HUT58527A - Process for producing pharmaceutical compositions against endotoxinaemia - Google Patents

Description

A találmány eljárást ismertet az endotoxinémia esetén feldúsuló endotoxin toxikus hatásának leküzdésére alkalmas gyógyszer előállítására. A készítmény egyik hatékony komponense transzferrin.

A transzferrin 80.000 Dalton átlagos molekulasúlyú glükoprotein.

Az emberi és az állati sejtnedvben kb. 290 mg/dl koncentrációban /embernél a normál érték 200-400 mg/dl közötti/ fordul elő.

A transzferrin föhivatásaként mindeddig azt a képességét tekintették, hogy megkötni és megkötésére után a vas víz-lerakatba és a vérképző szervek retikulocitáihoz.

képes - különösen a szállítani, s ezen képes. Ilymódon a elszállításra kerül

III. vegyértékű - vasat belül egy vagy két molekula vas vékonybélben való felszívódás a májban és a lépben található

A transzferrin további fontos funkciója bakteriosztatikus tulajdonsága /Martin C.M., Jandl J.H., Finland J. Infect. Dis. (1963) 112 : 158-163; Flechter J. : Immunology (1971) 20 : 493-500/. A vas a baktériumok növekedésének lényeges tényezője. A vasnak a transzferrinnel alkotott komplexe révén a szabad vas koncentrációja a sejtnedvben az alatt az érték alatt tartható, ami a baktériumok növekedéséhez szükséges. A transzferrin bakteriosztatikus hatásából Berger és Beger /Arzneim. Forsch. (1988) 38 : 817-820; és Prog. Clin. Bioi. Rés. (1988) 272 : 115-124/ azt a következtetést vonják le, hogy a transzferrinnek vasmentes alakjában kiterjedt Gram-negativ fertőzéseknél még az antimikrobiális terápia adalékaként is szerepe lehet a szokásos antibiotikum terápia kiegészítésére. Azt az előnyt nyújtja, hogy hatásmechanizmusa alapján nem várható rezisztencia kifejlődése.

Az endotoxin a Gram-negativ baktériumok sejtfalának egyik alkotórésze, amely a baktérium szétesése során felszabadul. Ez egy 1 x 10^ Daltonig terjedő molekulasúlyú makromolekula, amely főleg cukorvegyületekböl és zsírsavakból áll. Emellett még olyan fehérje-maradványokat is magához kapcsolhat, amelyek a baktériumok sejtfalából erednek. Az endotoxin molekulája három szerkezetileg és immunbiológiailag különböző alrégióból épül fel:

Az 1. alrégió az 0-specifikus lánc, több ismétlődő oligoszaharid egységből áll, amelyeket mindenkor legfeljebb öt semleges cukor alkot. Az oligoszaharidők száma a baktériumfajtától függ: pl.

az általunk vizsgált Salmonella abortus equi-böl származó endotoxin ebben a régióban 8 oligoszaharid egységet tartalmaz.

A 2. alrégió a mag-oligoszaharid egyebek között N-acetilglükozanimból, glükózból, heptózból és 2-keto-3-dezoxi-oktonsavból áll.

A 3. alrégió , a lipid-A (mólsúly 2000 Dalton), egy foszforilezett D-glükozamin - diszaharidból áll, amelyhez több - mintegy 7 - hosszúláncú zsírsav kapcsolódik amid- vagy észter - kötésben. A toxikus tulajdonságok hordozója a lipid - A, amelyben a toxikus hatást egyes zsír savmaradékok fejtik ki.

Az endotoxin molekula mérete és töltési viszonyai alapján a három különböző alrégió sok csoportjára, illetve oldalláncára különféle vegyületek és fehérjék tudnak ráhelyezödni anélkül, hogy ezáltal az endotoxin toxikus tulajdonságait befolyásolhatnák. Fiziológiai értelemben a lipid-A-n egy fehérje, az un. lipid-A-hoz assziciált fehérje kötődik. E fehérje-alkotórész leválasztása az endotoxinról egyes endotoxinoknál nem okoz a toxikus hatásban semmiféle változást. Mégis számos endotoxinnál azt találták, hogy fehérje felvitele az endotoxinra a toxikus hatás lényeges növekedésével járhat /Rietschel E. Th. et al. (1982) Bacterial Endotoxins : Chemical Structure, Biological Activity and Ro'le in Septicaemia, Scand. J. Inf. Dis. Suppl. 31: 8-21; 17. o./. Megfigyelték például, hogy bizonyos endotoxinok, amelyekről a fehérje-részt lehasitották /Morrison D.C. , Oudes Z.G., Beetz J. (1980): The role of lipid-A and lipid-A associated protein in cell degranulation mechanisms; Eaker D., Waldström T. Natural Toxins cimü monográfiájában, Pergamon Press, New York 287-294.0./. Állatkísérletes vizsgálatokban ugyancsak megállapítható volt az állatoknak beadott endotoxin toxikus hatásának csökkenése, amikor fehérje alkotórészüket lehasitották /Hitchcock P.J. és Morrison D.C. (1984) The protein component of bacterial endotoxins, az E.T. Rietschel által szerkesztett Handbook of Endotoxins cimü kötetben, 339-376. o.; Elsevier Science Publishers B.V./.

ο. es

- 4 Berger és Beger /Arzneim. Forsch. (1988) 38: 817-820.

Progr. Clin. Rés. (1982) 172,; 116-124. o./ izotópkisérletekkel kimutatták, hogy az emberi transzferrin, mégpedig csak vasmentes formában, kötődhet az endotoxinhoz. Megállapították továbbá, az alfa2~globulin mint például a Gc-globulin endotoxinhoz való kapcsolódását. E kutatási eredmények alapján a közlemények szerzői azt feltételezték, hogy a transzferrin - vasmentes alakjában - a szervezetben feltehetően az endotoxin cárrierfehérjék szerepében bír élettani jelentőséggel. Hasonló carrier-szerepet írtak le a nagy sűrűségű lipoproteinröl /Munford R.S., Hall C.L., Dietschy J.M. (1981) : Binding of Salmonella typhimurium lipopolysaccharides to rat high-density lipoproteins Infect. immun. 34: 835-843. o./. A vasmentes transzferrin endotoxin makromolekulára való kapcsolódásának izotópokkal kivitelezett kimutatása mindazonáltal nem ad a szakember számára olyan utalásokat, hogy ezáltal az átcsoportosulás által egyáltalán, és ha igen milyen mértékben befolyásolható az endotoxin biológiai, azaz toxikus hatása.

Berger és Beger egy összehasonlító kísérletben izotópos módszerekkel azt is vizsgálták /Arzneim. Forsch. (1988) 38: 817-820. és Progr. Clin. Bioi. Rés. (1988) 272: 115-124. o./, hogy egy primer és szekunder immunhiány esetében alkalmazott immuglobulin készítmény képes-e endotoxint megkötni /Arzneim. Forsch. (1988) 38: 817-820. o./. A szerzők az endotoxin kötődését az immuglobulinhoz nem tudták kimutatni. Az endotoxinnak az összehasonlitóan vizsgált IgG-készitményhez való kötődésének hiánya alapján kézenfekvőén tételezhető fel az, hogy az immunglobulinoknak a szervezetben semmiféle endotoxin-hordozó szerepük nincs. E kísérletek ismeretében a cárrier-szerep javítása a transzferrin és immunglobulin kombinálásával ugyancsak nem várható el. E kísérletekből semmi olyan útmutatás nem adódik, hogy az endotoxinok biológiai hatása immunglobulinokkal befolyásolható lenne.

Az endotoxin normális körülmények között az egészségeseknél is átjut a bélből a vérpályába. Valamely toxikus szervezeti károsodás elleni védelem érdekében az egészséges egyed plazmája képes arra, hogy a bélből átlépő endotoxint folytonosan hatástalanítsa. Erőteljes endotoxin beáramlás esetén azonban a plazma endotoxint hatástalanító képessége gyorsan kimerül és a plazmában növekvő mértékben jelenik meg a biológiailag hatásos endotoxin, ami az endotoxinémia klinikai képének kialakulásához vezet.

Az endotoxin felfokozott bejutására a vérpályába különösen a kiterjedt Gram-negativ fertőzések baktericid hatású antibiotikummal való kezelése nyomán kerül sor. Ez esetben az endotoxin hatására káros mediátorok fel szabadulására és a sejt energiaés anyagcseréjének olyna zavarására kerül sor, amiből sejtpusztulás, végső esetben egy szerv működési csődje adódhat.

A szepszis klinikai képe a legtöbb esetben egybevág ?z endotoxin vérbeli koncentrációjának alakulása és értéke tekintetében /Nitsche et al. Intensive Care Med. 12 Suppl. (1986) 186. /. Ebből eredően azon megbetegedéseknél, amelyek során megsokszorozódott mennyiségű endotoxinnak a vérbe jutása folytán endotoxinémia lép fel, további terápiás intézkedések kívánatosak, amelyekkel az endotoxin aktivitását a vérben le lehet csökkenteni hogy ezáltal a kórkép lefolyását kedvezően befolyásolhassuk.

Az állatkísérletes vizsgálatok azt mutatták, hogy lehetségesnek látszik a plazmában az endotoxin tevékenység csökkenése olyan hiperimmunglobulin készítményekkel, amelyek szelektíven dúsítottak az endotoxin toxikus részére ható antitestekkel /lipid-A antitestek/. Olyan immunglobulin készítmények, amelyekben a lipid-A antitesteket szelektíven feldúsították ezideig csak csekély mennyiségben álltak gyógyászati célokra rendelkezésre, miután a megfelelő donorok kiválasztása nagyon költséges. Egy bizonyos fokig az endotoxin aktivitás a plazmában 7S Igkészitmények adásával is csökkenthető, amit feltehetően ezek lipid-A antitest alkotórészének tulajdoníthatunk. Az endotoxin semlegesítésének bizonyos mértékű fokozása az IgG-készitmények Ig-M-frakciójú immunglobulinokban való feldúsitása útján érhető el, amelyekben magasabb lipid-A antitest szint várható el /Appelmelk B.J. et al. (1987) Microbiol. Pathogenesis 2: 391-393./.

A gyógyászat számára mindezideig rendelkezésre álló lehetőségek döntő hátrányokat mutatnak, amelyek abban állnak, hogy ezek a véráramban fellépő endotoxinnak csak bizonyos csekély százalékát hatástalanítják. Erőteljes endotoxin beáramlás esetén, amint az például az egész hasüregre kiterjedő hashártyagyulladás /diffúz peritonotis/ esetében tapasztalható, mindezen gyógyászati beavatkozások ellenére a véráramban még éppen elég biológiailag aktív endotoxin kering ahhoz, hogy hosszabb időtartam alatt valamilyen szervi károsodást okozhasson.

A találmány célja olyan szer létrehozása, amely gyógyászati készítményként alkalmas az endotoxinok toxikus hatásának leküzdésére, azokban az esetekben, amikor ezek kóros állapotokban sokszoros koncentrációban jutnak be a véráramba.

A találmány szerinti célkitűzést részben transzferrin alkalmazásával oldjuk meg. E célra a transzferrint vasmentes vagy vashoz kötött állapotban használjuk fel. Különösen hatékonynak mutatkozik a transzferrinnek olyan immunglobulinokkal való kombinálása, amelyek vagy csak IgG-t vagy Ig-G-t és IgM-et, valamint IgA-t tartalmaznak. A transzferrint lehetséges egy szérumkonzervben feldúsítani, hogy azt a szérumban fellelhető plazmafehérjékkel ilymódonkombináljuk.

A találmány szerinti eljárás lényege, hogy transzferrinböl vagy csekély mennyiségű vasat megkötött transzferrinböl vagy nagyobb mennyiségű vasat megkötött transzferrinböl vagy vassal telitett transzferrinböl és immunglobulinból önmagában ismert módon parenterális gyógyszerkészítményt állítunk elő.

A találmány szerinti eljárást célszerű úgy foganatosítani, hogy a csekély mennyiségű vasat megkötött transzferrin grammonként legalább 0,4 pg vasat tartalmazzon.

A találmány szerinti eljárást célszerűen úgy is lehet foganatosítani, hogy a nagyobb mennyiségű vasat megkötött transzferrin grammonként több mint 100 pg vasat tartalmazzon.

Az eljárás előnyösen úgy is kivitelezhető, hogy a készítmény a transzferrin mellett IgG vagy IgG és IgM, valamint IgA fehérjefrakciók oldatát tartalmazza.

Az eljárást úgy célszerű megvalósítani, hogy a transzferrin és az immunglobulin koncentrációja egyaránt 200-400 mg/dl közötti, célszerűen 312 mg/dl körüli legyen.

Az eljárás egy előnyös megvalósítása során az immunglobulinhoz az IgM frakciót 12 % körüli mennyiségben adjuk hozzá.

A transzferrinnel való endotoxin inaktiválás, valamint a transzferrin immunglobulinnal való kombinációjának ilyen hatását a következő vizsgálatokkal szemléltetjük: .

Vasmentes transzferrint /un. apotranszferrin/, valamint vasat tartalmazó transzferrint egyedül, illetve immunglobulin készítményekkel kombinálva in vitro é s in vivő kísérletekben arra vizsgáltunk, hogy e készítmények milyen mértékben képesek az endotoxin aktivitását csökkenteni.

In vitro vizsgálatok:

A/ A biológiai hatékonyságot befolyásoló kvantitatív vizsgálatok

Emberi transzferrint és immunglobulinnal kombinált transzferrint növekvő koncentrációjú endotoxinnal 60 percen át 37°C-on inkubáltunk. Az inkubáció befejezése után kvantitative meghatároztuk az endotoxin biológiai hatékonyságát a felülúszóban módosított Lumulus-tesztet alkalmazva kromogén szubsztrátumot használva /Nitsche et al. a Watson S. W. , Levin J., Novitsky T.J. által szerkesztett: Detection of Bacterial Endotoxins with the Limulus Amebocyte Lysate Test (1987), 417-429. o./. A Limulus-teszt ezen változatánál a kimutathatóság alsó határa 1 EU/dl. A Limulus-teszttel megállapított endotoxin aktivitás jól vág egybe az endotoxin biológiai hatékonyságával /Nitsche D., Fiad H.D. és Blum B. (1990) Endotoxin Determination by the Limulus-Test and the Biological Activity of Endotoxin /Közlése előkészületben/ .

A viszgálatokhoz olyan transzferrint /Trf.Fe/A// használtunk, amelynek 5 %-os oldata 25 pg/dl vasat tartalmaz, azaz a transzferrin 1 g-ja 5 pg vasat, továbbá olyan transzferrint /Trf.Fe/B//, amelynek 5 %-os oldata 950 pg/dl vasat, 1 g-ja pedig 190 pg vasat tartalmaz.

Ezen kívül olyan transzferrint is használtunk, amely messzemenően vasmentes volt /Trf.-O/. Ez esetben a vas meghatározása a Megraw és Bouda által leirt /Megraw R.E., Hritz A. M., Babson A.L. és Caroll J.J. (1973) Clin. Biochem. 6: 266; Bouda J. (1968) Clin. Chem. Acta 21: 159/ eljárással történt, amelynek érzékenysége 0,5 pg/dl. 5 %-os oldatban vas nem volt kimutatható.

R

A következő immunglobulinokat használtuk: 7S IgG /Intraglobin , Sandoglobin^/, valamint 7S IgG 12 % IgM-mel dúsítva /Pentaglobin^/.

A következő baktériumtörzsek endotoxinját használtuk: Salmonella abortus aqui /NOVOPYREVAL /, Pseudomonas aeruginosa Fisher Typ 7, valamint az FDA Escherichia coli 0113:H 10:K0-ból származó EC-5 jelzésű sztenderdjét.

AZ ENDOTOXINT INAKTIVALO KAPACITÁS MEGHATAROZASA

Annak érdekében, és immunglobulin kvantifikálható hogy a transzferrin illetve a transzferrin kombináció endotoxint inaktiváló képessége legyen, meghatároztuk az INAKTIVÁLÁST

KAPACITÁST. A mérés pontosságának érdekében nem az ekvivalencia tartományában mértünk, hanem 10 EU/dl endotoxin felesleg mellett kiviteleztük a mérést.

E paraméter kiszámításához megállapítottuk azt az endotoxin mennyiséget /EU/dl/, amelyet a mindenkori fehérjekészitményhez kell hozzáadni ahhoz, hogy a felülúszóban jelenlevő szabad endotoxin mennyisége 60 perces 37°c-on való inkubáció után még 10 EU/dl, illetve 100 EU/dl legyen, ezt az endotoxin koncentrációt abból az összefüggésből számoltuk ki, amely a mindenkori készítményhez /transzferrin, immunglobulin és transzferrin-immunglobulin kombináció/ hozzáadott endotoxin mennyiség és az inkubáció után a felülúszóban meghatározott endotoxin koncentrációk között fennáll. Az inaktiválási kapacitás meghatározására egy mérési sorozatot végeztünk növekvő koncentrációjú endotoxinnal /10 EU/dl, 25 EU/dl, 100 EU/dl, 200 EU/dl, 300 EU/dl, 500 EU/dl, valamint 750 és 1000 EU/dl/, amelyeket különféle fehérjekészitményekkel 60 percig inkubáltunk. A kiindulási reakcióelegy transzferrin, illetve immunglobulin koncentrációja 312,5 mg/dl volt.

A transzferrin-immunglobulin kombináció vizsgálata esetében mindkét fehérjekomponens koncentrációja a kiindulási reakciókeverékben 312 mg/dl volt. Az ilymódon meghatározott endotoxin mennyiség képezi - az előzetesen hozzáadott 10 EU/dl, illetve 100 EU/dl endotoxin felesleg levonása után az EU/dl értékben kifejezett közepes endotoxin aktivitást, amely egy megfelelő fehérjeoldat /mg/dl/ által az adott körülmények között inaktiválható.

100 EU/dl össz-fehérje koncentrációra vonatkoztatva ez az endotoxin aktivitás képezi a mindekori transzferrin készítmény, illetve transzferrin-immunglobulin kombinációs készítmény közepes inaktiválási kapacitását EU/100 mg egységben kifejezve.

Eredmények (8/1, 8/2a és 8/2b ábrák

1/.Transzferrin

Endotoxin vasmentes transzferrinel /Trf.-O/ való inkubálása után az endotoxin fajtájától függően az aktivitás csökkenésének közepes mértéke 28,2-36 %

Endotoxin - 5%-os oldatra vonatkoztatva - 25pg/dl vasat tartalmazó transzferrinnel /Trf.-Fe/A/ / való inkubálása után az endotoxin aktivitása közepes csökkenése, annak fajtájától· függően 72-78,7% közötti.

A 950pg/dl vastartalmú / 5%-os transzferrin oldatra vonatkoztatva / transzferrin /Trf.-Fe/B// az endotoxin fajtájától függően 85,3-95,5% közötti aktivitás csökkenést okoz.

a/ 10 EU/dl endotoxin feleslegre vonatkoztatva az inaktiválás!

kapacitás:

I. Tr f. -0-n S. abortus equi esetében 1,8 EU/100 mg, E.

coli esetében 1,5 EU/100 mg és Pseudomonas aeruginosa esetében 1,7 EU/100 mg.

11. Trf.-Fe/A/-nál S. abortus E. coli esetében 11,0 aeruginosa esetében 10,4

III. Trf.-/B/-nél. S. abortus

E. coli esetében 52,3

equi esetében 7,1 EU/100 mg,
EU/100 mg EU/100 mg.	és	Pseudomonas
equi esetében	61	EU/100	mg,
EU/100 mg	és	Pseudomonas

aeruginosa esetében 64,5 EU/100 mg.

b/ 100 EU/dl endotoxin feleslegre vonatkoztatva az aktiválási kapacitás:

I.

Tr f.-0-nál S. abortus equi E. coli esetében 11,4 aeruginosa esetében 17,6 esetében

EU/100 mg EU/100 mg.

17,8 és

EU/100 mg, Pseudomonas

II. Trf.-Fe/A/-nál S. abortus equi esetében 89,9 EU/100 mg, E. coli esetében 108,2 EU/100 mg és Pseudomonas aereuginosa esetében 105,4 EU/100 mg.

III.

Trf.-Fe/B/-nél S. abortus equi mg. és Pseudomonas aeruginosa esetében 176,7 EU/100 esetében 433,4 EU/loo mg .

2. Transzferrin és /S IgG

A transzferrin kombinálása egy 7S IgG készítménnyel az endotoxin inaktiválás javításához vezet. Az endotoxin transzferrinnel /312 mg/dl / és 7S IgG-vel /312 mg/dl / való inkubálásakor az endotoxin aktivitása a vasmentes transzferrin alkalmazása esetén is 200EU/dl alatti endotoxin koncentrációnál 65,5-78%-kal koncentrációnál az endotoxin csökken. Magasabb aktivitás mértéke endotoxin már csak

47,1-54,9%-kal csökken. Ha azonban e helyett - 5%-os transzferrin oldatra vonatkoztatva - 25pg/dl vasat tartalmazó transzferrint /Trf.-Fe/A// használunk, akkor az endotoxin aktivitás csökkenése 82-88,8% közötti. Ha a transzferrin 5%-os oldatra vonatkoztatva - 950pg/dl vasat tartalmaz /Trf.-Fe/B// és 7S IgG-vel kombionáljuk, akkor az endotoxin aktivitásának 89,3-94,2%-a épül le.

a/ Ha 10 EU/dl endotoxin felesleget veszünk alapul az inaktiválási kapacitás:

I.	Tr f.-0 -nál +	7S IgG: S.	abortus equi	esetében 6,1
	EU/100 mg, E.	coli esetében	10.6 EU/100 mg	és Pseudomo-
	nas aeruginosa	esetében 11,4	EU/100 mg.
II.	Trf.-Fe/A/-nál	+ 7S IgG: S.	abortus equi esetében 20,4
	EU/100 mg, E.	coli esetében	24,5 EU/100 mg	és Pseudomo-
	nas aeruginosa	esetében 24,8	EU/100 mg.
III.	Trf,-Fe/B/-nél	+ 7S IgG: S.	abortus equi esetében 28,2
	EU/100 mg, E.	coli esetében	34,2 EU/100 mg	és Pseudomo-
	nas esetében 52,7 EU/100 mg.

b/ Ha 100 EU/dl endotoxin felesleget veszünk alapul az inaktiválási kapacitás:

I. Trf. 0-nál + 7S IgG: S. abortus equi esetében 28,6 EU/100 mg, E. coli esetében 30,7 EU/100 mg és Pseudomonas aeruginosa esetében 39,1 EU/100 mg.

II. Trf.-Fe/A/-nál + 7 S IgG : S. abortus equi 149,7 EU/100 mg, E. coli esetében 237,7 EU/100 mg és Pseudomonas aeruginosa esetében 210,5 EU/100 mg.

III. Tr f. -Fe/B/-nél + 7S IgG: S. abortus aqui esetében 257,5 EU/100 mg, E. coli esetében 358,4 EU/100 mg és Pseudomonas aeruginosa esetében 481,2 EU/100 mg.

3. Transzferrin és IgG/A/M/ 12 % IgM/

Ha egy Ig-készitményhez, amely 12 Z IgM-mel van dúsítva transzferrint adunk hozzá az inaktiválási kapacitás további emelkedését érhetjük el. Az endotoxin aktivitás csökkenése az IgG/A/M /12 % IgM/ /312 mg/dl/ és 312 mg/dl koncentrációjú olyan transzferrin kombinálása esetén, amelynek vastartalma 5 pg/g transzferrin, az inkubálással az endotoxin fajtától függően 75,2 - 78,7 7o.

190 ug/g vasat tartalmazó transzferrin /Trf.-Fe/B/ / és Ig/A/M alkalmazása esetén az endotoxin fajtától függően az aktivitás csökkenése 92 - 96,5 % közötti.

a/ Ha 10 EU/dl endotoxin felesleget veszünk alapul az aktivitáscsökkentési kapacitás:

I. Trf.-Fe/A/-nál + IgG/A/M : S. abortus equi esetében

7,1 EU/100 mg, E. coli esetében 11,1 EU/100 mg és Pseudomonas aeruginosa esetében 11,3 EU/100 mg.

II. Trf.-Fe/B/-nél + IgG/A/M: S. abortus equi esetében 88,6 EU/100 mg, E. coli esetében 74,8 EU/100 mg és Pseudomonas aeruginosa esetében 88,9 EU/100 mg.

b/ Ha 100 EU/dl endotoxin felesleget veszünk alapul az aktivitás csökkentési kapacitás:

I. Trf.Fe/A/-nál + IgG/A/M: S. abortus equi esetében 99,3 EU/100 mg, E. coli esetében 114,2 EU/100 mg és Pseudomonas aeruginosa esetében 112,5 EU/100 mg.

II. TRf.-Fe/B/-nél + IgG/A/M: S. abortus equi esetében 367,1

EU/100 mg, E. coli esetében 782,2 EU/100 mg és Pseudomonas aeruginosa esetében 1173,5 EU/100 mg.

B/ AZ IL-1 ES IL-6 MEDIATOROK FELSZABADITASARA GYAKOROLT BEFOLYÁS

A vizsgált vegyületek befolyásának megállapítása érdekében az endotoxin biológiai aktivitásába pótlólagos paraméterként bevontuk az IL-1 és IL-6 monocitákból való felszabadításra gyakorolt befolyást is. Ennek során az endotoxint először transzferrinnel, illetve transzferrin és immunglobulin kombinációjával inkubáltuk.

Ezt követöleg a felülúszót monocitákkal inkubáltuk és mértük a monocitákból falszabaditott interleukin-1 és interleukin-6 mediátorok koncentrációját a felülúszóban. 5 pg/g vasat tartalmazó transzferrint /TRF.-Fe/A//, illetve 190 pg/g vasat tartalmazót /Trf.-Fe/B// használtunk.

A következő immunglobulinokat alkalmaztuk: 7S IgG /Intraglobin , Sandoglobin^/, valamint IgG-t 12 % IgM-mel dúsítva /IgG/A/M/.

A következő baktériumtörzsek endotoxinjait használtuk:

S abortus equi /NOVOPYREXAL^/, továbbá az FDA E. coli 0113:H 10:K0 törzséből készült sztenderd endotoxint.

A transzferrint, immunglobulint, továbbá az immunglobulinnal kombinált transzferrint endotoxinnal 60 percig 37 °C-on inkubál- tűk. Kontrollként humán albumint használtunk.

A mindenkori protein koncentrációja a kiindulási reakcióelegyben 625 mg/dl, 312 mg/dl és 156 mg/dl volt. Az inkubációt 50-500 EU/dl közötti endotoxin koncentrációval viteleztük ki. Az inkubáció után a mindenkori endotoxin oldatot egészséges donorok mononukleáris sejtjeivel inkubáltuk /16 órán át, 37 °C-on/.

Ezt követöleg meghatároztuk a felszabadított IL-1 és IL-6 mediátorok koncentrációját. Az IL-1 meghatározása a fibroblasztproliferációs teszt segítségével történt /Loppnow H., Fiad H.D., Ulmer A.J. et al. (1989) Detection of interleukin-1 with dermal fibroblasts, Immunbioi. 179: 283-291./ egy EL4-6,1 thimosejtvonal alkalmazásával. Az IL-6 koncentrációját ugyancsak proliferációs teszttel határoztuk meg egy IL-6-tól függő murin hibridomát használva /Van Damme J., Cayphas S. et al. (1987) Eur.J. Biochem. 168: 543-550.; továbbá Van Oers M.H.J., Van dér Heyden A. és Aarden L.A. (1988): Clin. Exp. Immunoi. 71: 314-419./.

Azt találtuk, hogy az endotoxin transzferrinnel való inkubációja nyomán a mediátoroknak a mononukleáris sejtekből az endotoxin által kiváltott felszabadításának mértéke erőteljesen csökkent.

Ez a hatás függ a transzferrin vastartalmától, éspedig olymódon, hogy ennek hatásfoka a vastartalom növelésével javítható. A transzferrin és az immunglobulinok kombinációjával a transzferrinnék a mediátorok felszabadítását gátló hatása még erősíthető is, ahol az immunglobilonokkal kombinálva magasabb hatásfok érhető el a transzferrin nagyobb vastartalma esetén.

Eredmények / 8/3 a és 8/3 b ábrák /

I. Transzferrin a/ 500 EU/dl endotoxin Trf.-Fe/A/-val való inkubálása nyomán az IL-1 közepes felszabadulása:

S. abortus equi esetében 211 U/ml és E. coli esetében 126 U/ml értéket tett ki. Az IL-6 felszabadulása S. abortus equi-nél 761 U/ml, E. colinál 1065 U/ml volt.

b/ 500 EU/dl endotoxin Trf.-Fe/B/-vel való inkubálása nyomán az IL-1 közepes felszabadulása: S. abortus equi esetében 810 U/ml és E. coli esetében 35 U/ml. Az IL-6 közepes felszabadulása S. abortus equi-nél 481 U/ml és E. colinál 415 U/ml volt.

II. Transzferrin és 7S IgG a/ 500 EU/dl endotoxin transzferrin és 7S IgG kombinációval való inkubálását vezette be a Trf.-Fe/A/ alkalmazása.

S. abortus equi-nél 85 U/ml IL-1 felszabadításával, ami E. cononál 34 U/ml volt. Az IL-6 felszabadított mennyisége

S. abortus equi esetében 561 U/ml és E. coli esetében 443 U/ml volt.

b/ Trf.-Fe/B/ alkalmazása esetén az IL-1 közepes felszabadulása S. abortus equi-nél 370 U/ml, E. colinál 16 U/ml volt. Az inkubáció után felszabadult IL-6 mennyiség S. abortus equi esetében 297 U/ml, E. coli esetében

271 U/ml volt.

III. Transzferrin és IgG/A/M /12 7» IgM/

Transzferrin hozzáadása egy olyan 7S IgG készítményhez, amelyet 12 % IgM-el gazdagítottak 312 mg% immunglobulin koncentrációnál és ugyancsak 312 mg%-os transzferrin koncentrációnál 600 EU/dl endotoxinnal való inkubáció után a következő képet mutatta:

a/

Trf.-Fe/B/ használata esetén S

U/ml IL-1, E. colinál 127 U/ml felszabadult IL-6 .mennyiség S.

678 U/ml, E. colinál 1065 U/ml.

abortuss equi-nél 173

IL-1 szabadult fel. A abortus equi esetében b / Tr f. -Fe/B/ IgG/A/M /12 7>/ -el való kombinációja esetében az IL-1 közepes felszabadítása S. abortus equinél 19 U/ml, E. colinál 4,5 U/ml volt. Az IL-6 felszabadítása ilyen körülmények között S. abortus equinél 204 U/ml, E. colinál 118 U/ml volt.

IV. FEHERJE

500 EU/dl endotoxint összehasonlítás céljából fehérjével inkubálunk. S. abortus equi esetében 2975 U/ml, E. coli esetében 2676 U/ml IL-1 szabadul fel. Az IL-6 felszabadítása S. abortus equinél 3018 U/ml, E. colinál 6233 U/ml.

C/ A plazma endotoxin-aktivitásának befolyásolása

Egészséges donorok humán plazmáját olymódon kezeltük transzferrinnel, hogy annak természetes transzferrin tartalma 312 mgZ-ra emelkedjék., A kontrollmintákhoz azonos mennyiségű fehérjét adtunk.

A transzferrinnel, illetve fehérjével kezelt plazmához endotoxint /Pseudomonas-endotoxin, Salmonella-endotoxin/ adtunk úgy, hogy a kiinduló reakcióelegyben a plazma 800 EU/dl és 300 EU/dl endotoxin aktivitását elérjük. A reakcióelegyet 37 °C-on inkubáltuk, Ezt kővetően meghatároztuk a visszamaradt endotoxin aktivitását .

Megállapítottuk, hogy azokhoz a mintákhoz képest, amelyekhez csak fehérjét adtunk a transzferrin hozzáadása a plazma inaktiváló képességét jelentősen növeli.

a/ Transzferrin /Trf.-Fe./B// hozzáadásakor az endotoxin inaktiválás növekedésének mértéke 800 EU/dl endotoxin koncentrációnál 73,8 7>, 300 EU/dl-nél 56,5 7> volt.

b/ Transzferrin /Trf.-Fe/A/ hozzáadásakor a plazma endotoxin inaktiválási képessége 800 EU/dl koncentrációnál 66,6 %-kal, 300 EU/dl-nél 42,8 %-kal emelkedett.

. ALLATKISERLETES VIZSGALATOK

Azokat az állatkísérletes vizsgálatokat, amelyek feladata annak tisztázása volt, hogy a transzferrin és a transzferrin kombinációja immunglobulinnal milyen hatással van az endotoxin aktivitására, a következők szerint folytattuk le:

250-300 g testsúlyú Wistar patkányoknak a vérlevétel céljából katétert helyeztünk a jobboldali nyaki visszérbe /Véna Jugularis/. Ezt követöleg különféle baktériumokat /E. coli, Klebsiella species és Pseudomonas Aeruginosa; /mindenkor 0,75 x 10^ CFU/ml koncentrációban/ meghatározott számban injiciáltunk a hasüregbe. 30 perccel a baktériumoknak a hasüregbe való bejuttatása után vénás katéteren keresztül egy perfuzoron át lassan, intavénásan bejuttatjuk a viszgálandó készítményt /transzferrin, továbbá transzferrin és immunglobulin/ 250 mg/testsúly kg adagban. A kontollállatok fehérjét kaptak, megfelelő adagolásban.

A vérben való erős endotoxin-áramlás előidézésére a baktériumok beadása után egy órával intravénásán baktericid antibiotikumot /IMIPENEM = Zienam^/ alkalmaztunk.

Az endotoxinaktivitás és a baktériumszám vérben való megállapítására a vér-levételek 30 perces időközökben a baktériumok beadását követően összesen 5 órán át folytak.

A következő készítmények kerültek intravénásán beadásra:

7S IgG /Sandoglobin^/; IgM /125/-el dúsított 7S IgG /Pentaglobin^/, 25 pG/dl vastartalmú transzferrin /Trf.-Fe/A//- 5 %-os transzferrin oldatra vonatkoztatva - , Trf.-Fe/B/ transzferrin 5 %-os transzferrin oldatra vonatkoztatott 950 pg/dl vastartalommal, továbbá transzferrin /Trf.Fe/A// és /Trf.-Fe/B// kombinációja IgM /12 %/-mel dúsított immunglobulinnal és transzferrin /Trf.-Fe/A// és Trf.-Fe/B/ 7S IgG /Sandoglobin^/nal együtt adva.

Eredmények / 8/4. ábra / a/ Fehérje beadása után az antibiotikum alkalmazását követően a plazmában az endotoxinaktivitás nagyon erősen emelkedik. Már egy órával az antibiotikum beadása után 192 EU/dl mértékű közepes endotoxin aktivitás észlelhető. Az antibiotikum beadása után 4 órával a plazmában 210 EU/dl endotoxinaktivitás mutatható ki.

b/ Az IgM /12%/-mel dúsított 7S IgG intravénás beadása a plazma endotoxinaktivitásának csökkenéséhez vezetett, amely egy órával az antibiotikum adása után a fehérje kontrollcsoporthoz képest, 46 %;os, négy órával később 53 %-os mértékű.

c/ Transzferrin /Trf.-Fe/A// intravénás adása nyomán a plazma erdeti endotoxin aktivitásának emelkedése - egy órával az antibiotikum beadása után - a fehérje kontrollcsoporthoz viszonyítva mintegy 36 %-kal csökkent.

d/ Transzferrin /Trf.-Fe/B// intravénás adása esetén a plazmában az endotoxinaktivitás eredeti növekedése az antibiotikum beadása után egy órával - a kontrollcsoporttal összehasonlítva - 72,5 %-kal csökken. Az antibiotikum beadása után órával az endotoxin aktivitás annál a csoportnál, amely Trf.-Fe/B/-t kapott még 63 %-kal alacsonyabb, mint a fehérjével kezelt csoportnál.

e/ Immunglobulinnal kombinált és 12 % IgM-mel dúsított transzferrin /Trf.-Fe/B// adása esetén a plazmában az endotoxin aktivitás erdeti növekedése - egy órával az antibiotikum beadása után - a fehérjét kapott kontrollcsoporthoz viszonyítva mintegy 75 %-kal alacsonyabb. 4 órával az antibiotikum beadása után annál a csoportnál, amely a kombinációt kapta az endotoxinaktivitás a fehérjét kapott csoporthoz képest 90 %-kal alacsonyabb.

Az eredmények összefoglaló értékelése

1. A transzferrin intravénás adagolás mellett, koncentrációtól függően, alkalmas arra, hogy az endotoxin aktivitását a vérben csökkentse.

2. Az endotoxin inaktiválásának mértéke a transzferrin vastartalmával növekszik. A transzferrin legkisebb vastartalma célszerűen 0,4 pg/g, előnyösen 100 pg/g feletti.

3. A vasmentes transzferrin hatása az endotoxinaktivitásra igen gyenge.

4. A transzferrin egyéb plazmafehérjékkel, különösen az IgG és az IgM frakciókkal, lehetővé teszi számottevően nagyobb hatás kifejtését az endoxin biológiai aktivitására, mint amilyen az egyes fehérjefrakciókkal kifejthető.

Az.endotoxin aktivitására való hatás szinergizmusának köszönhetően a transzferrin és az immunglobulinok kombinálásával mindkét fehérje inaktiváló hatása potencirozható.

5. A szinergizmusból eredően a transzferrin és az immunglobulinok kombinációja az endotoxin inaktiválási kapacitás lényeges emelkedésével tűnik ki.

6. Az endotoxin aktivitásának csökkentése már a vasmentes transzferrin immunglobulinokkal való kombinálásával is lehetséges, egy nagyobb inaktiválási kapacitás elérése érdekében kedvező, ha a transzferrin grammonkénti vastartalma legalább 0,4 pg. Különösen előnyös, ha a grammonkénti vastartalom 100 pg feletti.

7. Azon képességéből eredően, hogy az endotoxin aktivitását a vérben csökkenti, a vastartalmú transzferrin intravénás alkalmazása különösen megfelelő a vérpályába bejutott endotoxin toxikus hatásának leküzdésére.

8. A nagyobb inaktiválási kapacitás folytán a transzferrin és az immunglobulinok - a gyógyászat eszközeként való alkalmazása - kiválóan alkalmas az endotoxin toxikus hatásának leküzdésére, különösen azoknál a kóros elváltozásoknál, amelyekben tartósan erősebb és hosszabb időtartamú endotoxin behatolásra kerül sor a vérpályákban.

9. A transzferrin, illetve a transzferrin és az immunglobulinok kombinációja időben való terápiás bevetése esetén kedvező hatás várható bármilyen erdetü endotoxinémia klinikai lefolyására.

A találmány szerinti eljárás kivitelezését a következő példák szemléltetik:

1. PÉLDA

S. abortus equi-böl eredő 200 EU/dl endotoxint olyan 312 mg/dl koncentrációjú immunglobulinnal inkubálva, amely 12 % IgM-et tartalmaz /IgM/A/M/ az endotoxin in vitro aktivitásának mintegy 42 %-os csökkenését tapasztaljuk. Azonos koncentrációjú /312 mg/dl/ transzferrinnel, amelynek 5 %-os oldatra vonatkoztatott vastartalma 25 pg/dl /Trf.-Fe/A// az in vitro endotoxinaktivitás S. abortus equi esetében 73 %-kal, Pseudomonas aeruginosa esetében 76 %-kal csökken. Olyan transzferrinnel, amelynek 5 %-os oldatára vonatkoztatott vastartalma 950 pg/dl, S. abortus equi esetében az aktivitás 85 %-kal, Pseudomonas aeruginosa esetében 91 %-kal csökken.

A Trf.-Fe/B/ immunglobulinnal /IgG/A/M/ való kombinálása esetén alacsony /200 EU/dl alatti/ endotoxin koncentrációnál a magában adagolt Trf.-Fe/B/-hez képest az inaktiválás számottevő javulása nem következik be. Ezzel szemben a Trf.-Fe/B/ immunglobulinnal kombinálva azzal tűnik ki, hogy magasabb /300 EU/dl feletti/ koncentrációk esetén jóval több endotoxint inaktivál, mint amire a két fehérje önmagában képes. Trf.-Fe/B/ IgG/A/M /12 %/-al kombinálva 750 EU/dl koncentrációjú endotoxint S. abortus equi esetében 92 %-ban inaktivál, miközben a Trf.-Fe/B/ egymagában csak 82 %-ot.

Az inaktiválási kapacitás megadása pregnánsabban mutatja ki a Trf.-Fe/B/-t és az immunglobulint is tartalmazó kombináció különbségét /2a és 2b ábra/, mint a közepes inaktiválás százalékának megadása.

így például ez a kapacitás - 100 EU/dl endotoxin feleslegre vonatkoztatva - a Pseudomonas aeruginosa endotoxinjának esetében Trf.-Fe/B/ és immunglobulin /IgG/A/M/ kombináció alkalmazásakor 2,7-szer nagyobb, mint az egyedül használt Trf.-Fe/B/ inaktiválási kapacitása és 17,3-szer nagyobb, mint az immunglobulin /IgG/A/M/ /12 %/ egyedüli alkalmazása esetén.

Az inaktiválási kapacitás növelése a transzferrin immunglobulinnal való kombinálásával, megnyitja azt a lehetőséget, hogy e készítmény gyógyászati célú használata esetén erősebb és tar tósabb mértékű endotoxinnak a vérpályába jutása esetén is, mint ahogy az a diffúz peritonitisznél felléphet, feltarthatóvá és kezelhetővé tegyék a betegséget.

2. PÉLDA

Azoknak a feltételeknek megfelelően, amelyek Gram-negativ ferözések antibiotikummal való kezelése során felléphetnek, állatkísérletekben úgy értük el a vér endotoxin tartalmának emelkedését, hogy a hasüregbe baktériumokat juttattunk be és valamely baktericid hatású antibiotikum beadásának időpontjától kezdve a vérben az endotoxinaktivitás erőteljes növekedése volt megállapítható.

Amennyiben intravénásán egy immunglobulint vagy vastartalmú transzferrint vagy transzferrin /Trf.-Fe/B/ és immunglobulin kombinációt adtunk be, akkor az endotoxin szint növekedése a kontrollcsoporthoz képest, amely e helyett intravénásán fehérjét kapott, az alkalmazott plazmafehérjétöl függően, kevésbé vagy többé erőteljesen csökkent. Például a kontrollcsoport szintje a kísérlet végén 210 EU/dl volt, ez transzferrin adagolása esetén 77 EU/dl, transzferrin /Trf.-Fe/B// és immunglobulin /IgG/A/M/ beadása esetén pedig 22 EU/dl szintre csökkent.

A transferrin és immunglobulin adagolása útján az inaktiválási kapacitás növekedésével elérhető, hogy az endotoxin koncentráció növekedését a plazmában még tartós beáramlás esetén is megakadályozhassuk. A vashoz kötött transzferrin egyedül való adása kezdetben hasonló mértékű endotoxin aktivitáscsökkenést okoz, mint a transzferrin és immunglobulin kombináció /8/5. ábra/. A dózis emelése nélkül azonban a transzferrin inaktiválási kapacitása bizonyos idő után nem elegendő, ha a vérbe folyamatos endotoxin beáramlás történik, ami által a plazmában az endotoxin aktivitás újra növekedhet.

3. PÉLDA

Egy nőnemű paciensnél, akinél súlyos, hasüregi szepszis képe fejlődött ki és ebből kifolyólag bizonyos szervei felmondták a szolgálatot, sikerült a plazmában megnövekedett endotoxin aktivitást kimutatni.

mg/dl volt /normál mg/dl koncentrációban

A plazma transzferrin koncentrációja tartomány 200-400 mg/dl/. A plazmát 312 alkalmazott immunglobulinnal, amelyet

IgM-el dúsítottunk 30 percig 37 °C-on inkubálva az endotoxin aktivitás 17 %-kal csökkent. 312 mg/dl koncentrációjú transzfer rinnel /Trf.-Fe/A// inkubálva az endotoxin 29 %-a inaktiválódott.

A Trf.-Fe/A/-t immunglobulinnal kombinálva /egyenként 312 mg/dl koncentrációban/ a paciens plazmájában az endotoxin 39 %-a inak tiválódott .

Azonos mennyiségű, magasabb vastartalmú transzferrin /Trf.-Fe/B// megfelelő koncentrációban való alkalmazása után a paciens plazmájában az endotoxin 45 %-a inaktiválódott. Amikor a transzferrint /Trf.-Fe/B// IgM-mel dúsított immunglobulinnal /IgG/A/M/ kombináltuk a paciens plazmájában az endotoxin 53 %-a inaktiválódott, tehát 36 %-kal több, mint a tiszta immunglobulin készítménnyel.

Az endotoxin aktivitásának erőteljes csökkentése transzferrinnel és még erőteljesebb csökkentése transzferrin és immungobulin kombinálásával, intravénás alkalmazás esetén lehetőséget nyújt bármely erdetü endotoxinémia esetében a paciens kilátásainak döntő mértékű -megjavítására.

4. PÉLDA

Annak megállapítására, hogy mi a transzferrin immunglobulinnal való kombinálásának a letalitásra való befolyása, állatkísérleteket végeztünk. Wistar patkányoknak intraperitoneálisan meghatároq zott számú, 9 x 10 CFU/ml E. coli baktériumot adtunk be. Jellegzetes endotoxonémia előidézése érdekében 30 perccel később intravénásán egy bakteriosztatikus hatású antibiotikumot /IMIPENEM: 28 mg/testsúly kg alkalmaztunk. A bakteriális infekció lehető legradikálisabb szanálására az antibiotikumot 14 mg/testsúly kg mennyiségben további 3 napig adagoltuk 4 órás időközökben.

Egy állatcsoportnak /n=18/ 15 perccel a baktériumok beadása előtt 250 mg/kg dózisban vasban gazdag transzferrint /Trf.-Fe/B// adtunk. Egy további csoport /n=15/ 150 mg/kg transzferrint /Trf.-Fe/B// kapott intravénásán. Egy további csoport /n=15/ a baktériumok beadása előtt 12 7» IgM-mel dúsított polivalens

IgG készítményt /IgG/A/M/ kapott ugyancsak 150 mg/kg dózisban. A kontrollcsoport a baktériumok beadása előtt intravénásán csak fehérjét kapott 250 mg/kg dózisban.

Miközben a fehérje-csoport összes állatai és az immunglobulincsoport /IgG/A/M/ 80 %-a a baktériumok beadása után legkésőbb napon belül elhullott, addig az állatok 89 %-a életben maradt abban a csoportban, amely kizárólag 250 mg/dl transzferrint /Trf.-Fe/B//-t kapott. Ezzel ellentétben azon csoport állatainak, amely transzferrint kapott /Trf.-Fe/B// 150 mg/kg dózisban, a 74 7>-a elhullott. Azok közül az állatok közül, amelyek transzferrint /Trf.-Fe/B/ és immunglobulint /IgG/A/M/ kombinálva kaptak 94 7 túlélte a kísérletet.

Claims (6)

Szabadalmi igénypontok

1.

Eljárás endotoxinémia elleni gyógyszerkészítmények előállítására, azzal j ellemezve, hogy transzf errinböl vagy csekély mennyiségű vasat megkötött transzferrinböl vagy nagyobb mennyiségű vasat megkötött transzferrinböl vagy vassal telitett transzferrinböl és immunglobulinból önmagában ismert módon parenterális gyógyszerkészítményt állítunk elő.

2.

Az 1. igénypont szerinti eljárás kiviteli módja, azzal j e 1 lemezve, hogy a csekély mennyiségű vasat megkötött transzferrin grammonként legalább 0,4 pg vasat tartalmaz.

3.

Az 1. igénypont szerinti eljárás kiviteli módja, azzal j e 1 lemezve, hogy a nagyobb mennyiségű vasat megkötött transzferrin grammonként több mint 100 pg vasat tartalmaz.

4.

Az 1 - 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás kiviteli módja, azzal jellemezve, hogy a készítmény a transzferrin mellett IgG vagy IgG és IgM, valamint IgA fehérjefrakciók oldatát tartalmazza.

5.

Az 1 - 4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás kiviteli módja, azzal jellemezve, hogy a transzferrin és az immunglobulin koncentrációja egyaránt 200-400 mg/dl közötti, célszerűen 312 mg/dl körüli.

6.

Az 1 - 5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás kiviteli módja, azzal jellemezve, hogy az immunglobulinhoz az IgM frakciót 12 7» körüli mennyiségben adjuk hozzá.