CZ323496A3 - Pharmaceutical composition containing a catalyst of peroxy nitrite decomposition - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobů užití komplexů kovů k rozkladu peroxydusitanu, nových farmaceutických kompozic a způsobů jejich užití.

Vynález poskytuje zejména způsob léčby vybraných nemocí, zahrnující rozklad peroxydusitanu použitím sloučeniny, kterou je komplexem kovu. Tento rozklad s výhodou poskytuje benigní látky zabraňující vzniku škodlivých produktů rozkladu, například kyslíkových radikálů a která dále také zabraňují inaktivaci superoxiddismutázy (SOD) v přítomnosti peroxydusitanu. Proto, způsob užití vybraných komplexů kovů podle vynálezu, stejně tak jako způsob užití nových farmaceutických kompozic je při léčbě onemocnění výhodně ovlivněn léčbou zahrnující rozklad peroxydusitanu rychlostí převyšující přirozenou rychlost rozkladu, což zahrnuje podání účinného množství komplexu kovu, zvyšujícího rychlost rozkladu, ve formě dávkové jednotky.

Jinými slovy, způsoby léčby a nové kompozice vynálezu poskytují při léčbě onemocnění dvojnásobný užitek (l) zvýšení rychlosti katalytického rozkladu peroxydusitanu a (2) ochrana SOD proti inaktivaci peroxydusitaném.

Tak vynález poskytuje způsob léčby lidských onemocnění, která jsou takovým rozkladem výhodně ovlivněna, pomocí dříve neznámé ochrany před škodlivými vlivy, projevující se za přítomnosti peroxydusitanu v lidském těle. Navíc, protože je poskytnuta ochrana proti inaktivaci SOD, takový rozklad pak nabízí ochranu vůči onemocněním, které jsou spojeny s nadprodukcí superoxidu.

Tyto onemocnění zahrnují: ischemická reperfúzní poranění, například mrtvice, úraz hlavy a myokardiální ischémie, sepse, chronický nebo akutní zánět (například artritida a zánětlivé střevní onemocnění a tak podobně), syndrom respirační tísně u dospělých, rakovina, bronchopulmonární dysplazie, vedlejší účinky léků při léčbě rakoviny, kardiovaskulární onemocnění, diabetes (nezahrnuje léčbu porfyrinovými komplexy vanadia), roztroušená skleróza, Parkinsonova nemoc, familiální amyotrofická laterální skleróza, a kolitida a specifické neuronové poruchy, s výhodou ischemická reperfúze, zánět, sepse, roztroušená skleróza, Parkinsonova nemoc a mrtvice.

Dosavadní stav techniky

Je známa dvojí fyziologická role oxidu dusnatého (NO) jako pomocného posela a škodlivého meziproduktu. Jak se ukazuje oxid dusnatý vzniká v řadě buněčných typů včetně makrofág, neutrofilů, hepatocytů a endoteliálních buněk. Viz Hibbs a spol., Science, 1987, 235, 437-476; Rimele a spol,

J.Pharmacol. Exp. Ther., 1988, 245, 102-111; Curran a spol.,

J. Exp. Med., 1989, 170, 1769-1774; a Plamer a spol., Nátuře, 1987, 327, 524-526; podle pořadí. Chemická reakce odpovědná za produkci NO je katalyzována třídou enzymů uváděných jako syntázy oxidu dusnatého (NOS), které přeměňují L-arginin na citrulin a NO. Forstermann a spol., Biochemical Pharmacology, 1991, 42, 1849-1857. Zatímco role NO jako signální molekuly při stimulaci guanylátcyklázy je dobře prokázána, (Monocada a spol., Pharmacological Reviews, 1991, 43, 109-142), zdroje jeho toxicity zůstaly nejasné.

V nedávné době se ukázalo, že NO sám o sobě nemusí být odpovědný za buněčné poškození (viz Absts. of lst Annual Mtg. of Oxygen Society, č. 12-4, 1993, Charleston, SC, Nitric Oxide Requirěs Superoxide to Exert Bactericidal Activity autoři L. Brúnnelli a J.S. Beckman). Místo toho se ukázalo, že reaktivnější typ, peroxydusitan, vznikající reakcí superoxidu a NO, se podílí na cytotoxicitě pozorované při nadprodukci NO. Je známo, že peroxydusitan se rozkládá procesem, který je reakcí prvního řádu vzhledem k protonům. Rychlost rozkladu peroxydusitanu katalyzovaného protony ( níže přirozená rychlost rozkladu) je známa ze studie jeho rozkladu v různých rozmezích pH. (viz; Keith a spol. J Chem Soc (A), str.90, 1969). Pozorovaná rychlost rozkladu peroxydusitanu při pH 7,4 a teplotě udržované na 37°C odpovídá 3,6 * 10^_1 s^-1 (viz Becman a spol. Proč. Nati. Acad. Sci. USA roč. 87, str. 1620-1624, 1990). Backman ukazuje, že rozkladem peroxydusitanu vzniká silné oxidační činidlo, jehož reaktivita je podobná reaktivitě hydroxylových radikálů, což bylo hodnoceno oxidací deoxyribózy nebo dimethylsulfoxii du s dalšími náznaky toho, že superoxiddismutáza chrání vaskulární tkáň, stimulovanou vytvářet za patologických podmínek superoxid a NO*, zabráněním tvorby peroxydusitanu. Viz Backman a spol. Appařent Hydroxyl Radical Production by Peroxynitrite: Implication for Endothelial Injury from Nitric Oxid a Superoxid v Proč. Nati. Acad. Sci. USA, roč. 87, str. 1629-1624, únor 1990.

Dále je zjištěno, že se peroxydusitan rozkládá za vzniku hydroxylového radikálu a oxidu dusnatého, potenciálního nitračního činidla. Obé tyto látky jsou potenciálními oxidačními činidly, vykazujícími reakci s lipidní membránou

a sulfhydrylovými skupinami (viz Rádi a spol. Peroxynitrite Oxidation of Sulfhydryls v The Journal of Biological Chemistry, roč. 266, č.7, 5.dubna, str.4244-4250, 1991).

Hardy a spol. navrhují, že interakce Ο₂ ^- s oxidem dusnatým, kdy vzniká peroxydusitan nebo protonace O₂“, kdy vzniká perhydroxylový radikál, je zapojena při usmrcování HAE buněk způsobeného neutrofily (FASEB Meeting v 5.-9. dubna, 1992 v Anaheim, California) a dále Hardy a spol. naznačuje úlohu peroxydusitanu při oxidačním poškození lidských endoteliálních buněk (abstrakt v Experimental Biology sekce FASEB, 28. března až 1. dubna 1, 1993 v New Orleans, LA).

Jinými slovy škodlivé produkty rozkladu peroxydusitanu jsou speciálně probírány v mnoha odkazech. Dále se ukazuje, že výsledkem reakce peroxydusitanu s Mn a FeSOD je inaktivace enzymu (viz také Radí a spol., Arch. Biochem. Biophys.,1991, 288, 481-487). Nyní je známo, že peroxydusitan bude také inaktivovat CuZn SOD.

Účinky rozkladu peroxydusitanu, kterými jsou tvorba í

škodlivých rozkladných produktů’ nebo inaktivace SOD, jsou dobře dokumentovány u celé řady onemocnění.

Například studie, posuzující zhoubné účinky peroxydusitanu na krysí trakčník, je uvedena Rachmilewitzem a spol. v Peroxynitrite-induced Rat Colitis: A New Model of Cloníc Inflammantion z Gastroenterology 105 (6) 1993.

Backman a spol. v PCT/US91/07894 (podle U.S.Patentu č. 5,277,908) upřesňje, že peroxydusitan je tvořen reakcí superoxidu (O₂~) a oxidu dusnatého ve tkáních vystavených ischemickým, zánétlivýra nebo septickým stavům. Beckman a spol. spojuje nedostatečnosti SOD a peroxydusitan s amyotrofickou laterální sklerózou (ALS) v Nátuře, roč. 364, 12. srpna

1993 a Hogg a spol. a Beckman a spol., vzájemný vztah mezi peroxydusitanem a arťerosklerózou je ukázán v Biochemical Society Transaction, roč. 21, obdrženo 22. prosince 1992 a v Extensive Nitration of Protein Tyrosines in Human Atherosclerosis Detected by Immunohistochemistry, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, roč. 375, str. 81-88, únor 1994. V Chem. Res. Toxicol., roč.5, č.3, 1992 str. 425-431, viz také Cold-induced Brain Edema in Mice v The Journal of Biological Chemistry, roč. 268, č.21 uveřejnění 25. července, str. 15394-15398, 1993 je uvedena zmínka o účasti peroxydusitanu v různých stavech nemocí, u onemocnění plic, což je přisouzeno kouření cigaret, u aterosklerózy, u amyotrofické laterální sklerózy, u edému mozku způsobeného chladem.

Před nedávném byla Scherchem a spol. vyvinuta zkouška toxicity pro spinální neurony, aby se vyhledaly léky, které blokují toxicitu peroxydusitanu. (23rd Annual Meeting of the Society for Neuroscience, Washington, D.C., 7.-12. listopadu 1993) a uvedeno v Society for Neuroscience Abstacts 19 (1-3) 1993 a Biosis 94:4951.

Dále, tento vynález také poskytuje zvýšení známých fyziologických účinků superoxiddismutázy při léčbě nemocí na nich založených, pomocí ochrany SOD před inaktivací a to snížením přítomnosti peroxydusitanu. Z tohoto pohledu se SOD a její varianty se ukázaly být užitečné v inhibici nadprodukce superoxidu a oxidu dusnatého při léčbě nemocí. Takto se vynález vztahuje ke známé léčbě onemocnění pomocí SOD a variant SOD.

Beckman a spol. v PCT přihlášce také poukazuje na to, že SOD katalyzují dismutaci kyslíkového radikálu superoxidu a poskytuje odkazy, které ukazují, že SOD a její varianty jsou obecně užity, aby zabránily nebo snížily oxidační poškození při léčbě mrtvice a úrazu hlavy, srdeční ischémii, abdominální vaskulární okluzi, cystitidě a různých zánětlivých stavech. Backman a spol. v PCT přihlášce také připouští, a to u nemocí, které jsou spojeny s 0₂”, přítomnost peroxydusitanu, aniž by naznačil další zdokonalení vynálezu.

Další známé poznatky vztahující se k nemocem, které jsou spojeny s léčbou pomocí SOD nebo jejími variantami, je možno nalést v EP spise č. 0524161 (EP přihláška č. 92870097), na kterou se tudíž odvoláváme.

Porfyrinové komplexy jsou uveřejněny v U.S. Patentu č. 5,284,674 jako cenná diagnistická a terapeutická činidla, japonský Patentový spis Hei 5-331063 zveřejňuje nepeptidové analogy feoforbidu jako antagonisty receptorů endocerinu, v U.S. Patentu 5,286,474 jsou uveřejněny karotenoporfyriny jako cenné k lokalizaci a vizualizaci savčích rakovinných tkání a v U.S. Patentu č. 5,283,255 jsou uveřejněny podobné dusík obsahující makrocykly bez komplexovaného kovu jako cytotoxické látky. Nejsou zde ukázány žádné komplexy kovů a jejich užitečnost, jak je to v tomto vynálezu.

Nicméně se v Derwent Abstract komplexy kovů ukázaly být užitečnými sloučeninami, v JPO5277377 jako intermediáty a v U.S. Patentu č. 5,284,944 jako MRI látky; kyánová barviva v U.S.Patentu č. 5,283,146; fotovodivá kompozice ftalocyaninu v U.S. Patentu č. 5,283,146; registrační vrstva v optické registračním médiu v U.S. Patentu č. 5,284,943 a absorbenty blízké infračervené oblasti a displej/registrační materiály v abstraktu U.S. 5,296,1632.

Hemoprotein železa je uveřejněn jako účinné činidlo vázající nebo oxidující oxid dusnatý, který má škodlivý fyzioΊ logický účinnek, což je indukováno cytokinem nebo endotoxinem při léčbě onemocnění, například septického šoku v PCT přihlášce č. PCT/US93/01288 (spis č. WO 93/16721).

Jsou uveřejněny jiné komplexy a jejich užití. Například, Ftalocyaniny ruthenia” jsou zveřejněny v Platinum Metals Rev., 1995, 39, (1), 14-18; jako ve vodě rozpustná činidla pro fotodynamickou terapii rakoviny; vybrané metalo-organické komplexy jsou uveřejněny v U.S. Patentu č. 4,866,054 jako účinné při léčbě zánětu'; v U.S. Patentu č. 5,109,016 jsou antivirové kompozice ftalocyaninu a porfyrinů uveřejněny jako inhibitory infekce nebo replikace HIV ; rjeso-tetra(4-sulfonatofenyl)porfiny hořčíku jsou syntezovány a použity jako nádorově-selektivní MRI kontrastní látky; abstrakt. JP 03273082 ukazuje použití porfyrinů kovů odbourávající peroxid, jako antioxidantů při výrobě potravin a jiných produktů; U.S. Patent č. 4758429 ukazuje tetrafenylporfyrin sulfonát acetát jako vhodný k aktivaci magnetických a elektrických dipólů ve spojení se střídavým elektromagnetickým polem k léčbě artritidy a nemocí, které nejsou nakažlivé; abstrakt EP 392666 ukazuje použití netoxických labilních atomů kovů nebo komlexů, například 1,5,9,13-tetraazacyklohexadekan při léčbě viru, například HIV. CA 119:203240 uveřejňuje vybrané metaloporfyriny, která jsou ve francouzském patentu č. 91-6174 uvedena jako hypoglykemika. Četné další odkazy naznačují další analogická užití komplexů kovů.

Nakonec jsou v JPO 5331063 ukázány vybrané makrocykly obsahující dusík jako antagonisté.endoteliálních receptorů při léčbě a prevenci hypertenze, akutního renálního selhání, kardiomyopatie a infarktu myokardu.

Podstata vynálezu

Tento vynález je způsob léčby onemocnění, které je výhodně ovlivněno zrychleným rozkladem peroxydusitanu, tj. přes nebo více než je přirozená rychlost jeho rozkladu u lidí trpících tímto onemocněním, zahrnuje podání sloučeniny nebo sloučeniny, kterou je komplex kovu rozkládající peroxydusitan. S výhodou je peroxydusitan rozložen na benigní látky. Sloučenina má ligandovou strukturu v komplexu s kovem, například s jedním z přechodných kovů, například Mn, Fe, Ni, V. Výhodnými ligandy jsou makrocyklické ligandy, například porfyriny, azamakrocyly a podobně.

Vynález je nový způsob léčby onemocnění savců, včetně lidí, výhodně ovlivněné nepřítomností peroxydusitanu, zahrnující podání účinného množství rozklad zrychlující sloučeniny vzorce:

Struktura I

kde

R₃, Rg, Rg nebo R₁₂ jsou nezávisle vybranou skupinou obsahující: H, alkyl, alkenyl, CH₂COOH, fenyl, pyridinyl a N-alkylpyridyl, takže fenyl, pyridyl a N-alkylpyridyl jsou

i

R fenyl pyridyl

N-alkylpyridin které jsou připojeny k uhlíkovému atomu, a kde fenyl je nepovinně substituován halogenem, alkylem, arylem, benzylem, COOH, CONH₂, SO₃H, N0₂, NH₂, N(R)₃ ⁺, kde R je halogen, alkyl nebo alkylaryl;

pyridinyl je nepovinně substituován halogenem, alkylem, arylem, benzylem, COOH, CONH₂, SO₃H, NO₂, NH₂, N(R)₃ ⁺nebo NHCOR', kde R je shora defino váno a R'je alkyl; a kruh N-alkylpyridinu je nepovinně substituován halogenem, alkylem, arylem, benzylem, COOH, CONH₂, SO₃H, NO₂, NH₂, N(R)₃ ⁺ nebo NHCOR', kde R a R' jsou shora definovány;

R_lz R₂, R₄, R₅, R₇, R_g, R₁₀ nebo R-^ jsou nezávisle vybranou skupinou obsahující: H, alkyl, alkenyl, karboxyalkyl, Cl, Br, F, NO₂, hydroxyalkyl a SO^H nebo R^ a R₂ může tvořit kruh z 5 až 8 uhlíků, s výhodou 6;

X a Y jsou vhodné ligandy nebo náboj-neutralizující anionty, které jsou odvozevy od jakéhokoli monodentálního nebo polydentálního koordinačního ligandu nebo ligandového systému nebo jemu odpovídajícímu aniontu (například kyselina benzoová a benzoátový anion, fenol nebo fenoxidový anion, alkohol a alkoxidový anion) a jsou nezávisle vybrány ze skupiny skládající se z halogenid, oxo, aquo, hydroxo, alkohol, fenol, dioxygen, peroxo, hydroperoxo, alkylperoxo, arylperoxo, amoniak, alkylamino, arylamino, heterocykloalkylamino, heterocykloaryl, amino, aminooxidů, hydrazin alkylhydrazin, arylhydrazin, oxidu dusnatého, kyanid, kyanátu, thiokyanátu, isokyanátu, isothiokyanátu, alkylnitrilu, arylnitrilu, alkylisonitrilu, arylisonitrilu, dusičnanu, dusitanu, azido, alkylsulfonové kyseliny, arylsulfonové kyseliny, alkylsulfoxidu, arylsulfoxidu, alkylarylsulfoxidu, alkylsulfenové kyseliny, arylsulfenové kyseliny, alkylsulfinové kyseliny, arylsulfinové kyseliny, alkylthiol karboxylové kyseliny, arylthiol karboxylové kyseliny, alkylthiol thiokarboxylové kyseliny, arylthiol thiokarboxylové kyseliny, alkylkarboxylové kyseliny (například kyselina octová, trifluoroctové, oxalová), arylkarboxylové kyseliny (například kyselina benzoová, ftalová), močovina, alkylmočovina, arylmočovina, alkylarylmočovina, thiomočovina, alkylthiomočovina, arylthioi i

močovina, alkylarylthiomočovina, síran, siřičitan, hydrogensíran, hydrogensiřičitan, thiosíran, thiosiřičitan, alkylfosfin, arylfosfin, alkylfosfinoxid, arylfosfinoxid, alkyli .

arylfosf inoxid, alkylfosf insulfid,· arylfosf insulfid, alkylarylfosf insulf idu, kyselina alkylfosforitá, kyselina arylfosf oritá, kyselina alkylfosforná, kyselina alkylfosfinitá, kyselina arylfosfinitá, fosforečnan, thiofosforečnan, fosfit, pyrofosfit, trifosforečnan, hydrogenfosforečnan, dihydrofosforečnan, alkylguanidino, arylguanidino, alkylarylguanidino, alkylkarbamát, arylkarbamát, alkylarylkarbamát, ali i

kylthiokarbamát, arylthiokarbamát, alkylarylthiokarbamát, alkyldithiokarbamát, aryldithiokarbamát, alkylaryldithiokarbamát, hydrogenuhličitan, uhličitan, chloristan, chlorečnan, chloritan, chlornan, bromistan, bromičnan, bromitan, bromnan, tetrahalomanganan, tetrafluoroborát, hexafluorofosforečnan, hexafluoroantimoničnan, fosfornan, jodičnan, jodistan, metaboritan, tetraarylborát, tetraalkylborát, vinan, salicylát, sukcinát, citrát, askorbát, sacharinát, aminokyseliny, kyselina hydroxamová, thiotosylát a anionty iontoměničových plyskyřic, nebo systémů; s výhradou, že když komplex, obsahující X a Y, má výsledný pozitivní náboj, pak je přítomno Z a je protiiontem, který je nezávisle X nebo Y, nebo když komplex obsahující X a Y má výsledný negativní náboj , pak je přítomno Z a je protiiontem vybraným ze skupiny skládající se z kationtů alkalických kovů a alkalických zemin, organických kationtů, například alkyl nebo alkylarylamonné kationty; a

M je vybráno ze skupiny Mn, Fe, Ni a V;

Struktura II

Rj _z ^R2' ^R3' ^R4^{Z R}5' ^R6' ^R7· ^8' ^R9' ^10' ^Rll^{z R}12' ^R13· ^r14' ^r15 ^{a r}16 3^sou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující:

H; SO₃H, COOH, NC>2, NH₂, a N-alkylamino;

X, Y, Z a M jsou vybrány jak definováno výše;

Struktura III kde

R' je CH nebo N;

kde

R_1# R₅, Rg a R₁₃ jsou nezávisle přímou vazbou nebo CH₂;

^R2' R2'z R4, R4'ř Rg, Rg', Rg, Rg', Κχο' ^R10'' ^R12' ^R12'' ^r14' ^r14'' ^r16 '^R16^z 3^sou nezávisle H, nebo alkyl; R3, Ry, R_llz R^5 jsou nezávisle H nebo alkyl;

X, Y, Z a M jsou definovány výše;

kde ^Rl' ^r5' ^R8 a R₃2 jsou nezávisle přímou vazbou nebo CH₂;

R₂, R₂'z ^R4z R4', ^R6' ^Ró'' ^R7' Rg, Rg' , Ru, ^Rll'/ ^R13'

R13', Rj4 jsou nezávisle H nebo alkyl;

R₃ a R₁₀ jsou nezávisle H nebo alkyl;

X, Y, Z a M jsou definovány výše;

kde

R^, R^, Rg a R^2 jsou nezávisle přímou vazbou nebo CH₂;

R₂ ^{r R}2 ^{f 1 R}3 ^{r R}5 ^{1 R}5 ' t ^R7 ⁹ Rg ^f Rg ^{1 1 R}11^{9 R}H ' ^{1 R}13 R₁₃', R14 jsou nezávisle H, nebo alkyl;

R₁₀ je H nebo alkyl;

X, Y, Z a M jsou definovány výše;

R11

R

R₆

Rff' A 7 H_e kde

Rj, R₄, Ry a Rjq jsou nezávisle přímou vazbou nebo CH₂;

^{z R}2 *^z R3, R5, R5' t Rgt Rg, Rg^z/ Rg, Rll' R]_]_^z Rj₂ 3^SOU nezávisle H, nebo alkyl;

X, Y, Z a M jsou definovány výše;

kde

R-]_, R₄, R_g a R_1;l jsou nezávisle přímou vazbou nebo CH₂;

^R2' R₃, R3', R5/ R5'/ R7, R7't Rg/ ^R1O' ^R10' ^{a R}12' ^r12^{z a R}i3 jsou nezávisle H nebo alkyl;

X, Y, Z a M jsou definovány výše;

kde 'R_lr R₄, R₇ a R₁₀ jsou nezávisle jsou nezávisle H nebo alkyl ^R2' R₃, R₃'z R₅, Rg', Rg, Rg, Rg, Rg·, R_n, R_n' a R₁₂ jsou nezávisle H nebo alkyl;

X, Y, Z a M jsou definovány výše;

kde

R_lz R₃, R₄ a Rg jsou nezávisle H, nebo alkyl; ·

R₂ a R₅ jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující: H, alkyl, SO₃H, NO₂, NH₂, halogen, COOH a N(R₃)⁺ kde R je definováno výše;

X, Y, Z a M jsou definovány výše;

R3 kde

R_lz R₂, R₃, R₄ jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující: H, alkyl, SO₃H, N0₂, NH₂, halogen, COOH a N(R₃)⁺ kde R je definováno výše;

X, Y, Z a M jsou definovány výše;

Struktura IV

kde

R_x, Rj.' , R2 , R₂ ^z > ^3 > ^3 ^z ' ^4 ' ^4 ^z > ^5 ' ^5 ' ' ^6 ' ^6 ' ' ^7 ^z

R₇' jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující: H, alkyl, alkoxy, N0₂, aryl, halogen, NH₂, SO₃H a R_g, Rg', ^R7 ^{a R}7^zse každý může spojit s jedním jiným Rg, Rg',R₇ a R₇', aby se vytvořila cyklická skupina, s výhodou cykloalkylová skupina mající 6 uhlíků;

M¹ je Fe, Ni nebo V;

X, Y a Z jsou definovány výše společně s farmaceuticky přijatelným nosičem, s výhodou ve formě dávkové jednotky.

Vynálezem je také farmaceutická kompozice pro léčbu lidských onemocnění, která jsou výhodně ovlivněna urychlením rozkladu peroxydusitanu a to nad! rychlost jeho přirozeného rozkladu, zahrnující pro člověkaí účinné množství sloučeniny

I vzorce I, II, IIIA, IIIB, HIC, I.llD, IIIE, IIIF, IIIG,

IIIH, jak jsou definovány výše s farmaceuticky přijatelným nosičem ve formě dávkové jednotky.

I

X, Y a Z jsou každý farmaceuticky přijatelný anion nebo kation.

Přehled obrázků na výkresech

Příkladná provedení vynálezu jsou znázorněna na výkresech, kde:

Obrázek 1: Graf ^kods proti koncentraci katalyzátoru

Fe(III)TMPS a Fe(III)TPPS ukazuje katalytický rozklad peroxydusitanu komplexy kovů.

Obrázek 2: Graf ukazuje inaktivaci CuZnSOD peroxydusitanem.

Obrázek 3: Graf ukazuje ochranu CuZnSOD závislou na koncent raci katalyzátoru vůči inaktivaci peroxydusitanem při užití katalyzátoru rozkladu peroxydusitanu Fe(III)TMPyP.

Obrázek 4: Graf ukazuje ochranu CuZnSOD závislou na koncent raci katalyzátoru vůči inaktivaci peroxydusitanem při užití katalyzátoru rozkladu peroxydusitanu Fe(III)TMPS.

Obrázek 5: Poškození lidských mikrovaskulárních endoteliálních buněk způsobené peroxydusitanem. Účinný peroxydusitan byl navrstven přímo na povrch HMDE buněk značených ⁵¹Cr, pěstovaných na plotnách o 96 jamkách určených pro buněčné kultury. Stupeň specifického buněčného poškození byl určen po 45 minutách a vztažen ke koncentraci peroxydusitanu pomocí regrese nejmenších čtverců.; Hodnoty představují průměr tří replik +/- SEM.

Obrázek 6: Peroxydusitanové katalyzátory, Fe(TMPyP) (trojúhelník) a Ni(II)dienoN₄)PF₆(kruh) byly při zkoušce buněčného poškození přidány k HDME buňkám, hned před přidáním účinného peroxydusitanu. Stupeň specifického poškození buněk byl hodnocen po 45 minutách pomocí množství uvolněné radioaktivně značené látky do média. Hodnoty představují průměr tří replik +/- SEM. *p<0,01 proti 0 μιηοΐ/ΐ ověřeno Dunnettovým testem.

Obrázek 7: Inhibice poškození lidských endoteliálních buněk aorty způsobeného neutrofily pomocí Fe(TMPyP). Peroxydusitanový katalyzátor, Fe(TMPyP), byl při zkoušce buněčného poškození přidán k neutrofilům a to hned před jejich aktivací pomocí TNF/C5a. Po 2 hodinách byl hodnocen stupeň specifického poškození buněk pomocí množství uvolněné radioaktivně značené látky do média. Hodnoty představují průměr tří replik +/- SEM. *p<0,01 proti 0 μιηοΐ/ΐ ověřeno Dunnettovým testem.

Obrázek 8: Porovnání Ni a Fe katalytické ochrany RAW buněk vůči poškození způsobeného PN(peroxydusitanem). RAW 264.7 buňky byly naočkovány přibližně v množství 2xl0⁵ na jamku na plotny o 96 jamkách. Peroxydusitan (360 μπιοί/ΐ) byl přidán do každé jamky s buňkami v přítomnosti zvyšujících se koncentrací Ni katalyzátorů nebo FeTMPyP, což se projeví v celkové ochraně vůči poškození způsobeného peroxydusitanem, určeno schoplostí buněk metabolizovat Alamar Blue na fluorescenční produkt. Každý stav představuje průměr 4 jamek+sem.

Obrázek 9; Ochrana RAW buněk Fe-katalyzátory vůči poškození způsobeného peroxydusitanem. Buňky byly ošetřeny 500 μιηοΐ/ΐ peroxydusitanem v přítomnosti nebo nepřítomnosti následujících katalyzátorů: FeTMPyP, FeTMPS, FeTPPS. Byla sledována životaschopnost buněk, jak je popsáno v textu a v popisu obrázků 1, 2 a 3. Hodnoty představují průměr 4 stanovení±sem.

Obrázek 10: FeTMPS, FeTMPyP nebo ZnTMPyP (30 mg/kg, intravenózně bolus) podaný 3 hodiny po vyvolání reakce lipopoly19 sacharidem z E. coli (LPS, 3 mg/kg, intravenozně bolus) kdy dojde ke zvýšení úniku radioaktivně značeného albuminu ( extravazace plazmy, μΙ/g buněk). Účinky FeTMPS, FeTMPyP nebo ZnTMPyP jsou sledovány v krysím jejunu o 1 hodinu později (například 4 hodiny po vyvolání LPS reakce). Výsledky jsou ukázány jako pruměrts.e.m z 4-8 krys.

Příkladná provedení vynálezu

Jak je zde užito, termín alkyl samotný nebo v kombinaci znamená nerozvětvený nebo rozvětvený řetězec alkylové skupiny obsahující pravděpodobně 1 až 22 atomů uhlíku, s výhodou pravděpodobně od 1 do 18 atomů uhlíku, a nejlépe pravděpodobně od 1 do 12 atomů uhlíku. Příklady takových skupin obsahují, avšak nejsou omezeny na: methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sek. butyl, terč. butyl, pentyl , isoamyl, hexyl, oktyl, nonyl, decyl, dodecyl, tetradecyl, hexadecyl oktadecyl a eikosyl. Termín aryl, samotný nebo v kombinaci, znamená fenylovou nebo naftylovou skupinu, která nepovinně nese jeden nebo více substituentů vybraných z alkyl, cykloalkyl, cykloalkenyl, aryl, heterocyklus, alkoxyaryl, alkaryl, alkoxy, halogen, hydroxy, amin, kyano, nitro, alkylthio, fenoxy, ether, trifluormethyl a podobně, například fenyl, p-tolyl, 4-methoxyfenyl, 4-(terč. butoxyJfenyl, 4-fluorfenyl, 4-chlorfenyl, 4-hydroxyfenyl,

1- naftyl, 2-naftyl a podobně. Termín aralkyl, samotný nebo v kombinaci, znamená alkylovou nebo cykloalkylovou skupinu jak je zde definováno, kde je atom vodíku nahrazen arylovou skupinou jak je zde definováno, například benzyl,

2- fenylethyl a podobně. Termín heterocyklický znamená kruhové struktury obsahující v kruhu kromě uhlíkových atomů ta20 ké nejméně jeden jiný atom. Nejběžnější je dusík, kyslík a síra. . Příklady heterocyklů jsou zahrnuty, avšak nejsou omezeny na: pyrrolidinyl, piperidyl, imidazolidinyl, tetrahydrofuryl, tetrahydrothienyl, furyl, thienyl, pyridyl, chinolyl, isochinolyl, pyridazinyl, pyrazinyl, indolyl, imidazolyl, oxazolyl, thiazolyl, pyrazolyl, pyridinyl, benzoxadiazolyl, benzothiadiazolyl, triazolyl a tetrazolyl skupiny. Termín cykloalkyl, samotný nebo v kombinaci znamená cykloalkylovou skupinu obsahující od 3 do pravděpodobně 10, s výhodou od 3 do pravděpodobně 8 a nejlépe od 3 do pravděpodobně 6 uhlíkových atomů. Příklady takových cykloalkylových skupin jsou zahrnuty, avšak nejsou omezeny na cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyl, cykloheptyl, cyklooktyl a perhydronaftyl. Termín cykloálkenyl, samotný nebo v kombinaci znamená cykioaikenyíovou skupinu mající jednu nebo dvě dvojné vazby. Příklady takových cykloalkenylových skupin jsou zahrnuty, avšak nejsou omezeny na: cyklopentenyl, cyklohexenyl, cyklooktenyl, cyklopentadienyl, cyklohexadienyl, cyklooktadienyl.

Makrocyklické ligandy užitečné v tomto vynálezu , kde vzorcem je Struktura I, mohou být připraveny podle obecných, v technice známých způsobů syntézy k přípravě určitých ligandů. Viz například,

1) Campestrini, S.; Meunier, B. Inorg. Chem. 31, 1999-2006, (1992).

2) Robert, A.; Loock, B.; Momenteau, M.; Meunier, B. Inorg. Chem. 30, 706-711, (1991).

3) Lindsey, J.S.; Wagner, R.W.J. Org. Chem. 54, 828-836, (1989).

4) Zipplies, M.F.; Lee, W.A.; Bruice, T.C.J. Am. Chem. Soc.

108, 4433-4445, (1986).

Makrocyklické ligandy užitečné v tomto vynálezu, kde vzorcem je Struktura II, mohou být připraveny podle obecných, v technice známých způsobů syntézy k přípravě určitých ligandu. Viz například,

1) Některé sloučeniny jsou komerčně dostupné od Porphyrin Products, lne. (Logan, Utah).

2) Y.L. Meltze; Phthalocyanine Technology in Chemical Press Reviews č. 42.; Niyes Data Corp, Park Ridge, N.J. (1970).

Makrocyklické ligandy užitečné v tomto vynálezu, kde vzorcem je Struktura III, mohou být připraveny podle obecných, v technice známých způsobů syntézy k přípravě určitých ligandů. Viz například,

1) Goedken, V.L.; Molin-Case, J.; Whang, Y-A; J.C.S. Chem. Comm. 337-338, (1973)

2) Martin, J.G.; Cummings, S.C.; Inorg. Chem. 12, 1477-1482, (1973).

3) Riley, D.P.; Stone, J.A.; Bush, D.H.; J.Am.Chem. Soc. 98 1752-1762, (1976).

4) Dabrowiak, J.C.; Merrell, P.H.; Stone, J.A.; Bush, D.H.; J.Am.Chem.Soc. 95, 6613-6622, (1973).

5) Riley, D.P.; Busch, D.H.; Inorg. Chem. 23, 3235-3241 (1984).

6) Watkins, D.D.; Riley, D.P.; Stone, J.A.; Bush, D.H.; Inorg. Chem. 15, 387-393, (1976).

7) Riley, D.P.; Stone, J.A.; Busch, D.H.; J.Am.Chem. Soc. 99, 767-777, (1977).

Makrocyklické ligandy užitečné v tomto vynálezu, kde vzorcem je Struktura IV, mohou být připraveny podle obecných, v technice známých způsobů syntézy k přípavě určitých ligandů. Viz například,

1) Diehl, H.; Hoch, C.C.; inorganic Synthesis roč.3, str.196.

McGraw-Hill, New York (1950).

2) Srinivasan, K.; Michaud, P.; Kochi, J.K.; J.Am.Chem.Soc. 108, 2309-2320, (1986).

3) Samsel, E. G.; Srinivasan, K.; Kochi, J.K.; J.Am.Chem.Soc 107, 7606-7617, (1985).

Sloučeniny vynálezu mohou mít jeden nebo více asymetrických uhlíkových atomů a takto mohou existovat ve formě optických izomerů, stejně tak ve formě svých racemických a neracemických směsí. Optické izomery mohou být získány rozpuštěním racemických směsí podle obecných postupů, například tvorbou diastereoizomerických solí působením opticky aktivní kyseliny. Příklady vhodných kyselin jsou: kyselina vinná, diacetylvinná, dibenzoylvinná, ditoluoylvinná a kafrsulfonová a pak oddělení směsi diastereoizomerů krystalizací, následované uvolnění opticky;aktivních bází z těchto solí. Jiný postup oddělení optických izomerů zahrnuje použití optimálně vybrané chirální chromatografické kolony tak, aby bylo oddělení enantiomerů maximální. Ještě další dostupný způsob zahrnuje syntézu kovalentních diasteroizomerních molekul reakcí jedné nebo více skupin(y) sekunárních aminů sloučenin podle vynálezu s opticky čistou kyselinou v aktivované formě nebo s opticky čistým isokyanátem. Syntetizované diastereoizomery mohou být odděleny obecnými prostředky, například chromatografií, destilací, krystalizací nebo sublimací, a pak hydrolyzovány, aby se uvolnil enantiomerně čistý ligand. Opticky aktivní sloučeniny podle vynálezu mohou být získány podobně použitím opticky aktivních výchozích látek, například přirozených aminokyselin.

Aby se prověřila katalytická aktivita komplexů kovů podle vynálezu při rozkladu peroxydusitanu, je peroxydusitan připraven a izolován v podobě sodné sůli a to reakcí kyselého peroxidu vodíku s dusitanem sodným, následováno rychlým ukončením s NaOH jak prohlašují Haifpenny a Robinson, v J. Chem. Soc., 1952, 928-938. Absorpční maximum peroxydusitanu je při 302 nm s extinkčním koeficientem 1670 M^-1cm^-1. Proto je možné přímo sledovat rozklad peroxydusitanu pomocí stop-fow spektrofotometrické analýzy, monitorováním rozkladu absorbance při 302 nm. Sloučenina podle vynálezu je identifikována tímto sledováním rozkladu peroxydusitanu s přídavkem komplexu kovu při rychlosti převyšující rychlost přirozeného rozkladu.

Vedle toho je zjištěno, že peroxydusitan inaktivuje enzym CuZnSOD v závislosti na koncentraci. Do této doby bylo známo, že peroxydusitan také inaktivuje MnSOD (viz Peroxonitrite-Mediated Tyrosine,Nitration Catalyzed By Superoxid Dismutase, autory jsou Ischiropoulos a spol. v Archives of Biochemistry a Biophysics, roč. 298, č.2, 1. listopad, str. 431-437, 1992), vylález poskytuje sloučeninu, která chrání CuZnSOD vůči inaktivaci peroxydusitaném.

Takto se ukazuje se, že sloučenina vynálezu je užitečná při léčbě lidského onemocnění, výhodně ovliněného přítomností enzymu SOD.

Léčba podle vynálezu je určena pro takový stav nemoci, který je bud zapříčiněn přítomností peroxydusitanu, což je způsobeno nepřítomnosti ochranného enzymu SOD, například při infarktu myokardu, mrtvici nebo autoimunitních onemocněních. Ukazuje se, že tyto nemoci jsou spojeny s přítomností peroxydusitanu.

Ve vynálezu jsou uvedeny ty komplexy kovů, u kterých byl stanoven účinek při rozkladu peroxydusitanu.

Předpokládané ekvivalenty výše vyložených obecných vzorců sloučenin a derivátů, stejně tak jako meziproduktů jsou sloučeniny jinak jim odpovídající a mající stejné obecné vlastnosti, například jsou to tautomery těchto sloučenin například kde jedna nebo více různých R skupin jsou prostými variantami substituentů jak je definováno, například kde substituenty jsou vyššími alkylovými skupinami, než jak bylo ukázáno nebo kde tosylové skupiny jsou jiné dusík nebo kyslík chránící skupiny nebo kde O-tosylová skupina je halogenid. Anionty mající jiný náboj než 1, například uhličitan, fosforečnan a hydrogenfosforečnan mohou být užity místo těch, které mají náboj 1 a to pokud neovlivní nepříznivé celkovou aktivitu komplexu. Nicméně, následkem užití aniontů, majících jiný náboj než 1, dojde k nepatrné změně obecného, výše vyloženého vzorce komplexu. Dále, kde substituent je nebo může být určen jako vodík, substituent určité chemické povahy, který se liší od vodíku v této pozici, například halogen, hydroxy, amino a podobná funkční skupina, není kritický, pokud nepříznivě neovlivní celkovou aktivitu eventuálně proces syntézy.

Výše popsané chemické reakce v odkazech jsou obecně popsány ve své šíři tak, že jsou vhodné k jejich nejširšímu užití pro přípravu sloučenin podle vynálezu. Tak jak jsou reakce popsány v uvedeném rozsahu, nemusí být použitelné na každou sloučeninu. Sloučeniny, pro které toto připadá v úvahu, budou snadno odborníky v dané oblasti rozpoznány. Ve všech takových případech, bud mohou být reakce provedeny obecnými úpravami, které jsou známy odborníkům v dané oblasti, například vhodnou ochranou interferujících skupin, změnou na alternativní konvenční činidla, obvyklou úpravou reakční ch podmínek a podobné nebo jiné zde uveřejněné reakce nebo jiný běžný způsob bude vhodný pro přípravu příslušných sloučenin podle vynálezu. Ve všech způsobech přípravy jsou všechny výchozí látky známé nebo snadno připravítelné ze známých výchozích látek.

Bez dalších pojednání se domníváme, že odborník v dané oblasti může, užitím předchozího popisu, využít vynález v jeho plné šíři. Následující výhodná speciální provedení jsou proto vyloženy pouze jako ilustrativní, aniž by jakkoli omezovaly zbytek popisu.

Příklady

Všechny činidla byla užita, tak jak byla získána, jinak je označeno. 5,10,15,20-tetrakis(N-metyl-4-pyridyl)porfyrin tetratosylát a acetato-5,10,15,20-tetrakis(4-sulfonátopyridyl)porfyrin železítý (III) komplex byly koupeny od Porphyrin Products Inc. (Logan, UT). Citrát železité (III) a EDTA železité (III) komplexy byly koupeny od Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI). Veškerá spektra (NMR) nukleární magnetické resonance byly získány na Varian VXR-300 nebo na Varian VXR-400 spektrometrech. Kvalitativní a kvantitativní hmotnostní spektra byla provedena na Finnigan MAT90, Finnigan 4500 a VG40-250T spektrometrech.

Příklad 1

Syntéza komplexu acetato(5,10,15,20-tetrakis(N-metyl-4-pyridyl)porfinato)tetratosylátu železitého(III), Fe(III)TMPyP.

5,10,15,20-tetra-(N-metylpyridyl)porfyrin tetratosylát, (H₂TMPyP) (0,30 g, 0,231 mmol) byl dán do 100 ml baňky s kruhovýn dnem vybavené magnetickou míchací tyčinkou a byl rozpuštěn v minimálním množství MeOH (methanol). Byl přidán bezvodý Fe(0Ac)₂ (0,120 g, 0,692 mmol) po němž hned následovalo přidání 25 ml ledové kyseliny octové a 100 μΐ triethylaminu. Reakční směs byla zahřáta tak, aby refluxovala. Reakce byla sledována spektroskopicky ve viditelné oblasti a byla ukončena, když se objevil silný pás při 426 nm udávající metalovaný porfyrin. Methanol byl odstraněn odpařením a pevná látka byla znovu rozpuštěna v malém množství methanolu. Směs byla ve vakuu zakoncentrována na celkový objem pravděpodobně 20 ml, což je objem, při kterém dochází ve srážení nezreagovaného Fe(OAc)₂. Pevná látka byla centrifugací oddělena a matečný louh byl podroben chromatografii na koloně Sephadex LH-20 (2 x30 cm) užitím methanolu jako elučního činidla. Počáteční barevný pás byl zachycen a Fe(lil)TMPyP(OAc) byl vyizolován vysrážením po odpaření rozpoštědla a rozetření s etherem, což dá 85 mg (26%) požadovaného produktu, jak bylo potvrzeno hmotnostní spektrální analýzou.

Příklad 2

Syntéza oktasodné soli 5,10,15,20-tetrakis(3,5-disulfonátomesityl)porfyrinu (H₂TMPS).

5,10,15,20-tetramesitylporfyrin (H₂TMPS) byl připraven kondenzací pyrrolu a mesitaldehydu v utěsněných skleněných trubicích podle Badgerovy metody ( G.M.Badger, R.A. Jones, R.L. Laslett, Aust. J. Chem., 17, 1022, [1964]) nebo při refuxaci kollidinu podle Meunierovy přípravy z literatury (Meunier a spol. Noův. J. Chim., 10, 39-49,[1986]). Příměsi chloru byly odstraněny oxidací 2,3-dichlor-5,6-dikyano-l,4benzochinonem při refluxaci benzenu, následováno chromatografií na alumině. Výsledkem obou metod jsou téměř identické výtěžky H₂TMPS.

Syntéza H₂TMPS byla provedena užitím nepatrné změny Meunierovy metody (Meuniera spol. Inorg. Chem, 31, 1999-2006,(1992]). Do baňky 25 ml s kruhovým dnem, vybavené zpětným chladičem a míchací tyčinkou byl dán H₂TMP (1,0 g, 1,28 mmol). Bylo přidáno 10 ml olea (H₂SO₄ + 18-23% SO₃) a reakce byla zahřívána na 80°C po 40 minut. Po ochlazení reakce byl obsah baňky po kapkách přidán do 100 ml vody chlazené v ledové lázni. Výsledný vodný roztok byl neutralizován 2N NaOH (pravděpodobně 220 ml) na pH=6-7. Voda byla odstraněna odpařením a výsledný pevný zbytek byl rozetřen s minimálním množstvím methanolu. Výsledná sraženina byla odstraněna filtrací a filtrát byl dále koncentrován ve vakuu na 60 ml. Výsledná sraženina (přídatný Na₂SO₄) byla oddělena centrifugací. Supernatant byl do sucha odpařen, vytvořilo se 1,59 g (78%) požadovaného suifonovaného porfyrinu.

Příklad 3

Syntéza oktasodné soli acetato-5,10,15,20-tetrakis(3,5-disulfonátomesityl)porfyrinu manganitého(III) (Mn(III)TMPS).

H₂TMPS (0,2 g, 0,125 mmol) a Mn(0Ac)₂ (0,296 g, 1,71 mmol) bylo rozpuštěno v 38 ml vody a zahříváno na 85°C po dobu 1 hodiny. Reakce byla sledována spektroskopicky ve viditelné oblasti a její ukončení bylo určeno, když Soretův pás (416 nm) volné báze porfyrinu byl nahrazen novým pásem při 468 nm, který je charakteristický pro Mn(III) sloučeniny porfyrinu. Objem reakční směsi byl zmenšen ve vakuu na 10 ml a byla provedena chromatografie na katexu (H+ typ) Dowex

50WX-8, aby se odstranil nadbytek Mn(OAc)₂. Objem eluátu byl zmenšen na 10 ml a adjustován na pH= 8,0 pomocí l,0N NaOH. Výsledný roztok byl odpařen do sucha. Zbytek byl rozpuštěn v 7 ml methanolu a byla provedena chromatografie na koloně Sephadex LH-20, užitím methanolu jako elučního činidla. Zachycení nachového pásu a odpaření do sucha dává 0,175 g (90%) požadovaného metalovaného porfyrinu, což bylo potvrzeno hmotnostní spektrální anylýzou.

Příklad 4

Syntéza oktasodné soli acetáto-5,10,15,20-tetrakis(3,5-disulfonátomesityl)porfyrinu železitého (III)(Fe(III)TMPS).

H₂TMPS (0,2 g, 0,125 mmol) a Fe(0Ac)₂ (0,300g, 1,72 mmol) byly rozpuštěny ve 38 ml vody. Reakční směs byla přivedena k refluxu a byla sledována spektroskopicky ve viditelné oblasti, aby se zjistilo dokončení metalace. Po skončení byla reakční směs filtrována a její objem zmenšen na 10 ml. Oranžově-hnědá reakční směs byla vedena přes katexovou kolonu (H+ typ) Dowex 50WX-8, aby se odstranil nadbytek Fe(OAc)₂. Objem eluátu byl zmenšen na 10 ml a adjustován na pH=7,5 pomocí l,0N NaOH. Výsledný roztok byl odpařen do sucha. Zbytek byl rozpuštěn v 7 ml methanolu a byla provedena chromatografie na koloně Sephadex LH-20 užitím methanolu jako elučního činidla. Odpaření oranžově-hnědého pásu do sucha dá 0,170 g (72%) požadovaného Fe porfyrinu, což bylo potvrzeno hmotnostní spektrální analýzou.

Příklad 5

Syntéza oktasodné soli acetáto-5,10,15,20-tetrakis(3,5-disulfonátomesityl)porfyrinu niklnatého(II) (Ni(II)TMPS).

H₂TMPS (0,1 g, 0,063 mmol) a Nl(OAc)₂ (o,156g, 0,63 mmol) byly rozpuštěny ve 20 ml vody a byly po 3 h refluxovány. Oranžová barva reakční směsi udávala přítomnost Ni porfyrinu. Ukončení reakce bylo potvrzeno spektroskopicky ve viditelné oblasti. Objem reakční směsi byl zmenšen na 5 ml a byla provedena chromatografie na ionexové koloně (typ H+) Dowex 50 WX-8, aby se odstranil nadbytek Ni(OAc)₂· Objem eluátu byl zmenšen na 5 ml a adjustován ňa pH=8,0 pomocí 1,0 N NaOH. Výsledný roztok byl odpařen do sucha. Zbytek byl rozpuštěn v 7 ml methanolu a byla provedena chromatografie na koloně Sephadex LH-20 užitím methanolu jako eiučního činidla. Produkt byl vyizolován odstraněním rozpouštědla, to dalo 0,090 g požadovaného metalovaného porfyrinú, což bylo potvrzeno hmotnostní spektrální analýzou.

Příklad 6

Syntéza ligand N,N'-ethylenbis(3,3'-dimethoxysalicylidenamin) Byla užita úprava Colemanova postupu (Coleman a spol.

Inorg. Chem, 20, 700, [1981]). Do 100 ml baňky s kulatým dnem, vybavené míchací tyčinkou bylo dáno 25 ml bezvodého ethanolu a 3-methoxysalicylaldehydu (3,04 g, 0,02 mol). 20 ml čerstvě připraveného bezvodého ethanolu a ethylendiaminu (0,601 g, 0,01 mol) bylo do salicylaldehydu přidáno v jedné dávce. Během 1 h, co byla reakční směs refluxuvána, se objevila žluto-oranžová sraženina. Zachycení produktu filtrací, promytí 100 ml horkého ethanolu, a vysušení ve vakuu dá

4,4 g (98%) požadovaného produktu.

Příklad 7

Syntéza komplexu chlor[N,N'-ethylenbis(3,3'-dimethoxysalicylidenamináto)železitého (III)

N,N'-ethylenbis(3,3'-dimethoxysalicylidenamin) (0,05g,

0,188 mmol) byl rozpuštěn ve 20 ml methanolu a FeCl₃ (0,030 g, 0,188 mmol) byl přidán v jedné dávce. Roztok byl 1 h refluxován a potom bylo vákuově odstraněno rozpouštědlo. Nachový zbytek byl promyt minimálním množství vody. Rozpuštění pevné látky v 10 ml methanolu, její zfiltrování a reizolování odstraněním rozpouštědla dá 0,047 g (70%) požadovaného komplexu železa.

Příklad 8

Syntéza komplexu (12,14-dimethyl-l,4,8,11-tetraazacyklotetradeka-ll,13-dienáto) hexafluorofosforečnanu nikelnatého(II), Ni(II)([14]dienoN₄)PFg

Ni(II)([14]dienoN₄)PF_g byl připraven podle Martinovy a Cummingsovy metody ( Martin, J.G.; Cummings, S.C. Inorg.Chem., 12, 1477-1482, [1973]. Sloučenina byla charakterizována hmotnostní spektrální analýzou a ukázalo se, že je shodná s požadovanou strukturou.

Příklad 9

Syntéza komplexu (12,14-dimethyl-l,4,8,11-tetraazacyklotetradeka-11,14-dien)hexafluorofosforečnanu nikelnatého (II).

NÍ(II)([14]dÍenN₄)(PF₆)₂.

Ni(II)([14]dienN₄)(PFg)₂ byl připraven z Ni(II)([14]dienoN₄)PFg podle Martinovy a Cummingsovy metody (Martin,J.G.; Cummings, S.C. Inorg.Chem., 12, 1477-1482, [1973]).

Příklad 10

Syntéza komplexu 6,8,15,17-tetradimethyldibenzo[b,i][l,4,8,

11]tetraazatetradeka-2,4,7,9,12,14-hexaenáto nikelnatého (II), Ni(II)[14]12enN₄

Ni(II)[14]12enN₄ byl připraven podle metody Goendkena a spol. (Goendken a spol., J.C.S. Chem.Comm., 337-338, [1973]). Komplex byl charakterizován hmotnostní spektroskopickou analýzou a byl shodný s požadovanou strukturou.

Příklad 11

Tento příklad popisuje přípravu zásobních roztoků peroxydusitanu užitých v těchto studiích. Byla užita pozměněná verze postupu popsaná Hughsem (Hughs, M.N.; Nicklin, H.G. J. Chem. SOC., (A), 450-452, [1968]).

Do 10 ml silně míchaného roztoku 0,6M NaN0₂ udržovaného při 0°C bylo přidán stejný objem;roztoku HC1/H₂O₂ (0,6 M HCl a 0,7 M H₂O₂), následován rychlým přídavkem 10 ml 0,75M NaOH. Na výsledný žlutý roztok bylo po 3 minuty působeno MnO₂ a byl okamžitě zfiltrován. Filtrát byl několik dnů ponechán v mrazničce při -20°C, což se projevilo frakcionací peroxydusitanu sodného, patrného jako jemně žlutý pás v horní části baňky. Po zachycení žlutého pásu, bylo vytěženo pravděpodobně 1 ml 280 mM roztoku peroxydusitanu sodného. Tento roztok mohl být při -20°C za současného míchání zmrazen na několik dní za minimálního rozkladu peroxydusitanu.

Příklad 12

Tento příklad popisuje postupy, kterými se obvykle stop flow kinetickou analýzou stanovuje, jestli jsou sloučeniny katalyzátory rozkladu peroxydusitanu.

Všechny analýzy byly provedeny užitím tlumivých roztoků fosforečnanu draselného (Calbiochem), které byly biologicky kvalitní, užitím ultra čisté vody, připravené podle Rileyho metody (Riley, D.P. a spol. Anal. Biochem. 196, 344-349, [1991]). Kinetická měření byla provedena na rychle símajícím Stopped-flow spektrometru OLIS ( On-Line Instrument Systems lne., Bogart, Georgia) užitím operačního systému

OLIS-RSM-lOOO k získání dat a manipulaci. Peroxydusitan silně absorbuje při 302 nm (extinkční koeficient = 1670 M^cm“¹) a ukázalo se, že se rozkládá procesem, který je reakcí 1. řádu vzhledem k peroxydusitanu sodném a reakcí prvního řádu vzhledem k protonům. (Hughs, M.N.; Nicklin, H.G. J.chem.SOC.,(A), 450-452, [1968] S t₁/₂=l,9 S při 37°C pH=7,4 (Beckman, J.S. a spol. Proč.Nati.Acad. Sci. USA, 87, 1620-1624, [1990]).

Tedy, přirozená rychlost rozkladu peroxydusitanu sodného byla v typickém pokusu stanovena následovně. Injekční stříkačka malého objemu stopped-flow spektrofotometru je naplněna 24 mM zásobním roztokem peroxydusitanu sodného v 50 mM NaOH a injekční stříkačka velkého objemu stopped-flow spektrofotometru je naplněna 100 mM roztokem fosforečnanu draselného pH=7,4. Všechna stopped-flow měření byla provedena při 22±1°C. Vstříknutí roztoků do vzorkové komory má za následek pravděpodobně 25 násobné zředění zásobního peroxydusitanu. Rozklad peroxydusitanu sodného je reakcí prvního řádu vzhledem k peroxydusitanu při t-^/₂=5,2 s a k_oj_0g=l,39 x 10^-1± 0,15 s^-1. Aby se prověřila aktivita katalytického rozkladu peroxydusitanu, byl komplex kovu rozpuštěn ve 100 mM tumivého roztoku fosforečnanu draselného pH=7,4 a tímto byla naplněna injekční stříkačka velkého objemu a byl sledován rozklad peroxydusitanu, jako byl popsán výše. Pro testované komplexy byla stanovena katalytická rychlostní konstanta (^kkat M^-1s^-1) při měnících se koncentracích komplexů a grafickým znázorněním kOk_S proti [komplex] Tabulka 1. K_Qds byla získána zprůměrováním tří stopped-flow analýz pro každou koncentraci katalyzátoru. Hodnoty reprezentující tuto analýzu jsou ukázány pro různé sloučeniny na Obrázku 1. Jed33 noduché di a trivalentní chloridové soli Mn, Fe, Co, Cu, a Ni nevykazují žádnou katalytickou aktivitu rozkladu peroxydusitanu při koncentraci 0,050 mM a níže.

TABULKA 1

Katalytické rychlostní konstanty pro rozklad peroxydusitanu sodného komplexy kovů při pH= 7,4 a teplotě 22°C

Č. vzorku	Komplex	kkat(M lsek-1)
1	Fe(III)TMPyP	2,75 * 106
	Fe(III)TPPS	2,06 * 106
	methemoglobin	3,20 * 105
	oxyhemoglobin	2,94 * 105
4	Fe(III)TMPS	1,60 * 105
5	NÍ(II)TMPS	8,72 * 104
7	Fe(III)(3,3'MeO2Salen) 8,72 * 104
3	Mn(III)TMPS	2,90 * 104
8	Ni(II)([14]dienoN4	)PF6 2,05 * 104
9	Ni(II)([14]dienoN4	)(PF6)2 1,80 * IO4
10	Ni(II)[14]12enN4	1,70 * 104
	Fe(III)EDTA	2,00 * 104
	Fe(III)citrát	1,50 * 104
2	H2TMPS	inaktivní
l(SM)b	H2TMPyP	inaktivní
	ZnTMPyP	inaktivní
-	NÍ(CR)Cl2 a	inaktivní

^aCR = 2,12-dimethyl-3,7,11,17-tetraazabicyklo[11.3.l]heptadeka-1(17),2,11,13,15-pentaen ^bvýchozí látka

Příklad 13

Tento příklad ilustruje inaktivaci CuZn-superoxiddismutázy (CuZnSOD) peroxydusitanem a ten katalyzátor rozkladu peroxydusitanu vykazující aktivitu v Příkladě 12 chrání CuZnSOD proti inaktivaci peroxydusitanem.

Zásobní roztoky CuZnSOD z hovězích jater (DDI Pharmaceuticals lne., Mountain View CA) byly připraveny rozpuštěním pravděpodobně 1,0 mg enzymu v 10 ml 50 mM tlumívého roztoku fosforečnanu draselného při pH=7,4. Aktivita tohoto roztoku dismutovat superoxid byla stanovena Rileyho metodou (Riley, D.P. a spol. Anal. Biochem. 196, 344-349, [1991]). Všechny k_Qbs i^sou průměry trojice běhů užitím stopped-flow spektrofotometru, vyrobeného Kinetic Instruments lne. (Ann Arbor, MI) a který byl zapojen k osobnímu počítači MAC IICX.

Inaktivace CuZnSOD peroxydusitanem

Inaktivace peroxydusitanem byla provedena přidáváním 1 ml zásobního roztoku CuZnSOD do 50 mM tlumivého roztoku fosforečnanu draselného pH=7,4, tak aby byl konečný objem zkoušky 10 ml po přídavku roztoků peroxydusitanu a EDTA. Do těchto zkušebních roztoků byla přidána rozdílná množství peroxydusitanu (25 mM zásobní roztok), tak aby se konečná koncentrace peroxydusitanu při zkoušce lišila od 0, 25, 50, 75 a 100 μιηοΐ/ΐ. Po přídavku peroxydusitanu bylo do každého zkušebního roztoku přidáno 100 flitrů zásobního 2,5 mM roztoku EDTA tak, aby konečná koncentrace EDTA byla 250 μιηοΐ/ΐ. U každého roztoku byla pak zkoušena superoxiddismu35 tázová aktivita stopped-flow analýzou, centraci peroxydusitanu je ukázán na reakčni směs, která obsahovala CuZnSOD v přítomnosti samotné 250 μιηοΐ/ΐ EDTA a 100 μιηοΐ/ΐ dusitanu draselného nebo dusitanu, nevykazovala žádný pokles CuZnSOD aktivity.

Příklad 14

Ochrana CuZnSOD vůči inaktivace peroxydusitaném užitím katalyzátorů rozkladu peroxydusitanu.

Zkušební roztoky byly připraveny jako je výše popsáno, vyjma přídavku odlišných katalyzátorů rozkladu peroxydusitanu. Konečný objem zkušebních roztoků byl udržován na 10 ml. Do zkušebních roztoků bylo přidáno Fe(III)TMPyP (0,5 a 1,0 μιηοΐ/ΐ konečná koncentrace) a Fe(III)TMPS (1,0 a 0,5 μιηοΐ/ΐ konečná koncentrace). Do roztoků pak byla přidána různá množství peroxydusitanu, aby bylo dosaženo konečných koncentrací 0, 25, 50, 75 a 100 μιηοΐ/ΐ. Po skončení působení peroxydusitanu byla přidána EDTA na konečnou koncentraci 250 μπιοί/ΐ. Roztoky byly zkoušeny na SOD aktivitu. Graf k_obs proti [peroxydusitanu] při různých koncentracích katalyzátorů ilustruje ochranný účinek Fe(III)TMPyP viz Obrázek 3 a Fe(III)TMPS viz Obrázek 4. Ukázalo se, že Fe(III)TMPyP a Fe(III)TMPS nejsou účinnými katalyzátory dimutace superoxidu, za podmínek ve kterých se zkouška prováděla.

Příklad 15

Graf k_obs proti konObrázku 2. Kontrolní

In Vitro vyhodnocení:

Materiály: Lidský rekombinantní tumor necrosis faktor-alfa (TNH-a) byl získán od Genzyme Corporation, Cambridge, MA. Lidský rekombinantní komplement C5a a L-arginin (L-Arg) byl koupen od Sigma Chemical Company, St. Louis, MO. Podle postupu uvedeného výše byl připraven účinný peroxydusitan.

Izolace endoteliálních buněk: Lidské kožní mikrovaskulární endoteliální buňky (HDME buňky) z neonatální předkožky byly připraveny, jak bylo dříve popsáno (Marks, R.M., Czerniecki, Μ., a Penny, R. In Vit. Cell. Devel. Biol., 21, 627-635 [1985]). V krátkosti, tkáň neonatální předkožky od několika dárců byla omyta v 70% ethanolu, nakrájena na malé kousky a pak vložena na 7-9 minut do tripsinu (0,6%; Irvine Scientific, Santa Ana, CA) a EDTA (1%; Sigma Chemical Company, St.Louis, MO). Endoteliální buňky byly odstraněny ostřím skalpelu tlačením na nezrohovatělý povrch tkáně. Buňky byly cenrifugovány přes hustotní gradient 35% Percoll (Sigma Chemical Company, St.Louis, MO). Po centrifugací při 250 x g po 10 minut byly buňky, odpovídající hustotě menší než 1,048 g/ml, odebrány a vrstveny na želatinu, která pokrývala nádoby určené pro tkáňové kultury (0,1%; Sigma Chemical Company, St.Louis, MO). Kontaminující buňky byly denně odstraňovány užitím jehly, 25 kalibr, připevněné nahoru tuberkulinové injekční stříkačky. Přečištěné endoteliální buňky se pětkrát pasážovaly (pravděpodobně 8 populačních zdvojení) v MCDB 131 (Endoteliální bazální médium; Clonetic Corporation) s přídavkem 30% lidského séra (BioWittaker, lne., Walkersville, MD), 10 ng/ml EGF (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA), 2 mM L-glutamin (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) a 250 μg/ml dibutyryl cAMP, 1 μg/ml hydrokortizonu (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). Tyto buňky byly charakterizovány jako normální endoteliální buňky testováním endoteliálních buněčných ukazatelů (imunoreaktivita faktoru VIII, s buňkou spojený angiotensin měnící aktivitu enzymu, a sorpce lipoproteinu nízké hustoty (LDL)). Pro použití k následu37 jícím zkouškám byly buňky při pátém pasážování konzervovány hlubokým mrazením v 10% DMSO (dimethylsulfoxid), poté co byly testovány jako negativní na mykoplazmu (Coriel Institute, Camden, NJ).

Příprava neutrofilů: Lidské neutrofily byly izolovány z periferní krve zdravých dárců (Look, D.C., Rapp, S.R., Keller, B.T., a Holtzman, M.J. Am. J.Physiol.,263, L79-L87 [1992]). Krev, která se nesráží EDTA, byla připravena užitím jednoho kroku hustotní centrifugace (PMN Prep, Robbins Scientific, Sunnyvale, CA), za níž následuje několikeré promytí v Hanksově tlumivém fyziologickém rozkoku (HBSS; Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) a hypotonická lýze erytrocytů. Preparáty obsahují >95% neutrofilů a byly >95% životaschopné za exkluze trypan blue (GIBCO Laboratories, Grand Island NY). Přečištěné neutrofily byly suspendovány v HBSS doplněného 0,01% BSA (Miles, Inc., Kankakee, IL) a 300 μπιοΐ/litr L-Arg (HBSSBA) v koncentraci 5 x 10⁶ buněk/ml.

Zkoušky poranění endoteliálních buněk: Cytotoxické účinky stimulovaných neutrofilů nebo peroxydusitanu na endoteliální buňky byly zjištěny užitím Zkoušky uvolnění ⁵¹Cr jak je popsána Moldowem (Moldow a spol. Methods Enzymol., 105, 378-385, [1984]). HDME buňky při pátém pasážování byly pěstovány do hustoty pravděpodobně 1-2 x 10⁴ buněk/cm² (pravděpodobně 90% splývání) na mikrotitračních plotnách o 96 jamkách a značeny po dobu 18 hodin 10 gCi/ml chromanem [⁵¹Cr] sodným (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL). HDME buňky byly cytokinálné-aktivovány po dobu 4 hodin 100 U/ml rekombinantním tumor necrosis faktorem-alfa (TNF-a; Genzyme Corporation, Cambridge, MA), pak dvakrát promyty HBSSBA. Suspenze neutrofilů byly přidány v koncentraci 2,5 x 10⁵/jamku a nechaly se na 15 minut ustálit. Jestliže nebylo jinak zaznamenáno, byly neutrofily aktivovány iniciací s 25 U/ml TNF-a po dobu 10 minut, následováno aktivací 3 pg/ml komplementární složkou C5a (Sigma Chemical Company, St.Louis, MO)'. Inkubace pokračovaly 2 h při 37°C. Peroxydusitan byl užit za nepřítomnosti neutrofilů. Z 25 mM zásobního roztoku peroxydusitanu v 50 mM NaOH bylo přidáno na vrstvu HDME buněk takové množství, aby konečná koncentrace peroxydusitanu byla od 0-800 μπιοί/ΐ. Veškeré inhibitory byly v HBSSBA připraveny čerstvé ihned před zkouškou a přidány v objemu 1/10 jamky a to ještě před přídavkem peroxydusitanu nebo neutrofilní aktivace.

Uvolnění ⁵¹Cr bylo stanoveno odsátím supernatantu z každé jamky (rozpustná frakce). Monovrstvy byly opatrně promyty HBSSBA, aby se odstranily buňky, které nepřilnuly a roztoky po promytí byly spojeny s rozpustnou frakcí. Buňky z každé jamky, které přilnuly byly solubilizovány IN NaOH a odstraněny do oddělené trubice. Obě frakce byly analyzovány pomocí gama scintilační spektrometrií. Výsledky byly vyjádřeny jako procento uvolnění ⁵¹Cr následovně: % uvolnění = cpm (rozpustná frakce + frakce s nepřilnutými buňkami/ celková cmp na jamku) x 100. Specifická cytotoxicita odráží rozdíl mezi uvolněním ⁵¹Cr indukované stimulovanými neutrofily a nestimulovanými neutrofily ( typicky nad 1-2% spontální uvolnění), výsledky byly potvrzeny v 2-3 oddělených zkouškách a uvedené údaje jsou reprezentativní.

Jak může být patrné z Obrázku 5, přídavek peroxydusita39 nu k endoteliálním buňkám má za následek na dávce závislé zvýšení poškození buněk, dokazující cytotoxické účinky peroxydusitanu. Komplexy, které se ukázaly být pomocí stopped-flow analýzy katalyzátory rozkladu peroxydusitanu pomocí jsou schopné ochrany vůči poškození buněk, které je způsobeno peroxydusitanem Obrázek 6. Tyto komplexy jsou také schopné ochrany vůči poškození buněk, které je způsobeno neutrofily v podobné dávce Obrázek 7.

Příklad 16

Protokol zkoušek buněčné ochrany užitím katalyzátorů rozkladu peroxydusitanu: Zkouška životaschopnosti buňky byla založena tak, aby bylo umožněno rychlé posouzení účinnosti katalyzátorů peroxydusitanu (PN) při ochraně buněk před poškozením a úmrtím způsobených peroxydusitanem. Syntetický PN byl pulzem exogenně přidán do buněk. Aby se zlepšilo hodnocení účinnosti PN katalyzátorů při ochraně buněk před poškozením způsobeným PN, bylo stanoveno takové množství peroxydusitanu (v 50 mM NaOH), které způsobuje maximální poškození (100%) a to pak bylo přidáno v podobě exogenního pulsu do každé z jamek s buňkami v přítomnosti nebo nepřítomnosti katalyzátoru. Doprovázející NaOH nebylo samo o sobě toxické.

Buňky (RAW 264,7 buňky nebo buňky P815 mastocytomu; American Type Culture Collection, Rockville, Md) byly pěstovány tak, aby se shlukly na plotnách tkáňových kultur o 96 jamkách. Aby se odstranil protein a jiné sérové komponenty, které by mohly reagovat s exogenním peroxydusitanem, byla každá jamka byla dvakrát promyta Dulbeccovým fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (DPBS; GXBCO BRL, Grand Island, NY). Do každé jamky pak bylo přidáno 200 μΐ DPBS. PN byl pak přidán v rostoucích koncentracích do jednotlivých jamek a byla sledována životaschopnost buněk. Dávka, při které je usmrcení buněk maximální, se pak využije pro stanovení katalytické ochrany.

Do samostatných jamek s buňkami byl přidán fyziologický roztok pufrovaný fosfátem (200 μΐ) obsahující vzrůstající koncentrace katalyzátoru. Do všech jamek s buňkami byla postupně dána maximální dávka PN. Po 15 minutách je médium z každé jamky odstraněno a buňky mohou být buď přes noc regenerovány v Earles minimálním základním médiu (Earles MEM)bez fenolové červeně a doplněny 10% fetálním hovězím sérem, nebo je eventuelně ten den u buněk na plotně zkoušena mitochondriální integrita užitím zkoušky životaschopnosti pomocí Alamar Blue(Alamar Biosciences, lne.; Sacramento, CA). V obou případech byly buňky inkubovány při 37°C v 5% co₂.

Poškození buněk je měřeno následovně. Krátce, 10% Alamar Blue (V/V) v Earles MEM s 10% FBS je přidáno do každé jamky s buňkami na 1-2 hodiny. Buněčnou metabolizací barvy se tvoří fluorescenční produkt, který se přímo vztahuje na počet životaschopných buněk. Mimoto tvorba fluorescenčního metabolitu je lineání více než 2 hodiny. Množství fluorescenčního produktu v 100 μΐ upraveného média z každé jamky s buňkami je pak po exitaci při 545 nm měřeno pomocí IDEXX fluorescenčního deskového čítače (nastavení míry zesílení 1%) když emisní vlnová délka je 575 nm. Životaschopnost je dána buď absolutními fluorescenčními jednotkami, nebo jako procento hodnoty získané pro neošetřené buňky (100%).

Jak může patrné z obrázku 8, oba Fe- a Ni- koordinované katalyzátory byly schopny chránit buňky myší monocyt-makrofágové řady RAW 264,7; v tomto pokusu byl PN přidán v dávce způsobující 50% pokles životaschopnosti buněk.

Porovnání působení vzrůstajících dávek PN na RAW a buňky P815 nevykazují žádný důkaz odlišné citlivosti k peroxydusitanu způsobujícího jejich poškození (výsledky nejsou ukázány). Nicméně, jak ukazuje Obrázek 9, existuje signifikantní ochrana buněk pomocí Fe-TMPyP, FeTMPS a FeTPPS, zatímco H₂TMPyP a ZnTMPyP byly poměrně neúčinné (výsledky nejsou ukázána), výsledek se shoduje s nedostatkem jejich katalytické aktivity. Přídavek katalyzátoru po NP nebyl schopen zabránit buněčnému poranění (výsledky nejsou ukázány), což ukazuje schopnost katalyzátoru ochránit buňky přímo před oxidačním poškozením z důvodu PN.

Příklad 17

In vivo vyhodnocení:

Edém packy způsobeny karagénanem. Účinky peroxydusitanových katalyzátorů in vivo byly zpočátku testovány na edému packy způsobeného karagénanem. Volba užití tohoto in vivo modelu zánětu byla založena na poznání, že 1) zánětlivá odpověď je blokována NOS inhibitory a 2) superoxiddismutázou (SOD). Toto ukazuje účast obou NO a O₂“. Samci Sprague Dawley krys byli koupeni od Harlan Sprague-Dawley (Indianopolis, IN). Tyto krysy (175-200 g) dostali subplantární injekci karagénanu do pravé zadní packy (0,1 ml 1% suspenze v 0,85% fyziologickém roztoku). Objem packy byl měřen plethysmometrem těsně před injekcí karagénanu a pak v hodinových intervalech od 1 do 6hodin. Edém byl vyjádřen u každého zvířete jako zvětšení objemu packy (v ml), měřené po injekci karagénanu, vztaženo k objemu před injekcí.

Krysám byly dány 1 hodinu po intraplantární injekci karagénanu bolus intravanózní injekce aktivního nebo inaktivního katalyzátoru; otok packy byl poté hodnocen každou hodinu až do 6 hodin. Relativní procenta inhibice získaná s těmito činidly jsou shrnuta v Tabulce 2. Při těchto experimentálních podmínkách inaktivní peroxydusitanové katalyzátory H₂TMPS, ZnTMPyP nebo MnTPPS (všechny podány v 30 mg/kg) nebo FeCl₃ (5 mg/kg, n=6) selhaly při inhibici tvorby edému.

Tabulka 2 % Inhibice_edému_packy_katalyzátory rozkladu peroxydusitanu čas (h) od injikace karagénanu

Sloučenina	Dávka (mg/kg)	1	2	3	4	5	6
FeTMPS	3	0	42	47	47	33	33
	10	0	61	Θ0	53	53	47
	30	0	85	80	80	80	81
FeTMPy	3	0	9	10	17	6	0
; ·	10	0	13	11	28	21	2
i '	30	0	44	43	50	32	32
FeTPPS	3	0	29	20	20	19	5
i	ío	0	17	20	23	19	20
	; 30	0	27	25	30	34	33
ZnTMPS	30	0	0	0	0	0	0
h2tmps	30	0	0	0	0	0	0
MnTMPS	30	0	0	0	0	0	0

Výsledky jsou vyjádřeny jako % inhibice edému packy, když byly porovnány k objemům získaných od kontrolních krys v tomtéž časovém bodě. Každý bod je průměr ± s.e.m pro n=6 zvířat.

Indukce intestinálního poškození endotoxinem u krys:

Syndrom selhání orgánů více orgánů (MOPS), který vyvolává následný septický záchvat je ve většině případů fatální. Motorem MOFS je gastrointestinální trakt, především tenké střevo. Rozsáhlá ischémie může být nalezena ve střevní sliznici z důvodu silné vazokonstrikce. Ischémie a hypoxie jejichž nástedky jsou léze sliznice, byly obě nalezeny u zvířat (krysa, kočka, psi) a člověka. Původem střevní léze je hypoxie. Během reperfúze (například po počáteční silné vazokonstrikci), může být 0₂~ uvolněn a může hrát důležitou roli při patogenézi lézí sliznice v gastrointestinálním traktu. Střevnímu poškození, které je výsledkem šoku způsobeného splanchnickými okluzemi artérií, zamezuje superoxiddismutáza a střevní zánět způsobený LPS je inhibován neselektivními inhibitory cesty oxidu dusnatého (Boughton-Smith, N.K. a spol., 1993). Nyní existuje hmotný experimentální a klinický důkaz, který naznačuje, že nadprodukce NO hraje důležitou patologickou roli při hypotenzi, snížení odpovědi na vazokonstriktory a při kardiovaskulárním kolapsu spojeného se septickým šokem. Kromě toho, inhibitory syntázy oxidu dusnatého zabraňují střevnímu poškození způsobeného endotoxinem. Vytvořili jsme model střevního pošnození endotoxinem 10 u krys a hodnotili jsme účinky terapeutického podání peroxydusitanových katalyzátorů.

Permeabilita střevních cév byla určena jako unikání hovězího sérového albuminu značeného [¹²⁵I] ([¹²⁵I]-BSA) do jejunální tkáně, podaného intravenózně (0,5 ml; 0,5 μΰί) společně s bud LPS (3 mg/kg, sérotyp 0111:B4) nebo izotonickým fyziologickým roztokem. 4 hodiny po podání LPS byly segmenty jejunální tkáně podvázány a odstraněny. Střevní tkáně byly rychle promyty, vysáty do sucha a zváženy. Krev (0,5 ml) byla odebrána do trubiček obsahujících citrát trisodný (0,318% konečná koncentrace) a plazma byla připravena centrifugací (10 OOOg x 10 min). Obsah [¹²⁵I]-BSA v segmentech celé tkáně a v celém podílu plazmy (100 μΐ) byl stanoven gama čítačem. Celkový obsah plazmy ve střevních tkáních byl vyjádřen jako μΐ/g tkáně. Změny intravaskulárního objemu ve střevní tkáni byly stanoveny v dodatečné skupině krys pomocí podání ([¹²⁵I]-BSA) intravenózně 2 minuty před odstraněním jejunumu. Byl stanoven obsah radioaktivně značeného BSA ve tkáních a plazmě a intravaskulární objem se vyjádřil jako μΐ/g tkáně. Tato hodnota byla odečtena z té, která byla získána při studiích úniku plazmy, aby se získala míra intestinálního úniku plazmového albuminu. Po podání LPS (4 hodiny) došlo ke signifikantnímu zvýšení (P>0,01) úniku plazmy (od 77±10 do 224±18 μΐ/g tkáně, n=8). Podání FeTMPS nebo FeTMPyP (30 mg/kg intravenózně, n=4), 3 h po injekci LPS, způsobilo redukci úniku radioaktivně znečeného albuminu, stanoveno o lh později, jak ukazuje Obrázek 10. Na rozdíl podání inaktivního peroxydusitanového katalyzátoru ZnTMPyP (30mg/kg intravenózně, n=4), 3 h po injekci LPS, neinhibovalo únik radioaktivně značeného albuminu, stanoveno o lh později (Obrá45 zek 10). Tyto výsledky jsou podepřeny histotologickou zkouškou jejunálrtích tkání. Kdy porovnáním ke krysám, jimž byl injikován fyziologický roztok, LPS způsobilo hluboké- jéjůnální poškození s vážným roztržením řas a klků. Poškození způsobené LPS bylo méně vážné v jejunumech odebraných krysám, kterým byl podán FeTMPS nebo FeTMPyP (30 mg/kg,'intravenózně) .

Tedy sloučeniny, které jsou sloučeninami* nebo komplexy podle vynálezu, jsou nové a mohou být užity při léčbě stavů a poruch řady zánětlivých onemocnění. Například, reperfúzní poranění ischemických orgánů, například reperfúzní poranění ischémického myokardu, zánětlivé střevní onemocnění, revmatické artritidy, osteoartritidy, hypertenze, psoriázy, rejekce orgánových transplantátů, orgánové konzervace, impotence, poranění způsobené zářením, astma, arterosklerózy, trombózy, agregace destiček, vedlejší účinky způsobené při léčbě rakovinných metastáz, chřipka, mrtvice, popáleniny, úrazy, akutní pankreatidy, pyelonefritidy, hepatitidy, autoimunitních onemocnění, diabetes mellitus závisející na inzulínu, rozptýlené intravaskulární koagulace, tukové embólie, respirační bolesti u dospělých a dětí a krvácení u novorozenců.

U pacientů přijímajících terapii IL-2 často vznikají vedlejší, potencionálně život ohrožující efekty, což zahrnuje horečku, zimnici, hypotenzi, syndrom kapilární propustnosti, stejně tak jako evidentní disfunkce řady orgánů, specificky včetně renálni insuficience a cholestatické žloutenky. IL-2 ovlivňuje komplexní síů cytokinů , která zahrnuje tumor necrosis faktor (TNF), interleukin 1 a 6. Proto pacienti podrobeni IL-2 terapii se podobají pacientům s endo46 toxémií (hypotenze, zvýšení hladin TNF, zvýšení hladin cytokinu atd.). Některé z nich způsobují uvolnění volných radikálů, stejné tak ovlivňují iNOS s následným uvolněním NO. Nedávné pojednání ukazuje, že iNOS je indukována u pacientů, kteří dostali IL-2 při léčbě karcinomu renálních buněk a maligního melanomu (Hibbs, J.B. a spol., Evidence for cytokine-inducible nitric oxid syntesis from L-arginine in patiens receiving interleukin-2 therapy. J. Clin. Invest. roč. 89, 867-877).

Aktivita sloučenin nebo komplexů podle vynálezu pro ochranu superoxiddismutázy může být ukázána užitím stopped-flow kinetických analýz, popsáno výše. Stopped-flow kynetická analýza je přesnou a přímou metodou pro kvantitativní sledování rychlostí rozkladu peroxydusitanu ve vodě. Stopped-flow kynetická analýza je vhodná k prověření komplexů, pokud jde o jejich katalytickou aktivitu při rozkladu peroxydusitanu a aktivní komplexy podle vynálezu, identifikované stopped-flow analýzou, jsou ukázány tak, aby se vztahovaly k léčbě poruch a stavů nemocí shora uvedených.

Jinými slovy, vynález se týká způsobů a kompozic pro léčbu nemoci nebo stavu, výhodně ovlivněného rozkladem peroxydusitanu rychlostí, která převyšuje přirozenou rychlost rozkladu, s výhodou u člověka trpícího takovou nemocí nebo stavem nemoci, zahrnující podání účinného, rychlost rozkladu peroxydusitanu zvyšujícího množství komplexu kovu ve formě dávkové jednotky, s výhodou kde komplex kovu je definován výše. Takové způsoby nebo kompozice dovršují léčbu těchto nemocí bez toho, aniž by nevýhodně ovlivnily normální biologicky výhodné mechanismy.

Celková denní dávka podaná pacientu v jediné nebo oddě- 47 lených dávkách smí být v množství, například pravděpodobně od 1 až 100 mg/kg tělěsné váhy a častěji pravděpodobně 3 až 30 mg/kg. Dávková jednotka kompozic může obsahovat taková množství svých podjednotek, aby tvořila denní dávku. Počet podjednotek je s výhodou pravděpodobně jednou až třikrát za den pravděpodobně 30 mg/kg na formu dávkové jednotky. Koncentrace dávek v séru jsou pravděpodobně 15 μιηοΐ/ΐ až 1,5 mmol/1 s výhodou v rozmezí od 3 až 300 μιηοΐ/ΐ.

Množství aktivní složky, která může být spojena s nosiči k výrobě formy jednotlivé dávky, bude odlišné a závislé na léčbě hostitele a určitém způsobu podání.

Režim dávkování, k léčbě stavu nemoci, sloučeninami eventuálně kompozicemi vynálezu je vybrán podle různých faktorů, včetně typu, věku, váhy, pohlaví, diety a stavu pacienta, prudkosti nemoci, cesty podání, farmaceutických ohledů, například aktivity, účinnosti, farmakokinetických a toxikologických profilů určitých působících sloučenin, zda je využit systém přivádějící lék a zda je sloučenina podána jako součást kombinace léků. Tedy, režim dávkování skutečně užitý, se může široce odlišovat, a proto se může odchylovat od výhodného režimu dávkování, zmíněného výše.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány orálně, parenterálně, inhalací spreje, rektálně nebo lokálně v ve formách dávkových jednotek obsahujících podle požadavku obvyklé netoxické přijatelné nosiče, adjuvancie a vehikulum. Lokální podání může také zahrnovat transdermální podání, například transdermální náplasti nebo iontoforetické prostředky. Termín parenterální, jak je zde užit, zahrnuje podkožní injekce, intravenózní, intramuskulární, intrasternální injekci, nebo infůzní techniky.

Injikovatelné preparáty, například sterilní injikovatelný vodný roztok nebo olejovitá suspenze mohou být vytvořeny, podle známého stavu techniky, užitím vhodných disperguj ících a zvlhčujících činidel a suspenzačních činidel. Sterilní injikovatelný preparát může být také sterilní injikovatelný roztok nebo suspenze v netoxickém parenterálně přijatelném ředidle nebo rozpouštědle, například jako roztok v 1,3-butandiolu. Mezi přijatelnými vehikuly a rozpouštědly, která mohou být využita, jsou voda, Ringersův roztok a isotonický roztok chloridu sodného. Kromě toho jako rozpouštědlo nebo suspenzní médium jsou obecně využity sterilní, fixní oleje. K tomuto účelu může být užit jakýkoliv jemný fixní olej včetně syntetických mono- nebo diglyceridů. Kromě toho mastné kyseliny, například kyselina olejová, nalezly užití při přípravě injikovatelných preparátů.

Čípky k rektálnímu podání léku mohou být připraveny smísením léku s vhodným neiritujícím excipientem, například kakaové máslo a polyethylenglykoly, které jsou při běžných teplotách pevné, ale kapalné při teplotě rekta, a proto se v rektu rozpustí a lék se uvolní.

Pevné dávkové formy pro orální podání mohou zahrnovat kapsuie, tablety, pilulky, prášky, granule a gely. Do takových pevných dávkových forem může být aktivní sloučenina vmíchána s nejméně jedním inertním ředidlem, například sacharóza, laktóza nebo kvasnice. Taková dávková forma může také zahrnovat, jako při normálním postupu, další substance, které jsou jiné než inertní ředidla, například mazací látky, například stearát hořečnatý. V případě kapsuii, tablet a pilulek mohou dávkové formy zahrnovat tlumiče. Tablety a pilulky mohou být dále připraveny s enterickými povlaky.

Kapalné dávkové formy k orálnímu podání mohou zahrnovat farmaceuticky přijatelné emulze, roztoky, suspenze, syrupy a léčebné nápoje obsahující inertní ředidla v technice obecně užívaná, například voda. Takové kompozice mohou také obsahovat adjuvancie, například smáčedla, emulgárory a suspendující činidla a ochucovadla dodávající sladkost, příchut a vůni.

Ačkoli mohou být sloučeniny podle vynálezu podány jako jediná aktivní farmaceutické činidla, mohou být také užity v kombinaci s jednou nebo více sloučeninami podle vynálezu nebo s jednou nebo více sloučeninami, které jsou známy jako účinné proti specifické nemoci, což je cílem léčby.

Claims (6)

1. Farmaceutická kompozice ve formě dávkové jednotky pro léčbu lidského pacienta, jehož stav je s výhodou ovlivněn zrychleným rozkladem peroxydusitanu, obsahující na dávkovou jednotku dostatečné množství komplexu kovu, katalyzujícího rozklad peroxydusitanu, pro zvýšení rychlosti rozkladu peroxydusitanu u takovéhoto pacienta.

2. Farmaceutická kompozice v formě dávkové jednotky pro léčbu lidského pacienta trpícího některým ze stavů ze skupiny, tvořené ischemickým reperfúzním poraněním, vedlejšími účinky chemoterapie při léčbě rakoviny, zánětem, sepsí, mrtvicí, infarktem myokardu, roztroušenou sklerózou nebo Parkinsonovou nemocí, zahrnující na dávkovou jednotku dostatečné množství komplexu kovu, katalyzujícího rozklad peroxydusitanu, pro zrychlení rozkladu peroxydusitanu u takovéhoto pacienta.

3. Kompozice podle nároku 1 nebo 2, kde je komplexem kovu ligandová struktura kovu vybraného ze skupiny Mn, Fe, Ni a V.

4. Kompozice podle nároku 3, kde komplexem kovu je Mn, Fe nebo Ni s makrocyklickým ligandem.

5. Kompozice podle nároku 4, kde kovovým komplexem je porfyrin nebo azamakrocyklus obsahující kov.

6. Kompozice podle nároku 5, kde komplexem kovu je vzorec

Struktura I kde

R₃, R₆, R_s nebo R_i2 jsou nezávisle vybranou skupinou obsahující: H, alkyl, alkenyl, CH_,COOH, fenyl, pyridinyl a N-alkylpyridyl, takže fenyl, pyridyl a N-alkylpyridyl jsou fenyl pyridyl

N-alkylpyridin které jsou připojeny k uhlíkovému atomu, a kde fenyl je nepovinně substituován halogenem, alkylem, arylem, benzylem, COOH, CONH₂, SO₃H, N0₂, NH₂, N(R)₃*, kde R je halogen, alkyl nebo alkylaryl;

pyridinyl je nepovinně substituován halogenem, alkylem, arylem, benzylem, COOH, CONH_a, SO₃H, N0_a, NH₂, N(R)₃*nebo NHCOR' kde R je shora definováno a R'j e alkyl; a kruh N-alkylpyridinu je nepovinně substituován halogenem, alkylem, arylem, benzylem, COOH, CONH₂, SO₃H, N0₂, NH_a, N(R)₃*nebo NHCOR' kde R a R' jsou shora definovány;

R₃, R₂, R₄, R_s, R₇, R_a, R_1O nebo R_laL jsou nezávisle vybranou skupinou obsahující : H, alkyl, alkenyl, karboxyalkyl, Cl, Br, F, N0_a, hydroxyalkyl a SO₃H nebo R_x a R₂ může tvořit kruh z 5 až 8 uhlíků, s výhodou 6;

X a Y jsou vhodné ligandy nebo náboj-neutralizující anionty, které jsou odvozevy od jakéhokoli monodentálního nebo polydentálního koordinačního ligandu nebo ligandového systému nebo jemu odpovídajícímu aniontu (například kyselina benzoová a benzoátový anion, fenol nebo fenoxidový anion, alkohol a alkoxidovy anion) a jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující: halogenid, oxo, aquo, hydroxo, alkohol, fenol, dioxygen, peroxo, hydroperoxo, alkylperoxo, arylperoxo, amoniak, alkylamino, arylamino, heterocykloalkylamino, heterocykloaryl, amino, aminooxidů, hydrazin, alkylhydrazin, arylhydrazin, oxidu dusnatého, kyanid, kyanátu, thiokyanátu, isokyanátu, isothiokyanátu, alkylnitrilu, arylnitrilu, alkylisonitrilu, arylisonitrilu, dusičnanu, dusitanu, azido, alkylsulfonové kyseliny, arylsulfonové kyseliny, alkylsulfoxidu, arylsulfoxidu, alkylarylsulfoxidu, alkylsulfenové kyseliny, arylsulfenové kyseliny, alkylsulfinové kyseliny, arylsulfinové kyseliny, alkylthiol karboxylové kyseliny, arylthiol karboxylové kyseliny, alkylthiol thiokarboxylové kyseliny, arylthiol thiokarboxylové kyseliny, alkylkarboxylové kyselí53 ny (například kyselina octová, trifluoroctová, oxalová), aryIkarboxylové kyseliny (například kyselina benzoová, ftalová), močovina, alkylmočovina, arylmočovina, alkylarylmočovina, thiomočovina, alkylthiomočovina, arylthiomočovina, alkylarylthiomočovina, síran, siřičitan, hydrogensíran, hydrogensiřičitan, thiosíran, thiosiřičitan, alkylfosfin, arylfosfin, alkylfosfinoxid, arylfosfinoxid, alkylarylfosfinoxid, alkylfosfinsulfid, arylfosfinsulfid, alkylarylfosfinsulfidu, kyselina alkylfosforitá, kyselina arylfosforitá, kyselina alkylfosforná, kyselina alkylfosfinitá, kyselina arylfosfinitá, fosforečnan, thiofosforečnan, fosfit, pyrofosfit, trifosforečnan, hydrogenfosforečnan, dihydrofosforečnan, alkylguanidino, arylguanidino, alkylarylguanidino, alkylkarbamát, arylkarbamát, alkylarylkarbamát, alkylthiokarbamát, arylthiokarbamát, alkylarylthiokarbamát, alkyldithiokarbamát, aryldithiokarbamát, alkylaryldithiokarbamát, hydrogenuhličitan, uhličitan, chloristan, chlorečnan, chloritan, chlornan, bromistan, bromičnan, bromitan, bromnan, tetrahalomanganan, tetrafluoroborát, hexafluorofosforečnan, hexafluoroantimoničnan, fosfornan, jodičnan, jodistan, metaboritan, tetraarylborát, tetraalkylborát, vinan, salicylát, sukcinát, citrát, askorbát, sacharinát, aminokyseliny, kyselina hydroxamová, thiotosylát a anionty iontoměničových pryskyřic, nebo systémů; s výhradou, že když komplex, obsahující X a Y, má výsledný pozitivní náboj, pak je přítomno Z a je protiiontem, který je nezávisle X nebo Y, nebo když komplex obsahující X a Y má výsledný negativní náboj, pak je přítomno Z a je protiiontem vybraným ze skupiny skládající se z kationtů alkalických kovů a alkalických zemin, organických kationtů, například alkyl nebo alkylarylamonné kation-