HUT65827A

HUT65827A - Polypeptides useful in animal treatment against mycoplasma infections

Info

Publication number: HUT65827A
Application number: HU9203128A
Authority: HU
Inventors: Jerry M Kuner; Christine Ko
Original assignee: Synergen Inc
Priority date: 1990-04-02
Filing date: 1991-04-01
Publication date: 1994-07-28
Also published as: CA2078131A1; HU9203128D0; FI924428A; AU1760295A; AU7682091A; FI924428A0; JPH05506984A; EP0527771A1; EP0527771A4; WO1991015593A1

Description

A találmány Mycoplasma szervezet elleni antitestek emlősökben, elsősorban sertésekben történő kimutatására alkalmas polipeptidekre vonatkozik. A találmány kiterjed a polipeptidek rekombináns DNS technikával történő előállítására, valamint az ehhez alkalmazható DNS szekvenciákat tartalmazó rekombináns fág kiónokra. A találmány tárgya továbbá vakcina készítmény és eljárás állatok vakcinálására Mycoplasma fertőzés gátlása érdekében.

Sertések enzootikus tüdőgyulladása, vagy más néven vírusos tüdőgyulladása, a fertőző tüdőgyulladás, az elülső lebeny tüdőgyulladás, az enzootikus vírusos tüdőgyulladás, és a mikoplazmatikus tüdőgyulladás ritkán okoz halált, de jelentős mértékben csökkenti a súlygyarapodást. Már korábban feltételezték, hogy a betegséget egy vírus okozza, de csak 1965-ben azonosították a Mycoplasma hyopneumoniae vagy más néven Mycoplasma suipneumoniae vírust.

A betegséget az orr járatokon keresztül a fertőzött sertések által kilélegzett, és a levegő által közvetített mikroorganizmusok terjesztik. A Mycoplasma mélyen megtelepszik a tüdő csucslebenyében és szivlebenyében, ahol látható lila szinü vagy szürke sérüléseket okoz, ami megnehezíti a lélegzést, és ezáltal csökkenti a súlygyarapodást. Az M. hyopneumoniae primer fertőzését más Mycoplasma fajták (M. hyorhinus és M. floculare) , valamint bakteriális patogének (Pasteurella és Bordetella fajták) szekunder fertőzése követi.

A Mycoplasma olyan prokarióta sejt, amely kisebb és • · • ·

- 3 szerkezetében egyszerűbb, mint a baktériumok, de összetettebb, mint a vírusok. A vírusoktól eltérően képesek az önálló életre, de gyakran kapcsolódnak eukarióta sejtekhez. Ennek során a sejtmembránhoz, és nem a sejtfalhoz kötődnek. Különösen kicsi a genomjuk, hossza mintegy 750 000 bp.

Bár nem gyakori, hogy a betegség halálos, jelentősen csökkenti a fertőzött állatok növekedését és súlygyarapodását, elsősorban akkor, mielőtt az állatok piacra kerülnek. Ezért az organizmussal fertőzött állatok vágóhídi értéke a nem fertőzött állatokhoz viszonyítva alacsonyabb.

A sertés tüdőgyulladás súlyos gazdasági következményei miatt olyan diagnosztikai tesztmódszerekre van szükség, amelyek kimutatják a Mycoplasma hyopneumoniae által okozott fertőzés jelenlétét. Olyan polipeptideket találtunk, amelyek felhasználhatók a fenti diagnózishoz, és bizonyos más Mycoplasma fertőzések kimutatásához. Ezek a polipeptidek az in vitro diagnosztikai vizsgálatban alkalmazva a fertőzött sertés szérumában kimutatják a Mycoplasma mikroorganizmusok elleni antitestek jelenlétét.

A polipeptidek alkalmazásának elősegítéséhez a találmány bemutat egy olyan eljárást, amely lehetővé teszi a polipeptidek rekombináns DNS technikával történő előállítását. A rekombináns DNS technika keretén belül olyan DNS szekvenciát alkalmazunk, amely külöönböző rekombináns fág kiónokat tartalmaz .

A találmány szerinti megoldás lehetővé teszi továbbá • · ·

- 4 megfelelő vakcina készítmény előállítását, valamint állatok Mycoplasma fertőzés elleni védelmét biztositó vakcinálási eljárást.

A találmány tárgya tehát különböző Mycoplasma fertőzések, elsősorban Mycoplasma hyopneumoniae fertőzés sertésben történő kimutatására alkalmas polipeptid, amely lehet A fehérje, B fehérje, C fehérje, D fehérje és E fehérje. A fenti fehérjék szakaszainak megfelelő DNS különböuő lambda fágokban található, de a C fehérje vonatkozásában azonosítottuk a teljes gént.

A találmány szerinti rekombináns DNS technikával a Mycoplasma felületi fehérjékkel analóg polipeptideket állítunk elő. Ezek a fehérjék a Mycoplasma hyopneumoniae és más Mycoplasma mikroorganizmusok által fertőzött sertések szérumával érintkezve immunodiagnosztikai komplexet képeznek. A polipeptidek rekombináns DNS technikával töörténő előállítása során úgy járunk el, hogy

a) Mycoplasma szervezetek által termelt polipeptidek antigén tulajdonságaival analóg antigén tulajdonságokkal rendelkező polipeptídet kódoló DNS szekvenciát állítunk elő;

b) a DNS szekvenciát gazda mikroorganizmusba bevihető és elszaporitható vektorba, igy a DNS szekvenciára vonatkozó operációs elemeket tartalmazó vektorba klónozzuk;

c) a DNS szekvenciát és az operációs elemeket tartalmazó vektort az antigén polipeptid kifejezésére alkalmas gazda mikroorganizmusba visszük be;

d) a gazda mikroorganizmust a vektor alkalmazásához és a polipeptid kifejezéséhez szükséges körülmények között tenyésztjük; és

e) tetszőleges sorrendben

i) a polipeptidet betakarítjuk, és ii) a polipeptidet hajtogatva kialakítjuk a Mycoplasma szervezet által termelt polipeptidek antigén tulajdonságaival analóg antigén tulajdonsághoz szükséges szerkezetet.

Az ábrák rövid ismertetése:

Az 1. ábra a lambda-gtll fág R69 kiónjába beépített Mycoplasma hyopneumoniae genom DNS teljes szekvenciáját és lefordított aminosav szekvenciáját mutatja. A DNS szekvencia (felső vonal) három bázisból álló kodonokra van osztva, amelyek a gén megfelelő leolvasó kerete alapján vannak csoportosítva. Az aminosav szekvencia (alsó vonal) a közvetlenül felette található DNS kodon lefordításából származik, és az aminosavak egybetüs kódja alapján van megadva.

A 2. ábra a rekombináns pUC18::28C2 plazmid klón Mycoplasma hyopneumoniae DNS szekvenciáját adja meg, ami tartalmazza a C fehérje teljes génjét. Összesen 4547 bp hosszúságú szakaszt szekvenáltunk. A szálon lefelé haladva mintegy 1700 bp DNS szakaszt nem szekvenáltunk. A C fehérje génje az 1801 számú nukleotidnál indul, és a 3672 számú nukleotidnál fejeződik be.

A 3. ábra a tisztított C fehérje endoproteinázzal történő emésztése után kapott peptidek aminosav szekvenciáját mutatja, és megadja a szekvenciáknak a teljes fehérje • » *

- 6 aminosav szekvenciáján belüli elhelyezkedését. A szekvenciát az aminosavak egybetüs kódja segítségével adjuk meg.

A 4. ábra a C fehérje gén teljes DNS szekvenciáját és aminosav szekvenciáját mutatja. A DNS szekvenciát (felső vonal) közvetlenül határoztuk meg (lásd VIII-B. példa), az aminosav szekvenciát (alsó vonal) a DNS szekvencia lefordítása alapján határoztuk meg. Az aminosav szekvencia aláhúzott szegmensei a szekvenciának azon részeit jelölik, amelyekre közvetlen aminosav szekvenálási adatokkal (lásd VIII—C. és -D. példa, valamint 3. ábra) rendelkezünk. A három UGA kodon (a DNS szekvenciában TGA) külön dobozokkal van jelölve. A lambda-gtll R69 klón inszertjének pozícióját (indul a 455. számú nukleotidnál és befejeződik a 976. számú nukleotidnál) a DNS szekvencia felett jelöljük. Az aminosav szekvenciát az aminosavak egybetüs kódja alapján adjuk meg.

Az 5. ábra a C fehérje gén 5' végén végrehajtott módosítást mutatja, amit az E. coliban történő rekombináns kifejezés érdekében pT5T plazmid vektorral végeztünk. A kezdeti 25 bázis egy BamHI restrikciós helyet kódol, ami lehetővé teszi a pT5T vektorhoz történő hozzákapcsolást. A kapcsolást TC3 transzlációs kapcsolóelemmel végezzük, amely a TAA transzlációs stopnál végződik. A TC3 kapcsoló elemet egy második start metionin kodon (ATG), és ezt a C fehérje gén követi. Az ábrán szerepel az eredeti és a módosított DNS szekvencia is, ahol a változatlan nukleotidokat kis betűvel és a módosított nukleotidokat nagy betűvel jelöljük a módosított szekvencián belül. A szekvencia lefordítását (az eredeti és módosított szekvenciák között változatlanul) a DNS szekvencia alatt kövér betűkkel adjuk meg. A besatirozott négyzetek restrikciós endonukleáz felismerő helyeket jelölnek a szekvencián belül, ahol a restrikciós endonukleáz nevét a négyzet alatt vagy felett adjuk meg.

A 6. ábra a pT5T::M852 expressziós plazmidban található inszert DNS szekvenciáját és lefordított aminosav szekvenciáját mutatja, amely a teljes hosszúságú rekombináns C fehérjét termeli. A transzláció az 1-helyzetü ATG-n indul, amit a TC3 kapcsolóelem (lásd az 5. ábrát) előz meg. A szekvencia transzlációja a természetes TAA stop kodonig folytatódik az 1876 számú nukleotidnál. Az E. coliban történő kifejezés elősegítése érdekében ebben a kiónban három UGA kodont (a DNS szekvenciában TGA) a C fehérje génjében UGG (TGG) kodonra cseréltük. Ezeket a TGG kodonokat a szekvenciában dobozokkal jelöljük. A 3' véghez kapcsolódó ATG start kodon miatt a számozási rendszer három nukleotiddal eltér a 4. ábrán alkalmazott rendszertől.

A 7. ábra a pT5T::M851 expressziós plazmidban található inszert DNS szekvenciáját és lefordított aminosav szekvenciáját mutatja, amely rekombináns csonkolt C fehérjét termel. A transzláció az 1-helyzetü ATG kodonnál indul, amit a TC3 kapcsolóelem (lásd az 5. ábrát) előz meg. A C fehérje transzlációja az 1294-1299 számú nukleotidnál található Hindin restrikciós helyig folytatódik, ahol az inszert a pT5T vektorhoz kapcsolódik, amely három további aminosavat (glicin, treonin, aszparáginsav) kódol a transzlációs stop kodon előtt. Ez az inszert a C fehérje génjében található három UGA kodon közül csak az első kettőt tartalmazza (a DNS szekvenciában TGA), és ezeket UGG (TGG) kodonokra cseréltük ebben a kiónban az E. coliban történő kifejezés elősegítése érdekében. Ezeket a TGG kodonokat a szekvenciában dobozokkal jelöljük. A 3' véghez kapcsolódó ATG start kodon miatt a számozási rendszer három nukleotiddal eltér a 4. ábrán alkalmazott rendszertől.

A 8. ábra a Coomassie Blue festékkel színezett poliakrilamid gél fényképe, amely az M. hyopneumoniae SÍ, 7S és 7P extraktumokban (lásd az X-A. példa) elektroforetikusan elválasztott fehérjéket mutatja.

A 9. ábra a pUC18::28C2 klón hasítási térképét mutatja, amely a teljes C fehérje gént tartalmazó M. hyopneumoniae genom klón. A fő ábra alatti nyilak a szekvenálási stratégiát mutatják, kijelölve a szekvenálás irányát és kiterjedését. Jelöljük továbbá az R69 klón szekvenciájának pozícióját, amely egy olyan izolált eredeti lambda-gtll klón, amely a C fehérje részeit kódolja. Jelöljük továbbá az R68 klón szekvenciájának pozícióit, amely egy másik lambda-gtll klón, amely a C fehérje kódoló szakasza előtt indul, és leolvasása a kódolási szekvenciában is tart. Jelöljük végül a C fehérjét kódoló szekvenciában a három UGA kodont.

A 10. ábra a pT5T::M852 bakteriális expressziós szerkezet néhány tulajdonságát mutatja, amely a teljes hosszúságú rekombináns C fehérjét kifejezi. A bemutatott jellemzők csak reprezentatív jellegűek, és nem jelentik a teljes skálát. Az árnyékolt rész az M. hyopneumoniae szegmenst mutatja, amely a C fehérje gént tartalmazza. A pT5T::M851 expressziós szerkezet, amely a csonkolt C fehérjét fejezi ki, lényegében azonos, azzal az eltéréssel, hogy hiányzik belőle a mintegy 2 kb Hindin fragmens.

Az aminosavak megjelölésére a következő hárombetűs és egybetüs kódokat alkalmazzuk:

Aminosav	Hárombetűs kód	Eqvbetüs kód
alanin	Alá	A
arginin	Arg	R
aszparágin	Asn	N
aszparaginsav	Asp	D
cisztein	Cys	C
glutamin	Gin	Q
glutaminsav	Glu	E
glicin	Gly	G
hisztidin	His	H
izoleucin	Ile	I
leucin	Leu	L
Lizin	Lys	K
metionin	Met	M
fenilalanin	Phe	F
prolin	Pro	P
szerin	Ser	S
treonin	Thr	T
triptofán	Trp	W
tirozin	Tyr	Y
valin	Val	V

Az ismeretlen aminosavakat *-gal jelöljük.

Mint fent említettük, a találmány olyan polipeptidekre vonatkozik, amelyek többek között Mycoplasma fertőzések sertésben történő in vitro diagnosztizálására alkalmazhatók.

Ezek a lényegében tiszta fehérjék különböző Mycoplasma hyopneumoniae fehérjékkel analógok, amelyek a sertés szövetében immunválaszt képesek kiváltani. Mivel a fertőzött sertésekben analóg antigénekkel szembeni immunválaszt váltunk ki, az ilyen fertőzött sertések széruma olyan antitesteket tartalmaz, amelyek egy vagy több találmány szerinti polipeptidet ismernek fel. Ezért a sértetlen polipeptidek önmagukban vagy kombinációban hatóanyagként szolgálnak a különböző Mycoplasma fajtákra vonatkozó antitestek sertés szérumban történő in vitro diagnosztikai vizsgálatához. Emellett a sértetlen polipeptidek önmagukban vagy kombinációban vakcina készítményként alkalmazhatók Mycoplasma fertőzés megelőzésére szolgáló immunválasz kiváltásához.

A fehérjékkel, antigénekkel vagy polipeptidekkel kapcsolatban alkalmazott analóg kifejezés olyan polipeptidre vonatkozik, amely képes a természetes Mycoplasma fehérjék sertésekben kiváltott fertőzésének hatására kialakuló antitestek kimutatására. Az analóg antigén tulajdonságokkal rendelkező polipeptid ezért bizonyos homológiát mutat a természetes Mycoplasma fehérjékkel. Megjegyezzük, hogy az analóg polipeptidek által kiváltott immunválasz lehet erősebb vagy gyengébb, mint a természetes Mycoplasma fehérjék által kiváltott válasz.

A lényegében homológ kifejezés azt jelenti, hogy a szóbanforgó fehérje oly mértékben homológ, hogy meghaladja a korábban ismert tisztított, és lényegében homológ fehérje készítményeket. Közelebbről ez azt jelenti, hogy a fehérje általában legalább 60 %-ban, előnyösen legalább 75 %-ban, elsősorban 85-90 %-ban homológ a természetes fehérjével. A homológ jelleg mértékét azon aminosav maradékok százalékában számoljuk, amelyek szekvenciájában azonos aminosav maradékokat tartalmazó sorbaállított két szekvencia kisebbikében találhatók, ha a két szekvenciát 100 aminosav hosszúságban négy hiány bevitele után összehasonlítjuk (Dayhoff M.O.: Atla of Protein Sequences and Structure, 5. kötet, 124. oldal (1972) , National Biochemical Research Foundation, Washington, USA).

A találmány szerinti fehérje előállítható természetes forrásokból, vagy szintetikus utón. A szintetikus polipeptid olyan aminosav szekvencia, amit természetes forrásból lényegében tiszta formában korábban nem izoláltak. A fenti értelmezés alapján a szintetikus polipeptidek közé tartoznak többek között olyan polipeptidek is, amelyeket rekombináns DNS technikával állítunk elő, vagy részben vagy egészben in vitro szintetizálunk. Közelebbről, a szintetikus polipeptidekben általában egy vagy két aminosav eltér az előnyös szekvenciától.

A leírás keretein belül a tiszta fehérje vagy tisztított fehérje kifejezés olyan fehérjére utal, amely lényegében mentes egyéb fehérjéktől. Ez közelebbről azt jelenti, hogy a találmány szerinti fehérje tisztasága legalább 50 %, előnyösen legalább 70 %, elsősorban 80-90 %.

A találmány értelmében a megjelölt in vitro diagnosztikai célokra különböző fehérjék alkalmazhatók. Ezek a kö• « » · * »4 «·· «

- 12 vetkezők: A fehérje, az M. hyopneumoniae 105 kd méretű fehérjéje; B fehérjéje; C fehérjéje; D fehérjéje; E fehérjéje.

fehérje, az M. fehérje, az M. fehérje, az M. fehérje, az M.

hyopneumoniae hyopneumoniae hyopneumon i ae hyopneumoniae kd méretű kd méretű kd méretű kd méretű

Megjegyezzük, hogy a fehérjékkel kapcsolatban megadott móltömegek nem az abszolút értéket jelölik.

Tapasztalataink szerint az A-E fehérjék a Mycoplasma szervezet felületén találhatók meg. Ha a sértetlen

Mycoplasma sejtet egy proteázzal (tripszinnel) kezeljük enyhe körülmények között, a fehérjék mindegyike érzékenynek bizonyul az emésztéssel szemben, ami arra utal, hogy a sejt felületén helyezkednek el.

Azt tapasztaltuk továbbá, hogy mindegyik fehérje egy vagy több olyan specifikus szakasszal rendelkezik, amely antigén determinánsként működik, és a Mycoplasma által fertőzött sertések szérumában megtalálható antitestek közül legalább egyet megköt. Ezek a specifikus antigén szakaszok, amelyek önmagukban vagy kombinációban fordulnak elő, teszik lehetővé az in vitro diagnosztikai vizsgálatot.

Azt tapasztaltuk továbbá, hogy legalább a C fehérje (egy 85 kd méretű fehérje) és ennek fragmense vakcina készítményként alkalmazható állatok Mycoplasma fertőzésének megelőzésére. Feltehető, hogy a többi találmány szerinti fehérje és annak változatai szintén immunválaszt váltanak ki, és védelmet biztosítanak a Mycoplasma fertőzéssel szemben. Ezek • 9

- 13 a fehérjék vagy fragmensek a vakcina készítményben alkalazhatók önmagukban vagy keverék formájában.

A találmány szerinti fehérjék szakaszait kódoló DNS szekvenciák lambda-gtll kiónokban találhatók. A teljes fehérjéket kódoló DNS szekvenciák ugyanabban a lambda-gtll tárban találhatók meg, amelyből a fenti kiónok származnak, és ezek a kiónok megfelelő módszerekkel azonosíthatók és izolálhatok.

Az A polipeptidet (105 kd) kódoló gén egyik szakasza a lambda-gtll R60b kiónban található, amely 1,5 kb méretű Mycoplasma DNS inszertet tartalmaz. Ez a fragmens KpnI és SacI restrikciós endonukleázokkal kihasítható, amelyek a farkazó vektor szekvenciát hasítják, de nem érintik az inszertet. A megfelelő R60b-a expressziós plazmid előállításához a lambda-gtll klón KpnI/SacI inszerciós fragmensét a pSEV6 plazmid vektorba visszük be.

A B polipeptidet (90 kd) kódoló gén egy szakasza megtalálható a lambda-gtll LMHC1-9 kiónban, amely 0,45 kb méretű Mycoplasma DNS inszertet tartalmaz. Ez a fragmens a KpnI és SacI restrikciós endonukleázokkal kihasítható, amelyek a farkazóvektor szekvenciát hasítják, de nem érintik az inszertet. A megfelelő LMHCl-9a expressziós plazmid előállításához a lambda-gtll klón KpnI/SacI inszerciós fragmensét a pSEV6 plazmid vektorba visszük be.

A C polipeptidet (85 kd) kódoló gén egy szakasza megtalálható a lambda-gtll R69 kiónban, amely 0,5 kb méretű (pontosabban 522 bázist tartalmazó) Mycoplasma DNS inszertet ·« » • · · · ··· ·· ··«

- 14 tartalmaz. Ez a fragmens KpnI és SacI restrikciós endonukleázokkal kihasítható, amelyek a farkazóvektor szekvenciát hasítják, de nem érintik az inszertet. A megfelelő R69b (más néven pSEV6::R69) expressziós plazmid előállításához a lambda-gtll klón KpnI/SacI inszerciós frgmensét a pSEV6 plazmid vektorba visszük be.

A D polipeptidet (70 kd) kódoló gén egy szakasza megtalálható a lambda-gtll 86-4 kiónban, amely 3,2 kb méretű Mycoplasma DNS inszertet tartalmaz. Ez a fragmens a KpnI és Saul restrikciós endonukleázokkal kihasítható, amelyek a farkazóvektor szekvenciát hasítják, de nem érintik az inszertet. A megfelelő 86-4c expressziós plazmid előállításához a lambda-gtll klón KpnI/SauI inszerciós fragmensét a pSEV6 plazmid vektorba visszük be.

Az E polipeptidet (43 kd) kódoló gén egy szakasza megtalálható a lambda-gtll Pl kiónban, amely 0,5 kb méretű Mycoplasma DNS inszertet tartalmaz. Ez a fragmens a KpnI és SacI restrikciós endonukleázokkal kimetszhető, amelyek hasítják a farkazóvektor szekvenciát, de nem érintik az inszertet. A megfelelő Plc expressziós plazmid előállításához a lamba-gtll klón KpnI/SacI inszerciós fragmensét a pSEV6 plazmid vektorba visszük be.

A fehérjéket vagy a javasolt antigén determinánsokat kódoló DNS különböző módszerekkel kifejezhető. A lambda-gtll fág kiónokban található DNS-t előnyösen emlős rendszerekben fejezzük ki.

Előnyösen úgy járunk el, hogy a kívánt DNS szakaszt ki»4 · · * · · · · ·4 * 4 ·4 ··« 4 4 »·44··

- 15 metszük a lambda-gtll fág kiónban található DNS-ből, és megfelelő formában mikrobiológiai kifejező rendszerbe visszük be. Ennek megfelelően az antigén polipeptidet úgy állítjuk elő, hogy

a) Mycoplasma szervezetek által termelt polipeptidek antigén tulajdonságaival analóg antigén tulajdonságokkal rendelkező polipeptidet kódoló DNS szekvenciát állítunk elő;

b) a DNS szekvenciát gazda mikroorganizmusba bevihető és elszaporitható vektorba, így a DNS szekvenciára vonatkozó operációs elemeket tartalmazó vektorba klónozzuk;

e) tetszőleges sorrendben

i) a polipeptidet betakarítjuk, és ii) a polipeptidet hajtogatva kialakítjuk a

Mycoplasma szervezet által termelt polipeptidek antigén tulajdonságaival analóg antigén tulajdonsághoz szükséges szerkezetet.

Mivel az M. hyopneumoniae egy prokariota szervezet, a genom DNS nem tartalmaz intronokat, és ezért közvetlenül felhasználható. Más Mycoplasma fajták azonban a normál UGA stop kodont használják triptofán ködönként a fehérje szintézisben. Mivel ez az M. hyopneumoniae vonatkozásában is »4 * *« · · 4 4 4 k · · Φ 4 · φ ••4 4 <·· · · ··· « «

- 16 igaz (lásd VIII-E. példa), más rendszerekben (például E. coliban) történő kifejezés során befejezetlen terminációt kapunk a fehérje szintézisben, amikor ezt a kodon stopként értelmezik. Az a kérdés, hogy ez a találmány szerinti fehérjéket is érinti-e, eldönthető, ha az expressziós vektort megfelelő tRNS-t elnyomó törzsben növesztjük. Ha a termináció befejezetlen, a probléma feltehetően megoldható az UGA kodont tartalmazó szakasz DNS szekvenálásával, és a megfelelő kodon helyspecifikus mutációval történő kicserélésével. A találmány értelmében a befejezetlen termináció elkerülése érdekében az UGA kodonokat kicseréljük (IX-A. példa).

A fenti eljárással kapott DNS-t a kívánt kifejező rendszerben alkalmazható expressziós vektorba visszük be. A találmány szerinti eljáráshoz bármely olyan vektor felhasználható, amely egy vagy több, fenti antigén polipeptidet kódoló DNS szekvenciát tartalmaz. Előnyösen alkalmazhatók a következő tulajdonságokkal rendelkező vektorok:

1) minimális mennyiségű gazdaszervezet-beli szekvenciát tartalmaz;

2) a kívánt gazdában stabil;

3) a kívánt gazdában nagyszámú másolatban van jelen;

4) szabályozható promotert tartalmaz; és

5) legalább egy olyan szelektálható markert kódoló DNS szekvenciát tartalmaz, amely a plazmidon belül egy olyan szakaszon található, amely független attól a szakasztól, amelybe az antigén polipeptidet kódoló

DNS szakaszt beépítjük.

A találmány értelmében előnyösen alkalmazhatók azok a klónozó vektorok, amelyek a fenti kritériumoknak megfelelően könnyen átalakíthatok. Ezek az átalakítások szakember számára közismertek, és az irodalomban megtalálhatók. Az előnyösen alkalmazható vektorokra példaként említhetők az 1. táblázatban megadott vektorok.

1. táblázat

Gazda	Vektor	Meqieovzés
E. coli	pUC8	sok szelektálható replikont
	pUC9	jellemeztek;
	pBR322	Maniatis, T. és munkatársai
	pGW7	(1982) Molecular Cloning:
	placlQ	A Laboratory Manual, Cold
	pDP8 pTAC pBR325 pUC18 pSEV6 M13mpl8 M13mpl9	Spring Harbor Laboratory
BACILLUS	pUBHO	Genetics and Biotechnology
B. subtilis	pSA0501	of Bacilli, Ganesan and
B. amyloliguefaciens	pSA2100	Hoch, 1984, Academic Press

• · • · · (táblázat folytatása)

Gazda Vektor Megjegyzés

B. strearotheromophi- 18 -

lus	pBD6 pBD8 pT127
PSEUDOMONAS	RSF1010	néhány vektor a Gram-negativ
P. aeruginosa	Rmsl49	baktériumok széles spektru-
P. putida	pKT209	mában alkalmazható, igy a
	RK2	Xanthomonas és Agrobacterium
	pSa727	törzsekben
CLOSTRIDIUM	PJU12	az E. coli és C. perfringens
C. perfringens	PJU7	esetén alkalmazható ingázó
	PJU10	plazmidot, Squires C. és
	PJU16	munkatársai (1984) Journal
	PJU13	Bacteriol. 159, 465-471 ismerteti.
SACCHAROMYCES	YEP24	Botstein és Davis: Molecular
S. cerevisiae	YIp5	Biology of the Yeast Saccha-
	YRpl7	romyces, Strathern, Jones and Broach, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory.

··-* · • · · · · · · • · · · ··· ·· ··« · ·

- 19 Megjegyezzük, hogy a fenti felsorolás csak bemutató jellegű, és a találmány értelmében minden olyan klónozó vektor alkalmazható, amelybe az antigén polipeptideket kódoló DNS szekvenciák a szükséges operációs elemekkel együtt beépíthetők.

Operációs elemként bármely szokásos operációs elem alkalmazható. Előnyös, ha a klónozó vektor legalább egy promotert, legalább egy riboszóma kötőszekvenciát és legaább egy transzkripciós terminátort tartalmaz. Előnyös továbbá, ha a klónozó vektor további operációs elemként tartalmaz legalább egy operátort, legalább egy vezérszekvenciát, amely lehetővé teszi, hogy a fehérje kijusson az intracelluláris térbe, továbbá legalább egy regulátort, és bármilyen olyan DNS szekvenciát, amely szükséges vagy előnyös a vektor DNS megfelelő transzkripciója és ezt követő transzlációja vonatkozásában.

A megadott listán belül klónozó vektorként előnyösen alkalmazhatók az E. coli vektor rendszerek, valamint azok a vektor plazmidok, amelyek Gram-negativ baktériumok széles spektrumában autonóm módon szaporodnak. Ezek előnyösen alkalmazhatók a Pseudomononas gazdaszervezetekben. Ilyen vektorokat ismertet például Tait R.C., Close T.J., Lundquist R.C., Hagiya Μ., Rodriguez R.L., Kado C.I.: Biotechnology, 269-275 (1983); Panopoulos N.J.: Genetic Engineering in the Plánt Sciences, Praeger Publishers, New York, New York, 163-185 (1981); Sakaguchi K.: Current Topic in Microbiology and Immunology, 96, 31-45 (1982).

»· ·««·

- 20 Különösen előnyösen alkalmazható az RSF1010 plazmid és származékai (Bagdasarian M., Bagdasarian M.M., Coleman S. és Timmis K.N.: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, Timmis, K.N. és Puhler A. kiadó, Elsevier, North Holland Biomedical Press (1979)). Az RSF1010 plazmid előnye, hogy viszonylag kisméretű, nagyszámú másolatot eredményez, ami könnyen transzformálható, és stabilan beépül az E. coli és Pseudomonas törzsekbe. Ebben a rendszerben előnyösen alkalmazható a Tac expressziós rendszer, amit az Escherichia törzsek vonatkozásában ismertettek, mivel az E. coli trp promotert könnyen felismeri a Pseudomonas RNS polimeráz (Sakaguch K.: Current Topics in Microbiology and Immunology, 96. 31-45 (1982); Gray G.L., McKeown K.A. , Jones A.J.S., Seeburg P.H. és Heyneker H.L.: Bio/Technology, 1984. február, 161-165). A transzkripciós aktivitás tovább fokozható, ha a promotert például E. coli vagy P. aeruginosa trp promoterre cseréljük.

Előnyösen úgy járunk el, hogy a P. aeruginosa-t olyan vektorral transzforrnáljuk, amely az antigén polipeptidet termeli intracelluláris termék, vagy a vezérszekvenciához kapcsolódó termék formájában, ahol ez utóbbi esetben a vezérszekvencia a terméket elszállítja a sejtből. Ennek során vezérszekvenciaként előnyösen alkalmazható a B-laktamáz, OmpA fehérje és a Pseudomonas-ból származó karboxi-peptidáz G2. A transzláció iniciálása bármely, az E. coli fehérjéknél szokásos módon megvalósítható, ahol az antigén polipeptid intracelluláris kifejezéséhez a gazdaszervezethez · ··· • · · · ·♦· 99 «·*

- 21 tartozó bármely nagy mennyiségben kifejezett fehérjéhez kapcsolt iniciátorhely felhasználható.

Abban az esetben, ha a Pseudomonas gazdaszervezet úgynevezett restrikciós mínusz törzsei nem hozzáférhetők, az E. coliból izolált plazmid szerkezetek transzformációja nem eléggé hatékony. Ezért, a Pseudomonas klónozó vektort a kívánt gazdaszervezetbe történő transzformálás előtt egy más fajtához tartozó r- m+ törzsön visszük át (Badgasarian M. és munkatársai: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, 411-422. oldal, Timmis and Puhler kiadó, Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979)).

A Bacillus-félékhez tartozó gazdaszervezetben kifejező rendszerként előnyösen alkalmazható a pUBHO plazmid. A többi gazdavektor szervezethez hasonlóan a Bacillus félékben is lehetőség van arra, hogy a találmány szerinti antigén polipeptideket intracellulárisan vagy kiválasztott fehérje formájában fejezzük ki. A Bacillus-félékben és E. coliban is szaporodó ingázó vektor alkalmazásával különböző gének állíthatók elő és vizsgálhatók (Dubnau D., Gryczan T., Contente, S. és Shivakumar A.G.: Génétic Engineering, 2. kötet, Setlow and Hollander kiadó, Plenum Press, New York, New York, 115-131 (1980)). Az antigén polipeptid B. subtilisből történő kifejezése és kiválasztása érdekében az a-amiláz szignál-szekvenciát előnyösen az antigén polipeptid kódoló szakaszához kapcsoljuk. Intracelluláris polipeptid előállításához a hordozható DNS szekvenciát transzlációs módon az α-amiláz vezérszekvencia riboszómakötő helyéhez

99 999·· ·· 9 9 ···

9 9 «··>a ♦ · 9· ··· «« ··* ··· kapcsoljuk.

A fenti szerkezetek bármelyikének transzkripcióját előnyösen α-amiláz promoterrel vagy ennek származékával irányítjuk. A származék tartalmazza a természetes a-amiláz promoter RNS polímeráz felismerő szekvenciáját, de emellett egy lac operátor szakasszal is rendelkezik. A Bacillus-félékben hasonló szabályozó hatást váltanak ki a penicillináz gén promoterből és a lac operátorból előállított hasonló hibrid promoterek is (Yansura D.G. és Henner: Genetics and Biotechnology of Bacilli, Ganesan A.T. és Hoch J.A. kiadó, Academic Press, 249-263 (1984)). A szabályozáshoz felhasználható továbbá a Laclű lacl génje is.

Clostridium törzsekben történő kifejezéshez előnyösen alkalmazható a pJU12 plazmid (Squires C.H. és munkatársai: J. Bacteriol. 159, 465-471 (1984)). A C. perfringens törzsbe történő transzformálás megvalósítható például Heefner D.L. és munkatársai módszerével (J. Bacteriol. 159, 460-464 (1984)). A transzkripciót a tetraciklin rezisztencia gén promotere irányítja. A transzláció a fenti tet^r gén Shine-Dalgarno szekvenciájához kapcsolódik, ami a többi gazdaszervezetben alkalmazható vektorok vonatkozásában a fent ismertetett módon történik.

Az élesztőbe bevitt idegen DNS különböző módszerekkel tartható fenn (Botstein D. és Davis R.W.: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, Strathern, Jones and Broach kiadó, 607-636 (1982)). A Saccharomyces-félékben előnyösen alkalmazható kifejező rendszerben az antigén polipeptid gént a 2 mikron plazmid hordozza. A 2 mikron kör előnye a viszonylag nagyszámú másolat és a cir° törzsekbe történő bevitelkor tapasztalható stabilitás. Ezek a vektorok általában tartalmazzák a replikációs origót, és legalább egy, pBR322-ből származó antibiotikum rezisztencia markert, ami lehetővé teszi az E. coliban történő szaporodást és szelektálódást. Emellett, a plazmid előnyösen 2 mikron szekvenciát és élesztő LEU2 gént tartalmaz, ami lehetővé teszi a LEU2 mutáns élesztők alkalmazását is.

A GÁLI élesztő gén szabályozható promoterét előnyösen az antigén polipeptid gén közvetlen transzkripciójához adaptáljuk. A DNS szekvencia élesztőben történő transzlációja olyan vezérszekvenciához kapcsolódik, ami szabályozza az élesztő α-faktor kiválasztását. Ez olyan fúziós fehérjét eredményez, ami élesztőben felhasználható, és a kívánt antigén polipeptidet kiválasztja. Alternatív lehetőség, hogy a sejten belüli kizáródás érdekében egy metionil antigén polipeptidet fordítunk le.

Mint az 1. táblázatban felsorolt, és a fent ismertetett egyedi klónozó vektorokból látható, az előnyös találmány szerinti vektorok mindegyikében különböző operációs elemek fordulhatnak elő. Ezekhez a vektorokhoz bármely olyan további operációs elem a szokásos módon hozzákapcsolható, amely a vektor alkalmazása szempontjából előnyös lehet.

A gyakorlatban ez azt jelenti, hogy ezek a vektorok olymódon előállíthatok, amely megkönnyíti az izolálást, az alkalmazást és a kicserélést. Ez elősegíti a fenti elemek és az antigén polipeptid kódoló szakasza kombinációjából álló nagyszámú funkcionális gén alkalmazását. További előny, hogy a legtöbb ilyen elem több, mint egy gazdaszervezetben alkalmazható.

Ezek a szabályozók bizonyos környezeti körülmények között megakadályozzák az antigén polipeptidet kódoló DNS szekvencia kifejeződését, mig más környezeti körülmények között lehetővé teszik a transzkripciót és a DNS szekvencia által kódolt fehérje ezt követő kifejezését. Ez közelebbről azt jelenti, hogy a vektorba olyan szabályozó szegmens építhető be, amely biztosítja, hogy a DNS szekvencia kifejeződése ne következzen be például izopropil-tio-B-d-galaktozid távollétében. Ebben az esetben a DNS-t tartalmazó transzformált mikroorganizmus a kívánt sejt sűrűségig tenyészthető az antigén polipeptid kifejezésének megindítása előtt. Ekkor a kívánt antigén polipeptid kifejezését úgy indítjuk meg, hogy a tápközeghez hozzáadjuk azt az anyagot, amely a kívánt sejtsürüség elérése után kiváltja a DNS szekvencia kifejezését.

További operációs elemként alkalmazhatók a riboszoma kötő helyek és más DNS szekvenciák, amelyek lehetővé teszik idegen fehérjéknek mikroorganizmusokban történő kifejezését. Az adott esetben előnyösen alkalmazható operációs elemeket a területen jártas szakember rutinszerűen kiválaszthatja. Az operációs elemek általános leírását megadja B. Lewin: Genes, Wiley and Sons, New York (1983). A megfelelő operációs eleinek különböző példái megtalálhatók az említett vektoroknál, és a vektorokat ismertető irodalmi helyeken.

A találmány szerinti megoldás egyik előnyös megvalósítási módja szerint egy további DNS szekvencia helyezkedik el közvetlenül az antigén polipeptidet kódoló DNS szekvencia előtt. A további DNS szekvencia transzlációs kapcsolóként működhet, vagyis olyan RNS-t kódol, amely a riboszómákat közvetlenül az antigén polipeptid RNS riboszoma kötő helyéhez irányítja.

A fent ismertetett klónozó vektorok valamennyi szükséges és kívánt komponensének szintézise és/vagy izolálása után a vektort a szokásos módon alkalmazzuk. A klónozó vektorok alkalmazásának különböző lehetőségei és feltételei szakember számára ismertek, és az irodalomban megtalálhatók. így például hasonló DNS szekvenciák megfelelő klónozó vektorba történő ligálását ismertetik Schonert és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 81, 5403-5407 (1984).

A találmány szerinti klónozó vektorok összeállításával kapcsolatban megjegyezzük továbbá, hogy minden egyes vektorba több antigén polipeptidet kódoló DNS szekvencia és ezt kisérő operációs elem beépíthető. Ilyen esetben a gazdaszervezet a vektorra vonatkoztatva nagyobb mennyiségben termeli a kívánt antigén polipeptidet. Az egy vektorba beépíthető DNS szekvencia másolatok számát gyakorlatilag csak az korlátozza, hogy az alkalmazott mikroorganizmus milyen méretű vektort képes felvenni, elszaporitani és átírni.

Emellett előnyös továbbá, ha a klónozó vektor olyan szelektálható markert, igy drog rezisztencia markert vagy bármely más szokásos markert tartalmaz, amely a gazda mikroorganizmusban szelektálható tulajdonságot fejez ki. Az ilyen drog rezisztencia vagy más szelektálható marker elősegíti a transzformánsok szelektálását. A klónozó vektorban alkalmazott szelektálható marker további előnye, hogy megakadályozza a tenyészközegbe bekerült szennyező mikroorganizmusok elszaporodását. Ebben az esetben a mikroorganizmusnak az indukált fenotipus túlélését biztositó körülmények között végzett tenyésztésével tiszta, transzformált tenyészetet nyerünk.

További előnyös megoldás, ha a kódoló szakasz 3' végét átszerkesztjük, ami lehetővé teszi 3' nem lefordított szekvenciák alkalmazását. Nem lefordított szekvenciaként előnyösen alkalmazhatók azok, amelyek stabilizálják az mRNS-t vagy elősegítik annak átírását, illetve azok, amelyek erős transzkripciós terminátor szignált adnak, amely stabilizálja a vektort (Gentz R., Langner A., Chang A.C.Y., Cohen S.H. és Bujard H. : Proc. Acad. Sci. USA, 78., 4936-4940 (1981)).

Az igy kapott vektort ezután a megfelelő gazda mikroorganizmusba visszük be. Mikroorganizmusként bármely olyan szervezet felhasználható, amely képes exogén DNS felvételére, és a benne lévő gének és kapcsolódó operációs elemek kifejezésére. Gazda mikroorganizmusként alkalmazhatók az anaerob, a fakultatív anaerob vagy aerob mikroorganizmusok.

♦ · · • · · · · · « ♦ · · · ··· «· ··· ···

- 27 A találmány szerinti megoldás során gazdaszervezetként előnyösen alkalmazhatók az élesztők és baktériumok. Élesztőként előnyösek a Saccharomyces-félék, elsősorban a Saccharomyces cerevisiae.

Baktériumként alkalmazhatók a Bacillus, Escherichia és Pseudomonas félék. Az előnyös gazda mikroorganizmusok néhány képviselőjét az 1. táblázatban soroltuk fel. Gazda mikroorganizmusként előnyösen alkalmazhatók továbbá a Bacillus subtilis, Escherichia coli vagy Pseudomonas aeruginosa.

A gazdaszervezet kiválasztása után a vektort a szokásos módon bevisszük a gazdaszervezetbe. Az alkalmazható módszerekre példaként említhetők az Advanced Bacterial Génétics, R.W. Davis és munkatársai, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1980) irodalmi helyen ismertetett módszerek. Bizonyos esetekben előnyös, ha a transzformációt alacsony hőmérsékleten végezzük, amikoris a gén kifejeződése az alkalmazott operációs elemeken keresztül a hőmérséklettel szabályozható. Ozmotikus szabályozó elemek alkalmazása esetén a transzformáció során a só koncentráció beállításával biztosítható a szintetikus gének megfelelő szabályozása.

Ha a rekombináns antigén polipeptid kifejezésére élesztőt kívánunk alkalmazni, akkor a klónozó vektort először előnyösen Escherichia coli-ba visszük be, ahol a vektor elszaparodik, majd kinyerhető és tisztítható. A vektort ezután az antigén polipeptid kifejezése érdekében az élesztőbe visszük.

• · *

- 28 A gazdaszervezetet az antigén polipeptid megfelelő kifejezését biztosító körülmények között tenyésztjük. Ezek a körülmények általában jellemzőek a kiválasztott gazda mikroorganizmusra és szakember által könnyen meghatározhatók, illetve az irodalomban megismerhetők (például Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. kiadás, Williams and Wilkins Company, Baltimore, Maryland, USA).

A transzformáció és a tenyésztés során figyelembe kell venni a vektorba beépített vagy jelenlévő, és a DNS szekvencia kifejezését szabályozó operációs elemekhez szükséges körülményeket. Eljárhatunk úgy, hogy a sejteket nagy sejtsürüségig tenyésztjük olyan szabályozó körülmények között, amelyek gátolják az antigén polipeptidet kódoló DNS szekvencia kifejezését. Az optimális sejtsürüség elérése után a környezeti körülményeket úgy változtatjuk meg, hogy kiváltsuk a DNS szekvencia kifejezését. így elérhető, hogy az antigén polipeptid előállítása olyan időintervallumban következzen be, amikor a gazdasejtek megközelítették az optimális sűrűséget, valamint az, hogy a kapott antigén polipeptid a kifejezéshez szükséges szabályozó körülmények beállítása után rövid időn belül begyüjthető.

Az alkalmazott transzkripciós terminátorok stabilizálják a vektort. A találmány értelmében előnyösen alkalmazhatók a Gentz és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 4936-4940 (1981) irodalmi helyen ismertetett szekvenciák.

Izoláltuk és szekvenáltuk a teljes C fehérje gént tartalmazó kiónt (pUC18::28C2). A pUC18::28C2 plazmid klón izo• · • Β

- 29 lálása során DNS hibridizációs mintaként az R69 klón inszertjét alkalmazzuk. Előállításához az M. hyopneumoniae DNS-t Sau3a restrikciós enzimmel részlegesen emésztjük, és a BamHI enzimmel hasított pUC18 plazmid vektorba visszük be (lásd VIII. példa). Szekvenáltuk a teljes gént és az azt körülölelő DNS egy részét (lásd VIII-B. példa és 2. ábra).

A szekvenált régión belül a gén pozíciójának meghatározásához a sértetlen, és M. hyopneumoniae sejtekből izolált C fehérje aminoterminális szekvenciáját meghatározva egy vonatkoztatási pontot állapítottunk meg (VIII-C. példa). Emellett, meghatároztuk különböző C fehérje peptid fragmensek aminosav-szekvenciáját, ahol a fragmenseket endopeptidázzal végzett emésztéssel és HPLC módszerrel végzett tisztítással állítottuk elő (lásd VIII-D. példa). A peptidek szekvenciáját a 3. ábra mutatja. A DNS szekvencia megfelelő leolvasó keretének meghatározásához ezeket az aminosav szekvenciákat alkalmaztuk. A teljes C fehérje lefordított DNS szekvenciáját a 4. ábra mutatja, ahol aláhúztuk a szekvenált peptidek helyzetét.

A sértetlen C fehérje aminoterminális szekvenciája egy kiterjedt nyílt leolvasó keret közepén helyezkedik el. Feltehető, hogy a C fehérje génje a gyakorlatban egy nagyobb fehérjét (mintegy 20 kd mérettel nagyobb) kódol, ami ezután 85 kd méretű fehérjévé alakul. Mivel a tapasztalatok szerint az érett C fehérje (85 kd) megfelelő védőhatást biztosit, közelebbről nem vizsgáltuk a kieső szakaszokat. A C fehérje (85 kd) génje (a kieső szakaszok kivételével) 624 aminosav •« ··»· • · · • · · ·· • · · • · · · ·

- 30 hosszúságú fehérjét kódol, amelynek számolt móltömege 70,5 kd. A számolt és az SDS-PAGE vizsgálattal meghatározott látszólag móltömeg közötti eltérés nem szokatlan. A C fehérje gén a kereten belül három UGA kodont (lásd a 4. ábra megjelölt részei) tartalmaz, a DNS-ben TGA kodon, amely triptofánt kódol (lásd VIII-E. példa). Az UGA alkalmazása triptofán ködönként a mikoplazmákban szokásos, de más szervezetekben (igy E. coli-ban) az UGA transzlációs terminátor szignálként szolgál. A C fehérje E. coliban történő kifejezéséhez az UGA kodont az E. coliban szokásos UGG (triptofán) kodonra cseréltük (lásd később, valamint IX. példa).

Az eredeti C fehérje klón, az R69 teljes egészében a C fehérje kódoló szekvenciáján belül helyezkedik el, és a 455 számú nukleotidnál indul, és a 976 számú nukleotidig terjed (lásd a 4. ábra).

A rekombináns C fehérje kifejező kiónjaként pT5T::M852 rekombináns plazmidot szerkesztettünk, amely a teljes C fehérjét (85 kd) E. coliban kifejezi. Az ehhez szükséges expressziós vektorban a három kereten belüli UGA kodont UGG kodonnal, az E. coliban szokásos triptofán kodonnal helyettesítettük. Ennek során a kodonok utolsó A nukleotidját G nukleotidra cseréltük. A folyamatot helyspecifikus in vitro mutációval végeztük (Kunkel és munkatársai: Methods in Enzymol. 154. 367-382 (1987)), amelynek során olyan rövid oligonukleotidot szintetizáltunk, amely a kicserélt nukleotidtól eltérően teljesen komplementer az adott szakasszal. Ez a pozíció olyan nukleotidot tartalmaz, amely a kívánt • · · · · · · • · · · · · · • · · · ··♦ ·» t · » ··· cserével komplementer. A szubsztitúció mindkét oldalán elegendő pontos komplementaritás van ahhoz, hogy az oligonukleotid a változatlan szekvenciát tartalmazó egyszálu vektorhoz kapcsolódjon. Amikor a második szál a primerként alkalmazott oligonukleotidon megszintetizálódik, a változtatás beépül, és az ezt követő replikációk során mindkét szálon szubsztituált DNS molekulák képződnek. Ezzel a technikával a C fehérje génben található mindhárom UGA kodont UGG kodonra cseréltük (lásd IX-A. példa).

A specifikus védő fehérje vagy fehérjék azonosításához hatékonysági vizsgálatokat (sertések Mycoplasma hyopneumoniae fertőzés elleni védelme) végeztünk. A specifikus védőfehérje kimutatásához és szükséges tisztításához. Alacsony védelmet biztositó viszonylag nyers extraktumokból kiindulva tisztítottuk és vizsgáltuk az egyedi fehérje komponenseket, amelynek során védőfehérjeként a C fehérjét azonosítottuk. A C fehérje rekombináns változatainak (teljes hosszúságú és csonkolt változat) klónozásával és kifejezésével szintén védő hatás érhető el, ami igazolja azt, hogy a C fehérje a védőszer.

Különböző fehérje extraktumokat és tisztított fehérjéket vizsgáltunk vakcinaként. Ezek a következők voltak:

SÍ: A teljes Mycoplasma hyopneumonae sejtből alacsony pH értéken felszabadított fehérjék extraktuma (X-A2. példa).

7S: Az SÍ extraktumban jelenlévő, és pH = 7,0 értéken oldatban maradó fehérjék (X-A3. példa). 1,25 tömeg% • · • ·· ··«· ·· · · · • · 9 · · · ♦ « · · ··· ·· ··«

- 32 SDS vagy 6 mól/1 karbamid adagolásával denaturálható.

C fehérje (természetes 85 kd fehérje): az SÍ vagy 7S mintából tisztítható (X-B. példa).

Teljes hosszúságú rekombináns C fehérje: IX. X-C példa.

Csonkolt rekombináns C fehérje: IX. és X-D. példa

A találmány szerinti megoldásnak egy adott problémához vagy környezethez történő adaptálása szakember feladata. A találmány szerinti megoldás megvalósításához alkalmazható izolációs és műveleti folyamatokat a következő példákban mutatjuk be anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korlátozódna.

I. példa

Lambda-qtll expressziós tár kialakítása

A. M. hvopneumoniae genom DNS expressziós tár kialakítása

A genom expressziós tár kialakítása lehetővé teszi, hogy az M. hyopneumoniae által kifejezett valamennyi antigenetikus aktivitású fehérje vonatkozásában reprezentatív kiónt találjunk. Mivel a prokariota DNS nem tartalmaz intronokat, nem szükséges cDNS tár kialakítása. A genom kis mérete miatt az M. hyopneumoniae genom megfelelő reprezentálásához viszonylag kis számú klón elegendő. Az M. hyopneumoniae genom méretét 750 kb értékre becsülve 1,4 x 10⁵ egyedi rekombináns szükséges ahhoz, hogy 99 %-os valószínűséggel minden 100 bp szakasz mindkét orientációban és mindhárom leolvasó keretben jelen legyen.

A lambda-gtll-ben peptidet kódoló klónozott DNS fragmenseket fejezünk ki fúziós fehérje formájában, ha ezeket a fágban található β-galaktozidáz gén karboxi-terminális részéhez közel eső egyetlen EcoRI helyre inszertáljuk. Az idegen DNS-nek a β-galaktozidáz génbe történő bevitele inaktiválja a gént, ezért a rekombináns fágok indikátor lemezen azonosíthatók.

Az M. hyopneumoniae genom expressziós tárat négy egymást követő lépésben állítjuk elő. Először kinyerjük a genom DNS-t az M. hyopneumoniae sejtekből. Másodszor ultrahangos besugárzással véletlenszerű fragmenseket állítunk elő, a tapadó végeket T4 polimeráz fág alkalmazásával tompa végekké alakítjuk, a belső EcoRI restrikciós helyeket EcoRI metilázzal védjük, EcoRI linkereket adunk a végekhez, és a felesleges linkereket lehasitjuk. Harmadszor az előállítót fragmenseket lambda-gtll vektor DNS-be (Vector Cloning Systems, San Diego, California, USA) ligáljuk, és in vitro pakoljuk. Végül az in vitro pakolt rekombináns fágokat alkalmazzuk.

1. Genom DNS előállítása Mvcoplasma hyopneumoniae sejtekből

Mintegy 10¹¹ megfagyasztott M. hyopneumoniae sejtet jégen felolvasztunk, és egy polipropilén csőbe töltjük. A sejtek térfogata 0,8 ml. Ehhez 1 ml proteináz K oldatot adunk, összetétele 0,075 mól/1 trisz (pH = 8), 0,17 mól/1 • ···♦ ·· » · · ·· • · · · · · · • · « · • · · ·· ··· ··«

- 34 EDTA (pH = 8), 0,15 tömeg% Triton X 100 és 400 gg/ml proteináz K (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA). A sejteket a proteináz K oldattal 65 ’C hőmérsékleten 30 percen keresztül inkubáljuk. Ezután 2,0 ml fenolt adunk az elegyhez, és a csövet óvatosan rázzuk 4 ’C hőmérsékleten 20 percen keresztül. A mintát ezután Beckman JA20 rotorban 5000 fordulat/perc értéken 5 percen keresztül 4 ’C hőmérsékleten centrifugáljuk. A vizes fázist egy nagylyuku műanyag pipettával eltávolítjuk. A vizes fázist ezután 2 ml kloroform/izoamil-alkohol 24:1 eleggyel 20 percen keresztül 4 °C hőmérsékleten rázva extraháljuk, majd 5 percen keresztül a fázisokat hagyjuk szétválni. Ezután a vizes fázist egy nagyfuratu műanyag pipettával eltávolítjuk.

A vizes fázist ezután fenollal, majd kloroform/izoamil-alkohol eleggyel a fent leirt módon ismét extraháljuk. Az extrahált vizes fázist 1/10 térfogatnyi 3,0 mól/1 nátrium-acetát törzsoldattal higitva 0,3 mól/1 koncentrációjú nátrium-acetát oldattá alakítjuk. A DNS-t 2,5 térfogatrész hideg etanol hozzáadásával kicsapjuk. Az etanolt óvatosan keverve kiterjedt viszkózus nukleinsav masszát kapunk, amit kisméretű üvegrudra tekerünk fel. Ezt az anyagot kétszer 70 tömeg%-os etanollal öblítjük, majd levegőn szárítjuk. A száraz nukleinsavat 0,5 ml TE pufferben 16 órán keresztül 4 ’C hőmérsékleten rázva ismét szuszpendáljuk.

Az M. hyopneumoniae DNS készítményből eltávolítjuk az esetleges RNS szennyezést, amelyhez a nukleinsavat RnázA enzimmel kezeljük. Ennek megvalósításához 0,5 ml sporozoita « ♦ ♦

- 35 nukleinsav készítményt, 2,5 /ig/ml RnázA enzimmel (Miles Laboratories, Elkhart, Indiana, USA) 65 °C hőmérsékleten 30 percen keresztül kezelünk. A vizes fázist 0,75 térfogatrész 7,5 mól/1 törzsoldat hozzáadásával 3,2 mól/1 koncentrációjú ammónium-acetát oldattá alakítjuk. A DNS-t ebből az oldatból 0,54 térfogatrész izopropanol hozzáadásával kicsapjuk. Az izopropanol keverésével nagykiterjedésü viszkózus pelletet kapunk, amit feltekercserlünk, és kétszer 80 %-os etanollal átöblitünk. Levegőn történő szárítás után a DNS-t 0,2 ml TE pufferben szuszpendáljuk.

Az M. hyopneumoniae DNS-t agaróz gélen elektroforizáljuk, majd a gélt etidium-bromiddal megfestjük. Az eredmények szerint a DNS móltömege nagy és RNS-től viszonylag mentes. A DNS koncentrációt 260 nm hullámhosszon optikai fényelnyelés segítségével határozzuk meg. A kapott készítmény 90 gg tisztított DNS-t tartalmaz.

2. Ultrahanggal besugárzott M. hyopneumoniae genom DNS fragmensek előállítása

A természetes polipeptid transzkripciójához és transzlációjához alkalmazott megfelelő leolvasó keretben elhelyezkedő M. hyopneumoniae genom fragmens előállításához ultrahangos besugárzással véletlenszerű fragmenseket állítunk elő, amelyek az összes lehetséges keretet reprezentálják.

Az M. hyopneumoniae DNS-t egy kisméretű mintában Branson Sonifier cell disrupter 200 set berendezéssel a legalacso··♦ ♦ ·· «·<· • · · · « • · · ··· • · · · ··· ·· ···

- 36 nyabb energiafokozaton besugározzuk. 80 μg DNS-t 200 ml ossz térfogatban háromszor 3 másodpercen keresztül kezelünk. Az igy kapott fragmensek mérete 0,3-23 kb érték között változik, a fragmensek többsége az 1,3-4,4 kb határok közé esik.

A besugárzás hatására keletkező tapadó végeket T4 DNS polimeráz (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, USA) segítségével tompa végekké alakítjuk. A reakciót 33 mmól/1 trisz-acetát (pH = 7,8), 66 mmól/1 kálium-acetát, 10 mmól/1 magnézium-acetát, 0,1 mg/ml borjuszérum albumin, 0,5 mmól/1 ditiotreitol és egyenként 0,1 mmól/1 dezoxinukleotid-trifoszfát (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) jelenlétében végezzük.

yg besugárzott DNS-t 20 egység T4 polimerázzal reagáltatunk 1 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten. A reakció megállításához az elegyet 10 percen keresztül 68 °C hőmérsékleten melegítjük. A sók feleslegének eltávolításához a reakcióelegyet TE-vel kiegyenlített Biogel P30 (BIO RÁD) oszlopon szűrjük át.

A belső EcoRI helyeket tartalmazó M. hyopneumoniae genom DNS fragmensek védelme érdekében módosítjuk a DNS-t. A fragmentált M. hyopneumoniae DNS-t EcoRI metilázzal (New England Biolabs) reagáltatjuk S-adenozil-metionin jelenlétében a gyártó előírásai szerint. A metilázt a reakcióelegy fenollal végzett extrahálásával inaktiváljuk, és a maradék fenolt éteres extrakcióval eltávolítjuk. Az elegyet ezután 0,3 mól/1 koncentrációjú nátrium-acetát oldattá alakítjuk, és 2,5 térfogatrész etanolt adunk hozzá. 30 percen keresztül

-70 °C hőmérsékleten tartjuk, majd a kicsapott DNS-t centrifugálással pelletáljuk. A kapott DNS-t TE pufferben szuszpendáljuk.

A tompa végű fragmensekhez rövid EcoRI linker oligonukleotidot (New England Biolabs) adunk 66 mmól/1 trisz (pH = = 7,6), 5 mmól/1 MgC12, 5 mmól/1 ditiotreitol és 10 mmól/1 ATP összetételű ligáló elegyben 5-10 gmól/l linker koncentráció mellett. Az elegyhez ezután T4 DNS ligázt (P.L. Biochemicals) adunk, és 14 °C hőmérsékleten 16 órán keresztül reagáltatjuk. A ligáló reakció befejezéséhez az elegyet 10 percen keresztül 70 ’C hőmérsékleten melegítjük.

Ezután 0,1 mól/1 végkoncentrációig nátrium-kloridot adunk hozzá, majd felesleges mennyiségű EcoRI enzimmel elegyítjük, és néhány órán keresztül 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. Az EcoRI enzim aktiválásához az elegyet 10 percen keresztül 70 °C hőmérsékleten melegítjük.

A linker feleslegének eltávolítása és a DNS fragmensek méret szerinti frakcionálása érdekében sűrűség centrifugálást végzünk 10-40 tömeg% szacharóz gradiens mellett 1 mól/1 nátrium-klorid, 20 mmól/1 trisz (pH =8) és 5 mmól/1 EDTA elegyben. A DNS-t a gradiens tetejére adjuk, és egy Beckman SW41 rotorban 26000 fordulat/perc értéken 24 órán keresztül 15 °C hőmérsékleten centrifugáljuk.

A frakciókat 0,3 ml alikvot részletekben összegyűjtjük. A mintákat vizes gélelektroforézis vizsgálattal és etidium-bromid megfestéssel vizsgálva összehasonlítjuk a fragment frakciók és a móltömeg marker méretét. Az 1-6 kb méretű fragmenseket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, dializáljuk, és Centricon 30 (Amicon) berendezésben koncentráljuk.

3. A fragmensek lambda-qtll-be történő ligálása és a rekombináns DNS in vitro pakolása

A foszfátéit és EcoRI enzimmel hasított lambda-gtll DNS-t az M. hyopneumoniae DNS előállított fragmenseivel keverjük. Ezeket a DNS-eket T4 DNS ligázzal (P.L. Biochemicals) egy éjszakán keresztül 14 °C hőmérsékleten ligáljuk. A ligáló elegy kis alikvot részét gélelektroforetikusan vizsgálva ellenőrizzük a ligáló reakció lefutását. Az elegyet ezután 5 percen keresztül 70 °C hőmérsékleten melegítjük, majd lambda in vitro pakoló extraktummal (Vector Cloning Systems, San Diego, California, USA) keverjük. Az elegyet 60 percen keresztül szobahőmérsékleten reagáltatjuk, majd a bakteriális növekedés megakadályozásához egy csepp kloroformmal elegyítjük. A keverék titrálása szerint 1,5 x 10⁵rekombinánst tartalmazó tárat állítottunk elő.

4· Az M. hyopneumoniae expressziós tár alkalmazása

A kapott fágot lambda-dil segítségével hígítjuk, és E. coli Y1088 törzsön adszorbeáljuk (Young R. és Davis R.: Science, 222, 778-782 (1983)). A tárat ezen a törzsön alkalmazva biztosítjuk, hogy a β-galaktozidáz gén ne fejeződjön ki, ennek következtében az E. coli gazdasejtre esetleg káros kódoló szekvenciát tartalmazó fágok nem fejeződnek ki, és nem vesznek el a tárból. A tár alkalmazásával ml-enként 6 x 10⁹ fágot tartalmazó törzset kapunk.

II. példa

Általános eljárás

A. Lambda-qtll:M.hvopneumoniae expressziós tár antitest vizsgálata

A lambda-gtll:M.hyopneumoniae expressziós tárat 150 mm-es lemezre számolva 5000-20000 fág sűrűséggel lemezekre visszük gazdaként E. coli Y1090 törzset alkalmazva (Young and Davis: Science, 222, 778-782 (1983)). A lemezeket 4 órán keresztül 37 °C vagy 42 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd nitrocellulóz szűrővel (BA-85, Schleicher and Schuell) letakarjuk, amit előzetesen 10 mmól/1 IPTG-ben áztattunk, és levegőn szárítottunk. Egy éjszakán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd a szűrőket háromszor 10 percen keresztül TBS-ben (10 mmól/1 trisz-HCl, pH - 8,0, 150 mmól/1 NaCl) mossuk. A nem-specifikus fehérjekötő helyek blokkolása érdekében a szűrőt 60 percen keresztül 2 % borjuszérum albuminnal (V. frakció, Miles Laboratories, Elkhart, Indiana, USA) kiegészített TBS-ben inkubáljuk. A szűrőket ezután egyenként vagy párokban 2 órán keresztül 10-20 ml primer antitesttel (például immun sertés szérummal, hiperímmun nyúl antimikoplazma szérummal, egér monoklonális antimikoplazma antitesttel) inkubáljuk általában 2 % borjuszérum albuminnal (BSA) kiegészített TBS-sel 1:200, vagy monoklonális antitest esetében 1:500 arányban hígítva. A szűrőket háromszor 10 percen keresztül 0,1 % ΝΡ-40-nel (Sigma) kiegészített TBS-sel mossuk, majd egyenként vagy párokban 60 percen keresztül 10-20 ml szekunder antitesttel (például peroxidáz-konjugált kecske antinyul IgG antitesttel, Cappel Laboratories) inkubáljuk 2 % BSA-val kiegészített TBS-sel 1:500 arányban hígítva. A szűrőket háromszor 10 percen keresztül TBS-ben mossuk, majd 200 ml TBS, 2,5 ml 3 %-os hidrogén-peroxid oldat és 40 ml 3 mg/ml koncentrációjú, metanolos 4-klór-l-naftol oldat elegyében színezzük. A színezés után a szűrőket vízbe merítjük. A pozitív színezésű plakkokat antitesttel a fent leirt módon több lépésben tisztítjuk.

B. A nitrocellulóz membránon immobilizált fehérjéhez kötött antitestek eluciója

Ha a fehérjéket nitrocellulóz membránon immobilizáljuk, például a poliakrilamid gélen elválasztott fehérjék Western folt transzferjével vagy az agar lemezről vett fág plakkok replikálásával, lehetővé válik az immobilizált fehérjéket specifikusan felismerő antitestek megkötése. Azok az antitestek, amelyek nem ismerik fel specifikus módon az immobilizált fehérjéket, oldatban maradnak, és könnyen kimoshatok, és csak a specifikusan kötött antitestek maradnak vissza.

A megkötött antitestek eluálásához a szűrőt alacsony pH-ju pufferben (5 mmól/1 glicin, pH = 2,3, 0,5 mól/1 nátrium-klorid, 0,5 tömeg% Tween 20 és 0,01 tömeg% BSA) duzzasztjuk, amely disszociálja az antitest-antigén komplexet. Ha az eluált antitestet azonnal semlegesítjük, vagyis 50 mmól/1 Trisz-HCl-lel mossuk, megőrzik teljes aktivitásukat, és különböző analitikai célokra alkalmazhatók.

1. Az inszert kiónnak megfelelő Mycoplasma fehérje meghatározása

A tisztított rekombináns klón lakk replikációiból eluált antitestet alkalmazzuk a kiónnak megfelelő Mycoplasma fehérje meghatározásához. A rekombináns klón plakk replikációjához kötött antitest eluálásával és a Mycoplasma fehérjék Western folt vizsgálatánál mintaként történő alkalmazásával lehetővé válik annak meghatározása, hogy a rekombináns klón milyen fehérjét kódol.

Egy adott tisztított rekombináns kiónból származó tízezer plakkból ötezret 100 mm-es lemezre viszünk, és a plakkot felszívjuk. A felszívó szűrőt háromszor 10 percen keresztül TBS-ben mossuk, és a nem-specifikusan kötött fehérjéket TBS + 10 % BSA elegyben 1 órán keresztül inkubálva blokkoljuk. A szűrőt háromszor 10 percen keresztül TBS-ben mossuk. Ezután 5 mm széles csikókat vágunk a szürőlemezből, és a csikhoz poliklonális anti Mycoplasma szérumot • · · »

- 42 kötünk. Ezután mossuk, és a fent leirt módon eluáljuk. Az eluált antitesteket alkalmazzuk mintaként a Mycoplasma fehérjék Western folt vizsgálatában.

III. példa

Fúziós fehérjék kifejezésére alkalmas plazmid vektorok

Az expressziós tárban egy sor antigén aktivitású M. hyopneumoniae rekombináns fág kiónt azonosítunk. Mivel a lambda-gtll lizogén korlátozott mennyiségű fúziós fehérjét termel, olyan plazmid expressziós vektort szerkesztünk, amely mg mennyiségekben termeli a fúziós fehérjét.

A. PSEV4 plazmid

A pLG2 plazmid (Guarente L.: Cell, 20, 543-553 (1980)) olyan pBR322 származék, amely a lambda-gtll-hez hasonlóan lac operátort és promoter szekvenciát tartalmaz a vad-tipusu B-galaktozidáz gén mellett, ez utóbbi egyetlen EcoRI helyet hordoz a gén 3' vége közelében. Emellett, a pLG2 plazmid lac represszor gént tartalmaz. Ha a lambda-gtll M. hyopneumoniae DNS inszertjét a fenti vektor EcoRI helyére visszük be, olyan fúziós fehérjét kapunk, amely azonos a tágban előzetesen azonosított fehérjével.

A pLG2 plazmidból a kifejezés előtt eltávolítunk egy extra EcoRI helyet. A pLG2 plazmidot EcoRI restrikciós endonukleázzal részlegesen emésztve linearizáljuk a plazmidot. A · · ·

- 43 plazmid DNS-t ezután preparativ agaróz gélre visszük, és a lineáris méretnek megfelelő DNS sávot eluáljuk a gélről. Az eluált DNS-t 0,3 mól/1 nátrium-acetát koncentráció beállításával, és 2,5 térfogatrész etanol hozzáadásával kicsapjuk. A DNS-t centrifugálással pelletáljuk, és a pelletet TE pufferben szuszpendáljuk. Az E. coli DNS polimeráz I Klenow fragmensét a DNS-sel keverjük dATP és dTTP jelenlétében, és ezzel feltöltjük az EcoRI tapadó végeket. Ezután 70 °C hőmérsékleten 10 percen keresztül inaktiváljuk, majd T4 DNS ligázt (P.L. Biochemicals) adunk hozzá, és 4 °C hőmérsékleten 16 órán keresztül inkubáljuk. A ligáit DNS-t E. coli AMA1004 törzsbe (Casadaban M. és munkatársai: Methods in Enzymology, 100, 293 (1983)) transzforrnáÍjuk.

A transzformánsokat ampicillin lemezeken kromagén szubsztrátum jelenlétében β-galaktozidáz aktivitásra (X-GAL) szelektáljuk. A β-galaktozidáz aktivitással rendelkező transzformánsokat a DNS EcoRI-gyel végzett hasításával vizsgáljuk. A transzformánsok közül azonosítjuk és jellemezzük a pSEV4 plazmidot, amely csak egyetlen EcoRI helyet tartalmaz a β-galaktozidáz gén karboxi-terminális vége közelében.

A pSEV4 plazmid a β-galaktozidáz gén karboxi-terminális vége közelében lévő egyetlen EcoRI hely mellett vad-tipusu lac operátort, promotert és represszort tartalmaz. Az IPTG 60 percen keresztül végzett indukálásával a B-galaktozidáz aktivitás 300-szorosára növelhető. A pSEV4 plazmidot tartalmazó indukálatlan sejtek mintegy 1000 egység/mg ossz

«

- 44 celluláris fehérjét termelnek, mig az IPTG-vel indukált sejtek fehérje termelése 300 000 egység/mg. Az indukált és az indukálatlan sejtek fehérje gél analízise szintén alátámasztja az indukált sejtek fokozott β-galaktozidáz termelését. Az uj pSEV4 plazmidot alkalmazzuk az M. hyopneumoniae antigének fúziós fehérjeként történő kifejezéséhez.

B. PSEV6 plazmid

A pSEV4 plazmid utódjának előállításához a lambda-gtll DNS inszertjének polarizált kazetta szubklónozását közvetlenül egy plazmid kifejező vektorba visszük be. Mivel az EcoRI inszert a pSEV4 bármely orientációjában szubklónozható, minden pSEV4 szubklónt meg kell vizsgálni antigén aktivitására. A pSEV6 plazmidot alkalmazó polarizált szubklónozás feleslegessé teszi az ilyen extra analízist.

A hasítási térkép szerint a pSEV4 plazmid öt restrikciós endonukleáz hellyel rendelkezik az lac operonban a B-galaktozidáz gén egyetlen EcoRI helyétől 5' irányba. A helyek közül három egyedi, és kettő egyedivé tehető a lac I gén és a pBR322-ből származó amp^r gén közötti felesleges DNS kiiktatásával. Az EcoRI helytől 3' irányban csak egy használható restrikciós helyet, egy Ncol helyet találtunk, ezért ebbe a szakaszba kémiailag szintetizált polilinker segítségével további restrikciós enzimhelyeket viszünk be.

A pSEV6 plazmidot két lépésben állítjuk elő. Először a pSEV4 plazmidot a felesleges DNS eliminálásával mintegy 5700 bp-vel megrövidítjük. A pSEV4 plazmidot Sphl restrikciós endonukleázzal hasítjuk, és az enzimet 70 °C hőmérsékleten 10 percen keresztül melegítve inaktiváljuk. A DNS-t ezután AatlI enzimmel részlegesen emésztjük, és a kapott fragmenseket preparativ agaróz gél elektroforézissei szétválasztjuk. A 7620 bp fragmenst kivágjuk a gélről, és elektroeluáljuk.

Az elektroeluált DNS-t 0,3 mól/1 koncentrációjú nátrium-acetát oldatból 2,5 térfogatrész etanol hozzáadásával, majd -70 °C hőmérsékleten 30 percen keresztül inkubálva kicsapjuk. A DNS-t Brinkman mikrocentrifugán 15 percen keresztül pelletáljuk, és a pelletet TE pufferben szuszpendáljuk. Az AatlI enzimmel végzett emésztés során keletkező tapadó végeket T4 DNS polímeráz (New England Biolabs) segítségével tompa végekké alakítjuk. A T4 DNS polimerázt melegítéssel inaktiváljuk, majd T4 DNS ligázzal (P.L. Biochemicals) ligáljuk a DNS fragmens tompa végeit. A ligáit DNS-t E. coli AMA1004 törzsbe transzforrnáÍjuk. A lac pozitív transzformánsokat a 7620 bp plazmidra vizsgáljuk. Az azonosítás és jellemzés szerint egy plazmid rendelkezik a kívánt szerkezettel, ez a plazmid a pSEV5 jelet kapta.

A pSEV5 plazmid DNS-ét a szokásos módon tisztítjuk, és ezután Ncol restrikciós endonukleázzal hasítjuk. Az alkalmazott enzim a β-galaktozidáz géntől 3' irányban található egyedi helyet hasítja. Kémiai utón olyan oligonukleotid adapter molekulát szintetizálunk, amely regenerálja az Ncol helyet, és további BglII és KpnI hellyel rendelkezik. Az adapter molekula szekvenciája a következő:

' -GTAAGGAGGAATAACATATGGAATTCGAG-3 ' ' -ACGTCATTCCTCCTTATTGTATACCTTAAGCTCCTAG-5 '

Ezt az oligonukleotidot T4 DNS ligáz (P.L. Biochemicals) segítségével az Ncol enzimmel hasított pSEV5 plazmiddal ligáljuk. A ligáit DNS-t E. coli AMA1004 törzsbe transzformáljuk. A kapott lac pozitív transzformánsok DNS-ét az egyedi KpnI és Ncol helyek jelenlétére vizsgáljuk. A vizsgálat során egy plazmid azonosítható, amely az összes kívánt szekvenciával rendelkezik. A kapott pSEV6 plazmidot alkalmazzuk a különböző antigén aktivitású fúziós fehérjék kifejezésére.

IV. példa

Rekombináns fúziós fehérjék tisztítása

A β-galaktozidáz::M.hyopneumoniae antigén fúziós fehérjéket β-galaktozidázra vonatkozó szubsztrát analóg affinitás oszlopon vagy a fehérje tisztítás klasszikus módszereivel tisztítjuk.

A. Extraktum előállítása

Két liter Luria tápközeget (pH = 7,5), amely 50 gg/ml ampicillint tartalmaz, 10-20 ml egy éjszakás E. coli AMA1004 tenyészettel inokulálunk, amely a rekombináns plazmidok egyikét tartalmazza. A sejteket 37 °C hőmérsékleten a »4 4 · 4 · • · · • 4 >·· közepes logaritmikus fázisig (Αθοθ = 0,2) hagyjuk növekedni. A fúziós fehérje képzésének kiváltásához 1 mmól/1 végkoncentrációig izoporpil-tio-galaktozidot (IPTG) adunk az elegyhez. A sejteket 2 órán keresztül hagyjuk növekedni, majd 5000 g értéken 4 °C hőmérsékleten 15 percen keresztül centrifugálva begyüjtjük. Az ezt követő műveleteket 4 °C hőmérsékleten végezzük.

A sejteket 20 ml törőpufferben (50 mmól/1 Trisz-HCl, pH = 7,5, 250 mmól/1 nátrium-klorid, 10 mmól/1 magnézium-klorid, 5 % glicerol, 1 mmól/1 fenil-metil-szulfonil-fluorid (PMSF)) 4 °C hőmérsékleten szuszpendáljuk, és 5000 g értéken 15 percen keresztül ismét centrifugáljuk. A sejteket 20-40 ml törő pufferben szuszpendáljuk. A sejteket ezen a ponton megfagyasztjuk, és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

A fagyasztás nélküli vagy felolvasztott sejteket francia présben (Aminco) 13,8 x 10⁷ Pa nyomáson roncsoljuk. A sejt törmeléket 3000 g értéken 30 percen keresztül végzett centrifugálással eltávolítjuk. Az extraktum további tisztítását 100 000 g értéken 30 percen keresztül végzett ultracentrifugálással végezzük. A fúziós fehérjét 20-40 % telítettségű ammónium-szulfát koncentráció beállításával kicsapjuk. Az ammónium-szulfát szükséges koncentrációját megfelelő előkisérletekkel (Heppel L.: Methods in Enzymology, 1, 570-576 (1955)) az egyedi fehérje vonatkozásában kell beállítani.

A csapadékos oldatot 1 órán keresztül kevertetjük, majd a csapadékot 30 000 g értéken 15 percen keresztül végzett centrifugálással eltávolítjuk. A pelletet 10-15 ml start

pufferben (50 mmól/1 Trisz-HCl, pH = 7,5, 250 mmól/1 nátrium-klorid, 10 mmól/1 magnézium-klorid, 1 mmól/1 ditiotreitol (DTT) és 0,1 tömeg% Triton X-100) oldjuk, és egy éjszakán keresztül 500 ml start pufferrel szemben dializáljuk.

1. Affinitás tisztítási eljárás

A β-galaktozidáz affinitás oszloppal végzett tisztítást Steers és Cuatrecasas: Methods in Enzymology, 34., 350-358 (1974) ismerteti. Az affinitás gyantát (p-amino-fenil-β-D-tiogalakto-piranozid-agaróz, Sigma) 1,5 cm x 15 cm méretű oszlopba töltjük. Az oszlopot 10 térfogatrész start pufferrel (50 mmól/1 Trisz-HCl, pH = 7,5, 250 mmól/1 nátrium-klorid, 10 mmól/1 magnézium-klorid, 1,0 mmól/1 ditiotreitol (DTT) és 0,1 Triton X-100) mossuk. Az oszlop használat után nagy mennyiségű eluciós pufferrel (0,1 mól/1 nátrium-borát, pH = 10,0, 250 mmól/1 nátrium-klorid, és 1 mmól/1 DTT) vagy 6 mól/1 guanidin-hidroklorid 50 mmól/1 Trisz-HCl-ben (pH = 7,5) felvett oldatával végzett mosással regenerálható. Mosás után az oszlopot 10 térfogatrész start pufferrel egyenlítjük ki.

Az affinitás kromatografáláshoz a dializált anyagot az előre kiegyensúlyozott affinitás oszlopra visszük 0,2 ml/perc áramlási sebességgel. A minta felvitele után az oszlopot 15 ml start pufferrel mossuk azonos áramlási sebességgel, majd 30 ml start pufferrel mossuk mintegy 0,5 • * • · · · • · • · · · · ml/perc áramlási sebességgel, végül 180 ml start pufferrel mossuk mintegy 1 ml/perc áramlási sebességgel. Ezután az oszlopot 120 ml Triton nélküli start pufferrel mossuk azonos áramlási sebességgel.

Az abszorbeált fehérjét 0,1 mól/1 nátrium-borát (pH = = 10,0), 250 mmól/1 nátrium-klorid, és 1 mmól/1 DTT elegyével mossuk 120 ml térfogatban mintegy 1 ml/perc áramlási sebességgel. A kívánt fehérjét tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és kívánt esetben Amicon ultraszürő eszközzel (Model 8050), amely YM-30 membránt tartalmaz, mintegy 10 ml térfogatra bekoncentráljuk.

2. Ultracentrifugás tisztítás

Néhány fúziós fehérje (például pSEV4::CH2-13) esetében eg másik tisztítási eljárás is alkalmazható, amelynek során szintén dializált fehérjét kapunk. A dializált anyagot 100 000 g értéken 30 percen keresztül ultracentrifugáljuk. A fúziós fehérjét tartalmazó pelletet kis térfogatrész dialízis pufferben (50 mmól/1 Trisz-HCl, pH = 7,5, 250 mmól/1 nátrium-klorid, 10 mmól/1 magnézium-klorid, 1,0 mmól/1 ditio-treitol (DTT) és 0,1 mól/1 Triton X-100) oldjuk. A kapott anyag tisztasága SDS poliakrilamid elektroforézis szerint nem éri el az affinitás oszlopon kapott anyag tisztaságát.

·«

3. Analízis

A kapott anyagot a BIO-RAD (Richmond, California, USA) fehérje vizsgálati módszerével a gyártó előírásai szerint analizáljuk. Emellett SDS poliakrilamid elektroforézist végzünk. A gélt a fehérje megfestésével vagy Western folt analízissel tesszük láthatóvá. A fehérje festést általában ezüst festékkel (Wray W.P. és munkatársai: Anal. Biochem. 118, 197-203 (1981)) vagy BIO-RAD fehérje festékkel végezzük. A Western folt analízist Remart J. és munkatársai: PNAS (USA), 76. 3116 (1979) módszerével végezzük.

A Western folt analízis során az oldott fehérje sávokat elektroforetikusan nitrocellulózra visszük át. A nitrocellulóz papirt BSA-val blokkoljuk, és specifikus antitesttel (anti-B-galaktozidáz vagy anti-mikoplazma szérum segítségével) vizsgáljuk. Mosás után a foltokat a megfelelő peroxidázzal konjugált második antitesttel kezeljük, majd a szint peroxidázzal katalizált reakcióval kifejlesztjük.

V. példa

A teljes M. hyopneumoniae gén fúziós fehérje kiónjának előállítása

A rekombináns M. hyopneumoniae kiónokat az adott polipeptidet kódoló szakasznak csak egy részét tartalmazó különböző anti-mikoplazma szérummal reagáltatjuk, mivel feltétel, hogy az inszert szekvencia a lambda-gtl1-ben a B- 51 -galaktozidáz gén keretén belül helyezkedjen el, és csak korlátozott számú kiónt vizsgáljuk. Bizonyos esetekben azonban az immun válasz maximalizálása vagy a válasz módosítása érdekében szükség van arra, hogy egy adott antigén M. hyopneumoniae polipeptid vonatkozásában a teljes kódoló szekvenciát klónozzuk. A teljes hosszúságú fragmenseket tartalmazó kiónok izolálását az alábbiakban ismertetjük.

A fent említett lambda-gtll expressziós tárat egyszerű genom tárnak is tekinthetjük, ha nincs arra szükség, hogy az M. hyopneumoniae inszert szegmenseit fúziós fehérje formájában fejezzük ki. Néhány klón az adott fehérjére vonatkozó teljes kódoló szakaszt tartalmazza, bár nem feltétlenül a B-galaktozidáz kifejező rendszer keretén belül.

Ezek a kiónok az antitest módszerrel feltárt és adott mikoplazma fehérjére vonatkozó klónokból származó mintákkal végzett DNS hibridizálással kimutathatók. Az ilyen kiónok inszert fragmensébe nick transzlációval E. coli DNS polimeráz alkalmazásával ³²P jelölésű dezoxinukleotidokat építünk be. A jelölt DNS-t ezután radioaktív mintaként alkalmazzuk a rekombináns lambda-gtll tárból a homológ M. hyopneumoniae szekvencia kiválasztásához. A rekombináns tárból ilymódon kiválasztott fágokat lac formájában tisztítjuk, a DNS-t előállítjuk, és az M. hyopneumoniae specifikus inszert hasítási térképét különböző restrikciós endonukleázokkal felvesszük. A kapott térképet a kezdeti klón hasonló térképével összehasonlítva ellenőrizzük az uj genom fág azonosságát.

• ·

- 52 Mivel a prokariota génekben nincsenek intronok, a kódolt fehérje méretéből meghatározható, hogy a jelölt DNS valamelyik oldalán milyen hosszú DNS szükséges a teljes gén felöleléséhez. A teljes gén nem foglalható be egyetlen kiónba, szakember számára mégis lehetséges a teljes gén előállítása. Ez megvalósítható például úgy, hogy végigsétálunk” az M. hyopneumoniae genom mentén, amelynek során izoláljuk az M. hyopneumoniae genom DNS-t farkazó fágokat (Bender E. és munkatársai: J. Mól. Bioi. 168, 17-33 (1983)). A fenti eljárással a teljes C fehérje gént előállítottuk (lásd a VIII. példát).

VI. példa

A felületi fehérjéknek megfelelő kiónok azonosítása

A Mycoplasma sejt felületén elhelyezkedő fehérjék proteázzal, igy tripszinnel emészthetők, ha a teljes sértetlen sejtet enyhe körülmények között az enzimmel kezeljük (Künkért M., Herrmann R. és Schaller H. : Infection and Immunity, 49, 329-335 (1985)). Ez a technika az antitest kiónból történő eluálásával kombinálva lehetővé teszi annak gyors eldöntését, hogy egy adott klón megfelel-e valamely tripszin-érzékeny felületi fehérjének. A tripszinezett és nem-tripszinezett mikoplazma sejtekből nyert fehérjéket szomszédos sávokra helyezve SDS poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztjuk. A kapott foltokat Western folt eljárással nitrocellulóz membránra visszük. Ezután poli• ♦

- 53 klonális szérumból nyert antitesttel vizsgáljuk, amit egy specifikus kiónból a II-B. példában ismertetett affinitás eluációs technikával tisztítunk.

A klón Western folt vizsgálata során a specifikus mikoplazma fehérjét nem-tripszinezett sejtből nyert fehérjével kötött antitesttel festjük meg. Ha a fehérje érzékeny a tripszinre, akkor a tripszinezett sejtből származó azonos fehérjének megfelelő folt üres marad, mig a tripszinre nem érzékeny sáv a kezeletlen sejtben elszineződik. Mivel az A, B, C, D és E fehérjék a tripszinre érzékenyek, feltételezhető, hogy ezek felületi fehérjék.

VII. példa

A C fehérje egy részét kódoló R69 klón DNS-ének szekvenálása

A rekombináns lambda-gtll R69 klón DNS-e a C fehérje egy részét kódolja. A kiónban található M. hyopneumoniae DNS inszertet szekvenáltuk. A kiónban található inszertet EcoRl segítségével kimetsszük, és M13mpl8 egyszálu szekvenáló vektorba szubklónozzuk (a vektor és a szekvenáló eljárás vonatkozásában lásd a VIII-B. példában megadott irodalmi forrást). Az inszertet mindkét orientációban hordozó szubklónokat izoláljuk, és a szekvenciát mindkét irányban meghatározzuk.

Az R69 inszert 5'---3' orientációját és a megfelelő leolvasó keretet közvetlenül a kétszálu lambda-gtll R69 klón « · *

- 54 (Chen és Seeburg: DNA, 4, 165 (1985)) lambda-gtll egyirányú és reverz primerek (New England Biolabs) alkalmazásával végzett szekvenálásával határozzuk meg.

A kiónban található DNS inszert 522 nukleotid hosszúságú, és 173 aminosavat kódol. A DNS szekvenciát és a lefordított aminosav szekvenciát, amely a C fehérje egy részét képezi, az 1. ábrán adjuk meg. Ez a DNS szekvencia teljes egészében a C fehérje kódoló szekvenciájában helyezkedik el, a 455. számú nukleotidnál indul, és a 976. számú nukleotidig tart, ami a 4. ábrán látható teljes génben található meg.

VIII. példa

A pUC18::28C2 klón izolálása és a C fehérje gén szekvenálása

A. A pUC18::28C2 klón izolálása

1. pUC qenomtár előállítása

A pUC M. hyopneumoniae genomtár előállításával olyan rekombináns tárat kapunk, amely nagyobb inszert fragmenseket tartalmaz, mint a lambda-gtll tár (I. példa), igy a teljes C fehérje egyetlen kiónban elfér.

A Mycoplasma hyopneumoniae genom DNS-t Sau3a restrikciós endonukleázzal részlegesen emésztjük, és 35 ml 10-40 tömeg% szaccharóz gradiensen 1 mól/1 nátrium-klorid, 0,02 mól/1

Trisz (pH =8) és 0,005 mól/1 EDTA elegyében méret szerint frakciónáljuk. Az emésztett DNS mintát a gradiens tetejére rétegezzük, és 100 000 g értéken 24 órán keresztül centrifugáljuk. 1 ml frakciót gyűjtünk a gradiens aljáról és a szétválasztott frakciók mintáit 0,5 tömeg%-os agaróz gélen TAE pufferben (0,04 mól/1 Trisz-acetát és 0,001 mól/1 EDTA) DNS méret standard mellett elektroforézissei futtatjuk, és az egyes frakciókban található DNS fragmensek mérethatárainak meghatározásához etidium-bromiddal megfestjük. A 8-12 kb DNS fragmenseket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, bekoncentráljuk, és TE8 pufferrel (0,01 mól/1 Trisz, 0,001 mól/1 EDTA, pH = 8) szemben dializáljuk.

A pUC18 vektort BamHI restrikciós endonukleázzal teljesen emésztjük, majd 1 pmól vektorra számolva 0,01 egység borjubél foszfatáz enzimmel (Boehringer, Mannheim) kétszer 30 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten CIP pufferben (1 mmól/1 cink-klorid, 1 mmól/1 magnézium-klorid és 10 mmól/1 Trisz-HCl, pH = 8,3) defoszforilezzük. Ezután fenollal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és TE8 pufferben szuszpendáljuk.

450 ng méret szerint szelektált genom fragmenst 50 ng BamHI-gyel emésztett pUC18 vektorral ligálunk 20 μΐ ligáló pufferben (0,066 mól/1 trisz, pH = 7,5, 0,005 mól/1 magnéz ium-klorid, 0,005 mól/1 ditiotreitol, 0,001 mól/1 adenozin-trifoszfát) 5 egység T4 DNS ligáz (Pharmacia) jelenlétében 5 órán keresztül szobahőmérsékleten. DH5a sejteket (Hanahan: J. Mól. Bioi. 166. 557 (1987) a ligáló eleggyel transzformálunk, és 50 Mg/ml ampicillint, 0,001 mól/1 IPTG-t (izopropil-tio-B-D-galaktozid) és 40 ^g/ml X-GAL-t (5-bróm-4-klór-3-indolil-B-D-galaktozid) tartalmazó Luria agar lemezre visszük. A lemezeket egy éjszakán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A fehér szinü telepeket friss Luria agar ampicillin lemezekre visszük, lemezenként 48 rácsos elrendezésben, és 37 °C hőmérsékleten növesztjük. Az 1700 független transzformánsból 36 sorozat választható ki. Mindegyik sorozatot több nitrocellulóz lemezre viszünk egy 48 fogú villás eszköz segítségével, és egy éjszakán keresztül 37 °C hőmérsékleten növesztjük.

A növekvő telepeket tartalmazó nitrocellulóz lemezeket DNS hibridizálással vizsgáljuk. A telepeket roncsoljuk, és a DNS-t a lemezeket 0,5 mól/1 nátrium-hidroxid és 1,5 mól/1 nátrium-klorid elegyében 0,5-1 percen keresztül bemeritve denaturáljuk, majd 1,5 mól/1 nátrium-klorid és 0,5 mól/1 Trisz-HCl (pH = 7,4) elegyében 1-3 percen keresztül semlegesítjük, majd 2 X SSC-vel átöblitjük. A lemezeken Whatman 3MM papír lapok között foltvizsgálatot végzünk, majd 2 órán kersztül 80 °C hőmérsékleten kezeljük. A lemezeket ezután a további vizsgálatig szobahőmérsékleten tároljuk.

2. A PUC18 tár vizsgálata a C fehérje gén jelenlétére

32_P jelölésű hibridizációs mintát készítünk az R69 kiónban lévő M. hyopneumoniae DNS inszertből. Az inszert a pSEV6::R69 kiónból nyerhető, amit a lambda-gtll-R69 inszert • »

- 57 pSEV6 plazmidba történő kazetta szubklónozásával állítunk elő (II-B. példa). A 0,6 kb inszert fragmens előállításához a pSEV6::R69 plazmid DNS-t EcoRI restrikciós endonukleázzal emésztjük, az inszertet felszabadítjuk, agaróz gél elektroforézissel (0,7 tömeg% agaróz, TAE puffér, 0,5 Mg/ml etidium-bromidot tartalmazó gél és puffer, 30 V, 3 óra) elválasztjuk. Az inszert sávját hosszú hullámhosszú UV fénnyel tesszük láthatóvá, közvetlenül a sáv alatt szikével bemetszést végzünk, és ebbe egy kis darab Whatman NA50 papirt helyezünk. Az elektroforézis folytatása során az inszert fragmens az NA50 papírba vándorol, és azon megkötődik. A papirt eltávolítjuk, és NET pufferrel (20 mmól/1 Trisz, pH = =8, 0,1 mmól/1 EDTA) mossuk. A fragmenst a papírról 1,0 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó NET pufferrel eluáljuk, butanollal extraháljuk, etanolban kicsapjuk és TE pufferben szuszpendáljuk. A tisztított fragmenst nick transzlációval ³²P-a dC segítségével (BIO-RAD nick transzlációs készlet) jelöljük a gyártó előírásai szerint. A jelölt fragmenst BIO-RAD P30 gyantán TE pufferben szűrve elválasztjuk a be nem épült nukleotidoktól.

A hibridizációs elegy összetétele 50 tömeg% formamid,

X SSPE, 1 tömeg% SDS, 0,1 tömeg% nátrium-pirofoszfát, 0,15 mg/ml tRNS, és 0,0125 mg/ml ultrahanggal besugárzott lazac sperma DNS. Ehhez adunk 400 000 dpm/ml jelölt mintát, amit előzetesen forróvizes fürdőn 5 percen keresztül denaturálunk, majd lehütünk. Ezzel az eleggyel mind a 36 rácsos mintázatot vizsgáljuk. A hibridizálást rázó inkubátorban °C hőmérsékleten 16 órán keresztül végezzük. A szürőlemezket ezután négyszer 15 percen keresztül 0,1 X SSPE és 1 tömeg% SDS elegyében 65 °C hőmérsékleten mossuk, szárítjuk, és Kodak XAR-5 röntgensugár filmen -70 °C hőmérsékleten DuPont Cronex Lightning Plus Intensifying Screen alkalmazásával autoradiográfiásan vizsgáljuk. A pozitív sötét jelek helyét a filmen megjelöljük, és és a megfelelő kiónokat kiválogatjuk a mester lemezekről. Ezeket egyetlen telep formájában elszélesztjük, és minden pozitív kiónból három telepet a fenti szűrő hibridizációs eljárással vizsgálva ellenőrizzük az eredményeket. Az ellenőrző vizsgálat után több tisztított pozitig kiónt (pUC18::6E6, pUC18::9Bl, pUC18::30C6, pUC18::19A3, pUC18::16H2, pUC18::28C2) folyékony közegben (50 jxg/ml ampicillinnel kiegészített Pluria közeg) növesztjük, és a DNS-t mini preparáló módszerrel (Holmes és Quigley: Anal. Biochem. 144, 193 (1981)) izoláljuk. A kiónok hasítási térképét felvesszük, egymáshoz hasonlítjuk, és meghatározzuk a kiónok közötti átfedést. A restrikciós analízishez alkalazott gélt nitrocellulózra visszük, és R69 inszert mintával Southern folt eljárással (Southern: J. Mól. Bioi. 98, 503 (1975)) vizsgáljuk, és meghatározzuk az E69 minta szegmens elhelyezkedését a nagyméretű pUC18 kiónokban. A kiónok egyike, a pUC18:28C2 alkalmas arra, hogy a 85 kd fehérje teljes génjét hordozza, mivel az R69 minta szegmens mindkét oldalán több, mint 2,5 kb DNS-t tartalmaz (a teljes gént 2,4 kb-nél rövidebb DNS kódolja). A fenti klón hasítási térképét a 9. ábra mutatja.

• · · « « · « • · · · · ··· ♦··

- 59 A pUC18::28C2 kiónt használjuk a gén szekvenálásához, és a specifikus nukleotidok megváltoztatásához szükséges helyspecifikus in vitro mutációhoz igényelt szubklónok előállításához .

B. A C fehérje gén DNS szekvenálása

A pUC18::28C2 genom klón mintegy 4500 bp hosszúságú szakaszát, amely alkalmas a C fehérje teljes génjének hordozására, szekvenáljuk. A szekvenálási eljárást a 9. ábra mutatja. A pUC18::28C2 megfelelő restrikciós enzimekkel előállított különböző fragmenseit (például KpnI/Hpal, Hpal/Hpal, Hpal/HindlII, Hpal/PstI, HindlII/HindlII, Hpal/BglII, HindlII/PstI) M13mpl8 vagy M13mpl9 fág vektorokba (Messing és munkatársai: Gene, 26, 101-106 (1983)) szubklónozzuk, és a lánclezáró DNS szekvenáláshoz specifikusan kifejlesztett enzimszekvenáz segítségével (Tábor és Richardson: PNAS, 84, 4767-4771 (1987)) szekvenáljuk. A DNS szekvenáz szekvenáló készletet (United States Biochemical Corp., USA) a gyártó előírásai szerint alkalmazzuk. A reakciókat 6 tömeg%-os akrilamid puffer gradiens gélen (Biggin és munkatársai: PNAS, 80, 3963-3965 (1983)) analizáljuk. A DNS szekvenciákat Pustell és Kafatos algoritmusával (Pustell és munkatársai: Nucleic Acid Rés., 12, 643-655 (1984)) az International Biotechnologies Inc. (New Haven, Connecticut, USA) software-ének felhasználásával analizáljuk. A C fehérje gén kódoló szakaszának DNS szekvenciáját mindkét szálon

meghatározzuk. A DNS szekvenáló reakció során primerként alkalmazhatók az M13 univerzális primer vagy szintetikus oligonukleotidok (Applied Biosystem DNA Sequencer).

C. A természetes C fehérje aminoterminális szekvenálása

A gélen tisztított C fehérjét az NH4HCO3 pufferben (X-B. példa) közvetlenül egy üvegszürőre visszük, és argon gáz alatt szárítva eltávolítjuk az NI^HCC^-at. A szekvenálás eredménye szerint a fenti minta aminoterminális szekvenciája QQQEANSTNSSP, ami összhangban van a pUC18::28C2 inszert 1801 számú nukleotidjánál kezdődő lefordított DNS szekvenciájával, amely a gén 5' végét határozza meg.

D. A C fehérje peptidjeinek aminosav szekvenálása

1. Általános stratégia

Mivel a 85 kd gén DNS szekvenciájának legnagyobb része már ismert (VIII-B. példa), a teljes aminosav szekvencia meghatározása nem szükséges. Az aminosav szekvenciából meg kell határozni azonban egy olyan szakaszt, amely lehetővé teszi a DNS szekvencia megfelelő leolvasó keretének meghatározását, és igy a kódoló szekvenciában a kereten belül található UGA kodonok helyének gyors meghatározását.

« · « « * « · * · · • « « • ·· ···

2. A C fehérje tisztítása az aminosav szekvenálás előkészítéséhez

A nagy tisztaságú C fehérjét az ioncserés oszlop kromatográfia és a preparativ SDS-PAGE eljárás kombinálásával állítjuk elő. A 7S extraktumból (X-A3. példa) kiindulva a C fehérjét Pharmacia Mono Q ioncserélő oszlopon a X-B2. példában ismertetett CHAPS módszerrel részlegesen tisztítjuk. A C fehérjét tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és preparativ gélen tovább tisztítjuk. Ezt lényegében a X-B4. példában leirt módon végezzük azzal a különbséggel, hogy a mintát a gélre történő felvitel előtt 2,5 tömeg% 2-merkapto-etanollal redukáljuk. Az endoproteáz emésztéshez alkalmazott fehérjét a gélszeletekről 0,5 X futtató pufferben (0,0125 mól/1 Trisz, 0,096 mól/1 glicin és 0,05 tömeg% SDS) a X-B4. példában leirt módon eluáljuk. A közvetlen aminoterminális szekvenáláshoz (VIII-C. példa) a gél szeleteteket 0,05 mól/1 NH4HOC3 és 0,1 tömeg% SDS elegyében áztatjuk, majd ISCO mintakoncentráló edénybe helyezzük, és ugyanezzel a pufferrel 50 V értéken 5 órán keresztül eluáljuk. A dekoncentrált mintát ezután 0,01 mól/1 NH4HCO3 és 0,05 tömeg% SDS elegyével 50-szeresére hígítjuk, majd ISCO mintakoncentráló edényben a fenti pufferrel dekoncentráljuk (50 V, 5 óra) .

«· a · • · * · · «· • · · · · · · • · · · ··· ·· ··· «*·

3. Peptid fraqmensek előállítása és tisztítása

A lizinnél történő hasításhoz a fehérjét 2 tömeg% koncentrációjú Lys-C endoproteináz enzimmel (Boehringer-Mannheim) hasítjuk 0,1 mól/1 Trisz (pH = 8,6) elegyben 37 °C hőmérsékleten 15 órán keresztül. A fehérjét ezután 2 tömeg% kimotripszin enzimmel (Boehringer-Mannheim) emésztjük 0,25 mól/1 ammónium-hidrogén-karbonát pufferben (pH =7,8) 37 °C hőmérsékleten 4 órán keresztül. A kapott peptideket reverz fázisú HPLC eljárással 5 Mm Vydac C4 oszlopon (4,5 x 250 mm) (The Separations Group) 0,1 tömeg%, vizes TFA-ban 0-50 tömeg% acetonitril gradienssel (0,5 %/perc) tisztítjuk. Az izolált peptideket üvegszürőn felfogjuk, és szekvenáljuk.

4. A peptid fraqmensek szekvenálása

Az automatizált szekvencia analízist Applied Biosystem 477A pulzáló folyadékfázisu és Applied Biosystem 470A gázfázisú szekvenáló készülékben on-line 120A fenil-tio-hidantoin aminosav analizátorral a szokásos program paraméterek és analizáló oldószerek segítségével végezzük. A szekvencia analízist 30-100 pmól mintákon végezzük, és az ismétlődő kitermelés 91-95 %.

·« · · • · · · · · · • · · · · · · •·· ·· ··« «*·

E. UGA kodonnal kódolt triptofán az M. hvopneumoniae-ben

A C fehérje részét képező YLKQNEWD peptid egy triptofánt (W) tartalmaz a 7. pozícióban, ami a DNS szekvenciában TGA ködönként jelenik meg (lásd 4. ábra, 1411-1413 számú nukleotid) . Ez azt igazolja, hogy az M. hyopneumoniaeben TGA (az RNS-ben UGA) kódolja a triptofánt, mint ez más mikoplazma fajtáknál is látható.

IX. példa

Rekombináns C fehérje (csonkolt és teljes hosszúságú változat) termelésére alkalmas expressziós kiónok előállítása

A C fehérje E. coliban történő kifejezéséhez a C fehérje génjében található UGA kodonokat UGG kodonra (az E. coliban alkalmazott triptofán kodonra) kell cserélni, és a génnek az expressziós vektorba történő beépítésének elősegítésére helyre kell állítani az 5' véget. A pT5T::M851 expressziós szerkezet a C fehérje csonkolt változatát kódolja. Ez a szerkezet az első két UGA kodont tartalmazza, amit UGG kodonra változtatunk. Később a gén C terminális szakaszát és a harmadik UGA kodont (UGG-re változtatva) tartalmazó DNS fragmenst a fenti szerkezetbe ligáivá pT5T::M852 szerkezetet kapunk, amely a teljes hosszúságú rekombináns C fehérjét kódolja. A folyamat megvalósítását az alábbiakban részletez zük.

• ·* ···» · • · · · » «· • · · · · · · • · < ·

A. Az UGA kodon UGG kodonra történő megváltoztatása oliqonukleotidra irányuló helvspecifikus in vitro mutációval

Az oligonukleotidra irányuló helyspecifikus in vitro mutáció kivitelezésével az UGA kodont UGG kodonra változtatjuk. A mutációt a mutagén in vitro mutagenézisz készlettel (BIO-RAD) végezzük Kunkel és munkatársai (Methods Enzymol. 154. 367-382 (1987)) módszerével. A mutációhoz szükséges genetikai szelekcióhoz gazdasejtként E. coli CJ236 törzset (genotípus: dut, ung, thi, rel Al, pCJ105[cap^r]) alkalmazzuk, ami igen erős szelekciót biztosit a dut (dUTPáz) és ung (uracil-N-glikoziláz) mutációk alapján a kettős szálú DNS nem mutált szálával szemben. Az uracillal szubsztituált és a mutációhoz alkalmazott templát DNS-t a vad-tipusu ung helyet tartalmazó gazdasejtbe, igy JM103 gazdába történő transzformálás során szelektíven roncsoljuk, igy elősegítjük az újonnan szintetizált mutált DNS replikációját.

A három UGA kodon megváltoztatását két lépésben végezzük. Az első lépésben az első két UGA kodon A bázisát G bázisra cseréljük egyidejűleg (231 és 1068 számú nukleotid), amelyek a C fehérje génben a kiindulási hely és az 1294 számú nukleotidnál található Hindin felismerő hely között helyezkednek el. A második lépésben a harmadik UGA kodon 1413 számú nukleotidnál elhelyezkedő A nukleotidját G nukleotidra cseréljük.

Az első két UGA kodon megváltoztatásához a pSEV6::R68SKH kiónt alkalmazzuk. A pSEV6::R68SKH előállításához a pUC18::28C2 genom klón (lásd a 9. ábrát) mintegy 2,1 kb Hpal fragmensét a pSEV6::R68 Hpal helyére építjük be. A pSEV6::R68 expressziós klón egy β-galaktozidáz fúziós klón, amely a C fehérje egy részét kódolja. Előállítható a lambda-gtll R68 klónból, amelyhez a pSEV6 plazmidon kazetta szubklónozást végzünk (III-B. példa). Az R68 inszertje a C fehérjét kódoló szekvencia 5’ vége előtt kezdődik (amit a fehérje aminoterminális vége határoz meg), de kereten belül van a fehérjét kódoló szekvenciával, és igy olyan fúziós fehérje keletkezik, amely részben C fehérjéből, és részben a C fehérjét kódoló szekvenciától felfelé elhelyezkedő szakaszból áll.

A kapott mintegy 2,4 kb Sstl/HindlII fragmens a fent említett C fehérje gén Hindin helyéhez viszonyított 5' véget tartalmazza. Ezt az M13mpl8-ba szubklónozva mutációhoz alkalmazható egyszálu DNS templátot kapunk. A két UGA kodon egy mutációs kísérletben egyidejűleg történő kicseréléséhez két oligonukleotidot állítunk elő. A 231 számú nukleotidnál található A nukleotid (4. ábra) lecseréléséhez a

5' GGGAAATTTTGTTTTCCAACCCAAGCATCTAAAAGTGCCTCG 3' szekvenciáju nukleotidot, és az 1068 számú nukleotidnál elhelyezkedő A nukleotid (4. ábra) lecseréléséhez a

5' GATCTTCGTCTTGGAGTTGACTCCAACTTGCAAAATTTAATC 3' szekvenciáju oligonukleotidot alkalmazzuk. Ez a két oligonukleotid komplementer a 4. ábrán megadott kódoló szállal • ·* ···* · • · · 4 ·· * • · · · · · · • < 4· • · · · * 4··«44

- 66 (és az ellenkező irányban olvasható le). Az oligonukleotidokban aláhúzással jelöljük a kritikus nukleotid helyettesítését.

A mutációs kísérletben kapott öt klón közül egyet kiválasztva (S9e klón) és szekvenálva igazoljuk, hogy mindkét UGA kodon UGG kodonra cserélődött. A megfelelően mutált Sstl/HindlII fragmenst az eredeti pSEV6:R68SKH vektorba visszaklónozzuk, és a mutált klón a pSEV6::R68SKHM jelet kapta. A mutációt a β-galaktozidáz fúziós fehérje méretének növekedése is igazolja, mivel az E. coli terminációs kodon (UGA) triptofán kodonra (UGG) cserélődött.

Az 1413 számú nukleotidnál elhelyezkedő harmadik UGA kodon A nukleotidjának G nukleotidra történő lecseréléséhez az 5' CTATCTAAAACAAAATGAATGGGATCAAGTTAAAACAACAAATAATGGCC 3' szekvenciáju oligonukleotidot alkalmazzuk. Ez az oligonukleotid a kódolószállal azonos (az A-G cserétől eltekintve) leolvasást végez, mivel a mutációhoz alkalmazott egyszálú klón az ellenkező szál volt.

A harmadik UGA kodon UGG kodonra történő lecseréléséhez a pUC18::28C2 (9. ábra) mintegy 2 kb Hindin fragmensét az M13mpl9-be klónozzuk, és a mutációt mutagén készlettel a gyártó előírása szerint végezzük. A kapott tiz klón közül kilencet szekvenálva ellenőrizzük, hogy az A nukleotid G nukleotidra cserélődött. A fennmaradó kísérletek során a 2Ha kiónt használjuk. A 2Ha klón Hindin fragmensét a HindlII-mal hasított és defoszforilezett pSEV6::R68SKHM kiónba li- • ·· ····4 •••44·» » · 4 ···« • 4 4· •·♦ ·· ··· «··

- 67 gáljuk. A kapott plazmid a pSEV6::M852a-l jelet kapta, és a teljes C fehérje gént tartalmazza, amelyben a három UGA kodont UGG kodonokra cseréltük. A mutációt szintén a β-galaktozidáz fúziós fehérje méretének növekedése igazolja.

B. A C fehérje gén 5' végének helyreállítása

A mutált pSEV6::R68SKHM kiónt használva a C fehérje gén 5’ végét helyreállítjuk, és az E. coliban a nem fuzionált változatot fejezzük ki. A C fehérje génhez tartozó DNS szekvencia restrikciós enzimmel végzett vizsgálata során három Spel hely mutatható ki a gén 5' végéhez tartozó első 120 nukleotidon belül (9. ábra). A gén aminoterminális részének helyreállításához olyan oligonukleotidokat szerkesztünk, amelyek kihasználják a három Spel helyet az oligonukleotidok és a gén megmaradt része közötti kapcsolat kialakításában. Az oligonukleotidok kialakítása során a Mycoplasma kodonokat E. coli által előnyben részesített kodonokra cseréltük, az első két Spel helyet kiiktattuk, és egy EcoRI és egy Nhel restrikciós helyet alakítottunk ki, mindezt a C fehérje eredeti aminosav szekvenciájának megváltoztatása nélkül. Az alkalmazott négy oligonukleotid szekvenciája a következő:

1) NA oligonukleotid:

' GATCCGATCTTGGAGGATGATTAAATGCAGCAGCAGGAAGCAAACTCCACGAATTCTAGCCCGAC 3' *4*·

- 68 ~

2) NB oligonukleotid:

5'TCGGGCTAGTCGGGCTAGAATTCGTGGAGTTTGCTTCCTGCTGCTGCATTTAATCATCCTCCAAGATCG 3'

3) NC oligonukleotid:

5' TAGCCCGAGCCCGAGCCCGACTAGCCCGAGCCCGGCTAGCCCGAGCTCCAGCCCGAGCCCGA 3'

4) ND oligonukleotid:

5' CTAGTCGGGCTCGGGCTGGAGCTCGGGCTAGCCGGGCTCGGGCTAGTCGGGCTCGGG 3 ’

Az NA és NB, valamint az NC és ND oligonukleotidok egymáshoz képest komplementerek. A C fehérje gén 5' végének helyreállításához a négy oligonukleotidot kinázzal kezeljük, az NA és NB, valamint az NC és ND oligonukleotidokat egymáshoz kapcsoljuk. A pSEV6::M851 szerkezetet Spel enzimmel emésztjük, és az emésztett DNS-t az összekapcsolt NC és ND oligonukleotidokkal ligáljuk. Ezt a DNS-t ezután az összekapcsolt NA és NB oligonukleotidokkal ligáivá helyreállítjuk a gén 5' végét. A ligáit DNS elegyet BamHI és Hindin enzimekkel emésztve olyan DNS fragmenst kapunk, amely a gén 5' vége és az 1294 számú nukleotidnál található HindlII felismerő hely közötti szakaszt tartalmazza. Ezt a DNS fragmenst használjuk a C fehérje csonkolt formájának kifejezéséhez. Az 5' szakasz helyreállítását az 5. ábra ismerteti .

C. C fehérje rekombináns kifejezése a T7 promoter rendszeren (pT5T vektor) alapuló expressziós vektor felhasználásával

1. A pT5T vektor ismertetése

A T7 promoteren alapuló pT5T expressziós vektor lényegében azonos a pJU1003 rendszerrel (Squires és munkatársai: J. Bioi. Chem. 263. 16297-16302 (1988)), azzal a különbséggel, hogy a T7 promoter 5’ vége felöli egyetlen BglII hely és a tetraciklin rezisztencia gén Clal hely közötti szakaszon egy rövid DNS található. Ennek a DNS-nek a szekvenciája:

ATCGATGATA AGCTGTCAAA CATGAGAATT GAGCTCCCCG GAGATCCTTA GCGAAAGCTA

Clal

AGGATTTTTT TTAGATCT

BglII

2. A csonkolt C fehérje kifejezésére alkalmas expressziós vektor

A pT5T vektort BamHI és Hindin restrikciós enzimekkel linearizáljuk és gélelektroforézissel tisztítjuk. A C fehérje gén helyreállított 5' vége és az 1294 számú nukleotidnál található HindlII hely közötti szakaszt a pSEV6::R68SKHM szerkezetből (IX-A1 példa) BamHI és HindlII • · · »

- 70 enzimekkel kimetszve olyan DNS fragmenst kapunk, amely tartalmazza az első két megváltoztatott UGA kodont. Ezt a fragmenst ligáivá pT5T::M851 expressziós szerkezetet kapunk.

3. A teljes hosszúságú C fehérje kifejezésére alkalmas expressziós vektor

A teljes C fehérje kifejezéséhez a 2Ha kiónból (IX-A példa) kimetszett és gélen tisztított mintegy 2 kb Hindin fragmenst, amely a harmadik megváltoztatott UGA kodont és a gén C terminális részét tartalmazza, HindlII restrikciós enzimmel emésztett, és lúgos foszfátázzál defoszforilezett pT5T::M851 vektorba ligáljuk. Mivel a HindlII fragmens mindkét orientációban ligálható az emésztett vektorhoz, a kapott transzformánsoknál felvesszük a hasítási térképet, és igy azonosítjuk a HindlII fragmens megfelelő orientációját. A kapott szerkezet a pT5T::M852 jelet kapja, és a 10. ábrán látható.

4. Rekombináns C fehérje (csonkolt vagy teljes hosszú- ságú változat) kifejezése

A pT5T::M851 szerkezetet (csonkolt C fehérje) és a pT5T::M852 szerkezetet (teljes hosszúságú C fehérje) E. coli BL21/DE3 törzsbe (Studier és Moffat: J. Mól. Bioi. 189, 113-130 (1986)) transzformáljuk. Az alkalmazott E. coli törzsben a T7 RNS polimeráz gént IPTG-vel indukálható lac • · ·

- 71 promoter szabályozza egy lizogén lambda bakteriofágon. Az IPTG által indukálható fehérjét kifejező klón mintegy 50 kd molekulatömegnél (csonkolt C fehérje) migrál. A pT5T::M851 szerkezetből származó fenti klón a pT5T::M851-B2B jelet kapja. A pT5T::M852 szerkezetből származó és IPTG által indukálható fehérjét kifejező klón mintegy 85 kd molekulatömegnél (teljes hosszúságú C fehérje) migrál, és a pT5T::M852-l jelet kapja. A pT5T::M852-1 klón által termelt rekombináns fehérje SDS poliakrilamid gél vizsgálat során együtt vándorol a mikoplazmából izolált természetes 85 kd fehérjével. Mind a rövid 85 kd, mint a teljes hosszúságú 85 kd rekombináns fehérje immun reakcióképességet mutat Western eljárással gélen tisztított természetes 85 kd fehérjével immunizált sertések szérumával (X-J példa).

A pT5T::M851 és a pT5T::M852 szerkezet DNS szekvenálása igazolja a rekombináns megfelelő szekvenciáját. A sértetlen rekombináns teljes hosszúságú C fehérje aminosav szekvenciájának aminoterminális vége az MQQQEANSTNSSPT szekvenciát mutatja, ami összhangban van az aminoterminális részén metioninnal kiegészített kezdeti szekvenciával (4. ábra). A szekvencia meghatározásához a sejtek francia préssel történő roncsolása után kapott oldhatatlan pellet (X-C példa) egy részét minta pufferben oldjuk, és poliakrilamid-gélen MZE 3328.IV rendszerrel (Moos és munkatársai: J. Bioi. Chem. 263. 6005-6008 (1988)) elektroforetikusan vizsgáljuk. Az elválasztott fehérjéket. PVDF Immobilon membránra visszük át, és Coomassie festékkel megszinezve láthatóvá tesszük. A * ·

- 72 rekombináns C fehérje sávjának környékét kivágjuk a membránról, a festéket eltávolítjuk, szekvenálóba helyezzük, és szekvenáljuk (VIII-D4 példa).

A teljes hosszúságú és a csonkolt rekombináns C fehérje kifejezését és tisztítását a X-C és X-D példa ismerteti.

X. példa

Vakcinálási kísérletek

A. Vakcináláshoz alkalmazott Mycoplasma sejtek fehérje extraktuma

1. M. hvopneumoniae sejtek növesztése és betakarítása

M. hyopneumoniae 64C törzset Friis közegben (Friis: Nord. Veterinaer Med. 27., 337-339 (1975)) 37 °C hőmérsékleten rázóedényben (1200 ml tenyészet a 2 literes edényekben) 230 fordulat/perc értéken növesztjük. A sejtek növekedését OD55Q - 0,2-0,3 értékig végezzük mintegy 2,5-3 napon keresztül, amelynek során a tápközeg színe vörösről sárgás-narancssárgás színre változik, és a tenyészet zavarossá válik. A sejteket 16 000 g értéken 15 percen keresztül 4 °C hőmérsékleten centrifugálva begyüjtjük. Ezután egytized térfogatrész 0,25 mól/1 nátrium-kloridban szuszpendáljuk, és a fenti körülmények között ismét centrifugáljuk. A kapott sejt pelletet 1/50 rész 0,25 mól/1 nátrium-klorid oldatban OD55Q = 10 érték mellett szuszpendáljuk.

2. Az M. hyopneumoniae sejtekből származó fehérjék alacsony pH-iu extraktuma (SÍ)

A begyűjtött és a szuszpendált M. hyopneumoniae sejtekhez (X-Al. példa) 1/4 térfogatrész 10 mmól/1 glicint (pH = 2,0) adunk, és 15 percen keresztül 4 °C hőmérsékleten kevertetjük. Az elegy végső pH értéke 2,5. Az elegyet 48 000 értéken 15 percen keresztül 4 °C hőmérsékleten centrifugáljuk. A felüluszót eltávolítjuk, és SÍ extraktumnak nevezzük. Az SÍ extraktum különböző fehérjéket tartalmaz, amint ez a 8. ábrán bemutatott SDS poliakrilamid gél fényképén látható. A fő fehérje komponensek a 87 kd, 85 kd (C fehérje), 65 kd és 50 kd sávnál jelentkeznek, emellett több kevésbé fontos komponens található. Az SÍ extraktumot bekoncentráljuk, és Amicon ultraszürő sejtekkel ellátott Amicon YM30 Diaflo Ultrafiltration membránon 2,76 x 10⁵ Pa nyomáson 4 °C hőmérsékleten sómentesitjük. Az extraktum egy század térfogatrészre történő bekoncentrálása több órát vesz igénybe, és a folyamat végén vastag fehérje réteget kapunk a szűrő membránon. A kezdeti térfogat 1/2 részének elérésekor 2 mmól/1 glicint (pH = 2,5) adunk az edényhez, és elkeverjük. A fehérje réteg lapokban leválik a membránról, amit 2 mmól/1 glicinben oldunk. Visszaoldás után a második bekoncentrálási lépésben a kezdeti térfogat egyszázad része 2,76 x 10⁵ Pa nyomáson egy órán belül elérhető. Ezt a koncentrátumot eltávolítjuk az edényből, és a membránt kétszer 2-3 ml 2 mmól/1 glicinnel (pH = 2,5) mossuk, a mosó• · · · • · · ·« · · · 9 · ·

- 74 folyadékokat a koncentrátummal egyesítjük. így sómentesitett koncentrátumot kapunk, amelynek térfogata az eredetihez viszonyítva mintegy 1/50. Ez a koncentrált SÍ extraktum az Sic jelet kapja, amely fehérje összetételében nem tér el az SÍ extraktumtól, amint ez a Coomassie Blue festékkel megszinezett SDS poliakrilamid gél fehérje sávjaiból látható.

3. A fehérjék frakcionálása pH kicsapásos módszerrel

A koncentrált sómentesitett Sic extraktumot 1 mól/1 MOPS (3-[N-morfolino]-propán-szulfonsav, pH = 7) 40 mmól/1 végkoncentrációig történő adagolásával pH = 7,0 értékre állítjuk, amikoris finom fehér csapadék válik le. A csapadékot centrifugáljuk (48 000 g, 15 perc, 4 ’C), majd 2 mmól/1 glicinben (pH = 2,5) oldjuk. A felüluszót 7S extraktumnak nevezzük, amely az ossz fehérjének mintegy 40 %-át tartalmazza, és a 85 kd és 65 kd fehérjékben dús, de emellett az 50 kd fehérje mintegy fele mennyiségét és néhány további kis fehérjét tartalmaz. Az oldott pellet, neve 7P extraktum, a fennmaradó 60 %-ot tartalmazza, dús a 87 kd fehérjében, és emellett az 50 kd fehérje mintegy felét, és néhány más kisebb fehérjét tartalmaz. Egyik frakció sem mentes a másik frakcióban megtalálható fehérjéktől. Az egyes frakciókban található és Coomassie festékkel megszinezett gélen kimutatott fehérjéket a 8. ábra mutatja.

• ·

- 75 Β. Μ. hyopneumoniae sejtekből származó C fehérje tisztítása

1. Ioncserélő kromatoqráfia

A természetes C fehérjét ioncserélő kromatográfiával tisztíthatjuk két különböző módon:

(1) a CHAPS módszer ikerionos CHAPS detergenst tartalmazó puffért alkalmaz, és kiindulási anyagként a 7S extraktumot használjuk; és (2) a karbamid módszer 6 mól/1 karbamidot tartalmazó puffért alkalmaz és kiindulási anyagként az Sic extraktumot használjuk.

Mindkét módszerrel megfelelő tisztítás végezhető, bár a karbamidot tartalmazó puffér valamivel jobb visszaoldódást mutat az eluciós profilban. Detergens vagy denaturálószer nélkül az eluciós csúcsok visszaoldódása különösen alacsony.

2. CHAPS módszer

A természetes C fehérje tisztításához kiindulási anyagként a 7S extraktumot alkalmazzuk, amely az alacsony pH-ju SÍ extraktum (X-A példa) bekoncentrált származékának felüluszója. A 7S extraktum nagy mennyiségű 85 kd fehérjét (C fehérje), valamint 65 kd fehérjét és 50 kd fehérjét, továbbá némi szennyező anyagot tartalmaz. Az ioncserés kromatográfiás Pharmacia Mono Q HR5/5 oszlopon (ágy térfogat • · »·♦· • · · · • · · · · ml) végezzük, amelyet Pharmacia FPLC rendszerhez csatla koztatunk. A CHAPS puffer összetétele 0,05 tömeg% CHAPS (3 - [ (3 -kolamido-propi 1) -dimet i 1-ammonium ] -1 -propán

-szulfonát), 0,02 mól/1 BISZ-TRISZ (bisz[2-hidroxi-etil]

-iminotrisz-[hidroxi-metil]-metán) , pH = 6,0. A minta össze tétele általában 34 ml 7S extraktum, 3,05 ml H₂O, 0,76 ml mól/1 BISZ-TRISZ (pH = 6,0), 0,19 ml 10 tömeg% CHAPS, amit

0,02 mól/1 BISZ-TRISZ (pH = 6) és 0,05 tömeg% CHAPS elegyével 38 ml ossz térfogatra töltünk. A mintát GELMAN

ACRODISC eldobható szűrőn (pórusméret 0,2 Mm) szűrjük. A mintát 1 ml/perc áramlással az oszlopra visszük, ezután 5-10 oszloptérfogat CHAPS pufferrel mossuk, végül lineáris gradiensü nátrium-klorid oldattal eluáljuk, ahol a nátrium-klorid oldatot a fenti pufferben vesszük fel. A gradiens 0-0,25 mól/1 nátrium-klorid 40 fehérje 0,08-0,10 mól/1 ml térfogaton keresztül. A 85 kd nátrium-klorid koncentrációnál eluálódik, amelynek során a csúcs áthúzódik a magasabb koncentrációjú nátrium-klorid frakciókba. A különböző frakciók mintáit SDS-PAGE eljárással analizáljuk, és a gélt ezüsttel megszinezve azonosítjuk a 85 kd fehérjét tartalmazó frakciókat. A 85 kd fehérjében dús frakciókat egyesítjük, ezek együttesen legalább 60 tömeg% 85 kd fehérjét tartalmaznak, a maradék különböző szennyezü fehérje. Ezeket az értékeket

Coomassie festékkel színezett gélen kaptuk. A fehérje kon centrációt BIO-RAD fehérje vizsgáló készlettel határoztuk meg.

♦ · ··♦· • · · · · · · • · · · •·· ·· · · · ···

3. Karbamid módszer

A karbamid puffér 6 mól/1 karbamidot (BRL, Ultratisztaságu, enzim fokozat) tartalmaz 0,02 mól/1 BISZ-TRISZ (pH = 6,0) elegyben. Kiinduló anyagként a bekoncentrált alacsony pH értékű extraktumot, az Sic extraktumot használjuk. A minta összetétele általában 4 ml Sic, 3,8 ml H₂O, amelyben 3,85 g karbamidot oldunk. A karbamid oldódása után 0,2 ml, 1 mól/1 BISZ-TRISZ puffért (pH = 6,0) adunk az elegyhez, és igy mintegy 10 ml oldatot kapunk, amely 6 mól/1 karbamidot, és 0,02 mól/1 BISZ-TRISZ puffért (pH = 6,0) tartalmaz. A mintát GELMAN ACRODISC eldobható szűrőn (pórusméret 0,2 Mm) szűrjük. A mintát 1 ml/perc áramlással Pharmacia Mono Q HR 5/5 oszlopra visszük, az oszlopot 5-10 oszloptérfogat karbamid pufferrel mossuk, majd lineáris gradiensü nátrium-klorid oldattal eluáljuk, ahol a nátrium-klorid oldatot a fenti pufferben vesszük fel. A gradiens értéke 0-0,25 mól/1 nátrium-klorid 40 ml térfogaton keresztül. A 85 kd fehérje 0,04-0,08 mól/1 koncentrációnál éles csúcs formájában eluálódik, amely csak kismértékben húzódik át a magasabb frakciókba. A frakciók mintáit SDS-PAGE eljárással analizáljuk, a gélt ezüsttel megfestve kiválogatjuk a 85 kd fehérjét tartalmazó frakciókat. A 85 kd fehérjében dús frakciókat összegyűjtjük, ezek általában 50 tömeg% 85 kd fehérjét tartalmaznak, a fő szenynyezés mintegy 50 kd fehérje és néhány más kisebb fehérje, amit Coomassie festékkel színezett gélen teszünk láthatóvá.

• · · • ·· ··♦· • · · · · • · · ··· « · · · '«· · » ···

- 78 A fehérje koncentrációt BIO-RAD fehérje vizsgáló készlettel határoztuk meg.

4. Gél tisztítás

A 85 kd fehérje további tisztítását preparativ SDS poliakrilamid gél elektroforézissei (SDS-PAGE) végezzük. A gél 8 cm hosszú, 14 cm széles és 7 mm vastag, összetétele 7,5 tömeg% akrilamid (7,3 tömeg% akrilamid és 0,2 tömeg% Ν,Ν'-metilén-biszakrilamid), 0,1 tömeg% SDS és 0,375 mól/1 Trisz-HC1 (pH = 8,8) elegyében felvéve. A dusitógél 1 cm hosszú, szélessége és vastagsága azonos, összetétele 4,5 tömeg% akrilamid (4,38 tömeg% akrilamid és 0,12 tömeg% N,N'-metilén-biszakrilamid) 0,1 tömeg% SDS és 0,125 mól/1 Trisz-HCl (pH = 6,8) elegyében felvéve. A futtató puffer összetétele 0,025 mól/1 Trisz bázis, 0,192 mól/1 glicin és 0,1 tömeg% SDS (pH = 8,3). A mintapuffer összetétele 10 vegyes% glicerin, 3 tömeg% SDS és 0,0625 mól/1 Trisz-HCl (pH = 6,8). A minták kezelése során redukálószert vagy festéket nem alkalmazunk. A mintát (az összegyűjtött 85 kd fehérjében dús oszlop frakciókat) azonos térfogatnyi mintapufferrel keverjük, és forró vízfürdőn 10 percen keresztül melegítjük. Ezután szobahőmérsékletre hütjük. Az elegyből 5 ml-t a gélre viszünk, és 50 mA áramerősségnél addig futtatjuk, míg az ionfront eléri a gél alját (mintegy 2,5 óra).

A fehérjesávnak a gélen történő lokalizálásához speciális folteljárást alkalmazunk. Amikor a gél futtatását be<♦ ·

- 79 fejeztük, eltávolítjuk az elektroforézis berendezésből, és vízszintesen egy üveglemezre fektetjük, majd a dusitógélt borotvapengével levágva eltávolítjuk. A gél felső futtatott felületére egy darab megnedvesitett (vízben) nitrocellulóz lapot (Schleicher és Schuell, BA-83, pórusméret 0,2 μιη) fektetünk, amelynek mérete valamivel nagyobb, mint a gél mérete. Erre egy megnedvesitett Whatman 3MM papírlapot fektetünk, végül két lap száraz 3MM papír, egy üveglemez és megfelelő súly (300-500 g) következik. Szobahőmérsékleten 30 percen keresztül állni hagyjuk, amelynek során a nitrocellulózba annyi fehérje vándorol át, ami megfestéssel láthatóvá tehető. A gél felületéről történő eltávolítás előtt a nitrocellulóz lap hátoldalát fekete VWR labor festékkel megjelöljük a gél széleit, igy a megfestés után a gél azonosítható. A nitrocellulóz lapot eltávolítjuk a gélről, háromszor TBS és 0,3 tömeg% Nonidet P-40 (TBS = trisz-pufferolt sóoldat: 0,15 mól/1 nátrium-klorid és 0,1 mól/1 Trisz-HCl, pH = 8,0) mossuk. A lapot ezután a fenti oldathoz adott 0,1 tömeg% vízmentes fekete india tintával (Koh-i-noor Rapidograph 3080-F Universal) megfestjük. A lapot 10-15 percen keresztül szobahőmérsékleten a színező oldatban áztatjuk, amelynek során megfestett sávok jelennek meg a nitrocellulóz lapnak a géllel érintkező oldalán. A gélt ezután a nitrocellulóz lapon lévő jelölés alapján azonosítjuk, és a legsötétebb és legvastagabb sávokat borotvapengével a gélből kivágjuk. A fehérjét a gélcsikokból eltávolítjuk, ehhez a csikókat tü nélküli eldobható műanyag fecs• · • »4«··' • · ·» t · · · · · •· · · «4· ·» ······

- 80 kendőn átpréselve 0,5 X futtató pufferbe adjuk, és 4 °C hőmérsékleten tároljuk.

A fehérjét a gélcsikokról ISCO mintakoncentráló edényben eluáljuk. Az átpréselt gélcsikokat az edénybe helyezzük, 0,5 X futtató pufferrel hígítjuk, és edényenként 1 W energiával 3-4 órán keresztül elektroeluáljuk. A bekoncentrált mintát pipettával eltávolítjuk, és a különöbző edényekből származó mintákat egyesitjük. A minta fehérje koncentrációjának meghatározásához különböző mennyiségű mintákat különöbző mennyiségű ismert standarddal együtt SDS-PAGE eljárással vizsgálunk, és a Coomassie Blue színezés után kapott fehérjesávok intenzitását összehasonlítjuk.

A bekoncentrált mintákat öszegyüjtjük, 0,5 X futtató pufferrel 1,0 mg/ml koncentrációig hígítjuk, és a vakcinálásig 4 °C hőmérsékleten tároljuk.

C. Teljes hosszúságú rekombimáns C fehérje kifejezése és tisztítása pT5T::M852-l törzset (IX-C példa) rázóedényben növesztünk (350 ml térfogat 2 literes rázóedényben, 250-350 fordulat/perc, 37 °C). Tápközegként 10 gg/ml tetraciklinnel kiegészített Luria tápközeget (1 tömeg% tripton, 0,5 tömeg% élesztő extraktum, 1 tömeg% nátrium-klorid, pH = 7,5) alkalmazunk. A sejteket = 0,7-0,9 értéknél 0,4 mmól/1

IPTG-vel (izopropil-tio-galaktopiranozid) indukáljuk. A sejteket az indukció után 8-11 órával (OD^qq = 1,4-1,6) • ·· «·4·«* ·· · · 9·· • · ··♦· · « · · · ··· r · ··«···

9000 g értéken 10 percen keresztül 4 °C hőmérsékleten centrifugálva begyüjtjük. A sejteket egytized térfogatrész 20 mmól/1 Trisz pufferben (pH = 8,2) szuszpendáljuk, 9000 g értéken 10 percen keresztül centrifugálva pelletáljuk, és egyszázad térfogatrész fenti pufferben ismét szuszpendáljuk. A sejteket francia présben (három fokozat, 1,2 x 10⁸ Pa) roncsoljuk. A roncsolt sejteket 48 000 g értéken 30 percen keresztül 4 °C hőmérsékleten centrifugáljuk. A centrifugálás után kapott pellet a teljes hosszúságú rekombináns C fehérjének legalább 90 %-át tartalmazza. A pelletet 20 mmól/1 Trisz pufferben (pH = 8,2) szuszpendáljuk, amelynek során tejszerü szuszpenziót kapunk. A fehérje szolubilizálásához a szuszpenziót azonos térfogatrész gél mintapufferben (100 °C, 10 perc) keverjük, és preparativ poliakrilamid gél elektroforézissel az M. hyopneumoniae sejtekből nyert természetes C fehérje tisztításánál leirt módon (X-B példa) tisztítjuk.

D. Csonkolt C fehérje kifejezése és tisztítása

A pT5T:M851-B2B törzset (IX-C példa) rázóedényben növesztjük (350 ml 2 literes rázóedényben, 250-350 fordulat/perc, 37 °C). Tápközegként 10 Mg/ml tetraciklinnel kiegészített Luria tápközeget (1 tömeg% tripton, 0,5 tömeg% élesztő extraktum, 1 tömeg% nátrium-klorid, pH = 7,5) alkalmazunk. A sejteket Οϋθοθ = 0,7-0,9 értéknél 0,4 mmól/1 IPTG-vel (izopropil-tio-galakto-piranozid) indukáljuk. A ·· ·

- 82 sejteket az indukció után 3-4 órával (OD₆qq = 1,4-1,6)

9000 g értéken 10 percen keresztül 4 °C hőmérsékleten centrifugálva begyüjtjük. A sejteket egytized térfogatrész mmól/1 Trisz pufferben (pH - 8,2) szuszpendáljuk, 9000 g értéken 10 percen keresztül centrifugáljuk, és egyszázad rész fenti pufferben ismét szuszpendáljuk. A sejteket francia présben (három fokozat 1,2 x 10⁸ Pa) roncsoljuk. A roncsolt sejteket 48 000 g értéken 30 percen keresztül 4 °C hőmérsékleten centrifugáljuk. A centrifugálás során kapott felüluszóban a csonkolt rekombináns C fehérje legalább %-a megtalálható. A csonkolt rekombináns C fehérje tisztítására két módszert alkalmazunk. Az ioncserés kromatografáláshoz a felüluszót 20 mmól/1 Trisz pufferrel (pH=8,2) 5-10-szeresére hígítjuk, és 6 mól/1 koncentrációig karbamiddal elegyítjük. Ezt mono Q FPLC oszlopra visszük, és nátrium-klorid gradienssel eluáljuk lényegében a természetes C fehérje ioncserés kromatográfiás tisztításánál ismertetett karbamid módszerrel (X-B példa), azzal a különbséggel, hogy pufferként 20 mmól/1 Trisz puffért (pH = 8,2) alkalmazunk. A csonkolt C fehérje 0,10-0,12 mól/1 nátrium-klorid koncentrációnál eluálódik.

A csonkolt C fehérjét preparativ gél elektroforézissel is tisztítjuk. A felüluszót 1:1 arányban gél mintapufferrel keverjük, és preparativ poliakrilamid gél elektroforézissel az M. hyopneumoniae sejtekből nyert természetes C fehérje tisztításánál leirt módon (X-B4. példa) tisztítjuk.

E. Vakcinálási kísérletek

Egészséges 5 hetes sertéseket 5-6 állatból álló csoportokra osztunk. Három csoportot (összesen 15-18 állatot) 3,0 ml mennyiségű intramuszkuláris injekció formájában kísérleti vakcinával vagy placeboval vakcinálunk, amit viz-az-olajban tipusu emulzió formájában alkalmazunk. Az állatok 7 napos időszakban 4 vakcinálást (50, 100, 200 és 400 pg fehérje injekciónként) kapnak.

Az utolsó injekciót követő második napon három Mycoplasma hyopneumoniae-val fertőzött donor állatot helyezünk minden csoportba a természetes fertőzés forrásaként. A donor állatokat mesterségesen fertőzzük az M. hyopneumoniae-vel, amelyhez fertőzött tüdőszövetből nyert homogenizátumot intranazális infúzió formájában adagolunk, ami súlyos fertőzést eredményez. A fertőzést azon a napon végezzük, amikor a vakcináit állatok megkapják az első injekciót, igy a kívánt súlyos fertőzés a szükséges ideig kialakul. A vakcináit és a donor állatokat az összekeverésig elkülönítve tartjuk. Az épület szellőztetését lecsökkentve elősegítjük a betegség átvitelét. Minden állatból vérmintát veszünk, először az első injekció előtt, majd az utolsó injekció után és a donor állatokkal történő összekeverés előtt.

Az összekeverést követő hat hét elteltével az állatokat megöljük, és a betegség súlyosságát a tüdőn vizsgáljuk. A tüdők vizsgálatát olyan személy végzi, aki a kezelésben nem vett részt. Az elsődleges kritérium a tüdőn vizuálisan meg található kiterjedt pneumoniás sérülések százalékos mennyisége. Az összegyűjtött tüdőszöveten közvetlen fluoreszcens antitest (IFA) vizsgálatot végzünk, amellyel meghatározzuk, hogy a kiterjedt sérülések tartalmaznak-e Mycoplasma hyopneumoniae fertőzést (X-G példa). A mintákat a mikoplazmától eltérő aerob baktériumok vizsgálatához tenyésztjük. A látható sérülésekkel rendelkező és az IFA teszt szerint pozitív állatokat fertőzöttnek minősítjük a betegség elterjedésének vizsgálata során. A vakcina hatékonyságának méréséhez használjuk az általános sérülési mértéket (átlag százalékos sérülés). Az átlagoláshoz a 0 % feletti, de 1 % alatti sérüléssel rendelkező állatokat 0,5 % értékben vettük figyelembe. A tüdősérülés adatait statisztikailag analizáljuk a négyzetgyök transzformációs módszerrel, és a 2. táblázatban megadott átlagértékeket az eredeti skálához transzformáljuk.

Egyes esetekben további vizsgálatokat is végzünk:

(1) ELISA vizsgálat (X-H példa) és Western folt analízis (X-J példa) a vakcináit sertések széruma és specifikus antigének közötti reakciók megállapításához.

(2) Metaboliás inhibició teszt (X-I példa) a vakcináit sertések szérumának az M. hyopneumoniae sejtek növekedésére gyakorolt in vivő hatásának megállapításához .

(3) Tüdőszövetek hisztológiás vizsgálata (X-K példa) a sérülés súlyosságának mikroszkopikus meghatározá sához .

F. A vakcinálási kísérlet eredményei

A vakcinálási kísérlet eredményeit a 2. táblázatban adjuk meg.

		2. táblázat
Kísérlet	Vakcina	Tüdősérülés		IFA
száma	fehérje	elterjedés	átlag (%)	pozitív
8702	SÍ	7/15^a	0,63^a	7/15^a
	vakcina nélkül	14/15^b	8,ll^b	14/15^b
	7S	5/15^a	0,23	5/15^a
8805	7S, 1,25 % SDS	4/15^a	0,08^a	7/15^b
	7S, 6 mól/1
	karbamid	4/14^a	0,28	6/14^a
	vakcina nélkül	12/15^b	2,23^b	12/15^b

8802 C fehérje (oszlopon tisztítva)

és és	15/33^a	0,66^a	17/32^a
8902 C fehérje
(gélen tisztítva)
placébo	27/33^b	3,13^b	27/32^b

- 86 (a 2. táblázat folytatása)

Kísérlet Vakcina Tüdősérülés IFA száma_____fehérje_________elterjedés átlag (%) pozitív

Teljes hosszúságú rekombináns C

8904	fehérje	17/30^a	0,44^a	17/30^a
és
8905	csonkolt	rekombináns
	C fehérje	19/30^a	0,86^a	19/30^a
	placébo	28/30^b	2,90^b	28/30^b

a, b = a függőleges oszlopokban a különböző indexekkel megjelölt értékek szignifikáns különbséget mutatnak, p < 0,05.

A vakcinálási kísérletek leírását a X-E példa tartalmazza.

A tüdősérülés adatait statisztikailag analizáljuk a négyzetgyök transzformálás módszerével, és a 2. táblázatban megadott átlag értékeket az eredeti skálához transzformáljuk.

Elterjedés:

A tüdősérüléssel rendelkező és pozitív IFA tesztet mutató állatok aránya a csoport létszámához viszonyítva. Ez az arány azt mutatja, hogy a betegség átvitelét milyen mértékben csökkenti a vakcinálás.

Átlag:

Egy adott csoportba tartozó állatok sérülésének átlaga. Ez a szám lehetővé teszi a betegség súlyosságának a különböző csoportok között történő összehasonlítását.

IFA pozitív:

Az IFA teszt (indirekt fluoreszcens antitest vizsgálat) az M. hyopneumoniae sejtek jelenlétét mutatja ki a tüdőszövetben, elsősorban a sérülésben. Ez az érték azt mutatja, hogy a sérülést valóban az M. hyopneumoniae fokozta-e, vagy valamely más szer (például más Mycoplasma faj vagy baktérium). A táblázatban a pozitív IFA tesztet mutató állatok számának és a csoporton belüli ossz létszám arányát adjuk meg. A teszt részletes elvégzését a X-G. példa ismerteti .

Az eredményekből a következő általános következtetések vonhatók le:

(1) Az SÍ extraktum lényeges védelmet biztosit az M. hyopneumoniae fertőzéssel szemben. A 8702 számú kísérletben az SÍ vakcina szignifikáns mértékben csökkenti az elterjedés mértékét, a sérülés átlagos százalékát és az IFA pozitív értéket mutató állatok számát, ha a vakcinálás nélküli kontrolihoz viszonyítjuk.

(2) A 7S extraktum jelentős védelmet biztosit az M. hyopneumoniae fertőzéssel szemben. A 8805 számú kísérletben a 7S vakcina szignifikáns mértékben csökkenti az elterjedést, és az IFA pozitív értéket mutató állatok számát, ha a vakcinálatlan kontrolihoz viszonyítjuk. Az átlagos sérülés • · · ·

- 88 szintén csökken, de ez statisztikailag nem szignifikáns, p < 0,05 értéknél.

(3) A 7S extraktum SDS detergenssel vagy karbamidban védő hatásának elroncsolása nélkül denaturálható. A 8805 számú kísérletben az 1,25 tömeg% SDS-sel denaturált 7S extraktummal végzett vakcinálás szignifikáns mértékben csökkenti az elterjedést, az átlag sérülést, ha a nem vakcináit kontrolihoz viszonyítjuk. Az IFA pozitív érték szintén csökken, de ez nem szignifikáns a p < 0,05 értéknél. A 6 mól/1 karbamiddal denaturált 7S extraktummal végzett vakcináláskor szignifikáns mértékben csökken az elterjedés, és az IFA pozitív érték, ha a nem vakcináit kontrolihoz viszonyítjuk. Az átlagos sérülés szintén csökken, de ez nem szignifikáns a p < 0,05 értéknél.

(4) Az M. hyopneumoniae sejtekből tisztított C fehérje jelentős védelmet nyújt az M. hyopneumoniae fertőzéssel szemben. Az eredmények a 8802 számú kísérlet (amelyben a C fehérjét ioncserés kromatográfiával tisztítjuk), és a 8902 számú kísérlet (amelyben a C fehérjét preparativ poliakrilamid gél elektroforézissel tovább tisztítjuk) kombinációjából adódnak. Nincs statisztikailag szignifikáns különbség a két kísérletben kapott eredmények között. Mindkét esetben szignifikáns csökkenés mutatható ki az elterjedésben, az átlag sérülésben és az IFA pozitív értékben, ha a placébóval vakcináit kontroll kísérlethez viszonyítjuk.

(5) A teljes hosszúságú rekombináns C fehérje jelentős védelmet nyújt az M. hyopneumoniae fertőzéssel szemben. Az

- 89 eredmények az 8904 és 8905 kísérletek (a két önálló kísérletben mindkét esetben preparativ poliakrilamid gélen tisztított fehérjét alkalmazunk) kombinációjából adódnak. Szignifikáns csökkenés mutatható ki az elterjedésben, az átlag sérülésben és az IFA pozitív értékben, ha a placébóval vakcináit kontrolihoz viszonyítjuk.

(6) A csonkolt rekombináns C fehérje jelentős védelmet nyújt az M. hyopneumoniae fertőzéssel szemben. Az eredmények a 8904 számú kísérlet (amelyben a fehérjét ioncserés kromatográf iával tisztítjuk), és a 8905 számú kísérlet (amelyben a fehérjét preparativ poliakrilamid gélen tisztítjuk) kombinációjából adódnak. Szignifikáns csökkenés mutatható ki az elterjedésben, az átlag sérülésben és az IFA pozitív értékben, ha a piacéból vakcináit kontrolihoz viszonyítjuk.

G. Közvetlen fluoreszcens antitest (IFA) teszt

Annak meghatározásához, hogy az állatokban megfigyelt sérüléseket valóban M. hyopneumoniae fertőzés okozta-e, szövetmintákat veszünk a fertőzött tüdő sérüléseiből, vagy a kimutatható sérülésektől mentes állatok tüdőlebenyének csúcsából. Ez az a szakasz, ahol a tüdő fertőzése először jelentkezik. A szövetmintákat fagyasztjuk, üveglemezre helyezzük, és acetonnal fixáljuk. Nyúl anti M. hyopneumoniae szérumot kötünk meg a mintákban, mossuk, majd fluoreszceinnel összekapcsolt kecske antinyul IgG vizsgálatot végzünk. A meg nem kötött antitesteket kimossuk, és a mintákat fluo·· · ·

- 90 reszcens mikroszkópon vizsgáljuk. Az alveolus körül fényes fluoreszcens gyűrűt mutató mintákat pozitívnak minősítjük. A kontroll minták csak háttér fluoreszcenciát mutatnak.

H. Enzimmel kapcsolt immunoszorbens vizsgálat (ELISA) mértőhelyes mikrotitráló lemezeket mérőhelyenként 0,3 gg antigénnel (tisztított természetes C fehérje, rekombináns teljes hosszúságú vagy csonkolt C fehérje, vagy ultrahanggal besugárzott teljes mikoplazma sejt) vonunk be 0,045 mól/1 nátrium-karbonát pufferben (pH = 9,6). Az antitestek nem specifikus kötődését 5 tömeg%-os zselatinnal, PBS-ben (10 mmól/1 nátrium-foszfát és 0,15 mól/1 nátrium-klorid, pH = = 7,4) blokkoljuk. A primer antitestek (vakcináit sertés szérum) higitási sorozatát PBS, 1 tömeg% zselatin és 0,05 tömeg% Tween 20 elegyében vesszük fel, és az antigénhez kötjük, majd mossuk, és hozzáadjuk a fenti pufferben a kecske antisertés IgG-vel (Kierkegard and Perry) kapcsolt szekunder antitest peroxidázt. Mosás után TMB Microwell peroxidáz szubsztrátumot (Kierkegard and Perry) adunk hozzá, és az elegyet 2-5 percen keresztül szobahőmérsékleten reagáltatjuk. A reakciót azonos térfogatnyi 1 mól/1 foszforsav hozzáadásával zárjuk le. A színes reakciótermékeket 450 nm hullámhosszon detektáljuk.

Az eredmények szerint a természetes C fehérjével vakcináit sertések széruma erős reakcióképességet mutat mindkét rekombináns fehérjével, ha a placébóval vakcináit kontroll91 ·· ···· · • · · · · · »·· · • · · >« ··· ··· hoz viszonyítjuk. A rekombináns fehérjék valamelyikével vakcináit sertések széruma szintén erős reakcióképességet mutat a természetes C fehérjével szemben. A természetes vagy rekombináns C fehérjével vakcináit sertések széruma erős reakcióképességet mutat az ultrahanggal besugárzott M. hyopneumoniae sejt antigénjével, mig a placébóval vakcináit kontrolinál ez nem mutatható ki.

I. Metabóliás inhibició teszt

Annak meghatározásához, hogy a C fehérjével vakcináit sertések szérumában jelenlévő antitestek közvetlen gátló hatást fejtenek ki az M. hyopneumoniae sejtek növekedésére, egy metabóliás inhibició tesztet végzünk. A Friis közegben (X-A. példa) a specifikus patogénektől mentes sertés szérumot vakcináit sertés szérumra cseréljük, és a sejtek növekedését a normál közegben mérhető növekedéshez viszonyítjuk. A tápközegben a fenol vörös színe vörösről sárgára változik, ami savtermelésre utal, ami az M. hyopneumoniae metabolizmusának normális terméke.

A placébóval vakcináit sertés szérum kismértékben gátolja a metabolizmust a normál közegü kontrolihoz képest. A természetes C fehérjével, teljes hosszúságú rekombináns c fehérjével, vagy csonkolt C fehérjével vakcináit sertések széruma azonban jelentős mértékben gátolja az M. hyopneumoniae metabolizmusát, amit a színváltozás késlekedése vagy elmaradása jelez. Ha a közeg pH értékét abban az időpontban • · »

- 92 megmérjük, amikor a normál közegü kontroll színét megváltoztatja (százszoros higitásu inokulumnál 3 nap), azt tapasztaljuk, hogy a C fehérjével végzett vakcinálás lényegesen csökkenti a savtermelést. A normál közegü kontroll pH = 6,7 értéket, mig a vakcináit csoport öt átlag alapján a természetes C fehérje esetében pH = 7,5 értéket, a teljes hoszszuságu rekombináns C fehérje esetében pH = 7,6 értéket, és a csonkolt C fehérje esetében pH = 7,5 értéket mutat. A placébóval vakcináit kontroll csoport széruma pH - 7,0 értéket mutat. Az inokulálatlan normál Friis közeg pH = 7,5 értékkel rendelkezik.

J. Vakcináit sertés szérum Western folt analízise

A fehérje mintákat az X-B4. példában leirt módon SDS-PAGE eljárással elválasztjuk, azzal a különbséggel, hogy 0,75 mm vastagságú gélt használunk, és a mintát felvitel előtt 2,5 mól/1 2-merkapto-etanollal redukáljuk. A fehérjéket nitrocellulóz lemere (Schleicher és Schuell, BA-83, pórusméret 0,2 μιη) visszük át a Polyblot transzfer rendszerrel (American Bionetics) a gyártó által javasolt puffer alkalmazásával 30 perc alatt 100 V feszültségen. A nem specifikus kötést 1 tömeg% borjuszérum albuminnal (Pentex, IV.

frakció, Miles Diagnostics) blokkoljuk TBS-ben (10 mmól/1 Trisz és 0,5 mól/1 nátrium-klorid, pH = 8,0). A primer antitestet (vakcináit sertések széruma) 1:200 arányban hígítjuk 0,2 tömeg% Tween 20-at (Sigma) tartalmazó TBS-sel szobahő93 • · ·♦»· · • · 4> · · • · ··· · • · · ·« ♦*· ·· mérsékleten 4-16 órán keresztül. A meg nem kötött antitestet 0,2 tömeg% Tween 20-szal kiegészített TBS-sel kimossuk (háromszor 10 percen keresztül szobahőmérsékleten rázzuk). A második antitestet (peroxiddal konjugált nyúl antisertés IgG, Cappel) ugyanabban a pufferben kötjük meg szobahőmérsékleten 2-4 óra alatt. A meg nem kötött antitestet és a szubsztrátumba merült foltot (300 μιηόΐ/ΐ 4-klór-l-naftol, 0,03 tömeg% hidrogén-peroxid, TBS és 10 % metanol elegyében) kimossuk. A reakciót a folt desztillált vízzel történő Öblítésével állítjuk meg.

A vizsgálat eredményei szerint a természetes C fehérjével vakcináit sertések széruma erősen kötődik (1) a teljes hosszúságú rekombináns C fehérjét kifejező E. coli pT5T:M852-l törzsből elválasztott fehérjéket tartalmazó Western eljárással kapott folban lévő kd sávhoz; és (2) a csonkolt C fehérjét kifejező E. coli pT5T:M851-B2B törzsből származó fehérjéket tartalmazó mező mintegy 50 kd sávjához.

Mindkét sáv a fenti törzsek által termelt rekombináns C fehérjének felel meg. A rekombináns C fehérjék egyikével vakcináit sertések széruma pedig erősen kötődik az M. hyopneumoniae 7S extraktumot (X-A3 példa) tartalmazó mező 85 kd sávjához, ami a C fehérjének felel meg.

K. Vakcináit sertések sérüléseinek hisztológiai analízise

A vakcinálási kísérletek során 15 sertésből álló három csoportból gyűjtött tüdő mintákon mikroszkópiailag vizsgáljuk a Mycoplasma pneumonia által okozott sérüléseket. A három csoport a rekombináns C fehérjével vakcináit csoport, a csonkolt C fehérjével vakcináit csoport és a placébóval vakcináit csoport. Minden tüdőnél egy sértetlen részből származó mintát és egy sérült részből származó mintát vizsgálunk, egy állat kivételével, ahol az IFA vizsgálat és a tenyésztés után sérült részből származó minta nem maradt.

Kiterjedt nyirokszövet tulfejlődés mutatható ki mikroszkopikusan a légutak és a kapcsolódó edények körül 9/16 placébó, 5/15 C fehérje és 7/15 csonkolt C fehérje vakcina csoportban. Hörgőközi pneumonia mikroszkopikus sérülései mutathatók ki 11/15 placébó, 6/15 C fehérje és 7/14 csonkolt C fehérje vakcina csoportban. A hörgőközi pneumoniát akut (ödéma és főként neutrofil leukocita) vagy krónikus alveolitisz (limfociták, plazmasejtek, makrofágok és neutrofil leukociták) jellemzik 11/15 placébó, 6/15 C fehérje és 7/25 csonkolt C fehérje vakcina csoportban. A tüdő sérülésmentes részéről származó mintákban nyirokszövet tulfejlődés háttere (1+) és hörgőközi pneumonia nem mutatható ki.

Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy a mikoplazmózissal együttjáró mikroszkopikus sérülések elterjedtebbek a placébó vakcinacsoportban, ami összhangban van a durva megfigyelé « ·· ·*·* · ·· Ο · Λ ·· <· · · · ·· · sekkel. Emellett, a hörgőközi pneumonia akut alveolitisz komponense gyakrabban jelentkezik a placébó csoportban, mint a rekombináns C fehérjével kezelt csoportban.

XI, példa

Más fajtákon történő alkalmazás

A Mycoplasma hyopneumoniae sertésekben enzootikus pneumoniát okoz. Más mikoplazmák más szervezetekben hasonló légzési betegségeket okoznak. így például az M. pneumoniae embereknél, az M. gallisepticum csirkéknél és az M. bovis szarvasmarháknál. Nagyon valószínű, hogy ezeknél a mikop.lazma fajtáknál is a C polipeptiddel homlóg felületi fehérjék találhatók, amelyek vakcinaként alkalmazhatók a fenti fertőzőkkel szemben. Ezeket a homológ fehérjéket kódoló gének izolálhatok úgy, hogy a C polipeptid gént mintaként alkalmazzuk a többi mikoplazma fajtából készített rekombináns DNS tár kevésbé szigorú körülmények között végzett DNS hibridizálásához. A rekombináns tár a VIII-A1 példában ismertetett pUC18 tárhoz hasonlóan állítható elő, és különböző szigoruságu körülmények között a VIII-A2 példában leirt módon R69 mintával vizsgálhatók. A DNS hibridizálást a kevésbé szigorú körülmények között 32 °C hőmérsékleten végezzük 30 tömeg% formamid 5X SSPE, 1 tömeg% SDS, 0,1 tömeg% nátrium-pirofoszfát, 0,15 mg/ml tRNS és 0,125 mg/ml ultrahanggal besugárzott lazac sperma DNS alkalmazásával. A kezdeti mosást ugyanebben a pufferben (minta nélkül, tRNS és ·

- 96 ultrahanggal besugárzott lazac sperma DNS) végezzük 32 °C hőmérsékleten (háromszor 10 percen keresztül), és a szűrőket a mintákkal hibridizálódó kiónok autoradiográfiás meghatározásához röntgen filmen exponáljuk. Ha ezek a körülmények túl gyengék, amit a filmen a túl nagyszámú pozitív klón jelez, a szűrőket szigorúbb körülmények között mossuk, amikoris a formamid koncentrációját 5 tömeg%-os lépésekben, és/vagy a mosás hőmérsékletét 5 °C lépésekben növeljük. Minden lépés után meghatározzuk a pozitív hibridizált kiónok számát. A paraméterek megfelelő kombinációjával kiiktatjuk a legtöbb hamis háttér jelet, és a visszamaradó, valóban pozitív kiónok a további vizsgálathoz felhasználhatók.

Az igy izolált pozitív kiónokból származó inszertet szekvenáló vektorba szubklónozzuk, és szekvenáljuk (lásd a VIII-B példában megadott eljárást, és általános stratégiát). A kódoló szekvencia aminoterminális részét és leolvasó keretét a C fehérjegén szekvenciájával történő összehasonlítás alapján határozzuk meg. Egy UGA kodon pozíciójának azonosítása után a kodon cseréjét és a kifejeződést meggyorsító további módosításokat a C fehérjegénnel kapcsolatban leirt általános előírás alapján (IX-A és IX-B példa) végezzük. A rekombináns fehérjék kifejezése, tisztítása és vizsgálata a fehérjék tulajdonságaitól függ (ami feltehetően hasonló a C polipeptidhez, és elvégezhető a IX-C4, X-B, X-C és X-D példa szerint), és befolyásolja továbbá a vizsgálathoz kiválasztott állat fajtája is.

Lehetséges az is, hogy az M. hyopneumoniából származó • « ·

- 97 rekombináns C fehérje védőhatást fejt ki más fajokkal szemben is. A rekombináns C fehérje közvetlen vakcina kísérletekben más Mycoplasma fajtákkal fertőzött állatokon vizsgálható.

XII. példa

C fehérje fragmensek és peptidek alkalmazása vakcinaként vagy diagnosztikumként

Fennáll annak a lehetősége, hogy a C fehérje fragmensei vakcinaként vagy diagnosztikai célokra alkalmazhatók. Ezek a fragmensek különböző módszerekkel előállithatók:

(1) A C fehérjegén egy szakaszát rekombináns kifejező vektorba klónozzuk, és a fragmenst rekombináns fehérjeként a csonkolt C fehérjéhez hasonló módon előállítjuk. Ez megvalósítható a fehérje tetszőleges szakaszával vagy a szakaszok tetszőleges kombinációjával.

(2) A rekombináns C fehérjét endoproteinázokkal, igy endoproteináz LysC enzimmel vagy kimotripszinnel az aminosav szekvenáláshoz alkalmazott peptidek előállításához hasonló módon (VIII-D3 példa) emésztjük, és az emésztett terméket reverz fázisú kromatográfiával vagy más kromatográfiás technikával tisztítjuk.

(3) A C fehérje szakaszainak megfelelő peptideket peptid-szintetizátor, igy Applied Biosystem Inc.

430Α modell segítségével kémiailag szintetizáljuk. Ez utóbbi módszer főleg rövidebb peptidek (legfeljebb 30 aminosav) alkalmazható, de hosszabb peptidek esetében sem zárható ki.

A C fehérje aminosav szekvenciájának azon szakaszai, amelyek feltehetően antigén hatással rendelkeznek, előnyösen kiválaszthatók egy olyan komputerprogramm segítségével, amely vizsgálja az egyes szakaszok hidrofilitását, amelyekről feltételezhető, hogy a fehérje felületén helyezkednek el (Hopp és Woods: Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78, 3824-3828 (1981)). Mivel a C fehérje denaturált fehérjeként is szignifikáns védőhatást fejt ki, ugyanez a fehérje különböző szakaszairól is feltételezhető. A C fehérje aminosav szekvenciájának bármely szegmense vagy a szegmensek tetszőleges kombinációja potenciálisan alkalmazható vakcinaként vagy diagnosztikai célokra.

A vakcinaként szolgáló peptid fragmenssel kapcsolatban feltétel, hogy a természetes C fehérjével szemben immunválaszt váltson ki (ha ezt sertésekben vakcinaként használjuk, lásd X-E példa). Az ilyen válasz kimutatható például Western folt analízissel, amely igazolja, hogy a fragmenssel vakcináit sertések széruma felismeri a C fehérjét tartalmazó Western folt 85 kd fehérjének megfelelő sávját. A C fehérjével szembeni sejten belüli immunválasz kimutatható továbbá a T-limfociták szaporodásának vizsgálatával (Schwartz és munkatársai: J. of Immunoi. 115. 1330 (1975)).

A diagnosztikai célokra alkalmazott fragmenssel szemben • ·· ···· · ·· · · · ·· • · · · · · · ··· ·· ·*· β· ·

- 99 feltétel, hogy az M. hyopneumonia által fertőzött sertések széruma analitikai módszerrel, így ELISA vizsgálattal (X-H. példa) kimutassa az illető fragmenst.

Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti megoldás különböző mértékben módosítható és változtatható. Az oltalmi kör minden olyan módosításra és változtatásra kiterjed, ami nem érinti a találmány szerinti megoldás lényegét .

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Mycoplasma hyopneumoniae-ből származó, lényegében tiszta fehérje, amely lehet A fehérje, B fehérje, C fehérje, D fehérje és E fehérje.
2. lambda fág gtll klón, amely lehet R60b, LMHC1-9, R69, 86-4 és Pl klón.
3. Eljárás Mycoplasma polipeptidekkel analóg, és antigén válasz kiváltására alkalmas polipeptidek rekombináns DNS technikával történő előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) Mycoplasma szervezetek által termelt polipeptidek antigén tulajdonságaival analóg antigén tulajdonságokkal rendelkező polipeptidet kódoló DNS szekvenciát állítunk elő;

b) a DNS szekvenciát gazda mikroorganizmusba bevihető és elszaporitható vektorba, igy a DNS szekvenciára vonatkozó operációs elemeket tartalmazó vektorba klónozzuk;

c) a DNS szekvenciát és az operációs elemeket tartalmazó vektort az antigén polipeptid kifejezésére alkalmas gazda mikroorganizmusba visszük be;

d) a gazda mikroorganizmust a vektor alkalmazásához és a polipeptid kifejezéséhez szükséges körülmények között tenyésztjük; és

e) tetszőleges sorrendben

i) a polipeptidet betakarítjuk, és ii) a polipeptidet hajtogatva kialakítjuk a

Mycoplasma szervezet által termelt polipeptidek antigén tulajdonságaival analóg antigén tulajdon«·*

- 101 sághoz szükséges szerkezetet.
4. Lényegében tiszta fehérje, amely lehet C fehérje, csonkolt C fehérje (mintegy 50 kd), a C fehérjével lényegében homoló fehérje és a C fehérje antigén fragmense.
5. A 4. igénypont szerinti fehérje, amely 1. ábra szerinti aminosav szekvenciával rendelkező fehérjét tartalmaz.
6. A 4. igénypont szerinti fehérje, amely 3. ábra szerinti aminosav szekvenciával rendelkező fehérjét tartalmaz, ahol az aminosav szekvencia a 3. ábrán megadott pozícióban található.
7. A 4. igénypont szerinti fehérje, amely a 4. ábra szerinti aminosav szekvenciával rendelkező fehérjét tartalmaz.
8. A 4. igénypont szerinti fehérje, amely 5. ábra szerinti aminosav szekvenciával rendelkező fehérjét tartalmaz.
9. A 4. igénypont szerinti fehérje, amely 6. ábra szerinti aminosav szekvenciával rendelkező fehérjét tartalmaz.
10. A 4. igénypont szerinti fehérje, amely 7. ábra szerinti aminosav szekvenciával rendelkező fehérjét tartalmaz.
11. Lényegében tiszta DNS szerkezet, amely C fehérjét, csonkolt C fehérjét (mintegy 50 kd), a C fehérjével lényegében homológ fehérjét és/vagy a C fehérje antigén fragmensét kódolja.
12. A 11. igénypont szerinti DNS szerkezet, amely 1. ábra szerinti szekvenciával rendelkezik.
13. A 11. igénypont szerinti DNS szerkezet, amely 2. ábra szerinti szekvenciával rendelkezik.

• ·4·

- 102 -
14. A 11. igénypont szerinti DNS szerkezet, amely a 2. ábra 1801-3672 számú nukleotidja közötti szekvenciával rendelkezik.
15. A 11. igénypont szerinti DNS szerkezet, amely a 4. ábra szerinti szekvenciával rendelkezik.
16. A 11. igénypont szerinti DNS szerkezet, amely az 5. ábra szerinti szekvenciával rendelkezik, ahol a szekvencia az 5. ábrán nagy betűkkel jelzett módosított szekvenciának felel meg.
17. A 11. igénypont szerinti DNS szerkezet, amely a 6. ábra szerinti szekvenciával rendelkezik.
18. A 11. igénypont szerinti DNS szerkezet, amely a 6. ábra 1-1875 számú nukleotidja közötti szekvenciával rendelkezik.
19. A 11. igénypont szerinti DNS szerkezet, amely az 1. ábra szerinti aminosav szekvenciát vagy az 1. ábra szerinti aminosav szekvenciával lényegében homológ aminosav szekvenciát kódol.
20. A 11. igénypont szerinti DNS szerkezet, amely a 7. ábra szerinti szekvenciával rendelkezik.
21. A 11. igénypont szerinti DNS szerkezet, amely a 7. ábra 1 és 1294-1299 számú nukleotidja közötti szekvenciával rendelkezik.
22. Expressziós szerkezet, amely C fehérjét, csonkolt C fehérjét (50 kd), a C fehérjével lényegében homológ fehérjét és/vagy a C fehérje antigén fragmensét termeli.
23. A 22. igénypont szerinti expressziós szerkezet • «4» • « • · · ·

103 szükebb körét képező pT5T::M851 szerkezet.
24. A 22. igénypont szerinti expressziós szerkezet szükebb körét képező pT5T::M852 szerkezet.
25. A 22. igénypont szerinti expressziós szerkezettel transzformált gazda mikroorganizmus.
26. A 25. igénypont szerinti gazda mikroorganizmus szükebb körét képező pT5T::M852-l gazda.
27. A 25. igénypont szerinti gazda mikroorganizmus szükebb körét képező pT5T::M851-B2B gazda.
28. Mycoplasma fertőzések állatban történő gátlására alkalmas vakcina készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a Mycoplasma fertőzés gátlására alkalmas mennyiségben C fehérje, csonkolt C fehérje (50 kd), a C fehérjével lényegében homológ fehérje, és a C fehérje antigén fragmense közül legalább egyet tartalmaz biológiailag alkalmazható hordozóanyag mellett.
29. Eljárás állatok vakcinálására a Mycoplasma fertőzés gátlására, azzal jellemezve, hogy az állatnak olyan vakcina készítményt adunk, amely hatóanyagként a Mycoplasma fertőzés gátlására alkalmas mennyiségben C fehérje, csonkolt C fehérje (50 kd), a C fehérjével lényegében homológ fehérje és a C fehérje antigén fragmense közül legalább egyet tartalmaz biológiailag alkalmazható hordozóanyag mellett.