HUT62332A - Process for producing activator protein acting on biosynthesis of macrolids and gene coding for same - Google Patents

Process for producing activator protein acting on biosynthesis of macrolids and gene coding for same Download PDF

Info

Publication number
HUT62332A
HUT62332A HU9202420A HU9202420A HUT62332A HU T62332 A HUT62332 A HU T62332A HU 9202420 A HU9202420 A HU 9202420A HU 9202420 A HU9202420 A HU 9202420A HU T62332 A HUT62332 A HU T62332A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
leu
arg
ctg
gly
gcc
Prior art date
Application number
HU9202420A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9202420D0 (en
Inventor
Ramachandra Nagaraja Rao
Jan Ross Turner
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of HU9202420D0 publication Critical patent/HU9202420D0/hu
Publication of HUT62332A publication Critical patent/HUT62332A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1292—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

A makrolid antibiotikumokra a raakrociklikus laktongyürü - az aglükon - jelenléte a jellemző /lásd általában a Macrolide antibioticsiChemistry, Biology and Praetice;
S. Omura, szerk. Academic Press, New York/. Az aglükönhöz egy vagy több dezoxxx-cukor kapcsolódik. A cukrok aciláltak lehetnek. A makrociklikus gyűrű általában 12-,14-, vagy 16-tagu, de nagyobb gyűrűk is ismertek. A makrolid antibiotikumok hatásmechanizmusa magába foglalja a fehérje szintézis gátlását.
A makrolid antibiotikumok igen hatásosak olyan grampozitiv mikroszervezetekkel szemben, mint a Staphylococcus, Streptococcus és a Diplococcus és hatásosak az olyan gram-’ negatív szervezetekkel szemben is mint a Neisseria gonorrhea és meningitidis, Bordatella pertussis és a Haemophilus influensae, ugyanott a 26. oldalon. Az összes fent felsorolt törzs komoly betegségek okozója lehet. A makrolidokat - ideértve a spiramicint és a tilozint - alacsony toxicitásuk miatt orvosi és állatorvosi területeken klinikai használatba vették, ugyanott 27. oldal.
A makrolidok családjába tartozó vegyületek, melyeket makrociklikus laktönökként is említenek, az antibiotikus aktivitáson túl is rendelkeznek előnyös tulajdonságokkal. Például az PK5o6 lehetséges immunoszuppressziv aktivitással rendelkezik, igy ígéretesnek bizonyul a szervátültetésekkor felmerülő kilökődés, a reumatoid arthritis és számos más . · . ·: ·; * . , . · · ··· ·· ·
- 3 autoimmunos állapot gátlását szolgáló terápiás alkalmazásban. Más makrolidok, mint pl. az avermektin az inszekticid és féregellenes aktivitást magába foglaló tulajdonságokkal rendelkeznek.
A makrolidok óriási klinikai jelentősége miatt kiemelkedő fontosságú a megfelelő bioszintetikus reakcióutak enzimjeinek termeléséért felelős gének klónozása. A gének az enzimszint organizmusban való emelésére használhatók, melynek következtében az antibiotikum termelés hatékonysága növelhető /Chater, 199o, Biotechnology 8:115-121/. A gének a különböző' enzimtermelők között átvihetők a hibrid antibiotikumok létrehozása céljából, mivel a bioszintetikus enzimek némelyike laza” szubsztrát specifitást mutat./Sadakane et al., 1982, J.Antibiotics 35: 68o-687; Hopwood, 1989, Philo Trans-R.
Soc. Bond. B324:549-562; Hutchison et al., 1989» Drug Discovery and Development Through The Energetic Engineering of Antibiotic-Producing Microorganisms, J.Med.Chem.32: 929937/. Továbbá a klónozott gének szubsztrátként szolgálhatnak mutagenezishez, mely a szubsztrát specifitásban bekövetkező változásokhoz vezethet. A gének a mutáns géneket tartalmazó törzsek előállításához is használhatók a találmány módszerének felhasználásával.
A fent leirt cél, az antibiotikum szintetikus reakcióutak klónozásának, elérésében van egy jelentős akadály, nevezetesen az ilyen reakcióutakkal rendelkező mikroorganizmusok azonosításának nehézsége. Történelmileg az antibiotikumok :
··· i
- 4 felfedezése akkor történt, amikor baktérium- és gombaelle> . nes aktivitásra vizsgáltak fermentációs tápleveseket. Egy ilyen megközelítés nem megfelelő abban, hogy a bioszintetikus reakcióutat csupán a termék az ezen termék termeléséhez vezető bioszintetikus reakcióuttól való logikus függő-'. sége foglalná magába. A 4·935,34ο számú U.S. Szabadalom bemutatja az antibiotikum rezisztencia gének a makrolid bioszintetikus reakcióutak felderítésére szolgáló próbákként a való alkalmazását. Azonban számos mechanizmus,mely révén az antibiotikumokkal szembeni rezisztencia elérhető, valamint a makrolidok, mint pl. az FK5o6 és az avermektin, nem antibiotikumként való alkalmazásai azt sugallják, hogy számos makrolid bioszintetikus reakcióut megszökhet a 4,935,34o számú U.S. szabadalom detektálási módszere elöl.
A találmány biztositja a makrolid bioszintetikus reakcióut egy szabályozó /aktivátor/ génjét, az srmR-t. Az srmR a makrolid bioszintetikus reakcióutakon belüli gének transzkripciós hatékonyságát fokozzák. Az srmR-t tartalmazó rekombináns DNS vektorok igy hasznosak a makrolidok termelési szintjeinek növelésében. Az srmR . hasznos a további makrolid bioszintetikus reakcióutak detektálására szolgáló . hibridizációs vizsgálatokban is. A találmány az srmR gént promóterének irányítása alatt biztosítja. Az srmR gén transzlációs terméke szintén hasznos az olyan antitestek létrehozá sában, melyek alkalmazhatók más makrolid bioszintetikus reakcióutak detektálásában.
A következőkben megadjuk a találmány rajzainak rövid leírását .
1. ábra: A pKC644-es kozmid egy restrikciós helye és funkciós térképe.
2. ábra: A Streptomyces ambofaciens Spiramicin Bioszintetikus Gén Régiójának egy restrikciós térképe.
A találmány magába foglalja azt a meglepő felfedezést, miszerint a Streptomyces ambofaciens makrolid bioszintetikus reakcióutjának srmR génje a S.ireptomyces ambofaciens /NRRL 19263/ makrolid bioszintetikus reakcióutjának pozitív regulátóraként /aktívátóraként/ szolgál.
A pKV644-es kozmid tartalmazza a Streptomyces ambofaciens genom egy kb, 32 kb-u szegmentjét. A pKG644-es kozmid a Northern Régiónál Research Laboratorytól /Peoria, IL /NRRL// szerezhető be az NRRL 18238-as katalógus számon. A találmány srmR génje a pKC644-es kozmid kb. 32 kb-u inzertjén belül helyezkedik el, igy a pKC644-es kozmid a találmány srmR génjének alkalmas forrásaként szolgál.
A pKC644-es kozmid az 1988 junius 7-én iktatott o7/ 2o3,387 számú U.S. Szabadalmi Alkalmazásban került leírásra.
A kényelem kedvéért a pKC644-es kozmid egy restrikciós endonukleáz térképét az 1. ábrán mutatjuk be. A Streptomyces ·- ambofaciens genomből származó pKC644 inzerten belül elhelyezkedő makrolid bioszintetikus gének elrendeződését a 2. ábrán mutatjuk be. Amint a 2» ábrából nyilvánvaló, az srmR gént számos restrikciós endonukleáz felismerő szekvencia szegélyezi.
Az srmR gén nukleotid szekvenciáit ideértve promóterét is /a transzkripciós aktiváló szekvenciát/ az alábbiakban az ID1 Szekvenciában mutatjuk be.
Az IDi Szekvencia
TGCTCGTTCC
TATGCCTCGT
GGCCTTTATG
CCGGATATCG
TCGAATAGAG CGAACGGTCA CTGTCAATGC
GCCGGAAATC
TCACCGCAGC
GAATTCATTT
GCCATGAAGC
TATGTCCTCC
CCTCGGTCGA
TTTGGTAAAG
ACGGTGTGGC
GGTTGAAGAG
CCACCGTGCG
CCCGGCCTTT
GCTGAAGCCG
TCTAGACGGA
CACAGGGATG
CCCCGGGCCA GCAGCCTTCA GCAAGACCCC CAGCCAGGGG GCGAAGACGG ATCCTTGAAA GGGGTGCCTG
CCGGGTAGCT ACCGCGGCCG TGAAGGAGGG CCCTCTCTTG ACGAAGGGGA
GCGTAATAGC CGGG ATG AGT
GAG CTG GGT TGT GGT GAA GAA GGG TCC GAA GAA GAC GAG TCG GAC
GAC GCA CTC GCG TTC CTC GAG TTC ATC GCC CGG TCG GCA CCA CGG
AGG GAA TAC GAC CGG CTC ATG GCC CGC GCC GAA CGC TCG GGC
GGC GAG GAG GAC CGG ATG CGC CGA CTG GAG CGC TTC AAC CGG
CTC GCG CTC ACC GCG CAG TCG ATG ATC GAG TAC CGC CGC GAC CGG
GAG GCG GAG CTC GCG GCC CTG GTC GAC GCC GCG CAC GAG TTC GTC
GCC GCG GGG CGG GGG AAG GAC CTG CTG GAG TCC ATC GCC CGG AGA
GCA CGG CTG CTG CTG AAG CTG GAC GTC TCC TAC GTC GGC CTG CAC
GAG GAG GAC CGG CCC GGC ACG GTG GTG CTG AGC GCC GAC GGC AAC
GCG GTC AAG GTC GCC GAG AGC TAC CGG CTG CCG GCC GAC GGC GGA
CTG GGC GCC ATG GTG CGC ACC TGC CGC GCT CCC TTC TGG ACC CCG
GAC TAC CTC GGG GAC AAC AGC TTC ACG CAC GTC GAG GCC GTC GAC
GAC ATC GTC CGC GCC GAA GGC CTG GGC GCG GTC CTG GCC GTC CCG
CTG TGC GCC GGG GGC GAA CCG ATG GGG GTC CTC TAC GTC GCC GAC
CGT CAG GTG CGG CAT CTG ACC CCC AAC GAG GTC ACC CTG CTG TGC
TCG CTC GCC GAT CTG GCC GCG GTG GCG ATC GAG CGC AAC CGG CTG
GTC GAG GAG CTC CAC GAC ACC ATC GGG CAA CTG CGC CAG GAC ATC
GGC GAG GCC CGC ACC GCC CTC GCG CGC ACC CGC AGG TCC GCC GAC
CTC CAG TCG CAC CTG GTC ACG CAG GTG ATG GAC AGG CGC GGC GCC
GAC TCG TTA CTC GCG ACG GCC GCC GAG GCG CTC GGC GGC CCA GCC
GGC CTG TGC AGC CCG CTC GGG CGC CCG CTC GCC GAG' TAC GGG ACC
CTG CGC CCC GTC GCC CCC ACG GAA CTG CGC GCG GCG TGC CGC CGG
GCC GCC GAG ACC GGC CGG CCC ACC TCC GTG GCC CCG GGG GTC TGG
ACG GTG CCC CTG CTT CCC GGG GGC AAC GCC GGC TTC CTG CTG ACC
GAC CTC GGT CCG GAC GCG GAC CAC ACC GCC GTC CCC CTG CTC CCG
ATG GTC GCC CGC ACC CTC GCG CTG CAC CTG CGC GTC CAG CAC GAC
GAC TCC CCC AAG GCG CAG AGC CAC CAG GAG TTC TTC GAC GAC CTG
ATC GGG GCG CCC CGC T.CA .CCC ACG CTC CTC AGG GAA CGC GCC CTG
ATG TTC TCC CTC AGC TTC CGC CGC CCG CAC GTG’, ’ GTG CTG GTG GCG
GGC GGA CCC CGC GGG ACC TCG CCG CGG CTG GAC CGG TCC GGC GCC
GAC TAC GCG AAG GAG CTC GGC GGG CTG TGC AGC GTG CGG GAC GGC
GCC GTC GTC CTG CTG CTG CCC GGC GAC GAC CCC GTC GCC GTG GCG
- 8 t· · ··
V
CAG ACC GCC GCC CCG GAG CTG ACC GAC CGC GCC GGG CAC CCC GTC
ACG GTG GGG GTC GCG GGC CCC GCC TCG ACC GTC GAC GGC ATC GCC
GAG GCG CAC CGT GAG GCC GCG AAG TGT CTG GAG ACC CTC CGC GCG
- CTC GGC GGC GAC GGC GGC ACC GCG TGC GCC TCC GAC CTG GGT TTC
CTG GGC ATG CTC CTC GCC GAG GAG AAC GAC GTC CCC GGT TAC ATC
AGG ACG ACG ATC GGC CCC GTG GTC GAC TAC GAC ACC CAC CGC TTC
ACG GAT CTG GTT CCC ACT CTG AGG GTG TAC CTG GAG TCG GGC AGG
AGC CCC ACG CGT GCC GCA GAG ACA CTG CGC GTG CAC CCG AAC ACC
GTC TAC CGG CGG CTG GAG CGC ATC GGC GTA CTG CTG GGA GAG GAC
TGG CAG TCA CCG GAG CGG GTG CTG GAC ATA CAA CTG GCC CTG CGG
CTC TAT CAG GTG CGC TGG GCG CTC TCC TCG CAA CCG GCG TCC GAG
ACC CGG GCC GTG CTC GGA TCG CTG CGC GAG TGA
Az ID1 Szekvenciában aláhúzással jelöltük a -35 és a -lo helynél levő szekvenciákat, ahol az RNS polimeráz kötődhet a transzkripció iniciálása céljából· Az is egyértelmű, hogy az ID1 Szekvenciában három lehetséges transzlációs iniciációs kódon szerepel, melyeket vastag betűvel jelöltünk.»
A pKC644 plazmid srmR génjét felhasználó komplementációs kísérletek kimutatták, hogy az srmR képes a makrolid bioszintetikus gén transzkripcióját visszaállítani srmR gén defektes mutánsokban az S. ambofaciens genom ezen régiójának inzertációs inaktiválásának köszönhetően. Lásd Richardson et al. /199o/ J, Bacteriol. 172:3790-3798. Integráló vektorokat felhasználó vizsgálatok megállapították, hogy az srmR képes ilyen mutánsokat komplementéin!, raig csökkentik a homológ rekombinációt, ezért létrehozzák az srmR azon képességét, hogy transz irányban működjön.
Az srmR géntermék azon képessége, hogy aktiválja a makrolid bioszintetikus gén transzkripcióját /növeli a szintjeit/ uj eszközt biztosit a makrolid bioszintézis hatékonyságának növeléséhez. Számos az srmR gént tartalmazó rekombináns DNS vektort szerkesztettek meg. Az általunk al~ kalmazott vektorokat és a S* ambofaciens genom régióját a 2. ábra illusztrálja. Az ilyen az srmR-t tartalmazó vektorok a o7/2o3,387 számú U.S. Alkalmazásban kerültek leírásra, melynek tartalmát, akárcsak a Richardson et al., supra, müvet a hivatkozás révén a találmányba építettük. A tudomány e területén képzett szakemberek méltányolják az srmR gén kihasználásán keresztül történő makrolid bioszintézis növelésére irányuló megközelítések sokoldalúságát, ahogy megvalósulnak a a o7/2o3,387 számú U.S. Alkalmazásban bemutatott különböző autonóm módon replikálódó és integrativ vektorokban és melyek a molekuláris biológusok szakértelmén belül vannak. Más a makrolid biosziiitetikus reakcióutak srmR általi aktiválásában hasznos vektorok közé tartoznak a tudomány számára jól ismert vektorok származékai, mint pl. a Streptomyces génsebészetében használatosak. Az ilyen vektorok közé tartoznak az ezekre való korlátozódás nélkül az 1. Táblázatban bemutatott vektorok.
Ιο -
1. Táblázat
Streptomyces plazmidok
Plazmid
Gazda
Katalógusszám
SCP2 Streptomyces coelicolor A3/2/ NRRL lpo42
SCP2X Streptomyces coelicolor Mloo NRRL 15o41
pEIi? Strepxomyces ambofaciens/pEL7 NRRL 12523
pUC6 Streptomyces espinosus KRRL 11439
pUC3 Streptomyces 3o22A KRRL 11441
SLP1 Streptomyces lividans KCIB1 ' 11417
pfflíloo Streptomyces Virginiáé KRRL 15156
pELlo3 Streptomyces granuloruber
A399 -12.13/pELlo3 KRRL 12 549
pIJ7o2 .Streptomyces lividans ATCC2 39155
National Collection of Industrial Bacteria /NCIB/, Torry
Research Station, Post Office Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen
AB98DG, Scotland, Unixed Kingdom
American Type Culture Collection, Rockville, MD 2o852 *’*·’ ’ ? ·: λ ί— ·· · ·:* .*.·
- 11 \ így a találmány egy a makrolid bioszintetikus gének transzkripciós.hatékonyságának fokozására szolgáló módszert biztosit. A módszer tartalmazza egy makrolidot termelő sugárgomba transzformálását, mely érzékeny az ilyen rekombináns vektorral való fejlesztésre. Ez a DNS vektor egy az említett sugárgombában funkcionáló transzkripciós aktiváló szekvenciához működőképesen kapcsolva tartalmazza az srmR gént. A transzformáció fogalma a találmányban való használat szerint a DNS egy gazdasejtbe való bejutását jelenti, bármely a következőkben felsorolt módszerrel, az ezekre való korlátozódás nélkül: transzdukció, transzformáció, konjugáció és elektroporáció. Egy mikroszervezet makrolid termelés srmR-rel való fokozással szembeni fogékonyságának meghatározása csupán rutin kísérleteket foglal magába.
A találmány srmB-rel való aktiválásához használatos meg felelő makrolid termelő mikroorganizmusok a 2. táblázatban bemutatott mikroorganizmusokat foglalják magukba.
- 12 ····
2. Táblázat
Makrolid-termelő mikroorganizmusok
Organizmus
Termék
Micromonospora rosarla
Streptomyces albireticuli albogriseolus albus albus var. coilmyceticus, ambofaciens antibioticus avermitillis bikiniensis bruneogriseus caelestis cinerochromogenes cirratus deltae djakartensis erythreus rosaramicin carbomycin miconomycin albomycetin coleimycin spiramycin és foromacidin D oleandomycin avermectinek chalcomycin albociklin
M188 és celesticetin cineromycin B cirramycin deltamycinek niddamycin erithromycin
2. Táblázat /folytatás/
Makrolid-termelő Mikroorganizmusok
Organizmus
Termék eurocidicus eurYthermus fasciculus felleus fimbriatus flavochromogenes methymycin angolamycin amaromycin argomycin és picromycin amaromycin amaromycin és shincomycinek
fradiae tylosin
fungicidicus 1U-181
fungicidicus var. espinomyceticus espinomycinek
furdicidicus mydecamycin
goshikiensis bandamycin
griseofaciens PA133A és B
griseoflavus acumycin
griseofuscus bundlin
griseolus griseomycin
griseospiralis relomycin
griseus borrelidin
2. Táblázat /folytatás/
Makrolid-termelő mikroorganizmusok
Organizmus termék.
Streptomyces griseus ssp. sulphurus halstedi hygroscopicus hygroscopicus s ub s p.
aureolacrimosus kitastoensis lavendulae loldensis macrosporeus maizeus mycarofaciens narbonensis narbonensis var.
olivochromogenes platensis rimosus iosamyceticus bafilomycinek karbomycin és leucanicid tylosin milbemycinek leucornycin és josamycin aldgamycin vernamycin A és B carbomycin
Ingramycin acetil-leukomycin és esplnomycin josamycin és narbomycin leucornycin A-^ és josamycin oleandomycin platenomycin tylosin és neutramycin • · · ·
2. Táblázat /folytatás/
Makrolid-termelő Mikroorganizmusok
Organizmus
Termék
rochei lankacidin és borrelidin
roseochromogenes albociklin
roseocitreus albociklin
spinichromogenes var. suragaoensis kujimycinek
tenaae karbomycin
thermotolerans karbomycin
venezuelae methimycinek
violaceoniger lankacidinek és
lankaraycin
Az srmR gén alkalmazható olyan próbák megszerkesztésében is, melyekkel a mikroorganizmusok gyorsan szkrinelhetők az aktivátor szekvenciákkal rendelkező makrolid bioszintetikus reakcióutak meglétére. Jól ismert a tudomány e területén, hogy a bioszintetikus reakcióutak összekapcsolódnak. Chater, 199o, Biotechnology 8:115-121; Sadakane et al., 1982, J. Antibiotics 35:68o-687; Hopwood, 1989, Phil. Trans-R.Soc.Lond. B324:549-562; és Hutchison et al., 1989, Drug Discovery and Development Through The Energetic engineering of Antibiotic-Producing Microorganisms J. Med. Chem, 32:929-937.
A találmány által biztosított srmR szekvenciája lehetővé teszi a képzett szakemberek számára, hogy az srmR gén kódoló régiójával reagáló próbát szerkesszenek meg. Az ilyen próbák jelölhetők a próbák detektálásának lehetővé tétele céljából, a próbával homológ DNS szekvenciához való kötődés révén. A próbák P-ral vagy biotinnal való jelölése jól ismert a tudomány számára. A 4,935,34o számú U.S. szabadalom, mely a hivatkozás révén a találmányba épül, jelölési technikákat és hibridizációs protokolt mutat be. Az oligonukleotid szintézis és jelölés, valamint hibridizációs protokollok szintén részletezésre kerülnek a következő müvekben: Sambrook, et al., Molecular Cloning /1982/ és Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology /1988/. így az srmR gén szekvencia a tudomány számára jól • · · ·
- 17 ismert jelölési és hibridizációs technikákkal kombinációban lehetővé teszik az srmR próbákkal hibridizáló aktivátor génekkel rendelkező makrolid bioszintetikus reakcióutak gyors detektálását. A képzett szakember felismeri, hogy az srmR kódoló szekvenciák különböző régióit képviselő próbák paneljait kell használni az ilyen makrolid bioszintetikus reakcióutak detektálásának optimalizálásához.
A makrolid bioszintetikus reakcióutak meglétének meghatározásához a szóbajöhető mikroszervezetek a sugárgombákra korlátozódnak. Az American Type Culture Collection felsorol számos ilyen mikroszervezetet, mig számos más szervezet olyan törzsgyüjteménytől szerezhető be, mint az NRRL / National Régiónál Research Laboratory, Peoria, IL/. A sugárgombák talajmintákból való izolálás! eljárásai jól ismertek·. Lásd Hopwood et al., Genetic Manipulatión of Streptomyces, A Laboratory Manual /1985/. Az érdeklődésre számot tartó 'DNS kifejezést a találmány céljaira a következőként határoztuk meg: egy sugárgombából egy genom könyvtárban preparált DNS vagy egy sugárgomba tenyészetének teljes DNS preparátuma. Az ilyen genom könyvtárak preparálása jól ismert a tudomány számára /lásd a 4>935,34o számú U.S. Szabadalmat; a Molecular Cloning supra c. müvet és a Current Protocolsdin Molecular Biology A Laboratory Manual, supra cimü müvet/.
A potenciális srmR transzlációs termék aminosav szekvenciáját az ID2 Szekvencia képviseli.
- 18 • · · · ·
Az ID2 Szekvencia
Met Ser Asp Leu Gly Ser Gly Glu Glu Gly Ser Glu Glu Asp Glu
Ser Asp Asp Alá Leu Alá Phe Leu Glu Phe Ile Alá Arg Ser Alá
Pro Arg Ser Glu Tyr Asp Arg Leu Met Alá Arg Alá Glu Ar& Ser
Gly Alá Asp Glu Asp Arg Met Arg Arg Leu Glu Arg Phe Asn Arg
Leu Alá Leu Thr Alá Gin Ser Met Ile Glu Tyr Arg Arg Asp Arg
Glu Alá Glu Leu Alá Alá Leu Val Asp Alá Alá His Glu Phe VA1
Alá Alá Arg Arg Gly Lys Asp Leu Leu Glu Ser Ile Alá Arg Arg
Alá Arg Leu Leu Leu Lys Leu ásp Val Ser Tyr Val Gly Leu His
Glu Glu Asp Arg Pro Gly Thr Val Val Leu Ser Alá Asp Gly Asn
Alá Val Lys Val Alá Glu Ser Tyr Arg Leu Pro Alá Asp Gly Gly
Leu Gly Alá Met Val Arg Thr Cys Arg Alá Pro Phe Trp Thr Pro
Asp Tyr Leu Gly Asp Asn Ser Phe Thr His Val Glu Alá Val Asp
Asp Ile Val Arg Alá Glu Gly Leu Arg Alá Val Leu Alá Val Pro
Leu Cys Alá Gly Gly Glu Pro Met Gly Val Leu Tyr Val Alá Asp
Arg Gin Val Arg His Leu Thr Pro Asn Glu Val Thr Leu Leu Cys
Ser Leu Alá Asp Leu Alá Alá Val Alá Ile Glu Arg Asn Arg Leu
Val Glu Glu Leu His Asp Thr Ile Gly Gin Leu Arg Gin Asp Ile
Gly Glu Alá Arg Thr Alá Leu Alá Arg Tjp· Arg Arg Ser Alá Asp
Leu Gin Ser His Leu Val Thr Gin Val Met Asp Arg Arg Gly Alá
Asp Ser Leu Leu Alá Thr Alá Alá Glu Alá Leu Gly Gly Gly Alá
Gly Leu Cys Ser Pro Leu Gly Arg Pro Leu Alá Glu Tyr Gly Thr
Leu Arg Pro Val Alá Pro Thr Glu Leu Arg Alá Alá Cys Arg Arg
Alá Alá Glu Thr Gly Arg Pro Thr Ser Val Alá Pro Gly Val Trp
Thr Val Pro Leu Leu Pro Gly Gly Asn Alá Gly Phe Leu Leu Thr
Asp Leu Gly Pro Asp Alá Asp His Thr Alá Val Pro Leu Leu Pro
Met Val Alá Arg Thr Leu Alá Leu His Leu Arg Val Gin His Asp
Asp Ser Pro Lys Alá Gin Ser His Gin Glu Phe Phe Asp Asp Leu
Ile Gly Alá Pro Arg Ser Pro Thr Leu Leu Arg Glu Arg Alá Leu
Met Phe Ser Leu Ser Phe Arg Arg Pro His Val Val Leu Val Alá
Gly Gly Pro Arg Gly Thr Ser Pro Arg Leu Asp Arg Ser Gyy Alá
Asp Tyr Alá Lys Glu Leu Gly Gly Leu Cys Ser Val Arg Asp Gly
Alá Val Val Leu Leu Lsu Pro Gly Asp Asp Pro Val Alá Val Alá
Gin Thr Alá Alá Pro Glu Leu Thr Asp Arg Alá Gly His Pro Val
Thr Val Gly Val Alá Gly Pro Alá Sser Thr Val Asp Gly Ile Alá
Asp Alá His Arg Glu Alá Alá Lys Cys Leu Glu Thr Leu Arg Alá
Leu Gly Gly Asp Gly Gly Thr Alá Cys Alá Ser Asp Leu Gly Phe
Leu Gly Met Leu Leu Alá Glu Glu Asn Asp Val Pro Gly Tyr Ile
Arg Thr Thr Ile Gly Pro Val Val Asp Tyr Asp Thr His Arg Phe
Thr Asp Leu Val Pro Thr Leu Arg Val Thr Leu Glu Ser Gly Arg
Ser Pro Thr Arg Alá Alá Glu Thr Leu Arg Val His Pro Asn Thr
Val Ser Arg Arg Leu Glu Arg Ile Gly Val Leu Leu Gly Glu Asp
Trp Gin Ser Pro Glu Arg Val Leu Asp Ile Gin Leu Alá Leu Arg
Leu Tyr Gin Val Arg Ser Alá Leu Ser Ser Gin Pro Alá Ser Glu
Thr Arg Alá Val Leu Gly Ser Leu Arg Glu
Az ID2 Szekvencia az srmR transzlációs termékek aminosav szekvenciáját képviseli, feltételezve, hogy a transzláció az ID1 szekvencia első ATG-jénél /ez a potenciális transzlációs • · · · · « · • ·· · • · ·· ··· • * · ···· * · · ·· ·· ····«····♦
- 2ο iniciációs kódon/ kezdődik. A tudomány e területén képzett szakember felismeri, hogy az adott srmR transzlációs tex-mék rövidebb lehet attól függően, hogy melyik ATG kódon szolgál transzlációs iniciációs kódonként, vagy másik lehetőségként három srmR aktivátor fehérje létezhet, melyek mindegyike a potenciális transzlációs iniciációs kódonok valamelyikénél ered. A transzlációs iniciációs kódon meghatározása a tudomány ismeretein belül eseik és csupán az szükséges hozzá, hogy az srmR fehérjét izolálják és N terminális szekvencia analízisnek vessék alá.
Az srmR gén transzlációs termékei hasznosak az olyan antitestek előállításában, melyekkel szervezetek lehet szkrinelni az olyan aktivátor fehérjék, mint az srmR jelenlétére, melynek jelenléte a makrolid bioszintetikus kapacitást jelzi. Az srmR transzlációs termék standard tisztítási módszerekkel izolálható immunogénként való használat céljából bármelyik az srmR expressziós vektorokkal - mint pl. a pKC644-gyel transzformált Streptomyces fajb'ól. Másik megoldásként és előnyöséhez aminosav szekvenciákat az srmR ismert aminosav szekvenciáiból szelektáljuk és szilárd fázisú aminosav szintézissel szintetizáljuk a rutinszerű immunizációs eljárásokban való alkalmazáshoz. A szilárd fázisú aminosav szintézis jól ismert a tudomány szájára. Az srmR-rel reaktív antiszérumok előállítására alkalmas immunizációs eljárásokat Immunológiai Módszertani Könyvek mutatják be, ilyen pl. a * · ·· · • · · í · *: ···. ··········»·
- 21 Mis he 11 et al., Selected Methods in Cellular Immunolog.v /198o/ és Langone et al., Methods in Enzymology 73° kötet, /1981/. Az srmR-rel reaktív antitestek jól ismert- . reagensekkel tisztíthatok - pl. Cianogén Bromid Aktivált Szefarózzal /Pharmacia Eine Cemicals/ mátrixként az immunogénként hasznositott aminosav szekvenciák párosításához, mely viszont affinitás kromatográfiás gyantaként használható az _srmR-rel reaktív antitestek tisztításához. Az affinitás! mátrixok létrehozásának és hasznosításának általános módszertana a Pharmacia termék irodalmában - melynek címe Affinity Chromatography - Principles and Methods kerül leírásra, mely igény esetén beszerezhető a Pharmaciától, valamint megtalálható a Methods in Enzymology 73« kötetében, supra.
A monoklonális antitest termelés hasonlóképpen jól ismert az immunológia tudományában. Lásd a Methods in Enzymology 73« kötetét, supra.
Az srmft-rel reaktív antitestek hasznosak az olyan aktivátor fehérjék detektálásában, mint pl. az srmR, számos' rutinszerű immunológiai analízis során: pl. az ELISA* bán, a radioimmunovizsgálatban és a hasonlókban. Lásd a Methods in Enzymology 73. kötetéi?, supra. Az ilyen immunovizsgálat alá vett szervezetek Starling J.J. et al., /1982/ Cancer Research 42:3o84 et seq. leírása szerint lizálhatók és száríthatok 96 üregű mikroszürő lemezekben.
♦ ··· • · ·· ··· • · · ·«·· • · · · ·· •· * · · · ······
- 22 Ezt követi a kérdéses minta /a szárított sejt lizátum/ srmR reaktív antitesttel való összehozása, mely antitest vagy köz12 5 vétlenül jelölhető olyan detexxor csoporttal, mint a alkalikus foszfatáz, torma-peroxidáz, avidin vagy másik lehetőségként az anti-srmR antitest szetektálható egy olyan másodlagos reagens hozzáadásával, mely specifikusan kötődik az srmR reaktív antitesthez és melyet detektor csoporttal jelöltünk. A Methods in Enzymology 73. kötete, supra, számos megközelítést részletez az immunovizsgálathoz, melyek bármelyike könnyen alkalmazható a találmány céljaira és melyek csupán rutin kísérletezést igényinek a kivitelezéshez.
A következőkben példákkal szemléltetjük a találmányt.
1. Példa
A pKC644-es kozmid izolálása
A pKC644-es kozmid /1. ábra/ a Northern Régiónál Research Center /NRRL, Peoria, IL, 616o4/ szerezhető be az E.coli K12 DK22 törzsben az NRRL B-18238 -as katalógus számon.
A pKC644-es kozmid DNS-t a találmány génjeinek izolálására hazsnáltuk, valamint a spiramycin bioszintetikus mutáns törzsek létrehozására. Az E.coli K12 DK22/pKC644 liofilezett • · ·
- 23 • · ·· • · · · alakját 2oo pg/ail apramycint tartalmazó L-agar lemezekre /lo g tripton, lo g NaCl, 5 g élesztőkivonat és 15 g agar per liter/ szélesztettük különálló telep^izolátum nyerése
tartalmazó L leves /L-agar, agar nélkül/ inokulálására használtuk és a nyert tenyészetet 3o C° hőmérsékleten levegőztetéssel inkubáltuk, mig a sejtek elérték a stacioner fázist.
A sejtekből a kozmid DNS-t Rao.et al., /1987 a Methods in Enzymology 153? 166-198; R.Wu and L. Grossman szerk. Academic Press , NY/ eljárásának megfelelően nyertük az alábbiakban leírtak szerint.
A sejteket 8ooo rpm fordulatszámon centrifugáltuk lo percig. Miután a felüluszót dekantáltuk a sejteket 7 ml 25 %-os szacharóz és 5o mM Tris-HCl /pH-8.o/ oldatában reszüszpendáltuk. Frissen készített lizoziraot /5 mg/ml-es oldat 0.25 ml mennyisége/ adtunk az oldathoz, o,5 26-os EDTA /pH=8.o/, o,4 ml mennyiségével és 5 mg/ml RN-áz A o,o5 ml mennyiségével együtt .A keveréket 15 percig inkubáltuk 37 C° hőmérsékleten. Ehhez Triton Litikus Keverék /15o mM Tris-HCl, pH=8,o, 3% Triton X-lo(^, 2oo mM EDTA/ o,75 ml mennyiségét adtuk, összekevertük és 15 percig jégen inkubáltuk. Ha a lizis nem volt teljes az inkubálást tovább . folytattuk kb. 5 percig 37 C° hőmérsékleten. A keveréket 2oooo rpm fordulatszámon 4o percig centrifugáltuk. A fe ···♦ · ··
- 24 lüluszót eltávolitottuk és megtartottuk. Egy CsCl gradienst készítettünk /1,55-ös sűrűségűt/ 28,65 g CsCl 31,2 ml DNS oldathoz való hozzáadásával. A grádiens oldatot összekevertük, hogy feloldódjon, majd nagy ultracentrifuga csövekbe vittük át. A csöveket megtöltöttük kb. o,6 ml etidiumbromiddal /lo mg/ml/ lezártuk és összekevertük.
A grádienst 49ooo rpm fordulatszámon 18 óráig centrifugáltuk. A plazmid DNS alsó csíkját - hosszuhullámu UV fénnyel tettük láthatóvá - összegyűjtöttük. Az etidiumbromidot 4-5-szöri izoamil alkohollal való extrahálással távolitottuk el. A DNS oldatot 2 liter TE pufferrel szemben dializáltuk és 2 óra múlva friss TE /lo mM Tris-Cl, pH=8.o 1 mM EDTA/ oldatra cseréltük. A dializált oldatot kétszer . fenollal és kétszer kloroform:izoamil alkohol /24:1/ elegyével extraháltuk. A DNS-t etanollal kicsapattuk l/lo térfogat 3 M-os nátrium-acetát és 3 térfogat etanol hozzáadásával. A DNS-t loooo rpm fordulatszámon való lo percig tartó centrifugálással gyűjtöttük össze, 7o %-os etanollal, majd loo %-os etanollal mostuk, megszáritottuk és kb. 25o ^ul steril TE-ben feloldottuk. A koncentrációt és a tisztaságot az optikai denzitás 2oo és 28o nm hullámhosszon való mérésével becsültük fel. A pKC644-es inzert DNS-ének egy restrikciós ciós helyét és funkciós térképét a csatolt rajzok 2. ábrája képviseli.
2. Példa
A Streptomyces ambofaciens /NRRL· 15263/, a S. fradiae
GS14 /tylA mutáns törzs/, a S.fradiae GS5o /tylB mutáns törzs törzs/ és a S. fradiae PM73 /tylB mutáns törzs/ transzformációja
A A találmányban használt oldatok
A következő oldatokra a példákon keresztül hivatkozunk és az egyértelműség kedvéért mutatjuk be őket.
1.____P tápközeg /kb. loo ml/:
Alkotórészek
Szacharóz
KgSO^
Nyomelem oldat /ld. a 3· pont/
MgCl2*6H20
Víz
Autoklávozás után hozzáadunk:
K2HPO4 /o,5%/
CaCl2‘2H20 /3,68%/ /N-tris-/hidroximetil/-metil-
2-aminoetán szulfonsav/,
TES puffer, o,25 M, pH=7,2
Mennyiség lo.3 g o,o25 g o,2 ml o,2o3 g
8o ml ml lo ml lo ml
2. Nyomelem oldat /kb. 1 liter/
Alkotórészek Mennyiség
ZnCl2 4o mg
FeCl3 ’ 6H2O 2oo mg
CuC12 * 2H20 lo mg
MnCl2 * 4H20 lo mg
Na2B4O? ·*1οΗ20 lo mg
/NH4/6Mo?024 ’ 4H20 lo mg
h20 1 liter
3. R2 Regenerációs Tápközeg /kb. 1 liter/
Alkotórészek Mennyiség
Szacharózlo3 g
K2S04 o,25 g
Nyomelsmoldat 2ml
MgClg ’ óH20 lo,12g
Glükóz log
L-aszparagin * 1 H202,o g
Kazaminosavo,l g
Agár 22g
Víz 7ooml-ig
A pH értéket 7,2-re igazítjuk autoklávozás előtt.
Autoklávozás után hozzáadunk:
KHoPO, /o,o5 g/loo ml/ c 4\
CaCl2 /2,22 g/loo ml/
TES puffer /5,73 g/loo ml, pH=7,2/ loo ml loo ml loo ml
4. Lágy Nutrient Agár /SNA, kb 1 liter/
Alkotórészek
Difco Bacto Nutrient Tápleves
Mennyiség
5.
R2YE tápközeg, azonos az R2 tápközeggel, de 2o ml
25%-os élesztőkivonatot adunk hozzá literenkénto
Elesztőkivonat - Malátakivonat /YEME, kb 1 liter/
Alkotórészek
Élesztőkivonat
Mennyiség
S
Pepton
Malátakivonat
Glükóz lo g
7. YEME + 34% Szacharóz Folyékony Teljes Tápközeg, azonos az YEME tápközeggel, de 34o g/liter szacharó szacharózt adunk hozzá.
8. YMX Tápközeg /kb. 1 liter/
Alkotórészek
Élesztőkivonat
Malátakivonat
Glükóz
- 28 9.
ΥΜΧ Agárban o,3 % élesztőkivonat, ο,3 % malátakivonat ο,2 % dextróz és 2,o % agar van.
Ιο.
11.
Tylozjn Fermentációs Tápközeg
Alkotórészek Mennyiség
Répa melasz 2 %
Kukoricaliszt 1,5 %
Halliszt o,9 %
Kukorica glutén o,9 %
Nátrium-klorid o,l %
Ammónium-foszfát /dibázikus/ o,o4 %
Kálcium-karbonát o,2 %
Nyers szója olaj 3 %
A tápközeg pH értékét 7,1-re állítjuk ΙΝ-os NaOH·
AS1 Tápközeg /kb. 1 liter deionizált viz/
Alkotórészek Mennyiség
Élesztőkivonat 1 g
L-alanin o,2 g
L-arginin /bázis mentes/ o,2 g
L-azparagin o,5 g
Oldható keményítő 5 g
Nátrium-klorid 2,5 g
Nátrium-szulfát lo g
Agar 2o g
- 29 12.
Spiramycin Fermentációs Sápközeg /kb. 1 liter/
Alkotórészek
Élesztőkivonat
Mennyiség lo g
KC1
2,5 g
MgSO^ o,l g kh2po4 lo g
PeCl2 o,o3 g
ZnCl2 o,o3 g
MnCl22 o,ol g
Ammónium-molibdát o,oo5 g
Ezeket az alkotórészeket feloldottuk 8oo ml vizben és autoklávoztuk. Ehhez adtunk azután steril burgony deytrint /lp g/ és glükózt /lo g/, 2oo ml vizben.
B. A Streptomyces transzformációja
Öt ml teljesen elszaporodott egy éjszakás Streptomyces tenyészetet -homogenizált és szonikált - használtunk 2o ml TBS+ o,3 % glicin inokulálására. A tenyészetet 3o G° hőmérsékleten 24 óráig inkubáltuk. Szövetőrlőben való homogenizálás után 5 ml homogenizátumot használtunk o,3 % glicinnel kiegészített 2o ml friss TBS inokulálására. A tenyészetet 3o C° hőmérsékleten 24 óráig inkubáltuk. A tenyészetet homogenizáltuk és egy 5o ral-es steril polisztirén centrifuga csőbe vittük át. A sejteket lo percig 35oo
- 3ο rpm fordulatszámon való centrifugálással pelletizáltuk, lo ml P táplevessel mostuk, majd újra pelletizáltuk. A sejteket ezután 1 mg/ml lizozimot tartalmazó 15-2 o ml P tápközegben reszuszpendáltuk, majd 1,5 óráig szobahőmérsékketen inkubáltuk. A protoplasztképzést kis minták fázis-kontraszt mikroszkópos vizsgálatával követtük nyomon. A protoplasztok gömb alakúak. A protoplasztokat az előbbiek szerint centrifugáltuk és kétszer mostuk P tápközegben. A sejteket 2o ml P tápközegben reszuszpendáltuk és minden transzformációhoz 2oo protoplasztot helyeztünk 1,5 ml-es Eppendorf csövekbe. Tiz p.1 mennyiségig DNS oldatokat adtunk hozzá óvatos keverés mellett. P tápközegben levő 5o %-os polietilén glikol looo 9oo yul mennyiségét adtuk hozzá azonnal. A 4 ml módosított R2 fedőagarban levő transzformációs keverék fél ml mennyiségét öntöttük szárított módosított R2 lemezekre. A lemezeket 3o G° hőmérsékleten 24 óráig inkubáltuk. A lemezekre ezután a kívánt antibiotikumot megfelelő mennyiségben tartalmazó módosított R2 fedőagart rétegeztük. A pHJL4ol-eredetü plazmidokkal tiosztreptont alkalmaztunk 5o yug/ml mennyiségben. A pOJlőo vagy a pKC473 eredetű plazmidokkal apramycint használtunk 5o /j.g/ral mennyiségben. Ha a Tn5 NmR gén jelen volt lo /ig/ml mennyiségben neomicint használtunk. A lemezeket 3o C° hőmérsékleten inkubáltuk, a transzformánsok 2-3 nap múlva / a S. fradiae esetében 7lo nap/ jelentek meg. A transzformánsokát a megfelelő
- 31 plazmid DNS jelenlétére vizsgáltuk a 3» Példában leirt módszerrel, lásd az alábbiakban
3. Példa
A plazmid DNS Streptomycesből való gyors izolálása
A sejteket 25 ml megfelelő koncentrációjú antibiotikummal kiegészített TSB-ben szaporítottuk. A sejteket egyszer lo,3 %-os szacharózban mostuk, pelletizáltuk és 5 ml lizozim oldatban /5 mg/ml lizozim o,3 M-os szacharózban, 25 mM Tris-Höl, pH=8,o, 25 mM EDTA/ reszuszpendáltuk. A keveréket 3o percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd 2,5 ml alkalikus lizis oldatot /o,3 M nátrium-hidroxid és 1% SDS/ adtunk hozzá. Rögtön ezután az oldatot erősen kevertük majd 5o C° hőmérsékleten 3o percig inkubáltuk. Az oldatot ezután erősen kevertük, majd 2 ml savas fenol: Sevag /kloroform :izoamil alkohol, 24:1/ keverékét adtuk hozzá és az extraktumot ismét erősen kevertük. A rétegeket asztali centrifugában való centrifugálással szeparáltuk. A vizes réteget /kb 7 ml/ o,7 ml 3 M-ós nátrium-acetátot tartalmazó csőbe vittük át. 2-propanol azonos mennyiségét adtuk hozzá és a keveréket összeráztuk. Az inkubálást lo percig szobahőmérsékleten végeztük. A DNS-t lo percig loooo rpm fordulatszámon való centrifugálással pelletizáltuk. A folyadékot dekantáltuk, 2o másodpercig centrifugáltuk és a folyadék utol
- 32 só maradványait itatós papírral távolitottuk el.
A pelíetet feloldottuk o,5 ml TE pufferben és egy 5o pl 3 M-os nátrium-acetátot tartalmazó Eppendorí® csőbe vittük át. Az oldatot egyszer semleges fenol:Sevag elegyével, egyszer Sevaggal extraháltuk, majd 2-propanol azonos mennyiségével precipitáltattuk. A keveréket 2 percig centrifugáltuk és az összes folyadékot a fent leírtak szerint távolitottuk el. A pelíetet újra feloldottuk o,5 ml TE pufferben és 5 pl o,5 M-os spermin-'HCl-t adtunk hozzáo Az oldatot összekevertük szobahőmérsékleten 5 percig inkubáltuk, majd 5 percig centrifugáltuk. A folyadékot eltávolitottuk. A pelletet 7o %-os etanolt, o,3 M nátrium-acetátot tartalmazó oldat 1 ml mennyiségével mostuk. A keveréket 5 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd 5 percig centrifugáltuk. A folyadékot eltávolitottuk, majd a pelíetet megszáritottuk. A pelíetet 25 pl TE-ben újra oldottuk és 1-2 pl mennyiséget használtunk aa egyes restrikciós enzimmel való emésztéshez.
A fent leirt plazmid izolálás! eljárások alkalmazhatók a hibridizációs vizsgálatok DNS forrásainak biztosításában is, melyekben a találmány srmR próbái kerülnek felhasználásra.

Claims (13)

  1. A SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Egy izolált DNS szekvencia azzal jellemezve, hogy az srmR aktivátor fehérjét kódolja.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti DNS szekvencia azzal jellemezve, hogy a következőket tartalmazza:
    ATG CGC CGA CTG GAG CGC TTC AAC CGG CTC GCC CTC ACC GCG CAG TCG ATG ATC GAG TAC CGC CGC GAC CGG GAG GCG GAG CTC GCG GCC CTG GTC GAC GCC GCG CAC GAG TTC GTC GCC GCC CGG CGG GGC AAG GAC CTG CTG GAG TCC ATC GCC CGC AGA GCA CGG CTG CTG CTG AAG CTG GAC GTC TCC TAC GTC GGC CTG CAC GAG GAG GAC CGG CCC GGC ACG GTG GTG CTG AGC GCC GAC GGC AAC GCG GTC AAG GTC GCC GAG AGC TAC CGG CTG CCG GCC GAC GGC GGA CTG GGC GCC ATG GTG CGC ACC TGC CGC GCT CCC TTC TGG ACC CCG GAC TAC. CTC GGG GAC AAC AGC TTC ACG CAC GTC GAG GCC GTC GAC GAC ATC GTC CGC GCC GAA GGC CTG CGC GCG GTC CTG GCC GTC CCG CTG TGC GCC GGG GGC GAA CCG ATG GGG GTC CTC TAC GTC GCC GAC CGT CAG GTG CGG CAT CTG ACC CCC AAC GAG GTC ACC CTG CTG TGC TCG CTC GCC GAT CTG GCC GCG GTG GCG ATC GAG CGC AAC CGG CTG GTC GAG GAG CTC CAC GAC ACC ATC GGG CAA CTG CGC CAG GAC ATC GGC GAG GCC CGC ACC GCC CTC GCG CGC ACC CGC AGG TCC GCC GAC CTC CAG TCG CAC CTG GTC ACG CAG GTG ATG GAC AGG CGC GGC GCC GAC TCG TTA CTC GCG ACG GCC GCC GAG GCG CTC GGC GGC GGA GCC GGC CTG TGC AGC CCG CTC GGG CGC CCG CTC GCC GAG TAC GGG ACC CTG CGC CCC GTC GCC CCC ACG GAA CTG CGC GCG GCG TGC CGC CGG GCC GCC GAG ACC GGC
    CGG CCC ACC TCC GTG GCC CCG GGG GTC TGG ACG GTG CCC CTG CTT CCC GGG GGC AAC GCC GGC TTC CTG CTG ACC GAC CTC GGT CCG GAC GCG GAC CAC ACC GCC GTC CCC CTG CTC CCG ATG GTC GCC CGC ACC GTC GCG CTG CAC CTG CGC GTC CAG CAC GAC GAC TCC CCC AAG GCG CAG AGC CAC CAG GAG TTC TTC GAC GAC CTG ATC GGG GCG CGC CGC TCA CCC ACG CTC CTC AGG GAA CGC GCC CTG ATG TTC TCC CTC AGC TTC CGC CGC CCG CAC GTG GTG CTG. GTG GCG GGC GGA CCC CGC GGG ACG TCG CCG CGG CTG GAC CGG TCC GGC GCC GAC TAC GCG AAG GAG CTG GGC GGG CTG TGC AGC GTG CGG GAC GGC GCC GTC GTC CTG CTG CTG CCC GGC GAC GAC CCC GTC GCC GTG GCG CAG ACC GCC GCC CCG GAG CTG ACC GAC CGC GCC GGG CAC CCC GTC ACC GTG GGG GTC GCG GGC CCC GCC TCG ACC GTC GAC GGC ATC GCC GAC GCG CAC CGT GAG GCG GCG AAG TGT CTG GAG ACC CTC CGC GCG CTC GGC GGC GAC GGC GGC AAC GCG TGC GCC TCC GAC CTG GGT TTC CTC GGC ATG CTC CTC GCC GAG GAG AAC GAC GTC CCC GGT TAC ATC AGG ACG ACG ATC GGC CCC GTG GTC GAC TAC GAC ACC CAC CGC TTC ACG GAT CTG GTT CCC ACT CTG AGG GTG TAC CTG GAG TCG GGC AGG AGC CCC ACG CGT GCC GCA GAG ACA CTG CGC GTG CAJC CCG AAC ACC GTC TCA CGG CGG CTG GAG CGC ATC GGC GTA CTG CTG GGA GAG GAC TGG CAG TCA CCG GAG CGG GTG CTG GAC ATA CAA CTG GCC CTG CGG CTC TAT CAG GTG CGC TGC GCG CTC TCC TCG CAA CCG GCG TCC GAG ACC CGG GCC GTG CTC GGA TCG CTG CGC GAG TGA
  3. 3· Eljárás a makrolid bioszintetikus reakcióutak azonosítására azzal jellemezve, hogy /a/ az ID1 Szekvencia srmR kódoló szekvenciájá val reagáló próbákat hozunk létre;
    /b/ az /a/ lépés', próbáit egy kérdéses DNS mintával hozzuk össze; és /c/ az /a/ lépés próbáinak a /b/ lépés kérdéses
    DNS mintájával való reaktivitását mérjük.
  4. 4. Egy Streptomycesben funkcionáló transzlációs aktiváló szekvencia azzal jellemezve, hogy DNS szekvenciája a következő:
    TGCTCGTTCC GCCGGAAATC ACGGTGTGGC CCCGGGGCCA CCGGGTAGCT TATGCCTCGT TCACCGCAGC GGTTGAAGAG GŰAGCCTTCA ACCCCGGCCG GGCCTTTATG GAATTCATTT CCACCGTGCC GCAACACCCC TGAAGGACGG CCGGATATCG GCCATGAAGC CCCGGCCTTT CAGCCAGGCG CCCTCTCTTG TCGAATAGAG TATGICCTGC GCTGAAQCCG CCGAAGAGGG ACGAAGGGGA )
    CGAACGGTGA CCTCGGTCGA TCTAGACGGA ATCCTTGAAA GCGTAATAGC
    CTGTCAATGC TTTGGTAAAG CACAGGGATG GGGGTGCCTG CGGG
  5. 5» Egy srmR aktivátor fehérje azzal jellemezve, hogy aminosav szekvenciája a következő:
    Met Ser Asp Leu Gly Ser Gly Glu Glu Gly Ser Glu Glu Asp Glu Ser Asp Asp Alá Leu nla Phe Leu Glu Phe Ile Alá Arg Ser Alá Pro Arg Ser Glu Tyr Asp Arg Leu Met Alá Arg Alá Glu Arg Ser Gly Alá Asp Glu Asp Arg Me t Arg Arg Leu Glu Arg Phe Asn Arg Leu Alá Leu Thr Alá Gin Ser Met He Glu Tyr Arg Arg Asp Arg Glu Alá Glu Leu Alá Alá Leu Val Asp Alá Alá His Glu Phe Val
    Alá Alá Arg Arg Gly Lys Asp Leu Leu Glu Ser Ile Alá Arg Arg Alá Arg Leu Leu Leu’ Lys Leu Asp Val Ser Tyr Val Gly Leu Lys Glu Glu Asp Arg Pro Gly Thr Val Val Leu Ser Alá Asp Gly Asn Alá Val Lys Val Alá Glu Ser Tyr Arg Leu Pro Alá Asp Gly Gly Leu Gly Alá Met Val Arg Thr Cys Arg Alá Pro Phe Trp Thr Pro Asp Tyr Leu Gly Asp Asn Ser Phe Thr His Val Glu Alá Val Asp Asp Ile Val Arg Alá Glu Gly Leu Arg Alá Val Leu Alá Val Pro Leu Cys Alá Gly Gly Glu Pro Met Gly Val Leu Tyr Val Alá Asp Arg Gin Val Arg His Leu Thr Pro Asn Glu Val Thr Leu Leu Cys Ser Leu Alá Asp Leu Alá Alá Val Alá Ile Glu Arg Asn Arg Leu Val Glu Glu Leu His Arg Thr Ile Gly Gin Leu Arg Gin Asp Ile Gly Glu Alá Arg Thr Alá Leu Alá Arg Thr 1 Arg Arg Ser Alá Asp Leu Gin Ser His Leu Val Thr Gin Val Met Asp Arg Arg Gly 4xla Asp Ser Leu Leu Alá Thr Alá Alá Glu Alá Leu Gly Gly Gly Alá Gly Leu Cys Ser Pro Leu Gly Arg Pro Leu Alá Glu Tyr Gly Thr Leu Arg Pro Val Alá Pro Thr Glu Leu Arg Alá Alá Cys Arg Arg Alá Alá Glu Thr Gly Arg Pro Thr Ser Val Apa Pro Gly Val Trp Thr Val Pro Leu Leu Pro Gly Gly Asn Alá .Gly Phe Leu Leu Thr Ásp Leu Gly Pro Asp Alá Asp His Thr Alá Val Pro Leu Leu Pro Met Val Alá Arg Thr Leu Alá Leu His Leu Arg Val Gin His Asp Asp Ser Pro Lys Alá Gin Ser His Gin Glu Phe Phe Asp Asp Leu Ile Gly Alá Pro Arg Sér Pro Thr Leu Leu Arg Glu Arg Alá Leu Met Phe Ser Leu Ser Phe Arg Arg Pro His Val Val Leu Val Alá Gly Gly Pro Arg Gly Thr Ser Pro Arg Leu Asp Arg Ser Gly Alá Asp Tyr Alá Lys Glu Leu Gly Gly Leu Cys Ser Val Arg Asp Gly
    • · ·· « · • * • · • · • · ·
    Alá Val Val Leu Leu Leu Pro Gly Asp Asp Pro Val Alá Val Alá Gin Thr Alá Alá Pro Glu Leu Thr Asp Arg Alá Gly His Pro Val Thr Val Gly Val Alá Gly Pro Alá Ser Thr Val Asp Gly Ile Alá Asp Alá His Arg Glu Alá Alá Lys Gys Leu Glu Thr .‘Leu Arg Alá Leu Gly Gly Asp Gly Gly Thr Alá Cys Alá Ser Asp Leu Gly Phe Leu. Gly Met Leu Leu Alá Glu Glu Asn Asp Val Pro Gly Tyr Ile Arg Thr Thr Ile Gly Pro Val Val Asp Tyr Asp Thr His Arg Phe Thr Asp Leu Val Pro Thr Leu Arg Val Tyr Leu Glu Ser Gly Arg Ser Pro Thr Arg Alá Alá Glu Thr Leu Arg Val His Pro Asn Thr Val Ser Arg Arg Leu Glu Arg Ile Gly Leu Val Leu Gly Glu Asp Tpr Gin Ser Pro Glu Arg Val Leu Asp Ile Gin Leu Alá Leu Arg Leu Tyr Gin Val Arg Ser Alá Leu Ser Ser Gin Pro Alá Ser Glu Thr Arg Alá Val Leu Gly Ser Leu Arg Glu
  6. 6. Egy antitest azzal jellemezve, hogy az 5· igénypont szerinti srmR aktivátor fehérjével raagál.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti antitest azzal jellemezve, hogy egy poliklonális antitest.
  8. 8. A 6. igénypont szerinti antitest azzal jellemezve, hogy egy monoklonális antitest.
  9. 9. Eljárás a makrolid bioszintetikus reakcióutak azo nosítására azzal jellemezve, hogy:
    /a/ a 6. igénypont szerinti antitestet egy kérdéses mintával reagáltatjuk, és
    - 38 / /b/ az antitest mintával szembeni reaktivitását mérjük.
  10. 10. Eljárás a makrolid bioszintetikus gének transzkripciós hatékonyságának fokozására azzal jellemezve, hogy az ilyen fejlesztésekkel szemben fogékony makrolid termelő sugárgombákat egy rekombináns DNS vektorral transzformáljuk, mely az említett sugárgombában funkcionáló transzkripciós aktiváló szekvenciához működőképesen kapcsolt srmB gént tartalmaz.
  11. 11. A lo. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett rekomibnáns DNS vektor a pKC644«
  12. 12. A lo. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett rekombináns DNS vektor a pKC6o4·
  13. 13. Aló. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett rekombináns DNS vektor a pKC571·
HU9202420A 1991-07-26 1992-07-23 Process for producing activator protein acting on biosynthesis of macrolids and gene coding for same HUT62332A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/736,178 US5514544A (en) 1991-07-26 1991-07-26 Activator gene for macrolide biosynthesis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9202420D0 HU9202420D0 (en) 1992-10-28
HUT62332A true HUT62332A (en) 1993-04-28

Family

ID=24958826

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9202420A HUT62332A (en) 1991-07-26 1992-07-23 Process for producing activator protein acting on biosynthesis of macrolids and gene coding for same

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5514544A (hu)
EP (1) EP0524832A3 (hu)
JP (1) JPH05317053A (hu)
AU (1) AU2052492A (hu)
CA (1) CA2074547A1 (hu)
HU (1) HUT62332A (hu)
IE (1) IE922435A1 (hu)
IL (1) IL102621A0 (hu)
MX (1) MX9204375A (hu)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE40596E1 (en) * 1993-04-08 2008-12-02 Novartis Ag Rapamycin assay
GB9307491D0 (en) 1993-04-08 1993-06-02 Sandoz Ltd Organic compounds
US6500960B1 (en) 1995-07-06 2002-12-31 Stanford University (Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University) Method to produce novel polyketides
US6066721A (en) * 1995-07-06 2000-05-23 Stanford University Method to produce novel polyketides
US6558942B1 (en) 1994-05-06 2003-05-06 The Leland Stanford Junior University Combinatorial polyketide libraries produced using a modular PKS gene cluster as scaffold
US6524812B1 (en) 1993-10-07 2003-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Genes encoding resistance to DNA alkylating agents
US6495348B1 (en) * 1993-10-07 2002-12-17 Regents Of The University Of Minnesota Mitomycin biosynthetic gene cluster
EP1493814A1 (en) * 1995-07-06 2005-01-05 The Leland Stanford Junior University Cell-free synthesis of polyketides
US6600029B1 (en) 1995-12-19 2003-07-29 Regents Of The University Of Minnesota Metabolic engineering of polyhydroxyalkanoate monomer synthases
US6677135B1 (en) * 1996-05-08 2004-01-13 Biogen, Inc. Ret ligand (RetL) for stimulating neutral and renal growth
US6503741B1 (en) 1998-05-28 2003-01-07 Kosan Biosciences, Inc. Polyketide synthase genes from Streptomyces venezuelae
US6902913B2 (en) * 1997-04-30 2005-06-07 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant narbonolide polyketide synthase
US6117659A (en) * 1997-04-30 2000-09-12 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant narbonolide polyketide synthase
US5976836A (en) * 1997-05-07 1999-11-02 Fermalogic, Inc. Methods and compositions for enhancing erythromycin production
US6265202B1 (en) 1998-06-26 2001-07-24 Regents Of The University Of Minnesota DNA encoding methymycin and pikromycin
EP1124968A2 (en) * 1998-10-28 2001-08-22 Kosan Biosciences, Inc. Library of novel "unnatural" natural products
US7001748B2 (en) * 1999-02-09 2006-02-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of making polyketides using hybrid polyketide synthases
US6753173B1 (en) 1999-02-09 2004-06-22 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods to mediate polyketide synthase module effectiveness
US20030194784A1 (en) * 2001-04-17 2003-10-16 Sherman David H. DNA encoding methymycin and pikromycin
WO2003076581A2 (en) * 2002-03-04 2003-09-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods to mediate polyketide synthase module effectiveness
US7579167B2 (en) 2002-10-08 2009-08-25 Aventis Pharma S. Polypeptides involved in the biosynthesis of spiramycins, nucleotide sequences encoding these polypeptides and applications thereof
CA2501445C (fr) * 2002-10-08 2016-01-26 Aventis Pharma S.A. Polypeptides impliques dans la biosynthese des spiramycines, sequences nucleotidiques codant ces polypeptides et leurs applications.
EP1905833B1 (fr) 2002-10-08 2015-08-12 Aventis Pharma S.A. Polypeptides impliqués dans la biosynthèse des spiramycines, séquences nucléotidiques codant ces polypeptides et leurs applications

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4935340A (en) * 1985-06-07 1990-06-19 Eli Lilly And Company Method of isolating antibiotic biosynthetic genes
FR2599743B1 (fr) * 1986-06-10 1988-09-30 Pasteur Institut Fragment d'adn comprenant au moins une partie d'un gene de resistance a l'erythromycine, son procede d'obtention et ses applications biochimiques
CA1307482C (en) * 1987-11-09 1992-09-15 Ronald G. Schoner Vectors and expression sequences for production of polypeptides
US5098837A (en) * 1988-06-07 1992-03-24 Eli Lilly And Company Macrolide biosynthetic genes for use in streptomyces and other organisms

Also Published As

Publication number Publication date
EP0524832A2 (en) 1993-01-27
MX9204375A (es) 1993-01-01
EP0524832A3 (en) 1993-12-08
CA2074547A1 (en) 1993-01-27
HU9202420D0 (en) 1992-10-28
IE922435A1 (en) 1993-01-27
US5514544A (en) 1996-05-07
JPH05317053A (ja) 1993-12-03
AU2052492A (en) 1993-01-28
IL102621A0 (en) 1993-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT62332A (en) Process for producing activator protein acting on biosynthesis of macrolids and gene coding for same
US5098837A (en) Macrolide biosynthetic genes for use in streptomyces and other organisms
Malpartida et al. Homology between Streptomyces genes coding for synthesis of different polyketides used to clone antibiotic biosynthetic genes
Stanzak et al. Cloning and expression in Streptomyces lividans of clustered erythromycin biosynthesis genes from Streptomyces erythreus
CA1339355C (en) Cloning vectors for streptomyces and use thereof in macrolide antibioticproduction
US5149639A (en) Biologically pure cultures of streptomyces and use thereof in macrolide antibiotic production
Otten et al. Cloning and expression of daunorubicin biosynthesis genes from Streptomyces peucetius and S. peucetius subsp. caesius
Liu et al. Genes for production of the enediyne antitumor antibiotic C-1027 in Streptomyces globisporus are clustered with the cagA gene that encodes the C-1027 apoprotein
AU634243B2 (en) Novel use of the site-specific integrating function of phage 0C31
Hutchinson et al. Genetic control of polyketide biosynthesis in the genus Streptomyces
US5149638A (en) Tylosin biosynthetic genes tylA, tylB and tylI
Mao et al. Genetic localization and molecular characterization of two key genes (mitAB) required for biosynthesis of the antitumor antibiotic mitomycin C
US6177262B1 (en) Recombinant host cells for the production of polyketides
Reeves et al. Analysis of an 8.1-kb DNA fragment contiguous with the erythromycin gene cluster of Saccharopolyspora erythraea in the eryCI-flanking region
Prasad et al. Cloning and characterization of a gene cluster for the production of polyketide macrolide dihydrochalcomycin in Streptomyces sp. KCTC 0041BP
US4904598A (en) Novel plasmid shuttle vectors conferring spiramycin resistance in streptomyces
US4879241A (en) Tylosin resistance-conferring gene, designated tlrB, for use in streptomyces and other organisms
US4886757A (en) Spiramycin resistance-conferring cloning vectors
US4889809A (en) Tylosin resistance-conferring gene, designated tlrC, for use in streptomyces fradiae
HU197352B (en) Process for producing phjl 210 plasmide and other double functional cloning vectors in connection with them for utilizing them in streptomycetes
JP2988735B2 (ja) マクロライド抗生物質の３位アシル化酵素をコードする遺伝子
Pageni et al. Characterization of a chalcosyltransferase (gerGTII) in dihydrochalcomycin biosynthesis
KR0165907B1 (ko) 아미노글라이코사이드계 항생제에 대해 다제내성을 지정하는 dna 단편
Jones Macrolide antibiotic resistance and production in Streptomyces narbonensis
Clark The tylLM region of the Streptomyces fradiae genome

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee