FR2779444A1 - Polypeptides possedant une activite de type beta-secretase et capables de cliver le precurseur naturel du peptide beta-amyloide (app) - Google Patents

Polypeptides possedant une activite de type beta-secretase et capables de cliver le precurseur naturel du peptide beta-amyloide (app) Download PDF

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Mohamed Moutaouakil
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Abstract

La présente invention concerne de nouveaux polypeptides et leur utilisation pharmaceutique. Plus particulièrement, la présente invention concerne de nouveaux polypeptides possédant une activité de type -secrétase caractérisés en ce qu'ils sont capables de cliver de manière spécifique le précurseur naturel du peptide -amyloïde (APP).

Description

La présente invention concerne de nouveaux polypeptides et leur
utilisation pharmaceutique. Plus particulièrement, la présente invention concerne de nouveaux polypeptides possédant une activité de type P3secrétase caractérisés en ce qu'ils sont capables de cliver de manière spécifique le précurseur naturel du peptide J3-amyloïde
(APP).
Les individus atteints par la maladie d'Alzheimer présentent des symptômes caractéristiques d'altérations de la mémoire, de perte des capacités intellectuelles et des fonctions cognitives. Ces changements pathologiques s'accompagnent d'une atrophie neuronale, d'une déplétion importante d'un certain type de récepteurs et également d'une réduction des connexions synaptiques. Ce syndrome comporte la présence de plaques séniles et de dégénérescences neurofibrillaires en quantités très importantes, principalement dans le cortex cérébral, l'hippocampe, le noyau
amygdalien et dans les vaisseaux sanguins corticaux.
Les plaques dites séniles sont des structures sphériques qui s'établissent lentement sur une dizaine d'années dans les espaces extracellulaires de l'hippocampe, du cortex et d'autres régions cérébrales. Leur constituant majeur est le peptide 3 amyloide (AP3) associé à d'autres protéines anormales. Ces structures sont entourées
par des axones et des neurones anormaux.
Les dégénérescences neurofibrillaires sont dues à une accumulation de faisceaux denses de fibres anormales dans le cytoplasme de certains neurones et principalement des cellules pyramidales du cortex. Ces enchevêtrements neurofibrillaires sont constitués d'une forme particulière de la proteine tau qui, associée à d'autres protéines, donne des paires de neurofilaments hélicoïdaux qui
perturbent la conduction de l'influx nerveux.
Des formes familiales de cette maladie ont été répertoriées et semblent résulter de modifications génétiques variées qui toutes provoquent l'accumulation anormale du peptide A[3. Ces dernières, très hétérogènes, ont été en particulier associées à diverses mutations sur les chromosomes 1,14 et 21. Ce dernier a d'autant plus suscité l'intérêt qu'il porte le gène codant pour la protéine précurseur du AP3. On comprend donc l'apparition précoce (55 ans) de la maladie d'Alzheimer chez les
sujets atteints du Syndrome de Down (trisomie 21).
Il est à noter que les individus affectés par des formes familiales de la maladie
ne représentent qu'un faible pourcentage parmi les sujets atteints.
Dans la quasi-totalité des cas de maladie d'Alzheimer non liés aux formes familiales, les individus agés de plus de 70 ans présentent des plaques séniles dans diverses régions du cerveau. Leur répartition est en revanche différente selon le type
de démence concernée.
D'une masse moléculaire de 4 kDa, le peptide Ap3 humain est généré par
clivages protéolytiques de son précurseur (APP) aux sites Met596-Asp597 et Val 636-
Ile637. La molécule libérée est constituée de 39 (à 42) acides aminés dont la séquence protéique est la suivante:
20 30 40
DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGWVV IA
En solution aqueuse, ce peptide adopte un arrangement tridimensionnel de type feuillet f3 plissé. Sa partie COOH-terminal très hydrophobe lui confère des propriétés d'agrégation dont le taux d'oligomérisation est fonction du pH (formation maximale à pH=5.4) et de la concentration du peptide. De plus, la séquence comprise entre les résidus Gly25 et Met35 confère à ce peptide des propriétés neurotrophiques et neurotoxiques. Le peptide A13 est un produit naturel secrété par les cellules et détectable dans le sang et le liquide cérébro-spinal. Bien que ce peptide soit neurotoxique, sa production n'est cependant pas suffisante à la formation des plaques amyloides. Un "processing" altéré ou une surexpression de son précurseur prédisposeraient au dépôt
du AP3 dans le cerveau.
Le transcrit primaire du précurseur du peptide f0-amyloïde (APP) subit un épissage alternatif pour générer des ARNm codant pour au moins S isoformes de 563, 695, 714, 751 et 770 acides aminés (a.a.), exprimées de façon ubiquitaire dans les
tissus et dont le taux diffère suivant le type cellulaire.
Les isoformes APP695 et 751 sont cependant restreintes exclusivement au système nerveux central et périphérique (notamment au niveau des synapses dans les astrocytes et des neurones) o ils peuvent jouer un rôle dans l'activité physiologique des synapses. Les isoformes APP751, APP563 et APP770 contiennent un "insert" de 56 a.a. homologue à l'inhibiteur de protéase de type "Kunitz". Par ailleurs, la forme secrétée de l'APP751 est identique à la nexine II, un inhibiteur de protéase impliqué
dans la régulation des sérines protéases extracellullaires.
L'APP est une glycoprotéine d'environ 120 kDa présentant les caractéristiques d'un récepteur de surface de type II. Bien que la fonction réelle de l'APP n'ait pas encore été élucidée, des études ont montré que cette glycoprotéine pourrait jouer un rôle dans la régulation de la croissance cellulaire ainsi que dans les interactions
d'adhésion dans l'inflammation, la regénération et la réponse immunitaire.
Toutes les isoformes de l'APP sont insérées dans le réticulum endoplasmique grâce à leur séquence "signal". Le précurseur est ensuite ciblé vers l'appareil de Golgi o il subit différentes modifications post-traductionnelles pour être ensuite ancré dans la membrane. Sous l'action de différentes protéases, I'APP peut alors y subir divers clivages (voir figure 1), dont certains sont majoritaires: L'activité protéasique, appelée ca-secrétase, clive à l'intérieur de la séquence
612 613
A13 entre les résidus Lys et Leu de l'APP695 pour générer un fragment NH2-
terminal secrété (désigné sAPPa: APPa, soluble) et contenant les 16 premiers a.a. du A13. L'activité protéasique, appelée 13- secrétase, clive la liaison peptidique du
596 597
doublet Met -Asp au sein du précurseur pour libérer un fragment APP NH2-
terminal secrété (désigné sAPPp: APPU soluble) délété totalement du A 13.
La 3ème activité protéasique, appelée y-secrétase, pourrait aussi agir entre les résidus Val636 à Ile637 du précurseur pour générer une proforme secrétée APPT
contenant le A [3.
Le constituant majeur des plaques séniles, qui apparaissent aussi bien dans les formes familiales que non familiales de la maladie d'Alzheimer est le peptide f3-
amyloide (A3).
Le peptide A3 résulte du clivage de son précurseur, I'APP, au site Met596-
Asp597 de l'APP selon une activité protéasique de type P3-secrétase et au site Val636 -
Ile637 selon une activité protéasique de type y-secrétase.
Parmi les formes les formes familiales de la maladie d'Alzheimer, une mutation en relation avec le site de clivage [3-secrétase a été identifiée. Il s'agit de la double mutation "suédoise" de l'APP (Lys 595Met596 =>Asn-Leu dans l'APP695) et qui présente une production accrue du peptide Af3 (donc une augmentation de la
maturation de l'APP en faveur de la voie amyloidogénique).
Cependant, il n'en demeure pas moins que dans la très grande majorité des cas
de maladie d'Alzheimer, l'APP est dans sa forme naturelle avec un site de clivage [3-
secrétase non muté.
Certaines protéases issues de l'homme, du rat ou du singe ont été étudiées par divers
auteurs et sont supposées être impliquées dans la maturation du précurseur APP.
Parmi ces enzymes on peut citer tout particulièrement les sérine protéases 1 et 2 (Abraham et al. (1991), Biochem. Biophys. Res. Commun., 174, 790-796; Matsumoto et al. (1994), Biochemistry, 33, 3941-3948; Matsumoto et al. (1994), Neurosciences Letters, 195, 171-174) ainsi que la Cathepsine G-like (Razzaboni et al. (1992), Brain Research, 589, 207216). Ces enzymes d'origine humaine ou simienne, clivent au
niveau du site Met 596-Asp597 de l'APP selon une activité protéasique de type 13-
secrétase, cependant, elles ont été mises en évidence ou partiellement purifiées à partir
de patients atteints par la maladie d'Alzheimer.
La formation du peptide P3-amyloïde résulte de l'action d'enzyme de type 13-
secrétase sur l'APP, on comprend l'importance de l'identification et de la caractérisation de système(s) enzymatique(s) de type [3-secrétase responsable(s)
sélectivement de la maturation post-traductionnelle du précurseur du peptide 13-
amyloïde au niveau du site Met596-Asp597 dans les cellules humaines ne provenant pas de patients atteints par la maladie d'Alzheimer. La connaissance de ces nouveaux systèmes enzymatiques permettent d'envisager la préparation de nouvelles molécules utilisables pharmaceutiquement et notamment capables d'intervenir sur le métabolisme du peptide P3-amrnyloïde dans des formes non familiales de la maladie d'Alzheimer. La présente invention résulte donc de l'identification et de la caractérisation par la demanderesse de polypeptides possédant une activité catalytique vis-à-vis du précurseur du peptide 13-amyloïde (APP) de type P3-secrétase. Au contraire des autres protéases identifiées, les polypeptides de la présente invention ont une spécificité d'action envers la forme naturelle de l'APP. La présente invention découle en particulier de la mise en évidence d'un polypeptide de 70 kDa, capable de cliver les
formes non mutées de l'APP.
Un premier objet de l'invention concerne donc des polypeptides ou leurs variants possédant une activité de type 13-secrétase caractérisés en ce qu'ils sont capables de cliver de manière spécifique le précuseur naturel du peptide 3-amyloïde
(APP).
Au sens de la présent invention, le terme variant désigne toute molécule ayant la même activité que les polypeptides de l'invention, obtenue par modification de nature génétique et/ou chimique de la séquence peptidique. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition, et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels variants peuvent être générés dans des buts différents, tel que celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance aux protéases, celui d'augmenter et/ou de modifier son activité, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés biologiques. Parmi les variants résultant d'une addition, on peut citer par exemple les polypeptides chimères comportant une partie hétérologue supplémentaire liée à l'extrêmité. Le terme variant comprend également des polypeptides homologues aux polypeptides décrits dans la présente invention, issus d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'autres organismes. Le substrat que clivent les polypeptides de l'invention ne présente pas de
mutation dans sa séquence peptidique et en particulier le précurseur du peptide P3-
amyloide ne porte pas la double mutation suédoise. Les polypeptides de l'invention ou leurs variants sont capables de cliver sélectivement la liaison peptidique du doublet Met596-Asp597 au sein de la forme native ou naturelle de l'APP. En particulier, les polypeptides de l'invention ne clivent pas les formes d'APP ayant la mutation suédoise (Lys595-Met596 =:>Asn-Leu). Cette dernière ayant été mise en évidence à partir de prélèvements réalisés sur le cerveau de patients atteints par la maladie d'Alzheimer. Les polypeptides selon l'invention ont été purifiés à partir de cellules humaines de sujets non atteints par la maladie d'Alzheimer et sont capables de cliver
l'APP dans sa forme naturelle au niveau de la liaison peptidique du doublet Met596-
Asp597 Aspss Les polypeptides de l'invention sont caractérisés en ce que leur activité n'est pas dépendante d'un second subtrat et/ou d'un ligand. On peut citer à titre d'exemples les ions et plus particulièrement des cations tels que les cations magnésiques ou calciques. En effet, d'autres protéines comme les sérines protéases 1 et 2 ou la Cathepsine G- like ayant une activité protéasique, nécéssitent la présence du calcium
pour être actives.
Les polypeptides selon l'invention possèdent une masse moléculaire comprise
entre 65 et 75 kDa et préférentiellement leur masse moléculaire est d'environ 70 kDa.
Leur point isoéléctrique est compris entre 6.0 et 7.0 et de préférence est égal à 6.0.
Ces polypeptides sont des endopeptidases de la famille des sérines protéases.
Préférentiellement, ces endopeptidases sont de type chymotrypsine sensible. En effet, le profil d'inhibition montre que ces endopeptidases sont totalement inhibées par le PMSF (Phenylmethane-sulfonil fluoride) et partiellement inhibées par le pefablock, le TPCK(L-I-Chloro-3[4tosylamido]-4-phenyl-2-butanone), la benzamidine. En outre,
elles sont totalement résistantes à l'inhibition par l'antipapaine.
Les polypeptides de l'invention ou leurs variants sont caractérisés par une
activité 3-secrétase maximale à un pH compris entre 7 et 8.
L'invention a également pour objet des composés non peptidiques ou non exclusivement peptidiques capables de cliver au site Met596-Asp597 le précurseur du peptide P3-amyloïde. De tels composés sont obtenus par reproduction des motifs actifs du polypeptide selon l'invention par des structures non peptidiques ou non exclusivement peptidiques et qui soient compatibles avec une utilisation pharmaceutique. A cet égard, l'invention concerne l'utilisation de polypeptides tels que décrits ci-avant pour la préparation de molécules non peptidiques, ou non exclusivement peptidiques, actives pharmacologiquement, par détermination des éléments structuraux de ces polypeptides qui sont importants pour leur activité et la reproduction de ces éléments par des structures non peptidiques ou non exclusivement peptidiques. L'invention a aussi pour objet des compositions pharmaceutiques
comprenant une ou plusieurs molécules ainsi préparées.
Selon une variante de l'invention, les polypeptides ou leurs variants comprennent en outre une séquence signal permettant une localisation cellulaire précise. Parmi les séquences utilisables, on peut citer de manière préférée, la séquence du peptide signal de IgkB, le peptide signal de l'APP, les peptides signal des sous-unités des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine musculaires et centraux etc... Un autre objet de l'invention consiste en un procédé de purification
enzymatique des polypeptides de l'invention, possédant une activité de type f3-
secrétase caractérisés en ce qu'ils sont capables de cliver de manière spécifique le précurseur naturel de l'APP. Ce procédé comporte les étapes suivantes: Le surnageant de la culture cellulaire est tout d'abord concentré sur membranes. Le produit de concentration subit ensuite les différentes étapes de la purification avec notamment une centrifugation sur membrane tangentielle suivie d'une chromatographie d'exclusion et d'une chromatographie échangeuse d'ions puis d'une chromatographie d'interactions hydrophobes et enfin d'une nouvelle
chromatographie d'exclusion.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une lignée cellulaire. Cette lignée a été sélectionnée parmi de nombreuses autres lignées humaines (voir Matériel et Méthodes) provenant d'origines diverses mais de sujets non atteints par la maladie d'Alzheimer. Ces lignées ont été utilisées pour la recherche des polypeptides de l'invention ou de leurs variants. Ainsi, ces lignées cellulaires humaines sont représentatives du Système Nerveux Central ou Périphérique et du Système Immunitaire et sont capables de réaliser le métabolisme normal du précurseur du peptide 13 amyloïde conduisant à sa production. De manière préférée la
lignée cellulaire sélectionnée est la lignée THP 1 (ATCC TIB 202) issue de monocyte.
Un autre objet de l'invention réside dans des anticorps ou fragment d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un polypeptide tel que défini ci-avant. De tels anticorps peuvent être générés par des méthodes connues de l'homme du métier. En particulier, ces anticorps peuvent être préparés par immunisation d'un animal contre un polypeptide de l'invention ou de l'un de ses variants puis par prélèvement du sang et isolement des anticorps. Ces anticorps peuvent également être générés par préparation d'hybridomes selon les techniques connues de l'homme de l'art. Les anticorps ou fragments d'anticorps selon l'invention peuvent notamment être utilisés pour leur faculté d'inhiber au moins en partie l'interaction entre le dit polypeptide et le précurseur du peptide P3-amyloïide et/ou pour d'inhiber au moins en partie l'activité [3-secrétase des polypeptides de
l'invention vis-à-vis du précurseur naturel du peptide P3-amyloïde.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'identification de composés capables d'inhiber au moins en partie l'interaction du polypeptide selon l'une et le précurseur du peptide P3amyloïde et/ou de moduler ou d'inhiber au moins
en partie l'activité [3-secrétase des polypeptides de l'invention.
La mise en évidence et/ou l'isolement de tels composés est réalisé selon les étapes suivantes: - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée telle que exprimant un polypeptide de l'invention dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas o celle-ci posséderait une affinité pour ledit polypeptide, et,
- on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de l'invention.
Dans un mode particulier, ce procédé de l'invention est adapté à la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes et d'antagonistes de l'activité [3-secrétase des polypeptides de l'invention. A partir de ces molécules agonistes ou antagonistes, il est possible par des techniques classiques connues de l'homme du métier et notamment
par séquençage d'obtenir leurs séquences nucléotidiques correspondantes.
Ainsi selon une variante de l'invention, il peut être particulièrement avantageux de faire exprimer in situ des molécules agonistes ou antagonistes des polypeptides de l'invention à partir de leurs séquences nucléotidiques. La préparation de ces molécules et leur expression in vivo, ex-vivo et/ou in vitro, nécessitent que leurs séquences nucléotidiques soient portées par un vecteur viral ou plasmidique et
soient transfectées au moyen dudit vecteur dans des cellules hôtes appropriées.
La présente invention concerne également l'utilisation des polypeptides définis précédemment ou de leurs variants pour la mise en évidence de ligands ainsi que de composés capables d'inhiber au moins en partie l'interaction du polypeptide et le précurseur du peptide [3-amyloide et/ou d'inhiber l'activité [3-secrétase des polypeptides de l'invention ou de leurs variants et/ou d'intervenir dans la métabolisme du précurseur naturel du peptide P3-amyloïde et/ou de ralentir la production du peptide [3-amyloïde. En effet, la présente invention se rapporte également à une méthode de mise en évidence de molécules pouvant influencer l'activité des polypeptides de l'invention. Cette méthode de "screening" comporte les étapes suivantes: - on met en contact les polypeptides de l'invention qui présentent une activité de type [3-secrétase avec une molécule ou un mélange contenant différentes
molécules, éventuellement non identifiées.
- on met en contact le mélange réactionel décrit dans l'étape précédente avec le substrat des polypeptides de l'invention qui est préférentiellement l'APP dans sa forme naturelle - on mesure l'activité P-secrétase sur l'APP
- on détecte et/ou on isole les molécules qui ont eu un effet sur l'activité 13-
secrétase des polypeptides de l'invention.
Un autre objet de l'invention concemrne l'utilisation d'un ligand ou d'un modulateur identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci- avant comme médicament. De tels ligands ou modulateurs de par leur capacité à interférer au niveau de l'activité,3-secrétase des polypeptides de l'invention vis-à-vis du précurseur naturel du peptide P3-amyloïde peuvent, en effet, permettre de traiter certaines
affections neurologiques et notamment la maladie d'Alzheimer.
L'invention a encore pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif soit un polypeptide tel que défini ciavant soit les
molécules agonistes, antogonistes ou ligands définis précédemment.
Elle a aussi pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps tel que défini
ci-avant, et/ou un oligonucléotide antisens.
Par ailleurs, elle a aussi pour objet les compositions pharmaceutiques dans
lesquelles les peptides, anticorps, ligands et/ou séquences nucléotidiques définis ci-
avant sont associés entre-eux ou avec d'autres principes actifs.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être utilisées pour inhiber au moins en partie l'interaction des polypeptides de l'invention ou de leurs variants avec le précurseur naturel du peptide 13-amyloïide et/ou pour inhiber au moins en partie l'activité [3secrétase et/ou intervenir sur le métabolisme du
précurseur du peptide P3-amyloïde pour inhiber ou ralentir la production du peptide P3-
amyloide. Il s'agit plus préférentiellement de compositions pharmaceutiques destinées au traitement de maladies neurodégénératives comme par exemple la
maladie d'Alzheimer.
Un autre objet de la présente invention est l'utilisation des molécules décrites auparavant (ligands, anticorps ou fragments d'anticorps, antagonistes, agonistes) pour inhiber au moins en partie l'interaction des polypeptides de l'invention ou de leurs variants et du précurseur naturel du peptide [3-amyloïde et/ou pour inhiber, au moins en partie, l'activité [3-secrétase des polypeptides de l'invention ou de leurs variants et/ou intervenir sur le métabolisme du précurseur du peptide P-amyloïde pour inhiber ou ralentir la production du peptide P3- amyloide. De manière préférée l'utilisation de ces molécules est envisagée pour le traitement des maladies neurodégénératives et en
particulier pour le traitement de la maladie d'Alzheimer.
Selon une variante de l'invention, les polypeptides de l'invention ou leurs
variants sont utilisés pour intervenir sur le métabolisme du peptide 3amyloïde.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les polypeptides ou leurs variants définis ci-avant sont utilisés pour mettre en évidence des ligands ou des composés capables d'inhiber au moins en partie l'interaction entre les polypeptides de l'invention ou leurs variants et le précurseur naturel du peptide [3-amyloide et/ou pour inhiber, au moins en partie, l'activité P3-secrétase des polypeptides de l'invention ou
de leurs variants et/ou intervenir sur le métabolisme du précurseur du peptide [5-
amyloïde pour inhiber ou ralentir la production du peptide P3-amyloïde.
Pour leur utilisation selon la présente invention, les polypeptides de l'invention et surtout leurs antagonistes, agonistes, anticorps et ligands sont préférentiellement associés à un ou des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour être formulés en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. Ils sont de préférence utilisés sous une forme injectable. I1 peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la
constitution de solutés injectables.
La présente invention sera plus amplement détaillée à l'aide des exemples ci
dessous considérés de manière descriptive et non limitative.
Légende des figures
Figure 1: Topographie et sites de clivage de l'APP.
Figure 2: description du procédé de purification des polypeptides de l'invention.
Figure 3 analyse par immunoblot du clivage par les polypeptides de l'invention des
précurseurs complets d'origine membranaire du peptide P-amyloide "normal" (APP-
K595M596) et "double muté" (APP- N595L596). Mise en évidence de la spécificité de clivage des polypeptides de l'invention envers le précurseur d'origine membranaire du
peptide P3-amyloide "normal" (APP- KM).
Pour chacun des précurseurs (APP-NL et APP-KM), la colonne 1 représente les membranes non incubées sans enzyme, la colonne 2 représente les membranes incubées à 37 C sans enzyme, alors que la colonne 3 correspond aux membranes incubées à 37 C avec les polypeptides de l'invention présentant une activité de type P-secrétase.
MATERIELS ET METHODES
Origine des lignées cellulaires On a utilisé 13 lignées cellulaires humaines d'origine variée pour la recherche des enzymes de maturation: Système nerveux central SW 1088 ATCC HTB 12 Astrocytome SW 1788 ATCC HTB 13 Astrocytome U-138 MG ATCC HTB 16 Glioblastome U-373 MG ATCC HTB 17 Gliobastome,astrocytome, grade III Système nerveux périphérique HMCB ATCC CRL 9607 Bowes melanoma Hs27 ATCC CRL 1634 Newborn foreskin MRC5 ATCC CCL 171 Lung, diploid Système immunitaire DAKIKI ATCC TIB 206 B-cell, Ig A secreting H9 ATCC HTB 176 T-cell lymphoma IM-9 ATCC CCL 159 Lymphoblast,Ig secreting K-562 ATCC CCI 243 Chronic myelogenous leukemia RPMI 1788 ATCC CCL 156 Peripheral blood, IgM secreting THPI ATCC TIB 202 Monocyte Culture Cellulaire Après décongélation, les cellules, selon leur origine, sont mises en culture soit dans le milieu "DMEM" soit dans le milieu "RPMI 1640" en présence de 10% de sérum de veau foetal. Ces cultures ont été réalisées dans des flacons de 1 litre à 37 C avec un renouvellement des milieux de cultures tous les 2 à 3 jours. Selon la lignée cellulaire étudiée, une période de 2 à 5 mois est nécessaire pour obtenir un volume de 18 litres de milieu de culture. La dernière étape de culture se fait pendant 48 heures en absence de sérum de veau foetal et de rouge de phénol. Ces cultures cellulaires sont ensuite centrifugées pour récupérer le surnageant qui servira à la purification des enzymes. Les lignées cellulaires HMCB, U-373 MG, U-138 MG, MRC5 et Hs27 ont été cultivées dans le milieu "DMEM" alors que les lignées SW 1088, SW 1783, K-562,
H9, DAKIKI, THP1, RPMI 1788 et IM-9 l'ont été dans le milieu "RPMI 1640".
Purification enzymatique Les 18 litres de surnageant de chaque culture cellulaire sont concentrés sur membranes ULTRASETTETM (FILTRON) ayant un seuil de coupure de 10OkDa, puis le produit de concentration obtenu a servi à la purification des activités protéolytiques selon le protocole suivant: - La première étape consiste en une centrifugation sur membrane tangentielle à 7000 rpm. Plus particulièrement, la concentration est réalisée sur membrane ULTRAFREE (MILLIPORE) ayant un seuil de coupure de 10kDa - Puis il est procédé à une chromatographie d'exclusion. Suivant un mode particulier
de l'invention la chromatographie d'exclusion à été réalisée sur colonne séphacryl S-
(Pharmacia) dont les limites d'exclusion sont 103 Da et 105 Da.
- Une chromatographie d'échange d'ions représente la troisième étape duprocédé. I1 a été utlisé notamment une colonne Q-sépharose (Pharmacia) dont le gel est constitué d'anions forts. La colonne est éluée par un gradient salin de 0 à 1 M en utilisant le
solvant A (Tris 25mM, pH 7.5) et le solvant B (Tris 25mM, NaCI 1M, pH 7. 5).
- L'avant dernière étape consiste en une chromatographie d'interactions hydrophobes, en particulier sur colonne phényl-sepharose-6 (Pharmacia) ayant un haut degré de substitution (40imol/g de gel). Cette colonne a été éluée avec un gradient de sulfate d'ammonium de 1 à 0 M en utilisant le solvant A (Tris 25mM, (NH4)2 S04 1 M, pH
7.5) et le solvant B (Tris 25mM, pH 7.5).
- Enfin, la dernière étape est une chromatographie d'exclusion, réalisée en particulier sur colonne TSKgel G2000SW (Interchim) dont le gel est constitué de supports rigides de silice, greffés avec un groupement hydrophile. L'éluant est un tampon Tris 25mrnM,
pH 7.5 contenant 250mM NaCI.
Tests enzymatiques Le suivi des activités P3-secrétase a été réalisé par des tests utilisant différents peptides mimant ou reproduisant la séquence des acides aminés du précurseur APP
au niveau du site de clivage enzymatique de type [3-secrétase (Tableau 1).
Pour la réalisation du peptide chromophore, 5,tl de peptide Z-Val-LysMet-
MCA (7-amino-6-methylcoumarin), dilué au 1/1000, sont incubés avec 5 Pl de surnageant pendant 6 heures à 37 C. La réaction est stoppée par addition de 3 fl de HCI 0,l IN, et l'activité enzymatique est déterminée par une mesure de la fluorescence
du chromophore AMC libre à 460nm.
Des peptides synthétiques, de tailles différentes, mimant ou reproduisant le site de clivage enzymatique de type P-secrétase ont été synthétisés pour être utilisés comme substrats dans l'étude de la caractérisation et de la spécificité des enzymes.(tableau 1)
On incube 5 l de surnageant avec 5 pl de peptide pendant 6 heures à 37 C.
La réaction est stoppée par addition de 3 pIl de HC1 0,1 IN, et l'activité enzymatique est déterminée par mesure de la densité optique à 215 nm des fragments de clivage
préalablement séparés par HPLC.
Les sites de clivage sont déduits par détermination de la séquence des
fragments résultant du clivage.
Le pourcentage de clivage [%= 100(Ao-Aj)/Ao] de chaque substrat peptidique a été évalué en mesurant l'absorbance à 215 nm (A) du substrat incubé en l'absence (Ao) et en la présence (Aj) de l'enzyme dans des conditions expérimentales identiques
(temps d'incubation, pH et concentration).
Le pourcentage d'inhibition [%= 100(Io-Ij)/Io] de chaque substrat incubé en la présence de l'enzyme a été évalué en mesurant l'absorbance à 215 nm pour un
substrat peptidique ou la fluorescence à 460 nm pour le substrat Z-ValLys-Met-
MCA en l'absence (I0) et en la présence (Ij) de l'inhibiteur dans les mêmes conditions
expérimentales.
Les précurseurs APP normal (APP-K 595M596) et APP possédant la double mutation "suédoise" (APP-N 595L596) ont été obtenus à partir d'extraits membranaires de cellules d'insectes infectées par le baculovirus contenant les gènes humains codant pour ces précurseurs. Ces extraits membranaires, incubés avec les polypeptides de l'invention ayant une activité 3-secrétase purifiés, sont analysés par immunoblot en utilisant l'anticorps WO-2 (Ida N. et al. (1996) J. Biol Chem 271, 22908-22914) dirigé contre les premiers acides aminés du peptide [3 amyloïde et l'anticorps monoclonal 22C1 1 (Boehringer Mannhein; Hilbich C. (1993) Journal of Biochemical
Chemistry, 268, 26571-26577) dirigé contre le motif NH2-terminal du précurseur.
EXEMPLES
Exemple 1. Mise en évidence des activités enzymatiques Cet exemple a pour but de mettre en évidence des activités enzymatiques dans des lignées cellulaires humaines de sujets non atteints par la maladie d'Alzheimer. Deux approches ont été utilisées pour la mise en évidence des protéases
susceptibles d'être impliquées dans la maturation de l'APP humain.
Approche Immunologique: A partir des 13 lignées cellulaires humaines décrites dans Matériel et Méthodes, la recherche des activités enzymatiques a été réalisée à l'aide de l'anticorps monoclonal 22C ll pour sélectionner les lignées cellulaires ayant la capacité de produire des quantités mesurables d'APP au niveau de la membrane et dans le milieu de culture cellulaire. L'anticorps monoclonal WO-2 a été utilisé pour révéler et
identifier les différents sites de clivage de l'APP.
Les résultats sont les suivants: - l'anticorps monoclonal 22C 1 1 a permis de sélectionner 8 lignées cellulaires (HMCB, MRC5, Hs27, SW1088, SW1783, H9, THPI et IM-9) sur les 13 testées au total. Pour les cellules choisies, l'analyse par immunoblot a aussi montré une différence de masse moléculaire entre l'APP membranaire (120 kDa) et les APP solubles (110-100 kDa). Ceci indique que le précurseur a subi, au niveau de sa
séquence COOH-terminale, un ou plusieurs clivage(s) enzymatique(s).
- L'analyse par immunoblot des entités moléculaires générées dans les 8 lignées sélectionnées à permis de révéler et d'identifier au moyen de l'anticorps monoclonal WO-2 les différents sites de clivage de I'APP et de montrer que le
précurseur du peptide A3 a subit une maturation différentielle.
Ainsi, cette approche a permis de sélectionner des lignées cellulaires ayant la capacité de produire des quantités mesurables d'APP au niveau de la membrane et dans le milieu de culture cellulaire et de montrer des clivages enzymatiques dans le
précurseur du peptide Ap.
Substrats peptidiques: Les peptides [KMD]APP(-5,+5) et Z-Val- Lys-Met-MCA (voir Matériel et Méthodes), dérivés de I'APP et mimant le site de clivage, ont été utilisés comme substrats pour la mise en évidence des différentes activités enzymatiques présentes
dans les 8 lignées cellulaires.
Une analyse combinée (HPLC, composition en acides aminés et détermination des séquences) des fragments générés par clivage du substrat [KMD]APP(-5,+5) a été réalisée dans les lignées sélectionnées. En effet, après incubation du substrat [KMD]APP(-5,+5) avec les surnageants, les fragments générés ont été d'abord séparés par HPLC sur une colonne reverse phase RPC18 (VYDAC) éluée par un gardient de 5-40% dtacétonétrile / 0.05% TFA. La séquence et/ou la composition en
acides aminés de ces fragments ont été déterminés par les techniques classiques.
Les résultats de cette analyse ont permis d'identifier un clivage majoritaire au niveau de la liaison peptidique Met Asp+l (correspondant au site Met596-Asp597 dans l'APP entier) et 2 clivages minoritaires au niveau des liaisons Ser5-Glu-4 (correspondant au site Ser592-Glu593 dans l'APP entier) et Ala+2-Glu+3 (correspondant
au site Ala 598-Glu599 dans l'APP entier) dans chacune des 8 lignées sélectionnees.
Une analyse du profil d'inhibition des activités enzymatiques des 8 lignées cellulaires, vis à vis du substrat fluorescent Z-Val-Lys-Met-MCA, a été également
effectuée (Tableau 2).
Les résultats de cette dernière analyse ont permis de révéler l'existence d'activités enzymatiques majeures de type sérine (inhibition par l'aprotinine et le pefabloc) et métallo-protéase (inhibition par l'EDTA et le phosphoramidon) dans chacune des 8 lignées sélectionnées (Tableau 2) Exemple 2. Purification et caractérisation de l'activité P3- secrétase Cet exemple a pour but de décrire la purification et de mettre en évidence les
caractéristiques des polypeptides de l'invention ayant une activité P3secrétase.
Sur la base de la sélection des 8 lignées cellulaires humaines et des résultats obtenus dans l'exemple 1, la lignée cellulaire THP-1 a été choisie, en raison de son cycle cellulaire rapide permettant d'obtenir de grandes quantités de protéines, pour être utilisée comme modèle pour la purification de l'activité P-secrétase recherchée
selon le protocole de purification décrit dans "Matériels et Méthodes".
Une analyse de l'activité résiduelle des fractions présentant des activités protéolitiques vis-à-vis des substrats Z-Val-Lys-Met-MCA et [KMD]APP(-5,+5) a été réalisé dans le but de poursuivre la purification des polypeptides de l'invention. A chaque étape de purification, les différentes fractions ont été d'abord mises en contact avec le peptide ZVal-Lys-Met-MCA afin d'isoler les fractions présentant des activités endoprotéolytiques. Ces dernières fractions sont ensuite testées vis-àvis du peptide [KMD]APP(-5,+5) afin d'isoler celles qui clivent préférentiellement ce substrat peptidique au niveau de la liaison peptidique Met-1-Asp+' (correspondant au site Met596-Asp597 dans l'APP entier). Les résultats de ces travaux ont permis de mettre en évidence différentes fractions présentant des activités endoprotéolytiques, isolées à partir de surnageants des 8 cultures cellulaires sélectionnées, en utilisant en
parallèle ces deux substrats.
Lors de la dernière étape du procédé de purification qui est une chromotographie d'exclusion sur colonne TSK 2000 (voir dans Matériel et Méthodes
pour les caractéristiques), plusieurs fractions protéiques ont été obtenues.
La mesure de l'activité résiduelle de ces fractions vis-à-vis du peptide
[KM]APP(-5,+5) a permis d'obtenir une seule fraction ayant une activité de type P3-
secrétase. Sa caractérisation a été effectuée par la mesure du poids moléculaire en éléctrophorèse sur gel de polyacrilamide, la mesure du point isoéléctrique, la recherche de l'activité maximale en fonction du pH ainsi que le profil d'inhibition par
des inhibiteurs classiques ("Matériels et Méthodes").
L'analyse par électrophorèse a été réalisée sur un gel de polyacrylamrnide 4-
% sur Phast-system (Pharmacia) en conditions dénaturantes ou normales et montre
une bande de masse moléculaire voisine de 70 kDa.
Le maximun d'activité, vis-à-vis du peptide [KMD]APP(-5,+5), a été observé
à des pH situés entre 7 et 8.
Le profil d'inhibition de cette fraction, vis à vis du peptide [KMD]APP(-
,+5), montre qu'il s'agit d'une sérine protéase: les pourcentages d'inhibition calculés étant respectivement de 100% pour le PMSF, 75% pour le pefablock, 25%
pour le TPCK, 10% pour la benzamidine et de 0% pour l'antipapaine.
Cet exemple décrit donc le procédé de purification ainsi que la recherche et la mise en évidence des différentes caractéristiques des polypeptides de l'invention
ayant une activité P-secrétase.
Exemple 3. Spécificité de l'activité [-secrétase
Cet exemple décrit l'analyse de l'activité 13-secrétase des polypeptides de l'invention.
Cette spécificité a été analysée en utilisant différents substrats, tel que: - des peptides mimant ou reproduisant la séquence des acides aminés du
précurseur au niveau du site de clivage et décrits dans le tableau 1.
- le précurseur du peptide [3 amyloide dans sa forme naturelle et mutée (mutation suédoise) Les polypeptides de l'invention ont été mis en contact avec les différents substrats et le pourcentage de clivage de ces substrats à été calculé. Les résulats sont
présentés dans le Tableau 3.
Pour les peptides synthétiques, l'analyse des données, regroupées dans le tableau 3, fait apparaître les caractéristiques concernant l'importance de quelques sous-sites impliqués dans la reconnaissance du substrat par cette [3 secrétase et permettent du conclure que: 1) Les sous-sites Pl et P2 sont essentiels (Partie A du tableau 3) et ce quelque
soit la taille des substrats. Il a été remarqué que la double mutation (Lys-Met=>Asn-
Leu) abolit totalement le clivage enzymatique.
2) Les sous-sites P, et Pl sont interactifs ou coopératifs (Partie B du tableau 3) En effet, une simple substitution en P2 (Lys=>Asn) ou en Pl (MetzLeu) décroît uniquement le taux de clivage alors que la double mutation dite "suédoise" abolit la
reconnaissance du substrat.
La substitution du résidu en P2 (Lys=>Arg) se traduit par une différence entre les taux de clivage des peptides ayant Leu en Pl ([KLD]-APP(-5,+5) et [RLD]-APP(-5,+5))
plus importante que celle observée pour les substrats ayant Met en Pl ([KMD]-APP(-
,+5) et [RMD]-APP(-5,+5)) 3) La taille et/ou le volume du résidu en Pl sont importants (Partie C Tabl.3): Le taux de clivage enzymatique décroît quand la contrainte exercée sur le squelette peptidique par la chaine latérale du sous-site Pl augmente. En effet, les expériences réalisée permettent d'obtenir un classement du taux de clivage en fonction de la substitution effectuée:
[KMD]-APP(-5,+5) > [KLD]-APP(-5,+5) > [KID]-APP(-5,+5) > [KVD]-APP(-5,+ 5)
4) Le résidu du sous-site P'l est nécessairement Asp ou Glu (Partie D Tab.3): En effet,les résultats ont montrés que la mutation de Asp par Asn ou Gln n'abolit pas le clivage du substrat; de plus,le clivage se produit au site Ala-Glu équivalent du site Met-Asp; en outre, le pseudo site Ala-Glu n'est accessible que dans le substrat naturel car, dans les mêmes conditions d'expériences, le taux de clivage du fragment
APP(1,5) n'est que de 35%.
Ainsi, sur la base des résultats obtenus précédemment avec les polypeptides de l'invention au niveau de la spécificité de clivage de type [3-secrétase, on peut envisager l'obtention d'inhibiteurs compétitifs avec le site de clivage Met-Asp de
nature peptidique, pseudo-peptidique ou non peptidique.
Pour les précurseurs d'origine membranaire du peptide P amyloïde, les produits de clivage des précurseurs complets (full-length) "normal" (APPK 595M596)
et "double muté" (APP- N595L596) par les polypeptides pour lesquels l'activité 3-
secrétase a mise en évidence dans les exemples 1 et 2, ont été révélés par immunoblot
en utilisant les anticorps 22C 11 et WO-2 (voir Matériel et Méthodes).
L'analyse des molécules par ces anticorps montre que le pourcentage de clivage du précurseur APP-KM augmente alors que celui du précurseur APPNL reste quasiment nul, et ce quel que soit les temps d'incubation au contact de l'enzyme. En effet, les résulats présentés dans la figure 3, montrent que: 20. pour les membranes bac.NL, c'est à dire les membranes incubées comportant le précurseur APP-NL, les mêmes bandes sont retrouvées quelquesoit les conditions d'expérience (colonnes 1, 2, et 3). Ainsi on ne constate pas de clivage par les
polypeptides de l'invention.
pour les membranes bac.WT, c'est à dire les membranes incubées comportant le précurseur naturel APP-KM, une nouvelle bande vers 12 kDa est apparue dans la colonne 3 par comparaison aux deux autres colonnes. La colonne 1 représente les membranes non incubées sans enzyme, la colonne 2 représente les membranes incubées à 37 C sans enzyme, alors que la colonne 3 correspond aux membranes incubées à 37 C avec les polypeptides de l'invention présentant une activité de type [3-secrétase. Il est à noter que la différence d'intensité des bandes entre les colonnes 1 et 2 des membranes bac.WT est due à la quantité de produit de départ déposé sur le gel. L'analyse par l'anticorps WO-2 à permis de révéler cette nouvelle bande de masse moléculaire d'environ 12 kDa et qui correspond au fragment COOH terminal issu du clivage du précurseur par la 3 secrétase au niveau de la liaison Met-Asp. Cette analyse permet de conclure au clivage du précurseur naturel APP-KM par les
polypeptides de l'invention.
Ce résultat indique donc que le précurseur APP-KM, et non le précurseur APP-NL, a été clivé de façon sélective, et confirme les données obtenues avec les
peptides substrats APP de 10, 20 ou 40 acides aminés.
En outre, cet exemple démontre que les polypeptides de l'invention isolés précédemment ont une activité de type [3-secrétase spécifique du précurseur naturel
du peptide P3 amyloide.
Peptides séquences en acides aminés I_ _ _ _ __! P2 Pl P 'l1 APP(1,+5) Asp AEFR [KMD]-APP(-5,+5) SEV Lys Met Asp AEFR [RMD]-APP(-5,+5) SEV Arg Met Asp AEFR [KLD]-APP(-5,+5) SEV Lys Leu Asp AEFR [RLD]-APP(-5,+5) SEV Arg Leu Asp AEFR [NLD]-APP(-5,+5) SEV Asn Leu Asp AEFR [NMD]-APP(-5,+5) SEV Asn Met Asp AEFR [KID]-APP(-5,+ 5) SEV Lys lie Asp AEFR [KVD]-APP(-5,+5) SEV Lys Val Asp AEFR [KMN]-APP(-5,+5) SEV Lys Met ASn AEFR [KMQ]APP(-5,+5) SEV Lys Met Gin AEFR [KM]-APP(-10,+10) KTEEISEV Lys Met Asp AEFRHDSGY [NL]-APP(-10,+10) KTEEISEV Asn Leu Asp AEFRHDSGY [KL]-APP(-10,+10) KTEEISEV Lys Leu Asp AEFRHDSGY [NM]-APP(-10,+10) KTEEISEV Asn Met Asp AEFRHDSGY [KM]-APP(-20,+ 20) TRPGSLTNIKTEEISEV Lys Met Asp AEFRHDSGYEVHHQKLVFF [NL]-APP(-20,+20) TRPGSLTNIKTEEISEV Asn Leu Asp AEFRHDSGYEVHHQKLVFF Tableau 1: tableau des peptides de différentes tailles mimant ou reproduisant le site de clivage de la 3-secrétase, synthétisés pour être utilisés comme substrat dans la caractérisation et la specifité enzymatique du polypeptide selon l'invention. InhibiteursUnes cellulaires HMCB H9 Hs27 IM-9 MRC-5 THP-1 SW1088 SW1783 Standard 100 100 100 100 100 100 100 100
E64 97 87 88 100 87 82 100 92
(0.1 mM)
EDTA 43 59 27 71 31 54 39 92
(3.3 mM) pepstatine 100 100 88 100 99 100 100 100 (10 lM) chymrostatine 95 87 72 97 75 71 100 100
*(5 PM)
aprotinine 90 100 40 97 97 93 100 100 (0.8 l.M) pefabloc M53 62 13 97 X 54 91 54 (3.3 jiM) phosphoramidon 97 62 83 79 66 89 70 76 (70 g M) captopril 96 87 97 100 100 100 100 100
(60 IM)
Tableau 2: Profil d'inhibition des activités enzymatiques des 8 lignées cellulaires sélectionnées vis à vis du peptide Z-Val-Lys-Met-MCA, exprimé en pourcentage d'activité. Peptides clivage(%) liaison clivée (A)-Mutation suédoise:effet de la taille [KMD]-APP(-5,+ 5) 65 MetVAsp
[NLD]-APP(-5,+5) 0
[KM]-APP(-10 O,+10 O) 45 non déterminée
[NL]-APP(-10,+10) 0
[KM]-APP(-20,+20) 90 non déterminée
[NL]-APP(-20,+20) 0
(B)-Mutation suédoise:importance des sous-site P2 et P [NMD]-APP(-5,+5) 45 MetAsp [KMD]-APP(-5,+5) 65 MetV Asp [KLD]-APP(-5,+5) 60 Leu'Asp
[NLD]-APP(-5,+5) 0,
[KMD]-APP(-5,+5) 65 MetVAsp [RMD]-APP(-5,+5) 80 Met'Asp [KLD]-APP(-6,+5) 60 LeuvAsp [RLD]-APP(-5,+5) 20 Leu'Asp (C)-Substitution en P1 _ [KMD]-APP(-5,+5) 65 Met Asp [KLD]-APP(-5,+5) 60 Leu'Asp [KID]-APP(-5,+5) 40 lleVAsp [KVD]- APP(-5,+5) 15 Val'Asp (D)-Substitution en P' [KMD]-APP(-5,+5) 65 Met'Asp [KMN]-APP(-5,+5) 70 AlaVGlu [KMQ]-APP(-5,+5) 80 Ala'Glu APP(1,+5) 35 AlaVGlu Tableau 3: résultats de l'analyse de la spécificité enzymatique du polypeptide de l'invention en utilisant des peptides mimant ou reproduisant la séquence des acides
aminés du précurseur APP, au niveau du site de clivage.
Références
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sensitive Western blot assay".

Claims (15)

    REVENDICATIONS I1. Polypcplidc possédant uneC activilté dc ltype f3-sccrélase caractérisé en ce qu'il est capable de cliver de manière spécifique le précuscur naturel du peptide li-amyloïde (APP).
  1. 2. Polypeptide slcon la revendicalion I caracterisé en ce que le précurscur du peptide I-amyiloïdc
    (APP) ne porte pas de mnltation dans sa séquence protéique.
  2. 3. Polypeplide selon la revendication I ou 2 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeplide purifié ài
    partir dc cellules humaines de sujet non atteint par la maladie d'Alzheimer.
  3. 4. Polh peptide selon l'une des revendications I à 3 caractérisé en ce qu'il
    - possede unlle masse moléculaire d'environ 71) Kda.
    - possède un point isoéléctrique d'environ 6.() - est uile endopeptidase de la famille des serines protéases - est unec endopeptidase de type chiymotrypsine sensible
    -atteint une activité maximnale à un pH compris entre 7 et 8.
  4. 5. Polypeptide selon la revendication 4 caractérisé cn ce que son activité n'est pas dépendante d'un
    second subtrat et/ou ligand.
  5. 6. Polypcptidc selon la revendication 5 caractérise en ce que son activitéle n'est pas dépendante d'ions et
    de preférence de cations calciques ou mnagnesiques.
  6. 7. Compose non peptidique ou non exclusivecent peptidique capable de cliver au site [i-secrétase le précurseur du peptlde [-amnyloide. obtenm par reproduction des motifs actifs du polypeptide selon les
    revendications I à 6 par des structures non peplidiques ou non exclisivecmient peptidiques.
  7. 8. Polypeptlde selon l'uie des revendications Ii à 7 caractérisé en ce qu'il comprend en outre une
    séquence signal.
  8. 9. Polypcptide selon la revendicalion 8 caracterise en ce que la sequence signal est choisie parmi la séquence du peptide signal de lgkB. le peptide signal de I'APP. les peptides signal des sous-unites des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine musculaires et ceniratux,
    21S 2779444
    1). Procede de purification ài partir dc cellules provenaint de sujets nlion atteints par la maladie
    d'Alzheimcr. d'un pol pcptidc slcon l'une des revendications I à 9 caractérisé cn ce qu'on réalisc Ies étapes
    suivantes -Ic surnageant dc la culture cellulairc cst prélevé puis concentre -Ie produit de concentratllon est à nouveau concentré sur membrane tangentiellc -Ic produit obtenu cst ensuitc purifie par chroinatographies succcssives ct notamment par
    chronmatographies d'exclusion. échanlgcuscs d'ions et d'interaction hydroplhcs.
    I 1. Utilisation d'une lignée cellulaire humainc rcprcscintativc du Système Nerveux Central ou Périphériquc ct du Svstmne Immuiiiitairc et capable de realiser le métabolisme normal du précurseur du peptide
    Ji amyiiloïde pour la production et des polypeptidcs dc l'invcntion definis selon les revendications I à 9. De
    manière préférée la ligneée cellulaire sélectionnée est la lignée THPI (ATCC TIB 202) issue de monlocxte.
  9. 12. Anticorps ou fragment d'anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé contre un polypeptide selon
    l'une des revendications I à 9 ct cnl ce qu'il possede la faculté d'inhiber au moins en partie l'intcraction cntrc Ic
    dit polxpeptide et Ic prccurseur du peptide Ji-aiy loïde et/ou d'inhiber l'activitc du polypeptide tel que défini selon la revendication I et/ou d'intervenir sur le métabolisilie du peptide [i-amyloïde 13. Procédé dc mise en évidence ou d'isolement de composcs capables d'inhiber au moins en partie
    l'interaction du polypeptide selon l'une des revendications I à 9 et le précurseur du peptide p-amyloïde et/ou
    d'inhiber l'activite dudit polypeptide. caractcrisé en ce que l'on realise les étapcs suivantes a - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, eéventuelicment non-identifiées. avec une cellule recombinée exprimant un polypeptide tel que defini selon l'une des
    revendications I à 9 dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans
    le cas ou cellc-ci posscéderait une affinité pour ledit polypeptide. et.
    b - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptidc.
  10. 14. Liganid d'un polypeptide tel que dcfimni selon les revendications I ài 9. susceptible d'être obtenu
    sclon le procédé dc la revendication 13.
  11. 15. Ligand selon la revendication 14 caractcrisé cni cc qu'il s'agit d'un antagoniste. d'un agoniste ou
    d'un inhibiteur du polypeptidc défini selon les revendications I ài 9.
  12. 16. Composition pharmaceutique comprenant cormme prmncipe actif au moins un inhibiteur du
    polypeptide selon l'une des revendications I àil 9.
    o 2779444 17. Composition pharmaceutique comprenani conmmnc principe actif au moins un anticorps ou fragment
    d'anticorps selon la rcvendicalion 12 ct/ou un ligand selon la revendication 14.
    IX. Compositions pharmlaceutiques dans lesqnelles les peptides. anticorps ou fragemnit d'anticorps selon la revendication 12. ligands ct/ou séquences nuclcéotidiques correspondantes définis selon la revendication 14 sontl associés cntre-euix. ou avec d'autres principes actifs, 19. Composition selon la revendication 16 i X18 destinéc ài minhiber au moins en partie l'interaction
    entre le polypeptide et le précurscur du peptlde J3-aiîylofde et/ou d'inhiber l'activité du polypeptide.
    21). Composition selon l'une des revendications 16 à 19 destinée à internenir sur le métabolisme du
    peptide Jl-anivloïde et de préférence pour inhiber ou ralentir la production de peptide 3-ainvmloïde,
    21, Composition selon l'une des revendications 16 à 20) destinée au traitement des maladies
    neurodégénératives. 22. Composition selon la revendication 21 destinée au traitement de la maladie d'Alhzcimner 23. Utilisation d'un anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 12 et/ou un ligand selon la revendication 14 pour inhiber au moins en partie l'interaction entre le polypeptide et le précurseur du peptide
    !i-amyloïdc et/ou d'inhiber l'activité du polypeptide et/ou intervenir sur le métabolisme du peptide P3-ainmloïde.
  13. 24. Utilisation des polypeptides selon les revendications I à 9 pour la preparation d'un médicament
    destine au traitement des maladies neurodégénératives et notamment la maladie d'Alhzeiminer.
  14. 25. Utilisation des polypeptides selon les revendications I à 9 pour la mise en évidence de ligands
    des polypeptidcs et/ou de composés capables d'inhiber au moins en partie l'interaction entre le polypeptide et le précurseur du peptide 3amivloïde et/ou d'inhiber l'activité du polypeptlde et/ou d'intervenir sur le métabolisme
    du peptide 14-ailNyloïdc.
  15. 26. Méthode de mise cin évidence de molécules qui modifient l'activilté des polypeptides définis selon
    les revendications I à 9. comportant les étapes suivantes
    - on met cnl contact les polypeptides de l'invention qui présente unec actixvité de type f3-secrétase avec
    une molécule ou un melange contenant différentes molécules. éventuellement non identifiées.
    - on met cn contact le melange réactionnel décrit dans l'étape précédente avec le subtrat des polypeptides de l'invention qui est préférentiellementl l'APP dans sa forme naturelle - on mesure l'activité i,-secrétase sur l'APP - on deétecte et/ou on isole les molécules qui modifient l'activité [i-secrétase des polypeptides de l'inventlon,
    3 A 2779444
    27, Vectecur viral ou plasmnidiquc contenant les séquences nucléotidiques des molecules agonistes ou
    antagonistes des polypeptidcs définis selon les revendications I à 9 pour la transfection dans des cellules hôtes
    appropriées des dites séquences et l'expression in vivo. cx-vivo et/ou in vitro des dites molécules agonistes ou antagonistes des polypcptides de l'invention
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