

- 43 kísérleti és klinikai bizonyíték van arra vonatkozóan, hogy a felesleges NO képződés fontos patológiai szerepet játszik a magas vérnyomás kialakulásában, az érszűkület kialakulásában, valamint a szeptikus sokk által kiváltott kardiovaszkuláris rohamokban. Továbbá, a nitrogén(ll)-oxid szintáz inhibitorok gátló hatást fejtenek ki az endotoxin által okozott bélkárosodással szemben. Kifejlesztettünk egy modellt a patkányoknál az endotoxin által kiváltott bélkárosodásra és a peroxinitrit katalizátorok ezzel kapcsolatos terápiás hatásának megállapítására.

Az intesztinális vaszkuláris permeabilitást az intravénásán adagolt (0,5 ml; 0,5 μθΐ) [¹²⁵l]-jelzett szarvasmarha szérumalbuminnak ([¹²⁵I]-BSA) a jejunális szövetbe való szivárgásával határoztuk meg, az intravénás adagolással egyidejűleg LPS-t (3 mg/kg, szerotípus O111:B4) vagy izotóniás oldatot adagoltunk. 4 órával az LPS adagolása után egy jejunális szövet szegmenst leválasztottunk és eltávolítottuk. Az intesztinális szövetet gyorsan mostuk, szárítottuk és a tömegét megmértük. 0,5 ml-es vérmintát vettünk egy csőbe, amely trinátrium-citrátot tartalmazott (0,318 % végső koncentráció), és plazmát készítettünk centrifugálással (10 000 g x 10 perc). Ezután gamma-számlálóval meghatároztuk a [¹²⁵I]-BSA tartalmat a teljes szövet szegmensében, valamint a plazma alikvot részében (100 μΙ). Az intesztinális szövet teljes plazmatartalmát μΙ/g szövet menynyiségben fejeztük ki. Az intesztinális szövet intravaszkuláris térfogat-változását egy további patkány kísérleti állatcsoporton határoztuk meg úgy, hogy intravénásán 2 perccel a jejunum eltávolítását megelőzően (¹²⁵l)-BSA-t adagoltunk. A radiojelzett szövet- és plazmatartalmat az intravaszkuláris térfogatban határoztuk meg és μΙ/g szövet értékben fejeztük ki. Ezt az értéket • · ····· · ·· • ········· ·· · ··· · · · ··

- 44 kivontuk a plazma-szivárgás vizsgálatnál kapott értékből, így kaptuk az intesztinális plazma albumin-szivárgás értékét. 4 órával az LPS adagolása után szignifikáns (P < 0,01) növekedést határoztunk meg a plazma szivárgásban (77±10 értékről 224±18 μΙ/g szövet értékre, n = 8). 3 órával az LPS injekció után FeTMPS-t vagy FeTMPyP-t adagoltunk (30 mg/kg i.v., n = 4), és ez a radiojelzett albumin-szivárgás csökkenését váltotta ki, ezt 1 órával később határoztuk meg, az eredmények a 10. ábrán láthatók. Ezzel szemben a ZnTMPyP inaktív peroxinitrit katalizátor adagolását követően (30 mg/kg i.v., n = 4) 3 órával az LPS injekció után nem határoztunk meg radiojelzett albuminszivárgás gátlást 1 óra elteltével (10. ábra). Ezeket az eredményeket a jejunális szövetek szövettani vizsgálatával is alátámasztottuk. Ha a sóoldattal kezelt patkányokhoz hasonlítjuk, az LPS jelentős mértékű jejunális károsodást váltott ki a redők és a bolyhok komoly széttöredezésével. Az LPS-kiváltott károsodás kevésbé volt komoly az FeTMPS vagy FeTMPyP anyagokkal kezelt patkányokból vett minták esetében (30 mg/kg, i.v.).

A fentiek alapján a találmány szerinti vegyületek vagy komplexek újak és alkalmazhatók különböző gyulladásos betegségek és elváltozások kezelésére. így például alkalmazhatók a következő esetekben: az ischémiás szervek reperfúziós károsodása, például reperfúziós károsodás az ischémiás miokardiumban, gyulladásos bélbetegségek, reumás arthritis, osteoarthritis, magas vérnyomás, psoriasis, szerv transzplantációknál kilökődések, szervkonzerválás, impotencia, sugárzás-indukált károsodások, asztma, atherosclerosis, trombózis, vérlemezke aggregáció, rák áttételek kezeléséből származó gyógyszer mellékhatások, influenza, agyvérzés, égési sebek, • · • · · · · · · • · · · · · · ····· · · · • ·*······· ·· · * · · · · · ··

- 45 trauma, akut pancreatitis, vese- és vesemedence gyulladás, hepatitis, autoimmun betegségek, inzulin-függő diabetes mellitus, disszeminált intravaszkuláris koaguláció, zsír embólia, felnőtt és gyermekkori respirációs elváltozások és hemorrhagia újszülötteknél.

Az IL-2 terápiával kezelt betegeknél gyakran fejlődik ki potenciális életveszély a mellékhatások következtében, ilyenek például a láz, hidegrázás, hipotenzió, kapilláris szivárgási szindróma, valamint több szervre kiterjedő diszfunkció, ilyenek különösen a veseelégtelenség és az epepangással kapcsolatos sárgaság. Az IL-2 a citokinek egy komplex hálózatát indukálja, ezek közé tartozik a tumor nekrózis faktor, interleukin 1 és 6. így az IL-2-kezelt betegek endotoxémiás betegek (hipotenzió, megnövekedett TNF szint, megnövekedett citokinszint, stb). Néhány ezek közül szabad gyökök felszabadulását indukálja, valamint iNOS-t indukál, ezt követő NO felszabadulással együtt. A legutóbbi kutatások azt mutatják, hogy az iNOS olyan betegeknél indukálódik, akik IL-2-kezelést kapnak vese sejtkarcinóma és rosszindulatú melanóma esetén [Hibbs, J.B. és munkatársai: Evidence fór cytokine-inducible nitric oxide synthesis from L-arginine in patients receiving interleukin-2 therapy. J. Clin. Invest. 89. kötet, 867-877.]

A találmány szerinti vegyületek vagy komplexek szuperoxid dizmutázzal szembeni védő hatását a fentiek szerinti stopped-flow kinetikus vizsgálattal mutathatjuk ki. A stopped-flow kinetikus analízis egy pontos és közvetlen módszer a peroxinitrit károsításának kvantitatív meghatározására vízben. A stopped-flow kinetikus analízis alkalmas a peroxinitrit bomlással szemben katalitikus hatású komplexek kiszűrésére és a találmány szerinti • · · • · · · · · · ····· · ·· • ········· ·· · «·· · · · · ·

- 46 aktív komplexek stopped-flow analízis alapján azonosítva alkalmasak a fentiekben említett betegségek és elváltozások kezelésére.

Más szavakkal, a találmány szerinti készítmények előnyösen befolyásolják a peroxinitrit bomlásával kapcsolatos betegségeket és a készítmények gyorsítják a természetes mértéket meghaladó mértékben a peroxinitrit bomlását olyan betegeknél, akik ilyen betegségben szenvednek, amikor ezeket a fémkomplexeket tartalmazó készítményeket dózisegység formájában a peroxinitrit bomlására nézve hatásos mennyiségben adagoljuk. Ezekkel a készítményekkel az említett betegségek úgy kezelhetők, hogy az hátrányosan nem befolyásolja a normál biológiai mechanizmust.

A gyógyszerkészítményeket adagolhatjuk naponta egy dózisban vagy több részletre osztva, a dózis értéke például 1 - 100 mg/testtömeg kg naponta, előnyösen 3 - 30 mg/kg. A dózisegység készítmény ezeket a mennyiségeket több adagban tartalmazza a napi adagoláshoz. Az ilyen kisebb adagokat előnyösen 1-3-szor adagoljuk naponta kb. 30 mg/kg mennyiségben egységenként. A dózisok szérumkoncentrációja 15 pmól -1,5 mmól, előnyösen 3 - 300 μσιόΙ közötti érték.

A hordozóanyaggal elkevert hatóanyag mennyisége általában függ a kezelendő betegtől és az adagolás módjától.

A betegségek kezelésére alkalmazott dózisok különböző faktoroktól függhetnek, ilyen például a beteg kora, tömege, neme, az étrendi és egyéb orvosi tünetek, a betegség komolysága, az adagolás módja, az adott vegyület különböző farmakológiai adottságai, így aktivitás, hatásosság, farmakokinetikai és toxikológiai profil, valamint az, hogy a készítmény tartalmaz-e ha- 47 • · · · · · · ····· · · · • ········« ·· · ··· · · « ·· tóanyag szállító rendszert és hatóanyag-kombinációban történik-e az adagolás. Ily módon az alkalmazott adott dózis széles körben változhat, és eltérhet a fentiekben megadott dózis intervallumtól is.

A találmány szerinti vegyületeket adagolhatjuk orálisan, parenterálisan, inhaláció útján, rektálisan vagy topikálisan a különböző dózisegységek formájában, amelyek a hatóanyagon kívül nemtoxikus, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagokat, adjuvánsokat és vivőanyagokat tartalmaznak. A topikális adagolás lehet továbbá még transzdermális adagolás is, így például transzdermális tapaszok és iontoforézisos eszközök útján is. A parenterális adagolás magában foglalja a szubkután, intravénás, intramuszkuláris, intraszternális adagolást, valamint az infúziós eljárást is.

Az injekciózható készítmények lehetnek például steril injekciózható vizes vagy olajos szuszpenziók, ezeket a szakterületen ismert módon állítjuk elő, alkalmas diszpergáló- vagy nedvesítő- és/vagy szuszpendálószerekkel. A steril injekciózható készítmények lehetnek steril injekciózható oldatok vagy szuszpenziók, nemtoxikus, parenterálisan elfogadható hígítóanyagban vagy oldószerben, így például az oldószer lehet 1,3-bután-diol. Az alkalmas hordozók és oldószerek lehetnek például a következők: víz, Ringer-féle oldat, valamint izotóniás nátrium-klorid-oldat. Oldószerként vagy szuszpendáló közegként továbbá alkalmazhatunk steril fixált olajokat, amelyeket általában oldószerként vagy szuszpendáló közegként alkalmaznak. Erre a célra bármilyen fixált olaj alkalmazható, ilyenek például a szintetikus mono- vagy digliceridek. Továbbá zsírsavak, így például olajsav is alkalmazható injekciók előállítására.

• · · · • ·

- 48 Rektális adagolásra alkalmas kúp készítményeket úgy állíthatjuk elő, hogy a hatóanyagot alkalmas, nem irritáló vivőanyaggal, így például kakaóvajjal és polietilénglikollal keverjük el, amely anyagok normál hőmérsékleten szilárdak, de a rektális adagolás hőmérsékletén folyékonyak, és ily módon a bevitel után megolvadnak, és a hatóanyag felszabadul.

Az orális adagolásra alkalmas szilárd készítmények lehetnek kapszulák, tabletták, pirulák, porok, granulátumok és gélek. Ezen készítményeknél a hatóanyagot legalább egy inért hordozóval, például szacharózzal, laktózzal vagy keményítővel keverjük el. Ezek a készítmények a normál gyakorlatban még egyéb anyagokat is tartalmazhatnak, így például kenőanyagokat, például magnézium-sztearátot. Kapszulák, tabletták és pirulák esetén a dózisegység tartalmazhat még pufferanyagot is. A tablettákat és pirulákat előállíthatjuk enterális bevonattal is.

Az orális adagolásra alkalmas folyékony dózisok lehetnek gyógyszerészetileg elfogadható emulziók, oldatok, szuszpenziók, szirupok, valamint elixírek, ezek általában a szakterületen ismert inért hígítóanyagokat, így például vizet tartalmaznak. A készítmények tartalmazhatnak továbbá adjuvánsokat is, így például nedvesítőszereket, emulgeáló- és szuszpendálószereket, továbbá édesítő-, íz- és illatanyagokat.

Bár a találmány szerinti vegyületeket általában egyetlen hatóanyagként adagoljuk, a készítmények tartalmazhatnak még továbbá egy vagy több találmány szerinti hatóanyagot vagy egy vagy több más ismert hatóanyagot is, amelyek az adott betegség kezelésére alkalmasak.

Claims (10)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Gyógyszerkészítmény humán betegségek kezelésére, amelyeket előnyösen befolyásol a peroxinitrit gyorsított bomlása, és amely készítmény a peroxinitrit bomlása gyorsításához elegendő mennyiségben tartalmaz egy peroxinitrit bomlását katalizáló fémkomplexet.
2. 2. Gyógyszerkészítmény dózisegység formájában a következő humán betegségek kezelésére: ischémiás reperfúziós károsodás, rák kemoterápiás kezelésből származó mellékhatások, gyulladások, szepszis, agyvérzés, miokardiális infarktus, multiplex sclerosis és Parkinson-kór, és amely készítmény a peroxinitrit bomlása gyorsításához elegendő mennyiségben tartalmaz egy peroxinitrit bomlását katalizáló fémkomplexet.
3. 3. Az 1-2. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a fémkomplex egy Mn, Fe, Ni vagy V fém ligandum.
4. 4. A 3. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a fémkomplex Mn, Fe vagy Ni és egy makrociklusos ligandum komplexe.
5. 5. A 4. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a fémkomplex egy fémet tartalmazó porfirin vagy azamakrociklusos vegyület.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a fémkomplex egy valamely következő általános képletnek megfelelő vegyület:

   (I) általános képletnek megfelelő vegyület, amely képletben:

   R₃, Re, Re vagy R12 jelentése egymástól függetlenül H, alkil-, alkenil-, CH₂COOH, fenil-, piridinil- vagy N-alkil-piridil-cso• · ···*· · ·· • ········· · · ··· · · · · ·

   - 50 port - ezeket az (a), (b) és (c) képlettel írjuk le és amelyek a szénatomhoz kapcsolódnak, és a fenilcsoport adott esetben valamely következő csoporttal szubsztituálva van: halogénatom, alkil-, aril-, benzil-, COOH, CONH₂, SO₃H, NO_2i NH₂, N(R)₃* képletű csoport, ahol

   R jelentése hidrogénatom, alkil- vagy alkil-aril-csoport;

   a piridinilcsoport adott esetben valamely következő csoporttal szubsztituálva van: halogénatom, alkil-, aril-, benzil-, COOH, CONH₂, SO₃H, NO₂, NH₂, N(R)₃ ⁺ vagy NHCOR' általános képletű csoport, ahol R jelentése a fenti és R' jelentése alkilcsoport, és az N-alkil-piridin-csoport adott esetben a következő csoportokkal szubsztituálva van: halogénatom, alkil-, aril-, benzil-, COOH, CONH₂, SO₃H, NO₂, NH₂, N(R)₃ ⁺ vagy NHCOR' általános képletű csoport, ahol R és R' jelentése a fenti;

   Rí, R2, R₄, Rs, R7, Re, R10 vagy Rn jelentése egymástól függetlenül H, alkil-, alkenil-, karboxialkil-, Cl, Br, F, NO₂, hidroxi-alkil- vagy SO₃H csoport, vagy Rí és R₂ jelentése együttesen egy 5-8 szénatomos, előnyösen 6 szénatomos gyűrűt alkotnak;

   X és Y jelentése alkalmas ligandum vagy töltés-semlegesítő anion, amely bármilyen monodentát vagy polidentát koordináló ligandumból vagy ligandum rendszerből vagy annak megfelelő anionjából (például benzoesav vagy benzoát anion, fenol vagy fenoxid anion, alkohol vagy alkoxid anion) származik, és jelentése egymástól függetlenül valamely kö- 51 vetkező csoport: halid, oxo, aquo, hidroxo, alkohol, fenol, dioxigén, peroxo, hidroperoxo, alkilperoxo, arilperoxo, ammónia, alkil-amino, aril-amino, heterociklusos alkil-amino, heterociklusos aril, amino, amin-oxidok, hidrazin, alkil-hidrazin, aril-hidrazin, nitrogén(ll)oxid, cianid, ciánét, tiocianát, izocianát, izotiocianát, alkil-nitril, aril-nitril, alkil-izonitril, áril-izonitriI, nitrát, nitrit, azido, alkil-szulfonsav, aril-szulfonsav, alkil-szulfoxid, aril-szulfoxid, alkil-aril-szulfoxid, alkil-szulfénsav, aril-szulfénsav, alkil-szulfinsav, aril-szulfinsav, alkil-tiol-karbonsav, aril-tiol-karbonsav, alkil-tiol-tiokarbonsav, aril-tiol-tiokarbonsav, alkil-karbonsav (például ecetsav, trifluor-ecetsav, oxálsav), aril-karbonsav (például benzoesav, ftálsav), karbamid, alkil-karbamid, aril-karbamid, alkil-aril-karbamid, tiokarbamid, alkil-tiokarbamid, aril-tiokarbamid, alkil-aril-tiokarbamid, szulfát, szulfit, biszulfát, biszulfit, tioszulfát, tioszulfit, hidroszulfit, alkil-foszfin, aril-foszfin, alkil-foszfin-oxid, aril-foszfin-oxid, alkil-aril-foszfin-oxid, alkil-foszfin-szulfid, aril-foszfin-szulfid, alkil-aril-foszfin-szulfid, alkil-foszfonsav, aril-foszfonsav, alkil-foszfinsav, aril-foszfinsav, alkil-foszfinossav, aril-foszfinossav, foszfát, tiofoszfát, foszfit, pirofoszfit, trifoszfát, hidrogén-foszfát, dihidrogén-foszfát, alkil-guanidino, aril-guanidino, alkil-aril-guanidino, alkil-karbamát, aril-karbamát, alkil-aril-karbamát, alkil-tiokarbamát, aril-tiokarbamát, alkil-aril-tiokarbamát, alkil-ditiokarbamát, aril-ditiokarbamát, alkil-aril-ditiokarbamát, bikarbónát, karbonát, perklorát, klórét, klorit, hipoklorit, perbromát, bromát, bromit, hipobromit, tetrahalo-manganát, tetrafluor-borát, hexafluor-foszfát, ····· · ·· • ·······»· ·· ··· · · · ··

   - 52 hexafluor-antimonát, hipofoszfit, jódat, perjodát, metaborát, tetraaril-borát, tetraalkil-borát, tartarát, szalicilát, szukcinát, citrát, aszkorbát, szacharinét, aminosav, hidroxaminsav, tiotozilát, továbbá ioncserélő gyantákból vagy gyantarendszerekből származó anionok; azzal a megkötéssel, hogyha az X és Y-tartalmú komplex pozitív töltésű, akkor Z jelentése egy ellenion, ami független X-től vagy Y-tól, vagy ha az X és Y-tartalmú komplex negatív töltésű, akkor Z jelentése egy ellenion, amely valamely következő: alkáli vagy alkálifém-kation, szerves kation, így például alkil- vagy alkil-aril-ammónium kation; és

   M jelentése valamely következő fém: Mn, Fe, Ni vagy V;

   (II) általános képletű vegyület - a képletben

   R' jelentése CH vagy N;

   Rí, R2, R3. R4, R5, Re, R7, Re, R9, Rio, Rl1, R12, R13, Rl4, Rl5 ÓS Ri₆ jelentése egymástól függetlenül valamely következő csoport: H, SO₃H, COOH, NO₂, NH₂ vagy N-alkil-amino-csoport,

   X, Y, Z és M jelentése a fenti;

   (Illa) általános képletű vegyület, amely képletben

   Rí, Rs, Rg és R₁₃ jelentése egymástól függetlenül vegyértékkötés vagy CH₂ csoport;

   R2, Rz’, R4, R4¹, Ρβ, Re', Re, Re', R10, Rio', R12, R12', R14, R14', R16, Ris' jelentése egymástól függetlenül H vagy alkilcsoport;

   R3, R7, R11, R15 jelentése egymástól függetlenül H vagy alkilcsoport;

   X, Y, Z és M jelentése a fenti;

   • · · · ···· ····

   - 53 (IIIB) általános képletű vegyület, amely képletben

   Rí, Rs, Re és R12 jelentése egymástól függetlenül vegyértékkötés vagy CH₂ csoport;

   R2, R₂', R*i R4', Re, Re', R7, R9, R9', R11, R11', R13, R13', R14 jelentése egymástól függetlenül H vagy alkilcsoport;

   R₃ és R₁₀ jelentése egymástól függetlenül H vagy alkilcsoport;

   X, Y, Z és M jelentése a fenti;

   (IIIC) általános képletű vegyület a képletben

   Rí, R4, Re, R12 jelentése egymástól függetlenül vegyértékkötés vagy CH₂ csoport;

   R2, R2', R3, Rs, Rs', R7, R9, R9', R11, R11', R13, Ri3', R14 jelentése egymástól függetlenül H vagy alkilcsoport;

   R10 jelentése H vagy alkilcsoport;

   X, Y, Z és M jelentése a fenti;

   (IIID) általános képletű vegyület, a képletben

   Rí, R₄, R7 és R10 jelentése egymástól függetlenül vegyértékkötés vagy CH₂ csoport;

   R2, R2', R3, Rs, Rs', Re, Re, Rs', R9, R11, Rn' és R₁₂ jelentése egymástól függetlenül H vagy alkilcsoport;

   X, Y, Z és M jelentése a fenti;

   (IIIE) általános képletű vegyület - a képletben

   Rí, R4, Rs és Rn jelentése egymástól függetlenül vegyértékkötés vagy CH₂ csoport;

   R2, R3, R3', Rs, Rs', R7, R7', R9, R10, Rio', R12, R12' és Ri₃ jelentése egymástól függetlenül H vagy alkilcsoport;

   • · * te · · ♦ · · te j « « • A « · · a··« · « · «·· · · « ·»

   - 54 R₆ jelentése hidrogénatom vagy alkilcsoport;

   X, Y, Zés M jelentése a fenti;

   (IIIF) általános képletű vegyület - a képletben

   Rí, R<, R7, és R₁₀ jelentése egymástól függetlenül H vagy alkilcsoport;

   R2, R3, R3'. Rs, Rs', Re, Re, R9, R9'. R11. R11' és R12 jelentése egymástól függetlenül H vagy alkilcsoport;

   X, Y, Z és M jelentése a fenti;

   (IIIG) általános képletű vegyület - a képletben

   Rí, R₃, R4 és R₆ jelentése egymástól függetlenül H vagy alkilcsoport;

   R₂ és R₅ jelentése egymástól függetlenül H, alkil-, SO₃H, NO₂, NH₂, halogén, COOH és N(R)₃ ⁺ csoport, ahol R jelentése a fenti;

   X, Y, Z és M jelentése a fenti;

   (IIIH) általános képletű vegyület - a képletben

   Rí, R2, R3, R4 jelentése egymástól függetlenül H, alkil-, SO₃H, NO₂, NH_2i halogén, COOH vagy N(R)₃ ⁺ képletű csoport, ahol R jelentése a fenti,

   X, Y, Z és M jelentése a fenti;

   (IV) általános képletű vegyület - a képletben

   Rí, Rí', R21 R2', R3, R3', R4, R4', Rs, Rs', Re, Re', R7 és R7' jelentése egymástól függetlenül Η, alkil, alkoxi, NO₂, aril, halogén, NH₂, SO₃H csoport, és R₆, Re', R7 és R₇' mindegyike együttesen egy másik R₆, Re', R7 és R7¹ csoporttal egy cik• ♦

   - 55 lusos, előnyösen 6 szénatomos cikloalkilcsoportot is alkothat,

   M¹ jelentése Fe, Ni vagy V,

   X, Y és Z jelentése a fenti.
7. 7. A 6. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a fémkomplex egy (I) általános képletnek megfelelő vegyület - a képletben Rí, R₂, R3, R4, Rs, Re, R7, Re, Rg, R10, R11, R12, Μ, X, Y és Z jelentése a 6. igénypont szerinti.
8. 8. A 6. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a fémkomplex egy (II) általános képletnek megfelelő vegyület, amely képletben Rí, R₂, R₃, R₄, Rs, Re, R7, Re, Rg, R10, R11, R12, R13, Ri4, X, Y és Z jelentése a 6. igénypont szerinti.
9. 9. A 6. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a fémkomplex egy (IV) általános képletnek megfelelő vegyület - a képletben Rí, Rí', R2, R2', R3, R3', R4, R4', Rs, Rs', R6, Re', R7, R₇', X, Y, Z és M¹ jelentése a 6. igénypont szerinti.
10. 10. A 6-9. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a fémkomplexben a fém valamely következő fém: Mn, Fe, Ni vagy V.