HUT69771A - Proteases causing abnormal degradation of amyloid beta-proteine precursors - Google Patents

Description

A találmány proteázokra vonatkozik, amelyek amiloid β-protein prekurzor abnormális degradációját okozzák. A találmány vonatkozik továbbá az Alzheimer kór kezelésére is.

Az Alzheimer kórban és Down kórban szenvedő személyek agyában, valamint ennél jóval kisebb mértékben a normál módon idősödött személyek agyában abnormális extracelluláris protein-kiválások mutatkoznak, amelyet amiloidnak nevezünk. Az amiloid kiválás káros és mérgező az azt körülvevő területre.

Az amiloid kiválások az elöregedett plakkok központjában, valamint az Alzheimer kórban (AD) szenvedő betegek agyának véredényeiben található. Az agyi amiloid fő komponense a β-protein, egy 4 Kd (39-42 aminosav) nagyságú fragmens (G.G. Glenner és mtársai, (1984), Biochem. Biophys. Rés. Comm., 12. kötet, 1131-35; C.L. Maters és mtársai, (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82. kötet, 4245-49; D.J. Selkoe és mtársai, (1986), Jour. Neurochem., 46. kötet, 1820-34; A.Roher és mtársai, (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83. kötet 266266), amely egy nagyobb 110-135 Kd β-protein prekurzorból (βPP) származik (D. Goldgaber és mtársai, (1987), Science, 235. kötet, 877-80; J. Kang és mtársai, (1987), Natúré, 325. kötet, 733-36; N.K. Robakis és mtársai, (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84. kötet, 4190-94; R.E. Tanzi és mtársai, (1987), Science, 235. kötet 880-83) . Az agyi amiloid ezen túlmenően és a β-proteinnal szorosan kapcsolatban tartalmaz még egy szerin proteáz inhibitort, αΐ-antikimotripszint (ACT).

Bizonyos β-ΡΡ transzkriptumok tartalmaznak egy doment, amely a Kunitz-típusú proteáz inhibitorokkal homológ (lásd például (N. Kitaguchi és mtársai, (1988), Natúré, 331. kötet,

• · · · · · * · · ··« ·· • · « ··· ··

-3530-32; P. Ponté és mtársai, 311. kötet, 525-27; R.E. Tanzi és mtársai, (1988), Natúré, 331. kötet, 528-30). A normál fizológiás C-terminális haítás, amely felszabadítja a β-ΡΡ (PN2) szekréciós formáját a β-protein domenen belül és a feltételezett membrán domenen kívül megy végbe.

M. Tsudo és mtársai (M. Tsudo és mtársai, (1987(, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84. kötet, 4215-18) ismertetik egy ligandum és e ligandum receptor oldala közötti térhálósodást diszukcinimidil-szuberáttal (DSS) végzett kezelés hatására.

Felismertünk az AD betegek agyában található proteolitikus faktorokat, amelyeket AD proteolitikus faktoroknak nevezünk. A találmány szerint a β-protein akkumulációja egy alternatív degradációs út következménye, amely abnormális β-ΡΡ képződését eredményezi és egy vagy több az AD proteolitikus faktorok közül részt vesz ezen abnormális folyamatban.

A találmány vonatkozik egy AD proteolitikus faktorra, amely képes a β-protein prekurzort hasítani a β-protein N-terminuszhoz közeli helyen. Egy előnyös kiviteli formánál az AD proteolitikus faktor képes a β-ΡΡ hasítására a β-protein domenen kívüli helyen és közel a β-protein N-terminusz-hoz, még előnyösebben egy a lizint követő helyen vagy egy a metionint követő helyen; egy első AD proteolitikus faktor egy kalcium-aktivált proteázt, előnyösen egy szerin proteázt tartalmaz; a szerin AD proteolitikus faktor aktivitását a PN2 és az ACT gátolja; egy második AD proteolitikus faktor egy cisztein proteázt tartalmaz; a cisztein proteáz egy metallopropteáz, CA²⁺- vagy Mg²⁺-függő (és esetleg Zn²⁺-függő) és molekulatömege kb. 43-68 kDa.

-4A találmány vonatkozik továbbá Alzheimer kórban szenvedő betegek kezelésére, amelynél a β-protein prekurzor proteolízist csökkentjük a β-protein N-terminuszához közeli helyen. Egy előnyös kiviteli formánál a találmány szerinti eljárásnál a betegnek egy inhibitort adagolunk, amely gátolja a proteolízist a β-ΡΡ β-protein domenjén kívüli helyen és a β-protein N-terminusz-hoz közeli helyen, és előnyösen gátolja a proteolízist a β-protein N-terminuszának szomszédságában, előnyösen úgy, hogy gátolja az ezen helyen ható proteolitikus faktor proteolitikus aktivitását; az inhibitor képes a vér-agygáton átjutni és az inhibitort például parenterálisan (intravaszkulárisan vagy intramuszkulárisan) vagy orálisan adagolhatjuk.

A találmány vonatkozik továbbá olyan betegség diagnosztizálási eljárására, amely amiloid akkumulációjával jár, különösen Alzheimer kór diagnosztizálására, amelynél meghatározzuk a betegtől származó mintában, így pédául egy szövet vagy nedv mintában az AD proteolitikus faktor mennyiségét.

A találmány vonatkozik továbbá egy a betegség kezelésére alkalmas szer vizsgálatára (kiválasztására), amelynél amiloidot akkumulálunk egy AD proteáznak egy peptiddel végzett inkubálásával, amely peptid aminósav szekvenciája megfelel a &protein N-terminuszáig terjedő szekvenciának, az inkubálást a vizsgálni kívánt szer jelenlétében végezzük, majd meghatározzuk a peptid degradációjának mértékét. Az ily módon vizsgált szer alkalmas lehet olyan betegségek kezelésénél, amelyeknél az AD proteáz által okozott peptiddegradáció kisebb az említett szer jelenlétében, mint ami várható lenne ugyanazon vagy hasonló reakciókörülmények között az említett szer jelenléte nélkül.

-5A találmány egy előnyös kiviteli formájánál a peptid aminosav szekvenciája egy 10 aminosavból álló szekvenciát tartalmaz a β-protein N-terminuszáig terjedően, még előnyösebben 5 vagy 6 aminosawal kezdődik az N-terminusztól upstream irányban.

A találmány vonatkozik továbbá egy mintából származó enzim tisztítására, különösen egy proteolitikus enzim tisztítsára, amelynél a mintát egy szubsztrátum vagy egy szubsztrátum-fragmens jelenlétében - amely szubsztrátumhoz vagy fragmenshez az enzim kötődik - inkubáljuk, majd a mintát DSS-sel kezeljük az enzim-szubsztrátum - komplexek térhálósítására, majd a komplexeket kinyerjük. Egy előnyös kiviteli formánál a szubsztrátum vagy a szubsztrátum-fragmens jelzett (különösen előnyösen rádió-jelzett).

Az 1. ábrán egy sor szerin proteáz aktivitást mutatunk be, olyan frakciókban, amelyeket előzőleg Alzheimer kórban szenvedő betegek (AD) agyhomogenizátumából nyertünk ki. A Panel A egy coomassie blue festékkel festett SDS-PAGE gél fényképe, amelyen a jódozott peptid, ¹²5i-HSEVKMDAEF (peptid Pl), hasítási terméke, majd az agyhomogenizátum frakciókkal való reakciója és a diszukcinimidil-szuberáttal (DSS) való térhálósítása látható. A Panel B egy, a Panel A szerinti gél röntgen-radiogramja. A panel C egy cellulóz mikrokristályos vékonyrétegkromatográfiás lemez (TLC) autoradiogrammja, amelyen a ¹²⁵I-P1 hasítási termékének az agyhomogenizátum frakcióval való reakciója látható.

A 2. ábrán szerin proteáz aktivitások sorozata látható AD betegek agyhomogenizátumából származó frakciókban, amelyeket

-6még méretkizárásos kromatográfiával tovább tisztítottunk. A megfelelő A, B, C panelokat az 1. ábrán ismertettük.

A 3. ábrán különböző szerekkel gátolt szerin proteáz aktivitásokat mutatunk be AD betegek agyhomogenizátumaiból származó frakcióban.

A 4. ábrán szekvencia térképet mutatunk be, amelyen látható a katepszin G által (felül) és a Ca²⁺ aktivált specifikus szerin proteáz (CASP) (találmány szerinti, alsó) által hasított Pl. A rövidítések jelentése a következő: H hisztidin, S szerin, E glutaminsav, V valin, K lizin, M metionin, D aszpartinsav, A alanin, F fenil-alanin. A számértékek a peptidkötés hasításának százalékos értékét mutatják a nyíllal jelölt helyeken.

Az 5. ábrán egy TLC lemez radiogrammját mutatjuk be, amelyen cisztein proteáz aktivitás látható olyan frakciókban, amelyeket AD betegek agyi homogenizátumából nyertünk ki DEAE-triszakril M ioncserés kromatográfiával. A frakciókat lineáris NaCl gradienssel eluáltuk (nyíllal jelölve a ábra alsó szélénél), radioaktív jóddal jelzett Pl jelenlétében inkubáltuk és TLC-vel választottuk el. A nem hasított Pl, valamint a hasított termék szekvenciája jobbra látható.

A 6. ábrán bemutatjuk a ditiotreitol (DTT) hatását az AD cisztein proteáz aktivitásra. Az AD proteáz aktivitású cisztein mintákat Pl-el inkubáltuk növekvő koncentrációjú DTT jelenlétében, majd meghatároztuk az aktivitást TLC segítségével. A jelzett DTT koncentráció: A. DTT oldószer önmagában (DTT nélkül) ; B. 5 mmól DTT, C. 2,5 mmól DTT, D. 1 mmól DTT, E. peptid önmagában (DTT és oldószer nélkül).

-ΊΑ. 7. ábrán látható a különböző inhibíciós szerek hatása a cisztein proteáz aktivitásra AD betegek agyi homogenizátumából származó frakciókban.

Cisztein AD proteolitikus faktor izolálása és tisztítása

A találmány szerinti AD proteolitikus faktort egy szövet homogenizátumban azonosíthatjuk és abból izolálhatjuk, például az ismert folyadékkromatográfiával.

A következőkben példaképpen bemutatunk egy eljárást, amellyel azonosítható, elválasztható és részlegesen jellemezhető egy AD proteolitikus faktor az agyi homogenizátumból. Nyilvánvaló, hogy az ismertetett eljárástól különböző részletektben eltérő élj ársok is alkalmazhatók az AD proteolitikus faktorok izolálására és tisztítására és ez szintén a találmány oltalmi körébe tartozik.

Az eljárás nagy általánosságban a következő lépésekből áll: a szövet homogenizálása,· nyers elválasztás végzése affinitásos folyadékkromatográfiával; további elválasztás egy első DEAE-ioncserélő oszloppal, majd oszlopon végzett gélszűrés, majd egy második DEAE-ioncserélő oszlopon végeztt elválasztás; dialízis és egy végső tisztítás affinitásos folyadékkromatográfiával. A leírás tartalmaz továbbá eljárást a tisztított Ad proteolitikus AD faktorok jellemzésére (molekulatömeg, szubsztrátum specificitás), valamint az aktivitás alkalmas inhibitorainak kiválasztására.

Az alábbiakban ismertetésre kerülő eljárást sikeresen alkalmaztuk AD agyi homogenizátumokból a cisztein AD proteáz elválasztására és tisztítására. A cisztein AD proteáz a Pl peptidet a Met csoport után hasítja. Molekulatömege 43-68 Kda,

-8ez egy metalloprotein, Ca²⁺- vagy Mg²⁺- és esetleg Zn²⁺-függő. Látszólagosan a legtöbb cisztein proteáz inhibitor hatásosan gátolja az AD cisztein proteázt, amelyet AD agyi homogenizátumokból választottunk el a következőkben leírtak szerint.

Agyi homogénizátumok

Ad betegektől származó agyi szövetet jéghideg 5x (térfogat/tömeg) trisz-Cl pufferban homogenizáljuk Waring típusú keverőben, amely puffer 1% Triton X-100 és 1 mmól ditiotreitol (DTT) anyagokat tartalmazott. A homogenizálás után az oldatot még 30 percig jégen keverjük, majd 10000 G mellett 60 percen át centrifugáljuk. A felülúszót, amely az oldható enzimet tartalmazza, ammonium-szülfát frakcionálásnak vetjük alá: 0-25%, 25-50%, 50-75% és >75%, az ammonium-szülfát sót lassan adagolva a felülúszóhoz jégen végzett keverés közben. Az oldatot ezután 20 percig keverjük, majd Sorval RC-58 típusú hűtött centrifugában 10000 G mellett 30 percig centrifugáljuk. A harmadik centrifugálás után a három, az ammonium-szulfát frakcionálási lépésekből származó precipitátumot trisz-Cl és 1 mmól DTT tartalmú pufferban, pH=7,4 oldjuk, a frakciókat ugyanezen pufferral szemben dializáljuk a következő lépések előtt.

Szintetikus peptid szubsztrátum

A proteáz vagy proteázok vizsgálatára, amelyek a E-protein N-terminusz szomszédságában hasítanak, egy ¹²⁵I-jelzett peptidet szintetizálunk, amelynek a szekvenciája HSEVKMDAEF (peptid Pl) és amely megfelel az ezen oldalt záró E-PP szekvenciának. A peptid öt aminosawal az N-terminusztói ···«

-9upstream irányban (az aszpartinsav, D, a β-protein N-terminuszánál van) és a feltételezett hasítási helyen keresztül magába a β-proteinben nyúlik be; a hisztidint, H, a radiojódozás céljából adagoljuk (azaz a hisztidin helyettesíti az izoleucint, amely a nativ β-protein ezen helyén található). A jelzett peptidet különböző tisztaságú agyi frakciókkal inkubáljuk és a kapott fragmenseket vékonyrétegkromatográfiával (TLC) elválasztjuk; az N-terminális fragmenseket autoradiográfiával mutatjuk ki. Egy ismeretlen hasítási termék hasítási helyét ezután a következőképpen mutatjuk ki: vagy a hasítási terméket közvetlenül szekvencia analízisnek vetjük alá, vagy az ismeretlen hasítási terméket összehasonlítjuk egy olyan hasítási termékkel, amelyet egy ismert enzimmel, így például katepszin G-vel nyertünk. Az AD agyból származó proteolitikus aktivitásokat meghatározhatjuk Western biot analízissel is, amelynél szubsztrátűmként patkány agyból származó teljes hosszúságú β-ΡΡ-t alkalmazunk.

Szintetikus peptid szubsztrátum degradációs aktivitásának vizsgálata

A különböző proteáz frakciókat vizsgáljuk a jódozott peptid Pl peptiddel szemben mutatott proteolitikus aktivitásra. Az inkubálást 37°C hőmérsékleten 50 mmól trisz-HCL-ben, pH=7,4 végezzük 1 mmól MgC12 + 1 mmól DTT jelenlétében. A proteolítikus termékekekt TLC-vel cellulóz mikrokristályos lemezeken elválasztjuk, oldószerként n-butanol/piridin/ecetsav/víz=15/10/3/12 (tf/tf) elegyet alkalmazva, majd ezután radiográfiát végezzük.

Cisztein proteáz tisztítása

-10Affigel Blue affinitásos kromatografia

Az Affigel Blue előnyös az első kromatográfiás lépésnél, mivel ez elválasztja a proteáz keveréket a szérum albumintól és egy nagy számú más egyéb protein fajtától. Az Affigel Blue-t (Bio-Rad) (1,5 cm x 33 cm) kiegyensúlyozunk 50 mmól trisz-Cl + 0,5 mmól DTT, pH=7,4, keverékkel, majd 0-0,5 mól NaCl lineáris gradienssel eluáljuk. Az átfolyási sebesség 20 ml/óra és 3 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk.

Első DEAE-ioncserés kromatografia

Az Affigel Blue keveréket, amely a proteáz aktivitást tartalmazza TLC-vel kimutatva, egy DEAE-trisz-akril M ioncserés oszlopra (1,5 cm x 10 cm) adagoljuk. Az oszlopot 50 mmól trisz-C1 + 1 mmól DTT, pH=7,4, keverékkel kiegyensúlyozzuk és 0-0,5 mól NaCl lineáris gradienssel eluáljuk, áramlási sebesség 20 ml/óra és 3 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk.

Gélszűréses kromatográfia

Az első DEAE-trisz-akril M gélszűréses lépésből származó proteáz aktivitásra pozitív keveréket 2,5 ml térfogatra töményítünk be újraszűréssel Amicon szűrő alaklamzásával (PM-10, kDa cutoff) nitrogénatmoszférában. A betöményített keveréket ezután Sephacryl S-200 gél szűrőoszlopra adagoljuk (2,5 cm x 66 cm), kiegyesúlyozzuk és 50 mmól trisz-Cl + 1 mmól DTT, pH=7,4 eleggyel eluáljuk. Az áramlási sebesség 25 ml/óra és 2,5 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk.

Második DEAE-ioncserés kromatográfia

A proteáz aktivitást tartalmazó és az előző Sephacryl S-200 oszlopról származó keveréket egy második DEAE-trisz-akril ioncserés oszlopon (1,5 cm x 4,5 cm) kromatografáljuk 0-0,5 mól

-11NaCl 5 mmól trisz-Cl + 1 mmól DTT, pH=7,4, elegyben, gradienssel, az áramlási sebesség 20 ml/óra és 2,2 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk.

Tiopropil Sepharose 6B affinításos kromatográfia

Egy utolsó lépésben a második DEAE-trisz-akril M gélszűrési lépésből származó, proteáz aktivitást tartalmazó keveréket 3 ml tréfogatra betöményitjük ultraszűréssel az előzőek szerint. A betöményített keveréket 1 éjszakán át dializáljuk kétszeri 500 ml 50 mmól trisz-Cl, pH=7,4 oldat alkalmazásával a DTT eltávolítására. A tiopropil-Sepharose 6B gyantát (0,4 g) gáztalanított 50 mmól trisz-Cl pH=7,4 pufferral majd 50 mmól trisz-Cl + 0,3 mól NaCl, pH=7,4 pufferral, majd 2 ml következő összetételű oldattal mossuk: 50 mmól trisz-Cl + 5 mmól 2-merkapto-etanol, pH=7,4, és 50 mmól trisz-Cl + 10 mmól 2-merkapto-etanol, pH=7,4. Az áramlási sebsség 4 ml/óra, és 2,2 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk.

Molekulatömeg meghatározása

A proteáz molekulatömegét gélszűréssel határozzuk meg Sephacryl S-200 oszlopon (2,5 cm x 66 cm), amelyet 50 mmól trisz-Cl + 1 mmól DTT, pH=7,4 eleggyel egyensúlyoztunk ki. Az oszlopot azonos összetételű pufferral eluáljuk, az áramlási sebesség 25 ml/óra és 2,2 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. A frakciókat ezután proteáz aktivitásra vizsgáljuk a fentiekben leírtak szerint. Protein standarként az oszlop kalibrációjához β-amilázt (200000 kDa), alkohol-dehidrogenázt (150000 kDa), albumint (66000 kDa), karbon-anhidrázt (29 kDa) és citokrom C-t (12400 kDa) alkalmazunk.

A proteáz látszólagos molekulatömegét szintén

-12meghatározhatjuk SD-PAGE segítségével. Molekulatömeg standardként a következőket alkalmazzuk: miozin (H-lánc) (228000 kDa), foszforiláz B (109600 kDa), szarvasmarhaszérum albumin (70000 kDa), tojásfehérje albumin (44100 kDa) és karbon-anhidráz (27900 kDa) .

AD cisztein proteázzal való peptid Pl degradáció gátlásának vizsgálata

A szintetikus peptid Pl-degradáló aktivitásra kifejtett különböző proteáz inhibitor reagensek hatásának vizsgálatához a proteolitikusan aktív mintát a megfelelő mennyiségű feltételezett inhibíciós reagenssel inkubáljuk 60 percen át 4°-on, majd a fentiek szerint vizsgáljuk a megmaradó, a Pl pepiiddel szembeni proteolitikus aktivitást. A kontroll reakciónál nem használunk inhibíciós reagenst vagy pedig csak a reagenshez alkalmazott oldószert vizsgáljuk.

PMSF törzsoldatokat 2-propanol, E-64 dimetil-szulfoxid (DMSO) és 1,10 O-fenantrolin, valamint etanolban oldott benzamidin-HCl oldószerekben oldjuk. Kétszer desztillált vízben jódacetamidot, Na-jódacetátot, EGTA-t, EDTA-t, bestatint, HMB-t és leupeptint oldunk.

A tisztított cisztein proteáz keverék szubsztrátum specificitásának vizsgálata

A tisztított proteáz keverék szubsztrátum specificitásának vizsgálatához a tisztított aktív frakciók alikvot részét SDS-szubsztrátum gélen elektroforizáljuk, amely gél még 1 mg/ml kazeint vagy zselatint is tartalmaz. A proteáz keveréket 1:1 arányban 2x Laemmli pufferral elkeverjük merkapto-etanol nélkül és 12% SDS poliakrilamid gél és 2x szokásos mennyiségű

-13ammonium-perszulfátot tartalmazó oszlopra visszük. Az elektroforézist 4°-on 20 mA-nél végezzük. Az elektroforézis után az SDS-t eltávolítjuk úgy, hogy a gélt 2,5% Triton X-100 oldószerben 30 percig rázzuk 25°-on. A gélt ezután 50 mmól trisz-Cl + 1 mmól CaC12 elegyben 2 napon át 37°-on inkubáljuk rázás közben. A gélt ezután 0,5% Coomassie Blue festékkel megfestjük, majd a festéket eltávolítjuk.

Cisztein AD proteáz rádiójelzése

A fentiek szerint előállított, tisztított proteázkeverék proteolitikus aktivitását erősen gátolja az NEM cisztein proteáz inhibitor. A proteázt ¹⁴C NEM-mel jelezzük, majd a mintát analizáljuk SDS-PAGE és autoradiográfia alkalmazásával a következők szerint. Mivel a ¹⁴C NEM n-pentánabn kerül forgalomba, az NEM oldatot azonos térfogatú kétszer desztillált vízhez adagoljuk és az n-pentánt gyenge nitrogénáramban elpárologtatjuk a felhasználás előtt. A proteáz keveréket ¹⁴C NEM jelenlétében (6,7 mmól végső NEM koncentráció) inkubáljuk 4°-on 2 órán át. Inkubálás után az oldatot azonos térfogatú 2x pufferral elkeverjük, majd 12% SDS akrilamid gélen elektroforetizáljuk, lényegében U.K. Laemli módszere szerint (U.K. Laemli (1970), Natúré, 227. kötet, 680-85). Az elektoroforézis után a gélt 40% metanolt, 10% ecetsavat (tf/tf) tartalmazó eleggyel 30 percen át mossuk, majd ezt követően 30 percen át Enlightning (New England Nuclear) oldattal mossuk, majd vákuumban melegítve szárítjuk. A gélt ezután filmmé alakítjuk két héten át intenzifikáló ernyő segítségével. A cisztein AD proteáz radiojelzetté válik annak révén, hogy a jelzett NEM inhibitorhoz kötődik.

-14A cisztein proteáz szubsztrátúrnának jellemzése

A fentiek szerint nyert tisztított AD proteáz aktivitását továbbá különböző kromogén szubsztrátumokkal, valamint teljes hosszúságú β-ΡΡ proteinnel szemben is kimutattuk. A proteázt 2 mmól MeOSuc-Glu-Val-Lys-Met-pNA, MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Met-pNA, Lys-pNA és Met-pNA szubsztrátum 50 mmól tirsz-Cl, 50 mmól CaC12« 100 mmól NaCl, 1,2 mmól DTT puferral, pH=7,9, készült oldatával inkubáltuk. Az abszorpcióban bekövetkező változást 400 nm-nél vizsgáltuk Titertek Multiskan™ ELISA leolvasó alkalmazásával. A kontroll reakciónál nem alkalmaztunk sem enzimet sem szubsztrátumot. A proteáz aktivitását teljes hosszúságú β-ΡΡ proteinnel szemben vizsgáltuk, amelyet patkányból nyertünk és a vizsgálatnál a proteázt 50 mmól trisz-Cl, pH=7,4, 1,2 mmól DTT, 1,7 mmól MgC12 tartalmú pufferban inkubáltuk. Az inkubálást 1 éjszakán át 37°-on végzetük, majd 7,5%-os SDS-PAGE gélen szeparáltunk. Az elválasztott polipeptideket PDVF membránokra (Millipore) vittük át Towbin és mtársai módszere szerint (Towbin és mtársai, (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76. kötet, 4350. A foltokat nyúl anti-E-PP antitestekkel immunofestettük, amelyeket a β-peptid N-terminuszánál végződő területre irányítottuk, a β-ΡΡ fragmenseket kecske anti-nyúl alkalikus foszfatázzal és a megfelelő színes szubsztrátummal mutattuk ki.

Az 5. ábrán cisztein proteáz aktivitást mutatunk be az AD betegek agyi homogenizátumából elválasztott frakciókban, DEAE-triszakril M-ioncserélő kromatgráfiát alkalmazva.

A 6. ábrán a DTT hatását mutatjuk be az AD cisztein proteáz aktivitásra.

-15Α 7. ábrán a különböző szerek inhibíciós hatását mutatjuk be a cisztein proteáz aktivitásra különböző frakciókban, amelyeket a fentiek szerint AD betegek agyi homogenizátumaiból nyertünk. Az AD cisztein proteolitikus faktor készítményt és az inhibitort (a jelzett koncentrációban) 0°-on 30 percen át inkubáltuk, majd vizsgáltuk a megmaradó aktivitásra. A 7. ábrán látható sávok jelentése a következő: A sáv H2O, B sáv Na-jód-acetát 5 mmól, C sáv E-64 (Sigma), 0,02 mmól, D sáv E-64, 0,01 mmól, E sáv p-hidroxi-higany-benzoát 5 mmól, F sáv N-etil-maleinimid 5 mmól, G sáv o-fenantrolin 4 mmól, H sáv o-fenantrolin 1,8 mmól, I sáv etanol, J sáv etanol/H20, K sáv PMSF 5 mmól, L sáv bestatin 0,02 mmól, M sáv EGTA 5 mmól, N sáv CaC12 2 mmól, 0 sáv DTT 5 mmól, P sáv peptid önmagában.

Szerin AD proteolitikus faktor elválasztása és jellemzése

A következőkben ismertetjük a Ca²⁺-aktivált szerin proteázt tartalmazó AD proteolitikus faktor azonosítását és tisztítását, amelynek Pl hasító aktivitása ACT-vel és PN2-vel van gátolva.

Az agyi frakciókat jódozott peptiddel (¹²⁵I-P1) inkubáljuk és diszukcinimidil-szuberáttal (DSS) kezeljük azon proteinek térhálósítására, amelyek közvetlen kapcsolatban voltak a peptiddel, azaz térhálósítjuk az enzim-szubsztrátum komplexet és ezzel kapcsolatban bármelyik proteáz-szubsztrátum komplexet. Ezután az enzimeket kinyerjük a frakciókban, amelyek a jelzett enzim-szubsztrátum komplexet tartalmazzák DSS térhálósítással stabilizálva, és az N-terminális fragmenseket autoradiográfiával kimutatjuk TLC lemezeken, lényegében a fentiekben a cisztein AD proteáznál leírtak szerint.

• · ·

-16Ezen vizsgálatok (TLC, DSS térhálósítás) alkalmazásával a specifikus szerin proteáz aktivitást részlegesen elválasztottuk az ALzheimer kóros agyi homogenizátumokból klasszikus folyadékkromatográfiával.

Az Alzheimer kóros agyból (AD agy) nyert specifikus proteáz aktivitás első tisztításának eredményét mutatjuk be az

1. ábrán. Az agyi homogenizátumokat foszfáttal pufférőit sóoldatban (PBS) készítjük (20 mmól foszfát puffer, pH=7, 0,15 mól NaCl, valamint 1 mmól ditiotreitol, DDT), majd 10000 G mellett centrifugáljuk. A felülúszót PBS-sel (20 mmól foszfát puffer, pH=7, 20 mmól NaCl) és 1 mmól DDT-vel szemben dializáljuk, majd egy DE52-cellulóz (Whatman) oszlopra adagoljuk és 10 mmól trisz-HCl (pH=7, 20 mmól NaCl) és 1 mmól DDT alkalmazásával kiegyensúlyozzuk, az oszlopot alaposan átmossuk és a megkötött proteineket 0,5 mólos NaCl alkalmazásával eluáljuk. Az aktív frakciót tovább tisztítjuk ammónium-szülfát precipitációval, majd dialízissel.

A tisztítás mértékét peptid degradációs vizsgálattal mutatjuk ki a következőképpen. Minden frakciót jódozott Pl peptiddel (¹²^I-P1, aminosav szekvencia: HSEVKMDAEF) inkubáljuk 10 mmól trisz-HCl-ben (pH=7,6, 1 mmól CaCl₂) 1 órán át, majd a hasítási terméket TLC-vel elválasztjuk cellulóz mikrokristályos lemezeken (J.T. Baker), majd autoradiográfiát végzünk (C panel). TLC oldatként n-butanol/piridin/ecetsav/víz=15/10/3/12 tf arányú oldatot alkalmazunk (P. Tempst és mtársai, (1983), Eur. Jour. Biochem., 135. kötet, 321-330). A frakciókat ¹²⁵I-P1 peptiddel reagáltatjuk 30 percen át 4°-on, majd 0,5 mmól DSS-sel térhálósítjuk 15 percen át szobahőmérsékleten, majd SDS ♦ · · ·

-17-PAGE gél elektroforézisnek vetjük alá, majd a gélt coomassie bleu festékkel megfestjük (A panel), szárítjuk és röntgen-film vizsgálatnak vetjük alá (B panel) .

Az 1. ábrán látható sávok jelentése a következő: sáv 1 Mw standardok, sáv 2, 6, 15 DE52 oszlopon átfolyó frakció, sáv 3, 7, 10 ammonium-szulfát (AS) precipitáció, 0-25%-os telítés, sáv 4, 8, 11 25-50% AS, sáv 5, 9, 12 50-75% AS, sáv 13 0,75% AS, sáv 14 kezeletlen ¹²⁵I-P1. A csillag (*) jelölés jelzi a kisebbik 30 Kd sávot. További tisztítással kimutattuk, amelynél PBS-ben 100000 G melletti centrifugálást végeztünk, majd ezt követően a pelleteket szolubilizáltuk 1% Triton X-100 tartalmú PBS-ben, majd egy további centrifugálást végeztünk 100000 G mellett, hogy ezen kezeléseket követően az enzimatikus aktivitás megtalálható mind az oldható frakcióban, mind a membrán-kötött frakcióban.

Az AD-agyból származó specifikus szerin proteáz tisztításának eredményét, amelyet méretkizárásos kromatográfiával végeztünk, a 2. ábrán mutatjuk be. Egy ammonium-szülfátos, 50-75%-os frakciót, amelyet a fentiek szerint nyertünk, dializálunk mono Q oszlop alkalmazásával (Pharmacia) , az eluálást 20-500 mmól NaCl gradienssel 10 mmól trisz-HCl, pH=7, 1 mmól DTT eleggyel végzett eluálással. Az aktivitást mutató frakciókat betöményítettük és Sephadex S-300 töltetű (Pharmacia) oszlopra vittük és 10 mmól trisz-HCl, pH=7, 200 mmól NaCl, 1 mmól DDT alkalmazásával eluáltuk.

A 2. ábrán látható A, B és C panelok azonosak az 1. ábrán látottakkal. Az S-300 oszlop 14-32 frakcióinak analízisét mutatjuk be, a frakciók számait jelezzük. Az első sáv a C

-18♦ · · · · ......

• · ··. :.. · · .·...... ·. .··

.......... ·..* panelben kezeletlen ¹²⁵I-P1, a második sáv az AS 50-75% frakció (az S-300 elválasztás előtt). A 23-28 frakciókat további analízis céljára megtartottuk.

A kezdeti tisztítást követően egyetlen proteint jeleztünk radioaffinitással. A következő tisztítási lépés egy fő proteint eredményezett, amelynek nagysága kb. 68 Kd (1. és 2. ábra), valamint egy kis proteint, amelynek nagysága 30 Kd (1. ábra).

A 3. ábrán bemutatjuk az inhibitoroknak a fentiek szerint elválasztott szerin AD proteolitikus faktor proteáz aktivitásra kifejtett hatását. Peptid degradációs vizsgálatot végeztünk, amelyek mindegyikénél 0,1 μg ¹²⁵I-P1, 1. ábra szerinti peptidet alkalmaztunk. A 3. ábrán a sávok jelentése a következő: sáv 1 és 11 nincs proteáz, sáv 10, 12 a PF proteáz frakció önmagában, sáv 2-9 és 13-16 a proteáz frakciót 15 percen át szobahőmérsékleten különböző szerekkel kezeltük, majd Pl-et adagoltunk a keverékhez és 37°-on 1 órán át inkubáltuk (kivéve a sáv 9-et, amelynél az inkubálás ideje 20 óra), sáv 2 PF + PN1 1 μπιόΐ, sáv 3 PF + ACT 0,4 μπιόΐ, sáv 4 PF + ACT 1 μτηόΐ, sáv 5 PF + ACT 1,5 μπιόΐ, sáv 6 PF + PN2 0,2 μπιόΐ, sáv 7 PF + PN2 0,4 μιηόΐ, sáv 8 PF + PN2 0,75 μπιόΐ 1 órán át, sáv 9 PF + PN2 0,15 μπιόΐ 20 órán át, sáv 13 PF + β-markapto-metanol 0,5 mmól, sáv 14 PF + 2 mmól Ca²⁺, sáv 15 PF + 2 mmól EGTA, sáv 16 PF + 1 mmól DFP.

Az EGTA, amely egy CA²⁺-függő proteáz inhibitor, és a DFPA, amely egy szerin proteáz inhibitor, gátolja a ¹²⁵I-P1 peptid AD proteolitikus faktorral való hasítását (3. ábra) jelezve, hogy ez a frakció gazdag a Ca²⁺ aktivált szerin proteázban. További Ca²⁺ növeli a degradációt (3. ábra, sáv ····

-1914) . Továbbá, két szerin proteáz inhibíciós protein, amely a humán agyból származik és amely részt vehet a β-ΡΡ, ACT (Calbiochem) és tisztított PN2 (szekréciós β-ΡΡ) degradációjának szabályozásában, szintén gátolja a Pl protein AD proteolitikus faktor által történő hasítását. Az AD proteolitikus faktor proteáz és a PN2 komplexe reverzibilis, lásd sáv 8 (1 órás inkubálás) és sáv 9 (20 órás inkubálás) összehasonlítását. Ezzel szemben a proteáz nexin 1 és az albumin nem befolyásolja az AD proteolitikus faktor aktivitását.

A Kunitz-típusú proteáz inhibitorok azonosak a proteáz nexin 2 inhibitorral (PN2, lásd például (W.E. Van Nostrand és mtársai, (1989), Natúré, 341. kötet, 546-49; T. Olstesdorf és mtársai, (1989), Natúré, 341. kötet, 144-47).

A peptid 1 hasítási termékének szekvenciáját, amely terméket a katepszin G és más ismert proteázok alkalmazásával nyertünk, összehasonlítottuk a szerin AD proteáz frakciók által nyert hasítási termékek szekvenciájával, az eredményeket a 4. ábrán mutatjuk be, ahol látható a Ca²⁺-aktivált specifikus szerin proteáz - amelyet Alzheimer kóros agyból nyertünk (CASP) hasítási terméke összehasonlítva a katepszin G-vel nyert peptid 1 hasítási termékkel. 5 μg nen jelzett peptidet inkubáltunk az enzimekkel 10 mmól trisz-HCl-el, pH=7,6, 1 mmól CaC12 pufferban 15 órán át 37°C hőmérsékleten. A kapott keveréket közvetlen peptid szekvenálással analizáltuk P. Tempst és mtársai leírása segítségével (P. Tempst és mtársai, (1989), Anal. Biochem., 183. kötet, 290-300) a nyilak alatt látható minden peptidkötés százalékos hasítási értéke. A nem

-20elválasztott proteolitikus fragmenteket közvetlenül keverék formában szekvenáltuk. A vizsgált enzimek közül csupán a katepszin G és az AD proteolitikus frakció hasította a Pl peptidet a metionin előtt és után, és csupán az enzimek közül ezek képesek hasítást létrehozni, hogy felszabaduljon a β-protein prekurzorból a β-protein N-terminusz része. Bár az AD proteolitikus faktor hasítási kinetikája relatíve lassú, az aktív AD proteolitikus faktor jelenléte az agyban biztosítaná a β-protein akkumulációját egy időn át. A részlegesen tisztított AD proteáz hasítja az Asp-Ala kötést (4. ábra), amely olyan β-proteint eredményezne, amelyből hiányzik az N-terminális metionin. A katepszin G humán agyszövetben nem mutatható ki az immunóhisztokémia vagy Western vagy Northern biot analízissel.

A kalcium-aktíváit AD proteolitikus faktor hasítja a metabolikusan jelzett endogén β-ΡΡ szubsztrátumot, valamint a Pl pepetidet. Jelzett ³⁵S-fi-PP peptidet [előállítása S. Sisodia és mtársai módszere szerint [(1990), Science, 248. kötet, 492-95) és beszerezve S. Sisodia-tól] AD proteolitikus faktorral inkubáltunk és a fragmenseket gélen elválasztottuk és a gélt autoradiográfiásan vizsgáltuk. A vizsgálat szerint a proteázok keveréke volt jelen és ezek közül egy vagy többnek szerepe lehet az olyan személyek agyában lejátszódó alternatív folyamatokban, amelyeknél abnormális amiloid lerakódás tapasztalható.

Azon túlmenően, hogy képes a szintetikus Pl peptidet bontani, a szerin proteáz frakció bontja a tisztított humán PN2-t is, valamint a metabolikusan jelzett ³⁵Met-PN2-t, amely a közegbe szekretálódik olyan sejtek révén, amelyek humán β-21PP770-el vannak transzfektálva. Más jelzett szekréciós proteinekre a proteáz nem hat.

Eddig két proteáz inhibitort írtak le, amelyek részt vehetnek a β-protein típusú amiloid kiválásokban, ezek a β-ΡΡ (PN2) (a β-protein prekurzor) és az ACT. Az agyban a β-ΡΡ két formája található, az egyik tartalmaz proteáz inhibíciós doment (751/770 aminosav) , a másikban ez hiányzik (695 aminosav), ezek mennyisége összehasonlítható mértékű, szemben a más egyéb szervekben jelenlévő β-ΡΡ-vel, ahol az inhibíciós forma van túlsúlyban. A két forma közötti különböző arány magyarázatot adhat a különösen egyedülálló β-protein típusú amiloid akkumulációra az agyban, bár a β-protein antitestek kimutathatók a bőrben, a belekben és az adrenális részekben is. Ha a β-ΡΡ mennyiségeket összehasonlítjuk az AD-ben és a kontroliokban, ezek nem tűnnek szignifikánsan különbözőnek, bár az abnormálisán degradált β-ΡΡ formák magas szintje mutatható ki az AD neuronokbán és neuritekben Western biot analízissel, amelyhez β-ΡΡ antitesteket alkalmaztunk.

Alkalmazás

Az AD betegeknél és még valószínűbben a normál idős betegeknél a β-protein nagy valószínűséggel a normál protein abnormális proteolitikus degradációja révén képződik. Az a felismerés, hogy az AD cisztein proteáz a lizin után hasít, azt jelzi, hogy az képes hasítnai a β-protein 15-17 aminosav helyeknél is (QKL, Q, glutamin, L, lizin) , amely a β-ΡΡ képződés normál fiziológiás helye. Kis mennyiségű változás a β-PP-ben, egy a proteázok és inhibitorok közötti nem egyensúlyi állapot befolyásolhatja a legtöbb agyi folyamatot, így például a

-22neurit extenziót.

A β-ΡΡ rendellenes proteolitikus degradációja hozzájárulhat az amiloid lerakódáshoz, amely viszont káros és toxikus lehet a neuronokra és az astrocytákra, így neuritikus választ váltanak ki az idegsejtek pusztulását és cognitiv károsodásokat okozva. Az AD kezelhető a találmány szerinti megoldással úgy, hogy a betegeknek a találmány szerinti AD proteolitikus aktivitást gátló szert adagolunk. Az ilyen inhibitor lehet például egy kompetitív inhibitor, így például egy β-ΡΡ molekula fragmense, amely megfelel a proteolitikus enzim kötési helyének.

Az AD proteolitikus aktivitás gátlására alkalmas szereket kiválaszthatjuk oly módon, hogy egy találmány szerinti AD proteázt egy ismert specifikus szubsztrátummal (például egy szintetikus oligopeptiddel, amelynek aminosav szekvenciája megfelel a β-protein N-terminuszáig terjedő szekvenciával) inkubálunk a kiválasztani kívánt szer jelenlétében olyan körülmények között, amelyek között várható, hogy az AD proteáz inhibitor jelenléte nélkül hasítja a szintetikus oligopeptidet az N-terminusz közelében. A szerek, amelyekről feltételezhető, hogy hatásosan gátolják a proteolizist ilyen vizsgálatoknál az inhibíciós hatásra vizsgálhatjuk in vitro modellekben és/vagy állati modellekben is.

Az előnyös inhibitor képes átlépni a vér-agygátat és így parenterálisan vagy orálisan adagolható. Az előnyös inhibitor továbbá egy peptidtől eltérő molekula úgy, hogy az inhibitor nem degradálódik gyorsan az adagolást követően. Az előnyös inhibitor továbbá spoecifikusan gátolja az AD proteáz β-ΡΡ

-23hasító aktivitását és általában nem gátolja az olyan agyi proteázok aktivitását, amelyek lényegesek a normál metabolizmushoz.

A proteolitikus fragmenseket, amelyek a találmány szerinti AD proteáz hatására a β-ΡΡ peptidből képződnek, kimutathatók például a β-ΡΡ C-terminusza és N-terminusza elleni antitestekkel Western biot analízissel. Az ilyen analízis seítséget nyújt annak megállapításában, hogy a β-ΡΡ molekula hol hasad és hogyan képződhet a β-protein. Ha a β-protein termelését in vitro végeztük, az inhibitorok vagy az inhibícióra alkalmasnak vélt szereket in vitro vizsgáljuk arra is, hogy milyen mértékben képesek gátolni az AD proteáz képződését.

A találmány szerinti tiszított AD proteázokkal szembeni monoklon antitesteket (mAb), amelyeket standard eljárások szerint nyerünk, használhatjuk arra a célra, hogy megállapítsuk és mennyiségileg is meghatározzuk az enzimek celluláris elhelyezkedését az agyban és más egyéb szövetekben, így bőrben, vesében és májban. Az ilyen monoklón antitestek alkalmazhatók az expressziós könyvtárak kiválasztásában is, amelyek alkalmazhatók az AD proteáz gének azonosításában és elhelyezésében és alkalmazahtók az ilyen AD proteáz gének kódolásához az Ad proteázt termelő expressziós rendszerekben való felhasználáshoz .

Az AD betegeknél bekövetkező amiloid lerakódások következtében létrejövő szövetkárosodások irreverzibilisnek tűnnek. Az AD betegekre jellemző neurológiai tünetek az ilyen szövetkárosodások eredményei. Hogy a találmány szerinti terápia az AD

-24kezelésére hatásos legyen azt azelőtt kell végezni, mielőtt az amiloid lerakódások lényegesen előrehaladottá válnak és azelőtt, mielőtt a neurológiai tüneteket megállapítják.

Az AD proteázok jelenlétének kimutatása és mennyiségének meghatározása egy eszköz lehet az AD betegség diagnosztizálására. Egy szövet vagy egy testnedv folyadék, így például egy vérminta, CSF, nyál vagy vizeletminta levehető és megvizsgálható AD proteáz jelenlétére, ami valószínűsíti az abnormális β-PP métábólizmust, amely β-proteint eredményez, majd végül amiloid lerakódást okoz a szövetben.

A találmány szerinti megoldás egyéb kiviteli formáit a következő igénypontok tartalmazzák. így például bármely, a DSS-től eltérő térhálósitó szer is alkalmazható az enzim elválasztási eljárásban, feltéve, hogy az a szer képes keresztkötéseket kialakítani egy enzim-szubsztrátum komplexben az enzim és a szubsztrátum azon részein, ahol az enzim és a szubsztrátum közelségben vannak.

Claims (15)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Agyból származó, kalcium-aktivált proteolitikus faktor, amely a β-protein prekurzort hasítja a β-protein domenen kívüli helyen és a β-protein N-terminuszához közel.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti proteolitikus faktor, amely képes a β-ΡΡ-t hasítani a β-protein N-terminuszához közeli helyen.
3. 3. A 2. igénypont szerinti proteolitikus faktor, amely képes a β-ΡΡ-t hasítani a lizint követő helyen vagy a metionint követő helyen, közel a β-protein N-terminuszához.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti proteolitikus faktor, amely szerin proteázt tartalmaz.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti proteolitikus faktor, amely cisztein proteázt tartalmaz.
6. 6. Eljárás Alzheimer kór kezelésére, azzal jellemezve, hogy csökkentjük a β-protein prekurzor proteolízist a β-protein N-terminuszához közeli helyen.
7. 7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a betegnek egy inhibitort adagolunk, amely inhibitor gátolja a proteolízist a β-ΡΡ β-protein domenjén kívül és a β-protein N-terminuszához közeli helynél.
8. 8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a betegnek egy inhibitort adagolunk, amely gátolja a proteolízist a β-protein N-terminuszának szomszédságában.
9. 9. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inhibitor gátolja a proteolitikus faktor proteolitikus aktivitását, amely proteolitikus faktor a β-ΡΡ β-protein ·· e domenjén kívül hat a β-protein N-terminuszához közeli helynél.
10. 10. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inhibitor gátolja a proteolitikus faktor proteolitikus aktivitását, amely proteolitikus faktor a β-ΡΡ β-protein N-terminusz szomszédáságában lévő helynél hat.
11. 11. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inhibitor képes a vér-agygáton átjutni in vivő.
12. 12. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inhibitort parenterálisan vagy orálisan adagoljuk.
13. 13. Eljárás egy enzim elválasztására egy mintából, azzal jellemezve, hogy a mintát az enzimnek egy jelzett szubsztrátumával vagy a szubsztrátum egy jelzett fragmensével inkubáljuk, amely szubsztrátumhoz vagy szubsztrátum-fragmenshez az enzim kötődik, a mintát egy térhálósító szerrel kezeljük az enzim-szubsztrátum komplexek közötti keresztkötések kialakítására, majd a jelzett komplexeket kinyerjük.
14. 14. Eljárás amiloid akkumulációjával kapcsolatos betegségek diagnosztizálására, azzal jellemezve, hogy a betegtől származó szövet- vagy testnedv-mintában meghatározzuk az AD proteolitikus faktor mennyiségét.
15. 15. Eljárás egy, az amiloid akkumulációjával kapcsolatos betegség kezelésére alkalmas szer kiválasztására, azzal jellemezve, hogy egy AD proteázt egy peptiddel inkubálunk, amelynek aminosav szekvenciája megfelel a β-protein N-terminuszáig terjedő szekvenciával, egy a kiválasztani kívánt szer jelenlétében, majd meghatározzuk a peptid degradációjának mértékét.